បទបញ្ញត្តិនៃស្ថេរភាព DeltaFosB ដោយផូស្វ័រ (2006)

J Neurosci ។ 2006 May 10;26(19):5131-42.

ប្រភព

នាយកដ្ឋានចិត្តសាស្ត្រមជ្ឈមណ្ឌលសម្រាប់សសៃប្រសាទមូលដ្ឋាននៃសាកលវិទ្យាល័យវេជ្ជសាស្ត្រភាគនិរតីនៃរដ្ឋតិចសាសរដ្ឋតិចសាស់រដ្ឋ Dallas រដ្ឋតិចសាស់ 75390-9070 សហរដ្ឋអាមេរិក។

អរូបី

កត្តាប្រតិចារិក DeltaFosB (ហៅផងដែរថា FosB2 ឬ FosB [ទម្រង់ខ្លី] គឺជាអ្នកសំរបសំរួលសំខាន់នៃប្លាស្ទិករយៈពេលវែងដែលបណ្តាលមកពីខួរក្បាលដោយការប៉ះពាល់រ៉ាំរ៉ៃទៅនឹងប្រភេទនៃការរំញោចចិត្តសាស្ត្ររួមទាំងគ្រឿងញៀននៃការរំលោភបំពានភាពតានតឹងនិងការប្រកាច់អេឡិចត្រូលីត។ ។ លក្ខណៈពិសេសប្លែកមួយរបស់ DeltaFosB គឺថានៅពេលវាបង្កើតវាមាននៅក្នុងខួរក្បាលក្នុងរយៈពេលយូរក្នុងអវត្តមាននៃការរំញោចបន្ថែមទៀត។ ទោះជាយ៉ាងណាក្តីយន្តការដែលមានស្ថេរភាពជាក់ស្តែងនៅមិនទាន់ដឹងនៅឡើយទេ។ នៅទីនេះយើងបង្ហាញថា DeltaFosB គឺជាកត្តាចម្លងដែលមានស្ថេរភាពដែលមានអាយុកាលពាក់កណ្តាលប្រហែល 10 ម៉ោងនៅក្នុងវប្បធម៌កោសិកា។ លើសពីនេះទៀតយើងបង្ហាញថា DeltaFosB គឺជាផូស្វ័រផូផូទីននៅក្នុងខួរក្បាលហើយផូស្វ័រនៃសំណល់សៀរៀលដែលត្រូវបានគេអភិរក្សខ្ពស់ (សឺជីអិចអេចអេស) នៅក្នុង DeltaFosB ការពារវាពីការរិចរិលរបស់ប្រូតេអ៊ីន។ យើងផ្តល់នូវភស្តុតាងជាច្រើនដែលបង្ហាញថាផូស្វ័រនេះត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយ casein kinase 27 ។ ការរកឃើញទាំងនេះគឺជាភស្ដុតាងដំបូងដែលថា DeltaFosB មានផូស្វ័រនិងបង្ហាញថាផូស្វ័ររួមចំណែកដល់ស្ថេរភាពរបស់វាដែលជាស្នូលនៃសមត្ថភាពក្នុងការសម្រុះសម្រួលអាដាប់ធ័រយូរអង្វែងនៅក្នុងខួរក្បាល។

សេចក្តីផ្តើម

កត្តាប្រតិចារិកΔFosBដែលត្រូវបានគេកំណត់ផងដែរថា FosB2 ឬ FosB [ទម្រង់ខ្លី] គឺជាវ៉ារ្យ៉ង់ពុះដែលបញ្ចប់ដោយអតិសុខុមប្រាណរបស់ហ្សែនភ្លាមៗ។ fosb ។ (Dobrazanski et al ។ , 1991 ។; Nakabeppu និង Nathans, 1991 ។; យ៉េននិងអិល។ , 1991) ។ ដូច FosB ប្រវែងពេញ, ΔFosBមានដែនមូលដ្ឋានភ្ជាប់ឌីអិនអេនិងខ្សែហ្សែនលីចូនដែលវាធ្វើឱ្យស្រអាប់ជាមួយប្រូតេអ៊ីនមិថុនាដើម្បីបង្កើតប្រូតេអ៊ីនសកម្ម -1 (AP-1) ដែលជាកត្តាកំណត់នៃហ្សែនជាច្រើន (Morgan និង Curran, 1995 ។; Rylski និង Kaczmarek, 2004 ។) ។ ទោះបីជាខ្វះផ្នែកមួយនៃដែនប្រតិបតិ្តការត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងអង្សាសេនៃអេហ្វបូប៊ីមុខងារΔFosBមានតួនាទីជាអ្នកធ្វើប្រតិចារិកប្រតិចារិកដ៏សកម្មនិងជាអ្នកបង្ក្រាបនៅក្នុងកោសិកាដែលមានវប្បធម៌និងខួរក្បាល។Dobrazanski et al ។ , 1991 ។; Nakabeppu និង Nathans, 1991 ។; Chen et al ។ , 1997; McClung និង Nestler, 2003; Kumar et al ។ , 2005).

ΔFosB ត្រូវបានបង្កើតឡើងក្នុងកំរិតខ្ពស់ក្នុងលក្ខណៈជាក់លាក់នៃតំបន់ក្នុងខួរក្បាលបន្ទាប់ពីមានជំងឺរ៉ាំរ៉ៃប៉ុន្តែមិនស្រួចស្រាវចំពោះការរំញោចចិត្តសាស្ត្ររួមទាំងភាពតានតឹងដំបៅជាក់លាក់ថ្នាំប្រឆាំងនឹងរោគនិងថ្នាំប្រឆាំងនឹងជំងឺធ្លាក់ទឹកចិត្តថ្នាំនៃការរំលោភបំពាននិងរង្វាន់ធម្មជាតិ។ (Hope et al ។ , 1994b; Hiroi និង Graybiel, 1996; Moratalla et al ។ , 1996; Bing et al ។ , 1997 ។; Mandelzys et al ។ , 1997; Kelz et al ។ , 1999; Werme et al ។ , 2002; Andersson et al ។ , 2003; Colby et al ។ , 2003; Peakman et al ។ , 2003 ។; Perrotti et al ។ , 2004; Zachariou et al ។ , 2006) ។ ការបង្កើតអេហ្វហ្វប៊ីបានទាក់ទងដោយផ្ទាល់ទៅនឹងផលប៉ះពាល់មុខងារនៃការរំញោចទាំងនេះជាច្រើនទៅលើខួរក្បាល។ ភាពស្ថិតស្ថេររបស់ evenFosB សូម្បីតែអវត្ដមាននៃការរំញោចបន្ថែមទៀតសម្គាល់វាពីកត្តាចម្លងគ្រួសារ Fos ផ្សេងទៀតដែលត្រូវបានបង្កើតយ៉ាងឆាប់រហ័សក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការរំញោចស្រួចស្រាវការរលួយត្រឡប់ទៅកម្រិតបាតវិញក្នុងរយៈពេលពីរបីម៉ោងហើយជាទូទៅបង្ហាញការអស់សង្ឃឹមបន្ទាប់ពីការរំញោចរ៉ាំរ៉ៃ (Hope et al ។ , 1992; Daunais et al ។ , 1993; Persico et al ។ , 1993 ។; Hiroi និង Graybiel, 1996; Perrotti et al ។ , 2004) ។ នេះធ្វើឱ្យΔFosBក្លាយជាអ្នកទាក់ទាញដើម្បីសម្រុះសម្រួលការផ្លាស់ប្តូរដែលមានរយៈពេលយូរអង្វែងនៅក្នុងហ្សែនដែលបញ្ជាក់ពីការបន្សាំសរសៃប្រសាទថេរដែលបណ្តាលមកពីការរំញោចរ៉ាំរ៉ៃជាក់លាក់។

ដោយសារតែវត្តមានរបស់ ofFosB ដែលអូសបន្លាយបានកើតឡើងក្នុងករណីដែលគ្មានការបញ្ចោញបន្ថែមនៃ mRNA របស់វា (Chen et al ។ , 1995) យើងបានប៉ាន់ស្មានថាមិនដូចអេហ្វអូប៊ីពេញម៉ោងនិងប្រូតេអ៊ីនគ្រួសារហ្វីសទាំងអស់ផ្សេងទៀតដែលមិនស្ថិតស្ថេរខាងរាងកាយΔFosBអាចជាកត្តាចម្លងមិនទៀងទាត់ (Hope et al ។ , 1994b; Chen et al ។ , 1997; Nestler et al ។ , 2001; McClung et al ។ , 2004) ។ ម៉្យាងវិញទៀតការវិភាគភាពស៊ាំនៃកោសិកាខួរក្បាលដែលត្រូវបានរំញោចស្រួចស្រាវនិងរ៉ាំរ៉ៃបានបង្ហាញថាការផ្លាស់ប្តូរជាក់ស្តែងរបស់ហ្វុសប៊ីប M_r (ម៉ូលេគុលម៉ូលេគុល) ពី ∼33 kDa ក្នុងស្ថានភាពធ្ងន់ធ្ងរដល់ ∼35 – 37 kDa ក្នុងកំឡុងពេលព្យាបាលរ៉ាំរ៉ៃ (Hope et al ។ , 1994a; Chen et al ។ , 1995) ។ ដោយសារតែមិនមានភស្តុតាងសម្រាប់អត្ថិភាពនៃ mRNA បន្ថែមដែលអាចអ៊ិនកូដសម្រាប់ isoforms ផ្សេងគ្នាទាំងនេះយើងបានប៉ាន់ប្រមាណបន្ថែមទៀតថាΔFosBត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរក្រោយវិស័យហើយប្រហែលជានេះរួមចំណែកដល់ស្ថេរភាពមិនធម្មតារបស់វា។ ទោះយ៉ាងណារហូតមកដល់ពេលនេះមិនមានការវិភាគជីវគីមីនៃការប្តូរវេនឬការផ្លាស់ប្តូរក្រោយឆ្លងទន្លេនៃΔFosBត្រូវបានគេរាយការណ៍ទេ។ គោលដៅនៃការសិក្សានាពេលបច្ចុប្បន្ននេះគឺដើម្បីកំនត់ថាΔFosBគឺជាផូស្វ័រនិងថាតើផូស្វ័រដើរតួក្នុងស្ថេរភាពរបស់វាដែរឬទេ។

ផ្នែកមុន ផ្នែកបន្ទាប់

សំភារៈនិងវិធីសាស្រ្ត

ខ្សែកោសិកាម៉ាំម៉ាននិងឌីអិនអេបង្កើត។

កោសិកា PC12 (Clontech, Mountainview, CA) ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយប្រើ DMEM ដែលមានជាតិគ្លុយកូសខ្ពស់ដែលមានផ្ទុកជាតិ l-glutamine (L-Gln) និងបំពេញបន្ថែមជាមួយនឹងសេរ៉ូមប៊ីរ៉ូអ៊ីន (XBSX%) របស់សេរ៉ូមសេះ (FBS), សេរ៉ូមសេះ 5% (ទាំងពី Invitrogen, Carlsbad, CA) ។ , ប៉េនីស៊ីលីន 10 U / មីលីលីត្រនិង 100 μg / មីលីលីត្រ streptomycin (ទាំងពីរមកពី Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ។ កោសិកា HeLa (ការប្រមូលវប្បធម៌ប្រភេទអាមេរិច, ម៉ាណាសាស, វី។ អេ។ អេ។ អេ។ អេ។ អិល) ត្រូវបានគេដាំដុះនៅក្នុងឌីអឹមអ៊ីដ្យូមមានជាតិស្ករខ្ពស់ដែលមានផ្ទុក L-Gln និងបំពេញបន្ថែមជាមួយ 100% FBS, ប៉េនីស៊ីលីននិង streptomycin ។ ខ្សែទូរស័ព្ទទាំងពីរត្រូវបានរក្សានៅសីតុណ្ហភាព 10 អង្សាសេនៅក្នុងតំបន់សើម 37% CO ។₂ បរិយាកាស។

ចំពោះការផ្លាស់ប្តូរបណ្តោះអាសន្នជាមួយឌីអិនអេ, កោសិកា PC12 ឬ HeLa ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងចានដែលមានអណ្តូងចំនួន ៦ (ស្រោបដោយកូឡាជែនទី ១ សម្រាប់កោសិកា PC12) ដើម្បីឈានដល់ចំណុចប្រសព្វ 90 – 100% នៅថ្ងៃបន្ទាប់ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានឆ្លងដោយប្រើ Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ។ នៅក្នុងការពិសោធន៍មួយចំនួន (សូមមើល។ រូប។ 1 ⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosBត្រូវបានបង្ហាញជាបណ្តោះអាសន្ននៅក្នុងកោសិកា PC12 តាមរយៈការឆ្លងមេរោគជាមួយវីរុសអ៊ប៉សដែលងាយនឹងបង្ករោគ (HSV) ។

DFosB និង FosB cDNAs ត្រូវបានទទួលពីការស្ថាបនាផេតថបផ្ទាល់ខ្លួនរបស់យើង (Chen et al ។ , 1997) និងបានដាក់បញ្ចូលទៅក្នុងវ៉ិចទ័រ pcDNA3.1 វ៉ិចទ័រ (អ៊ីនធូលីន) ។ ការស្ថាបនា pcDNA3.1-ΔFosB / FosB ទាំងនេះត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការបញ្ចេញមតិនៅក្នុងកោសិកាថនិកសត្វនិងជាគំរូសម្រាប់ mutagenesis ដឹកនាំនៅនឹងកន្លែង។ ក្រុមហ៊ុនបន្ត HSV-osFosB ត្រូវបានរៀបចំដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (Neve et al ។ , 1997) និងការរៀបចំមានមួយលីត្រ ∼1 × 10 ។⁸ pfu / ml ។

ការពិសោធន៍ជីពចរ។

ប្រហែល 24 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការឆ្លង / ការឆ្លងមេរោគកោសិកា (PC12 ឬ HeLa) នៅក្នុងចានអណ្តូងចំនួនប្រាំមួយត្រូវបានទឹកនាំទៅពីរទៅបីដងជាមួយ 2 មីលីក្រាមនៃ PBS ហើយដាក់បញ្ចូលនៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សាសេសម្រាប់ ∼1 ម៉ោងក្នុងស៊ីអេសអេស XXX មីល្លីម៉ែត្រមីស៊ីល / DMEM (Invitrogen) បំពេញបន្ថែមជាមួយអេជអេហ្វអេសអេចអរអេសចំនួន ៩៤ ភាគរយ (ហ៊ីក្លូនឡូហ្គែនយូ។ អិន) ដើម្បីលុបអាងហែលទឹកដែលមិនមានបំលាស់ទី។ នៅចុងបញ្ចប់នៃរយៈពេល“ ភាពអត់ឃ្លាន” នេះថ្នាំ (ប្រសិនបើកោសិកាត្រូវបានព្យាបាល) ត្រូវបានបន្ថែមហើយកោសិកាត្រូវបានដាក់ស្លាក (ជីពចរ) ជាមួយ 2 – 5 μCiនៃ ³⁵ការបញ្ចូលស្លាកប្រូតេអ៊ីនប្រូតេអ៊ីន (PerkinElmer, Wellesley, MA) សម្រាប់ ∼1 ម៉ោងនៅ 37 ° C ដើម្បីដាក់ស្លាកប្រូតេអ៊ីនដែលសំយោគថ្មីទាំងអស់។ បន្ទាប់មកកាំរស្មីត្រូវបានយកចេញដោយលាងកោសិកាពីរទៅបីដងជាមួយ 2 មីលីលីត្រនៃភីអេសប៊ីនិងអេ។ ³⁵ប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាកសញ្ញា S ត្រូវបានគេតាមដាន (ជំនួស) ដោយជំនួសឧបករណ៍ផ្ទុកដោយបន្ថែមត្រជាក់មធ្យម (nonradioactive) ជាមួយនឹង 5% FBS និងប្រមូលកោសិកានៅពេលវេលាផ្សេងៗគ្នា។ ការព្យាបាលកោសិកាត្រូវបានថែរក្សានៅទូទាំងការដេញតាម។ តួលេខទាំងអស់នៃការពិសោធន៍ទាំងនេះបង្ហាញពីបរិមាណដំបូងនៃប្រូតេអ៊ីនផ្សេងៗគ្នាដើម្បីបង្កើនការប្រៀបធៀបអត្រាវេនរបស់ពួកគេ។

សត្វនិងការព្យាបាលការប្រកាច់អេឡិចត្រូលីតរ៉ាំរ៉ៃ។

កណ្តុរឈ្មោលរបស់មនុស្សពេញវ័យស្ព្រេយដាឡៃ (200 – 300 ក្រាម; មន្ទីរពិសោធន៍ Charles River, Kingston, RI) ត្រូវបានព្យាបាលម្តងក្នុងមួយថ្ងៃជាមួយនឹងការឆក់អគ្គិសនី (អេសអេសអេស) សម្រាប់ 7 for 9 ឃ។ ECS ត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (Hope et al ។ , 1994a) ដោយប្រើមួយ។ យូហ្គោល។ (Comerio VA, អ៊ីតាលី) ឯកតា ECS ដែលមានការកំណត់ដូចខាងក្រោម: ប្រេកង់, 100 ជីពចរ / វិនាទី; ជីពចរជាមួយ, 0.5 ms; រយៈពេលឆក់, 1.0 s; និងបច្ចុប្បន្ន, 75 mA ។ សត្វដែលត្រូវបានគេមើលងាយត្រូវបានគេព្យាបាលស្របគ្នាដោយប្រើអេឡិចត្រូតត្រចៀកដោយមិនមានចរន្តអគ្គិសនី។

³² ការដាក់ស្លាកមេតាប៉ូលីស។

ចំពោះការដាក់ស្លាកចំណិតខួរក្បាលសត្វកណ្តុរត្រូវបានកាត់ខួរក្បាលខួរក្បាលត្រូវបានបែងចែកយ៉ាងឆាប់រហ័សហើយចំណិតផ្នែកខាងមុខផ្នែកខាងមុខនៃតំបន់ 300 werem ត្រូវបានគេរៀបចំជាមួយអេក្រង់មីក្រូអេសខេអេសខេ (Ted Pella, Redding, CA) ។ ចំណិតនេះត្រូវបានគេដាក់បញ្ចូលក្នុងបំពង់ប្លាស្ទិចក្នុងអេកអេសអេហ្វអេហ្វអេហ្វអេហ្វអេសអេហ្វអេសអេហ្វអេសអេហ្វអេសអេសអេចអេសអេចអេសអេសអេចអេសអេសនិងរក្សានៅសីតុណ្ហភាព 2 អង្សាសេក្រោមការពុះកញ្ជ្រោលទន់ភ្លន់ឥតឈប់ឈរជាមួយអូ។₂/សហ₂ ល្បាយ (ហាំមម័រ et al ។ , 1989 ។) ។ ចំណិត (ចំណិតពីរក្នុងមួយបំពង់) ត្រូវបានដាក់ស្លាកជាមួយ 1.3 mCi សម្រាប់ 8 – 10 ម៉ោងនៅក្នុងវត្តមានឬអវត្តមាននៃអាស៊ីដ okadaic (100 ng / ml) ។ នៅចុងបញ្ចប់នៃការភ្ញាស់នេះចំណិតត្រូវបានគេលាងយ៉ាងតិច ៣ ដងជាមួយអេសអេសអេហ្វត្រជាក់ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានធ្វើសភាគជាតិសាសន៍ដោយការដាក់បញ្ចូលក្នុងសឺវ័រនៅស៊ីធីអេសអេចអិលអេសនៃការសាយភាយវិទ្យុសកម្មត្រជាក់ (RIPA) សតិបណ្ដោះអាសន្ន [PBS, pH 250, 7.4 មម NaCl, 150% (v / v ) Igepal, 1% (w / v) សូដ្យូម deoxycholate, 0.5% (w / v) SDS, 0.1 មម EDTA] បានបន្ថែមមុនពេលប្រើជាមួយអេសឌីអេសរហូតដល់ 1%, ស្រាក្រឡុកប្រូសេស្តេរ៉ូនសម្រាប់កោសិកាថនិកសត្វ (ប្រើនៅ 0.6 μl / ml; Sigma-Aldrich), phosphatase inhibitor ក្រឡុក I និង II (ប្រើនៅ 5: 1; Sigma-Aldrich), XMSX ម។ ម។ ភី។ អេស។ អេស។ អិល, និងគ្លីសេរីន 100% ។ សភាគត្រូវបានដាំឱ្យពុះរយៈពេល 1 នាទីហើយត្រូវបានបោសសំអាតដោយផ្ចិតនៅ 2 X ។ g សម្រាប់ 15 នាទី។ ការផ្តោតអារម្មណ៍ប្រូតេអ៊ីននៅក្នុង supernatants លទ្ធផលត្រូវបានវាយតម្លៃដោយប្រើការអះអាងប្រូតេអ៊ីន BCA (Pierce, Holmdel, NJ) ។

សម្រាប់ ³²ការដាក់ស្លាក P នៃកោសិកាដែលមានលក្ខណៈជាកោសិកា ,24 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការឆ្លងមេរោគ / ការប្តូរកោសិកាត្រូវបានលាងសម្អាត ២ ទៅ ៣ ដងជាមួយនឹងផូស្វ័រដែលមិនមានផ្ទុកហើយបញ្ចូលក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកនេះរយៈពេល for1 ម៉ោង។ បន្ទាប់ពីរយៈពេលអត់ឃ្លាននេះ 0.2 – 0.3 mCi នៃ។ ³²PH₃PO₄ (PerkinElmer) ត្រូវបានបន្ថែមទៅអណ្តូងនីមួយៗហើយកោសិកាត្រូវបានដាក់ស្លាកសម្រាប់ 4 – 12 ម៉ោងអាស្រ័យលើប្រភេទនៃការពិសោធន៍ (សូមមើលផ្លែល្វា។ 1 – 7 សម្រាប់លក្ខណៈជាក់លាក់) ។ បន្ទាប់មកកោសិកាត្រូវបានទឹកនាំទៅបីដងជាមួយភី។ ភី។ អេសហើយដាក់លើទឹកកករយៈពេល 15 នាទីជាមួយស៊ីអ៊ិចអេសអេចអិលអិល។ Lysates ត្រូវបានប្រមូលដោយ scraping និងត្រូវបានឆ្លងកាត់ 50 ដងតាមរយៈម្ជុល 10 ga ដើម្បីកាត់ DNA, ដាំឱ្យពុះសម្រាប់ 25 នាទីនិងដាក់ចំកណ្តាលនៅ 10 rpm សម្រាប់ 15,000 – 15 នាទីនៅ 30 ° C ។ ឡេស្យូមដែលត្រូវបានគេបោសសំអាត (supernatants) ត្រូវបានផ្ទេរទៅបំពង់ថ្មីមួយហើយការវាយប្រូតេអុីន BCA (ព្យែរ) ត្រូវបានអនុវត្ត។ តួលេខទាំងអស់នៃការពិសោធន៍ទាំងនេះបង្ហាញបរិមាណប្រហាក់ប្រហែលនៃប្រូតេអ៊ីនសរុបប្រភេទ (WT) និងប្រូតេអ៊ីន S4A ΔFosBដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពប្រៀបធៀបនៃកម្រិត phosphorylation ដែលទាក់ទង។

គីមីនិងការព្យាបាលវប្បធម៌កោសិកា។

អាស៊ីត Okadaic (OA; Sigma-Aldrich) ត្រូវបានរំលាយនៅក្នុងអេតាណុលហើយត្រូវបានគេប្រើនៅកំហាប់ចុងក្រោយនៃ 100 ng / ml ។ 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB; Biomol, ការប្រជុំ Plymouth, PA) ត្រូវបានរំលាយនៅក្នុងឌីអុកស៊ីតស៊ុលហ្វីតឌីអុកស៊ីត (DMSO; Sigma-Aldrich) និងត្រូវបានប្រើក្នុងវប្បធម៌កោសិកានៅកំហាប់ចុងក្រោយនៃ 50 μm។ Spermine (Sigma-Aldrich) ត្រូវបានរំលាយនៅក្នុងទឹកហើយត្រូវបានប្រើនៅកំហាប់ចុងក្រោយនៃ 200 μm។ Calphostin-C (Biomol) ត្រូវបានរំលាយនៅក្នុង DMSO និងត្រូវបានប្រើនៅ 0.2 μmចំណែកឯ phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Promega, Madison, WI) ត្រូវបានរំលាយនៅក្នុង DMSO និងប្រើនៅ 0.1 μm។ សារធាតុ peptide inhibitory ដែលទាក់ទងនឹង myristoylated-autocamtide-2 ត្រូវបានរំលាយនៅក្នុងទឹកហើយត្រូវបានប្រើនៅកំហាប់ចុងក្រោយនៃ 1 និង 10 μm។ សារធាតុរារាំង kinase ប្រូតេអ៊ីនដែលមានវិសាលគមទូលំទូលាយ H-7 និង H-8 (ប៊ីម៉ាម៉ុល) ត្រូវបានរំលាយនៅក្នុងទឹកហើយត្រូវបានប្រើនៅកំហាប់ចុងក្រោយនៃ 150 និង 200 μmរៀងៗខ្លួន។ MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) និង epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) ទាំងពីរត្រូវបានរំលាយនៅក្នុង DMSO និងត្រូវបានប្រើនៅកំហាប់ចុងក្រោយនៃ 12.5 និង 7.5 μmរៀងៗខ្លួន។ នៅក្នុងការពិសោធន៍ទាំងអស់ DMSO (យានយន្ត) ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងកោសិកាដែលចាំបាច់ដើម្បីរក្សាបរិមាណថេរនៃឌីអេមអូអេឆ្លងកាត់ការព្យាបាល។ សម្រាប់។ ³²ការពិសោធន៏ផ្លាក P ថ្នាំត្រូវបានបន្ថែមភ្លាមៗនៅមុខផ្លាកហើយរក្សាទុកសំរាប់រយៈពេលដែលនៅសល់។ ចំពោះការពិសោធន៏ជីពចរថ្នាំត្រូវបានបន្ថែមនៅពេលដែលស៊ីខេ / ម៉េ“ អត់ឃ្លាន” រក្សាទុកក្នុងកំឡុងពេលដាក់ស្លាកហើយបន្ទាប់មកបន្ថែមចូលទៅក្នុងឧបករណ៍ដេញតាមវិញ។ អ្នករារាំងប្រូសេស្តេរ៉ូនត្រូវបានគេបង្កើតឡើងរៀងរាល់ 3 – 4 ម៉ោងនៅទូទាំងការដេញថ្លៃដើម្បីទូទាត់សងសម្រាប់ការផ្លាស់ប្តូររហ័សនៃ peptides ទាំងនេះ។

opFosB ប្រព័ន្ធការពារភាពស៊ាំការការពាររាងកាយនិងការធ្វើស្វ័យប្រវត្តិ។

ចំពោះភាពស៊ាំថ្នាំបញ្ចុះលាមកត្រូវបានពនលាយ 1: 5 ជាមួយ RIPA ធម្មតាដើម្បីធ្វើអោយកំហាប់ SDS ធ្លាក់ចុះដល់ 0.1% មុនពេលបន្តប្រើភាពស៊ាំការពាររាងកាយ (អាយភី) ។ ដើម្បីកំនត់ការចងដែលមិនសមហេតុសមផលលីចូតត្រូវបានសម្អាតជាមុនដោយប្រើប្រព័ន្ធការពាររាងកាយជាមួយអ៊ីហ្គីម៉ាអ៊ីហ្គីមនិងប្រូតេអ៊ីន G-Sepharose (Sigma-Aldrich) យ៉ាងហោចណាស់ 4 ម៉ោង។ ΔFosBក្រោយមកត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងពីលីស្យូសដែលត្រូវបានលុបចោលដោយប្រើអង្គបដិប្រាណប៉ូលីយូធ្យូនពពែដែលទទួលស្គាល់ពីអ៊ីដ្រូសែនផ្ទៃក្នុងទាំងហ្វុសប៊ីនិងΔFosB (SC-48G; សាន់តាប្រេហ្សិនជីវសាស្រ្តវិទ្យាសាន់តា Cruz, CA) នៅ 0.5 – 1 μg IgG ក្នុងប្រូតេអ៊ីន XysX μg។ (10 – 50 μgនៃប្រូតេអ៊ីនសរុប) ក្នុងបរិមាណសរុប 300 មីលីលីត្រ។ អាយភីត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងទន់ភ្លន់នៅសីតុណ្ហភាព 0.5 អង្សាសេនៅលើរ៉ោតទ័រយ៉ាងហោចណាស់មួយ 4 ម៉ោងហើយបន្ទាប់មក 8 μlនៃប្រូតេអ៊ីន G-Sepharose ត្រូវបានបន្ថែមហើយអាយភីត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងហោចណាស់យ៉ាងហោចណាស់ 15 ម៉ោង។ អាយភីត្រូវបានបញ្ចោញដោយបង្វិលនៅ 4 ×។ g សម្រាប់ 3 – 5 នាទីនៅ 4 ° C, លាងបីដងជាមួយ 0.5 មីលីលីត្រនៃ RIPA ធម្មតាត្រជាក់និងពីរដងជាមួយ PBS ត្រជាក់មានផ្ទុក 0.1% Tween 20 ។ អាយភីត្រូវបានគេយកទៅប្រើជាថ្មីនៅក្នុងស៊ីធីអិលស៊ីអិលស៊ីអិច ៨០ មីលីលីត្រនៃភីអេសប៊ីត្រជាក់បានផ្ទេរដាក់បញ្ចូលក្នុងបំពង់ថ្មីហើយប្រូតេអ៊ីនដែលមានប្រព័ន្ធការពាររាងកាយត្រូវបានលុបចោលដោយការបន្ថែម 0.5 – 15 μlនៃ 25 ×កាត់បន្ថយប៊ូហ្វេគំរូប្រូតេអ៊ីនឡាមមីលី។ ពិធីសារ IP នេះបណ្តាលឱ្យមានរបបទឹកភ្លៀងជាក់លាក់និងមានប្រសិទ្ធិភាពនៃស្ទើរតែទាំងអស់នៃអ័របូបូនៅក្នុងឡ។ ប្រូតេអ៊ីនដែលមានភាពស៊ាំត្រូវបានគេដាក់បញ្ចូលទៅក្នុងអេសអេសអេស - ភីអេសដោយផ្ទុកអាយអេសអេសទាំងមូលនៅលើជែលអេមអេសអេសអេសអេសអេសអេចអេសអេសអេស (ជីវរ៉ាឌីហីលស៊ីលីកា) ហើយបន្ទាប់មកផ្ទេរទៅ PVDF ឬនីត្រូរ៉ូលស៊ុល។ បន្ទាប់ពីការផ្ទេរភ្នាសស្ងួតខ្យល់និង។ ³²P- និង។ ³⁵ក្រុមតន្រ្តីប្រូតេអ៊ីនកាំរស្មី S-radiolabeled ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដោយខ្សែភាពយន្តស្វ័យប្រវត្ដិសាស្ដ្រដោយប្រើខ្សែភាពយន្តស្វ័យប្រវត្តិកម្ម Kodak (Rochester, NY) ក៏ដូចជាដោយ phosphorimaging ដោយប្រើព្យុះ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager ។ សរុប (មិនមានផូស្វ័រនិង phosphorylated) osFosB ក្នុងលីណូស្យូសកោសិកាឬសភាគដូចគ្នានៃខួរក្បាលត្រូវបានរកឃើញដោយការការពារមិនឱ្យជ្រាបចូលនៃប្រូតេអ៊ីនដែលអាចការពារបាន (ប្រើភ្នាសដូចគ្នាប្រើដើម្បីរក ³²ប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាក P) ឬមានបរិមាណស្មើគ្នានៃប្រូតេអ៊ីន lysate / homogenate ដែលទទួលរងនូវ SDS-PAGE ហើយផ្ទេរទៅ PVDF ឬ nitrocellulose ។ ភ្នាសរំអិលត្រូវបានរារាំងដោយការបញ្ចូលវាជាមួយទឹកដោះគោស្ងួតដែលមិនមែនជាសាច់ (Bio-Rad) នៅក្នុងអិចភីអេសបានបន្ថែមជាមួយនឹង 1% (v / v) Tween 0.1 (Sigma) សម្រាប់ 20 ម៉ោងនៅ 1 ° C ។ បន្ទាប់មកភ្នាសរំអិលត្រូវបានគេចាក់បញ្ចូលក្នុងអំលុងពេល 25 អង្សាសេដោយប្រើអង្គបដិប្រាណប៉ូលីសប្រឆាំងនឹងអេហ្វត្រូប៊ីបបង្កើតដោយប្រឆាំងនឹងអាស៊ីដអាមីណូ 4 – 1 នៃ FosB / ΔFosB (ប្រើនៅ 16: 1) ។ បន្ទាប់ពីការបង្កាត់បឋមភ្នាសត្រូវបានទឹកនាំទៅបួនដងសម្រាប់ 10,000 នាទីជាមួយនឹងការទប់ស្កាត់បណ្តោះអាសន្នហើយបន្ទាប់មកដាក់នៅសីតុណ្ហភាព 5 អង្សាសេសម្រាប់ ∼25 ម៉ោងជាមួយពពែទន្សាយប្រឆាំងនឹងទន្សាយ IgG ភ្ជាប់ទៅនឹងថ្នាំ horseradish peroxidase (ប្រើនៅ 1: 1 ក្នុងការរារាំងសតិបណ្ដោះអាសន្នពីវ៉ិចទ័រ។ មន្ទីរពិសោធន៍, ប៊ឺលីងហ្កា, CA) ។ Membranes បន្ទាប់មកត្រូវបានទឹកនាំទៅបីដងសម្រាប់ 5000 នាទីជាមួយនឹងការទប់ស្កាត់បណ្តោះអាសន្ននិងមួយដងសម្រាប់ 10 នាទីជាមួយ PBS ។ ក្រុមតន្រ្តីប្រូតេអ៊ីនΔFosBសរុបត្រូវបានគេមើលឃើញនៅលើខ្សែភាពយន្ដ Kodak MR ដោយការធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវជាតិគីមីស្យូម (Pierce) និង / ឬដោយការរកឃើញសារធាតុរាវពន្លឺដោយប្រើឧបករណ៍ឆ្លុះអេកអេស - បូក (អឹមស៍សាមជីវវិទ្យា) និងព្យុះផូស្វ័រអាយ។

ការបញ្ចេញជាតិខ្លាញ់និងការបន្សុទ្ធសារធាតុបំប៉ន recomFosB ពីកោសិកាសត្វល្អិត។

ΔFosBត្រូវបានគេយកចិត្ដទុកដាក់យ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងកោសិកាសត្វល្អិត Sf9 ដែលជាប្រូតេអ៊ីន N terminus hexa-His-tagged (N-His (6) ΔFosB) ដោយប្រើប្រព័ន្ធបញ្ចេញមតិ Bac-to-Bac (Invitrogen) និងធ្វើតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ និយាយដោយខ្លីΔFosB cDNA (សំណល់ 2 – 237) មានមុនដោយស្លាក N-ស្ថានីយដែលមានភាពស្មោះត្រង់ MGHHHHHAG ត្រូវបានគេដាក់បញ្ចូលក្នុងវ៉ិចទ័រ pFASTBacTM1 ដែលត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតពពួកពពួកពពួកពពួកពពួកពពួកពពួកពពួកពពុះឈាម។ កោសិកា Sf9 ត្រូវបានឆ្លងវីរុសផ្សំគ្នាហើយ N-His (6) ΔFosBត្រូវបានបន្សុតពីឡាស៊ែរកោសិកាដោយជំហានជែលក្រាហ្វិចជាច្រើនរួមទាំងក្រូម៉ូសូមភាពដូចគ្នាដោយប្រើជួរនីកែល (Qiagen, Valencia, CA) ការផ្លាស់ប្តូរគំនិតដោយប្រើជួរឈរម៉ូណូ (អាម័រសាមស៍) ជីវវិទ្យាវិទ្យាសាស្ត្រ) និងការដកទំហំចេញដោយប្រើជួរឈរត្រងជែល (អឹមស៍សាមជីវវិទ្យា) ។

in vitro ការសិក្សាផូស្វ័រ។

in vitro ប្រតិកម្ម phosphorylation សម្រាប់វគ្គសិក្សាពេលវេលានិងការវិភាគ stoichiometry ត្រូវបានអនុវត្តក្នុងបរិមាណនៃ 30 containingl ដែលមាន 10 μmស្រទាប់ខាងក្រោម (N-His (6) ΔFosBឬស្រទាប់ការពារវិជ្ជមាន) 250 μm ATP និង 1 μCi / [l [γ-³²P] ATP, សតិបណ្ដោះអាសន្នដែលផ្គត់ផ្គង់ដោយក្រុមហ៊ុនផលិត kinase និងមួយក្នុងចំណោម kinases ខាងក្រោម: CK2 (20 ng / ;l; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / ;l; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) ឬ p70S6K (2.5 mU / ;l; Upstate) ។ ប្រតិកម្មនៃវគ្គសិក្សាពេលវេលាត្រូវបានអនុវត្តដោយការដក 5 all បន្សំពីដំណោះស្រាយប្រតិកម្មនៅចំណុចពេលវេលាដែលបានកំណត់និងបន្ថែមបរិមាណ 4 equal ស្មើគ្នានឹងការកាត់បន្ថយសតិបណ្ដោះអាសន្ននៃប្រូតេអ៊ីន Laemmli ។ ប៉ារ៉ាម៉ែត្រគីទីនរបស់មីសម៉ីសមេនសម្រាប់ប្រតិកម្ម CK2 ត្រូវបានកំណត់ក្រោមលក្ខខណ្ឌថេរលីនេអ៊ែរដែលកំណត់ដោយអាណាចក្រ។ ប្រតិកម្មទាំងនេះត្រូវបានអនុវត្តសម្រាប់រយៈពេល 15 នាទីក្នុងបរិមាណ 10 containingl ដែលមានអង់ស៊ីម 2 ng / ,l, 250 μm ATP, 1 μCi / [l [γ-³²P] ATP, និង N-His (6) concentFosB ប្រមូលផ្តុំចាប់ពី 2.5 – 30 μm។ ប្រតិកម្មទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាព 30 អង្សាសេនៅក្នុងអាងងូតទឹក។ បន្ទាប់ពីអេសអេសអេស - ភីសនិងស្នាមប្រឡាក់ជែលជាមួយជីវ - សុកខូមេសស៊ី (ជីអូរ៉ាដ) ជែលត្រូវបានស្ងួតហើយ ³²ការបញ្ចូលផូផូស្វរត្រូវបានវាយតម្លៃដោយការវិភាគផូស្វ័រ (សូមមើលខាងក្រោមបរិមាណទិន្នន័យការគណនានិងស្ថិតិ) ។

ផែនទី phosphopeptide វិមាត្រនិងការវិភាគអាស៊ីត phosphoamino ។

ការវិភាគទាំងពីរនេះត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានពិពណ៌នា។ Ploegh និង Dunn (2000)។ សង្ខេប, បំណែកជែលស្ងួតមានផ្ទុក។ ³²អក្សរ P edFosB (ទាំងពី។ នៅក្នុង vitro ប្រតិកម្មឬពីសារធាតុ immunoprecipitates នៃកោសិកាដែលមានស្លាកមេតាប៉ូលីស) ត្រូវបានគេដកយកចេញជាតិទឹកលាងចាននិងទទួលរងការរំលាយអាហារ។ អរូបីដែលមានផលិតផលរំលាយអាហារព្យាយាមត្រូវបានធ្វើឱ្យធូររលុងហើយ lyophilate ត្រូវលាងសម្អាតជាច្រើនដងហើយលក់បន្តក្នុង 10 μlនៃសតិបណ្ដោះអាសន្ន electrophoresis, pH 1.9 ។ គំរូ (3 μl) ត្រូវបានគេប្រទះឃើញនៅលើចានរាងសំប៉ែតក្រូម៉ូសូម (TLC) ដែលមានរាងសំប៉ែត (អេណាលតេច, ញូកឃិក, ឌី) និងត្រូវបានបំបែកជាវិមាត្រមួយដោយអេឡិចត្រុសនិងវិមាត្រផ្សេងទៀតដោយឡើងអេចស៊ីអេស។ ផែនទីផូស្វ័រផូស្វាតជាលទ្ធផលត្រូវបានមើលឃើញដោយស្វ័យប្រវត្តិកម្មនិងផូស្វ័រ។ ចំពោះការវិភាគអាស៊ីត phosphoamino, 2 ofl នៃបំពង់រំលាយអាហារដែលត្រូវបានគេយកទៅប្រើក្នុងចរន្តអគ្គិសនីសតិបណ្ដោះអាសន្នត្រូវបានគេបោសសំអាតបន្ថែមទៀតដោយអ៊ីដ្រូក្លូនអេចអេអេសនៅអេកអេសអេសអេកអេកអេកអេកសម្រាប់ 105 នាទីគិតជាអិចអិលអេសអេមអិមអិមអេអេអិលអេជអិលអេ។₂ បរិយាកាស។ ប្រតិកម្មត្រូវបានបញ្ឈប់ដោយការរំលាយចំនួនប្រាំមួយដងនៅក្នុងទឹកហើយល្បាយនេះត្រូវបានធ្វើឱ្យធូររលុង។ សារធាតុ lyophilate ត្រូវបានប្រើឡើងវិញនៅក្នុង 5 μlនៃសតិបណ្ដោះអាសន្នអេឡិចត្រុសស៊ីសភីអេសអេសអេចអេសនិងបានប្រទះឃើញនៅលើចានស៊ីខ្យូសសែលឡូសរួមជាមួយផូផូ - ស, -Thr និង -Tyr ។ Electrophoresis ត្រូវបានអនុវត្តជាងពាក់កណ្តាលនៃប្រវែងនៃចាន TLC ដោយប្រើអេឡិចត្រុសហ្វ្រេសសឺរភីអេសអិលស៊ីហើយបន្ទាប់មកចានត្រូវបានផ្ទេរទៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន pH 1.9 ហើយអេឡិចត្រុសត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីបញ្ចប់។ ស្តង់ដារអាស៊ីត phosphoamino ត្រូវបានគេមើលឃើញតាមរយៈការបាញ់ថ្នាំលើចាន TLC ជាមួយនឹងដំណោះស្រាយ ninhydrin ក្នុងបរិមាណ 1.9% (v / v) នៅក្នុងអាសេតូននិង ³²គំរូអាសុីតអាមីណូដែលមានស្លាកត្រូវបានបង្ហាញឱ្យឃើញដោយអូតូដ្យូឌីជីសនិងផូស្វ័រ។

ផ្តួល CK2 si ដោយស៊ីអរអេអិន។

យើងបានប្រើវិធីសាស្ត្រជ្រៀតជ្រែក RNA ដើម្បីជ្រើសរើសកម្រិត CK2 (ជ្រើសរើសកម្រិតដ៏អាក្រក់) ។ឌីម៉ៃរ៉ា et al ។ , 2005 ។) ។ កោសិកា PC12 ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងចានអណ្តូងកូឡាជែន I-coated ចំនួន ៦ អាន់ឌ័រដើម្បីឈានដល់ចំណុចប្រសព្វ the70 – 80% នៅថ្ងៃបន្ទាប់នៅពេលដែលពួកគេត្រូវបានបញ្ជូនឆ្លងជាមួយស៊ីអេសអេចអិលអិមអិម (កំហាប់ចុងក្រោយ) នៃស៊ីអរអិនអេឌីអេសអេរឺអេអេអេអេអេអិនអេអិនអេអិមអេអិល។ αអនុសាខា Rat CK20 ដោយប្រើ 2 ofl នៃភ្នាក់ងារប្តូរឈ្មោះ SilentFectin (Bio-Rad) និងធ្វើតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ ប្រមាណជា 5 ម៉ោងក្រោយមកកោសិកាត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងរហ័សជាមួយ withFosB plasmid ដូចដែលបានបញ្ជាក់ខាងលើ។ ប្រមាណជា 24 ម៉ោងក្រោយមក (∼24 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការបញ្ជូនស៊ីអេអិនអេ) កោសិកាត្រូវបានដាក់បញ្ចូល ³²ការដាក់ស្លាកមេតាប៉ូលីសឬការវិភាគជីពចរដូចបានរៀបរាប់ខាងលើ។ CK2α siRNA ចំនួន ៤ ដូចខាងក្រោមត្រូវបានប្រើជាមួយលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា៖ 5′P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ′, 5′P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3′, 5′P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUUXNUM,′C ។ ក្នុងនាមជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមានយើងបានប្រើ។ Silencer ការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន #3 siRNA ពី Ambion (Austin, TX) ។ វិសាលភាពនៃការគោះទ្វារ CK2 ត្រូវបានត្រួតពិនិត្យដោយប្រព័ន្ធការពាររាងកាយដោយប្រើអង្គបដិប្រាណប៉ូលីអេកូប្រឆាំងនឹងស៊ីខេអេសអេច (កាតាឡុក # 2-06 ពីខាងលើ) មួយយប់នៅចំណុច 873: 1 ។ Tub-Tubulin ត្រូវបានប្រើជាវត្ថុបញ្ជាផ្ទុកហើយត្រូវបានរកឃើញជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណ monoclonal (កាតាឡុកលេខ # 1000-05 ពី Upstate) មួយយប់នៅចំណុច 661: 1 ។

mutagenesis ដឹកនាំកន្លែង។

ការផ្លាស់ប្តូរ Ser27 ទៅអាឡាឬទៅអេសភីត្រូវបានសម្រេចដោយប្រើឧបករណ៍ Mutagenesis ដឹកនាំដោយការផ្លាស់ប្តូររហ័ស (Stratagene, La Jolla, CA) និងធ្វើតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ ដើម្បីណែនាំការផ្លាស់ប្តូរ Ser27 នៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនកណ្តុរΔFosB, ថ្នាំបំប្លែងហ្សែនហ្សែនហ្សែនខាងក្រោមត្រូវបានប្រើ។ Ser27 ទៅអាឡា: (បញ្ច្រាសបឋម) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGA ។AGCCAGGTACTGAGACTCGGCCGGAGGG3 ′។ Ser27 ទៅ Asp (បញ្ជូនបន្តទៅមុខ) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′។ មូលដ្ឋានផ្លាស់ប្តូរមានលក្ខណៈដិតហើយដាប់ប៊្លុនសឺនសឺរត្រូវបានទ្រេត។

ជីវព័ត៌មានវិទ្យា។

ទីតាំង phosphorylation សក្តានុពលនិងគីនីសសម្រាប់ΔFosBត្រូវបានស្វែងរកដោយបញ្ជូនលំដាប់ប្រូតេអ៊ីនកណ្តុរទៅមូលដ្ឋានទិន្នន័យឯកទេសរួមមាន ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), ព្យាករណ៍ប្រូតេអ៊ីន (Rost et al ។ , 2004 ។) និង NetPhosK (Blom et al ។ , 2004 ។).

បរិមាណទិន្នន័យការគណនានិងស្ថិតិ។

បរិមាណប្រូតេអ៊ីនដែលមាននៅក្នុងភ្នាសរំអិល PVDF ឬ nitrocellulose ត្រូវបានកំណត់បរិមាណដោយប្រើ Storm PhosphorImager និងសូហ្វវែរ ImageQuant (Amersham Biosciences / ម៉ូលេគុលឌីណាមិក) ។ នៅក្នុងវប្បធម៌កោសិកានិងការសិក្សា phosphorylation ផ្នែកខួរក្បាល, តម្លៃដែលទទួលបានសម្រាប់។ ³²ប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាក P ត្រូវបានបែងចែកដោយតម្លៃដែលទទួលបានសម្រាប់ΔFosBសរុបនិងបានបង្ហាញជាសមាមាត្រ។ ក្នុង នៅក្នុង vitro ការសិក្សា phosphorylation ចំនួននៃ។ ³²P បានដាក់ស្លាកΔFosBក្នុងមួយម៉ូលនៃΔFosB (stoichiometry) ត្រូវបានគណនាដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (Sahin et al ។ , 2004 ។) ។ ការវាស់វែងទាំងអស់ត្រូវបានយកទៅក្នុងជួរបន្ទាត់នៃឧបករណ៍ដែលបានប្រើ។ ប៉ារ៉ាម៉ែត្រ Kinetic ត្រូវបានគណនាដោយប្រើម៉ូដែលម៉ៃឃើស - មីថិនសិន។ V = V_{អតិបរមា}[S] / ([S]+K_M) និង V_{អតិបរមា} = k₂[E_សរុប] ។ ពាក់កណ្តាលជីវិត (t_1/2) នៃΔFosBនិង FosB ត្រូវបានគេប៉ាន់ស្មានពីដីជីពចរ - (ប្រើតំរែតំរង់ nonlinear ដែលសមនឹងចំនុចទិន្នន័យល្អបំផុត) និងត្រូវគ្នាទៅនឹងពេលវេលាដែលបរិមាណប្រូតេអ៊ីននៅសល់គឺ 50% នៃដើម។ នៅក្នុងតួលេខទាំងអស់លទ្ធផលដែលបានបង្ហាញគឺជាតំណាងនៃការពិសោធន៍ឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ពីរទៅបី។ នៅក្នុងក្រាហ្វទាំងអស់ទិន្នន័យដែលបានបង្ហាញគឺជាមធ្យម± SEMs (3 ≤) ។ n ≤16) ។ សារៈសំខាន់ស្ថិតិនៃភាពខុសគ្នាត្រូវបានវាយតម្លៃដោយប្រើឧបករណ៍ដែលមិនមានលក្ខណៈ។ t ការធ្វើតេស្ត, កែតំរូវសំរាប់ការប្រៀបធៀបច្រើននិងសញ្ញាផ្កាយបង្ហាញ។ p ≤ 0.05 ។

ផ្នែកមុន ផ្នែកបន្ទាប់

លទ្ធផល

ΔFosBគឺជាកត្តាចម្លងមិនទៀងទាត់។

ទោះបីជាយើងបានប៉ាន់ស្មានកាលពីមុនថាΔFosBគឺជាកត្តាចម្លងថេរមួយ (Nestler et al ។ , 2001) ការវិភាគដោយផ្ទាល់នៃទម្រង់វេននៃប្រូតេអ៊ីនមិនត្រូវបានអនុវត្តទេ។ ដើម្បីឆ្លើយសំនួរនេះយើងបានធ្វើការពិសោធន៍ជីពចរដោយប្រើកោសិកា PC12 ដែលត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយដូចជាខ្សែកោសិកាណឺរ៉ូនដែលក្នុងនោះΔFosBត្រូវបានបង្ហាញបណ្តោះអាសន្នតាមរយៈការឆ្លងមេរោគជាមួយវីរុសអ៊ប៉សដែលងាយនឹងបង្ករោគ (HSV-osFosB) ។ ប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានសំយោគថ្មីត្រូវបានដាក់ស្លាកមេតាប៉ូលីស។ ³⁵S-Met / Cys និងលំនាំនៃការរិចរិលរបស់។ ³⁵ដាក់ស្លាក S ΔFosB (³⁵អេសអេហ្វ - ប៊ី) ត្រូវបានត្រួតពិនិត្យដោយប្រព័ន្ធការពាររាងកាយពីកោសិកាលីស្យូមដែលទទួលបាននៅចំណុចផ្សេងៗគ្នាបន្ទាប់ពីដកអាស៊ីដអាមីណូវិទ្យុសកម្មចេញ។ ការវិភាគលើអង្គបដិប្រាណដោយអេស។ អេស។ ភី - ភីនិងអាត្ម័នស្វ័យប្រវត្ដិបានបង្ហាញថាអាយុកាលពាក់កណ្តាលនៃអ័រហ្វូសក្នុងកោសិកា PC12 គឺ ∼10 ម៉ោង (រូបភព។ 1) ។ ការរកឃើញទាំងនេះបង្ហាញថាអាយុកាលពាក់កណ្តាលជីវិតរបស់ΔFosBខ្ពស់ជាងកត្តាចម្លងដែលមិនចេះរីងស្ងួត (សូមមើលការពិភាក្សា) រួមទាំងហ្វុសប៊ីដែលមានអាយុកាលពាក់កណ្តាលនៃវប្បធម៌កោសិកាត្រូវបានគេរាយការណ៍ថា ∼90 នាទី (Dobrazanski et al ។ , 1991 ។; ខាឡិន et al ។ 2004 ។) ។ លើសពីនេះទៀតវាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ថាការរិចរិលរបស់ΔFosBមិនសមនឹងខ្សែកោងបំបែកអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលដឺក្រេទី 1 ទេប៉ុន្តែផ្ទុយទៅវិញវាជាប៊ីលីទិកចាប់ផ្តើមដោយអត្រាថយចុះខ្សោយ។ នេះបង្ហាញពីអត្ថិភាពនៃប្រភេទសត្វច្រើនជាងមួយប្រភេទនិង / ឬផ្លូវនៃការរិចរិលច្រើនជាងមួយ។

មើលកំណែធំជាងនេះ:

ទាញយកជាស្លាយ PowerPoint

រូបភាព 1 ។

ΔFosBគឺជាកត្តាចម្លងមិនទៀងទាត់។ អាយុកាលពាក់កណ្តាលនៃΔFosBគឺ ∼10 ម៉ោងនៅក្នុងវប្បធម៌កោសិកា។ ΔFosBត្រូវបានសម្តែងនៅក្នុងកោសិកា PC12 ដោយការឆ្លងមេរោគ HSV-osFosB ឬការបញ្ជូនឆ្លងដោយប្រើផ្លាស្មាមីដΔFosBហើយកោសិកាត្រូវបានទទួលរងនូវការពិសោធន៍ជីពចរដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសម្ភារៈនិងវិធីសាស្រ្ត។ លទ្ធផលស្មើគ្នាត្រូវបានទទួលដោយមិនគិតពីវិធីសាស្ត្រដែលត្រូវបានប្រើដើម្បី overexpress ΔFosB។ តួលេខនេះបង្ហាញពីវគ្គសិក្សាពេលវេលា (និងតំណាង autoradiogram) នៃការរិចរិលរបស់ΔFosB។ ទិន្នន័យដែលបានគ្រោងទុកគឺជាមធ្យម± SEM យ៉ាងហោចណាស់ចំណុចទិន្នន័យបុគ្គលយ៉ាងតិច 15 ដែលទទួលបានពីការពិសោធន៍ឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ប្រាំ។ សម្រាប់ការប្រៀបធៀបរបាយការណ៍ពាក់កណ្តាលជីវិតនៃ FosB ដែលមានប្រវែងពេញលេញត្រូវបានចង្អុលបង្ហាញ។

ΔFosBគឺជា phosphoprotein នៅក្នុងខួរក្បាល។

យើងបានសន្មតថាការផ្លាស់ប្តូរក្រោយការធ្វើសមាហរណកម្ម mayFosB អាចរួមចំណែកដល់ស្ថេរភាពជាក់ស្តែងរបស់វា។ ដោយសារតែ phosphorylation ត្រូវបានបង្ហាញឱ្យផ្លាស់ប្តូរសកម្មភាពនៃកត្តាចម្លងតាមវិធីជាច្រើនរួមទាំងស្ថេរភាពរបស់វា (សម្រាប់ការពិនិត្យមើលសូមមើល) Desterro et al ។ , 2000 ។; Whitmarsh និង Davis, 2000 ។) យើងបានស៊ើបអង្កេតថាតើΔFosBគឺជាផូស្វ័រផូស្តុន។ ដល់ទីបញ្ចប់នេះការបញ្ចេញមតិΔFosBត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅក្នុងខួរក្បាលកណ្តុរដោយប្រើអេកូអេសរ៉ាំរ៉ៃដែលជាការព្យាបាលដែលគេដឹងថានាំអោយមានកំរិតខ្ពស់នៃΔFosBជាពិសេសនៅផ្នែកខាងផ្នែកខាងមុខ (Hope et al ។ , 1994a) ។ មួយថ្ងៃបន្ទាប់ពីការព្យាបាល ECS ចុងក្រោយនៅពេលដែលកំរិតΔFosBនៅតែខ្ពស់ដដែលចំណិតផ្នែកខាងមុខផ្នែកខាងមុខស្តើងត្រូវបានរៀបចំនិងដាក់ស្លាកមេតាណុលជាមួយ ³²P-orthophosphate ។ បណ្តុំប៉ារ៉ាឡែលមិនត្រូវបានថតដោយកាំរស្មីទេហើយទាំងនេះត្រូវបានប្រើដើម្បីរកកម្រិតΔFosBសរុប។ បន្ទាប់ពីភាពស៊ាំនឹងភាពស៊ាំជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង FosB / osFosB ជាក់លាក់និងការបំបែកប្រូតេអ៊ីនដែលមានប្រព័ន្ធការពាររាងកាយដោយអេស។ អេស។ ភី - ភី, phosphorylated ³²P ដែលមានស្លាកΔFosBត្រូវបានរកឃើញដោយស្វ័យប្រវត្តិកម្មចំណែកឯΔFosBត្រូវបានរកឃើញដោយប្រព័ន្ធការពាររាង។ ការវិភាគនេះបានបង្ហាញថាΔFosBត្រូវបាន phosphorylated នៅក្នុងខួរក្បាលដូចដែលបានបង្ហាញដោយជាក់លាក់។ ³²ក្រុមតន្រ្តី P ដែលមានស្លាក of35 kDa មានវត្តមាននៅក្នុងគំរូខួរក្បាលដែលត្រូវបានព្យាបាលជារ៉ាំរ៉ៃប៉ុន្តែវាមិនអាចរកឃើញនៅក្នុងឧបករណ៍បញ្ជាដែលត្រូវបានព្យាបាលរូបភព។ 2A) ។ នេះគឺស្របទៅនឹងការពិតដែលថាក្នុងករណីដែលគ្មានការរំញោចរ៉ាំរ៉ៃកម្រិតមូលដ្ឋាននៃΔFosBគឺទាបណាស់។ ភាពជាក់លាក់នៃប្រតិកម្ម immunoprecipitation ត្រូវបានបង្ហាញដោយកង្វះនៃសញ្ញានៅក្នុងរបបទឹកភ្លៀង IgG ដែលមិនមានអាយុកាល។

មើលកំណែធំជាងនេះ:

ទាញយកជាស្លាយ PowerPoint

រូបភាព 2 ។

ΔFosBគឺជា phosphoprotein នៅក្នុងខួរក្បាល។ A, ΔFosBត្រូវបាន phosphorylated នៅក្នុងខួរក្បាល។ Endogenous ΔFosBត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅក្នុងខួរក្បាលកណ្តុរដោយការព្យាបាលអេកូរ៉ាំរ៉ៃដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសំភារៈនិងវិធីសាស្រ្ត។ ចំណិតរាងពងក្រពើរាងពងក្រពើត្រូវបានដាក់ស្លាកមេតាប៉ូលីសជាមួយ។ ³²PH₃PO₄ អស់រយៈពេលជាច្រើនម៉ោង។ បន្ទាប់ពីការធ្វើសភាគនៃចំណិតΔFosBត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនិង phosphorylated ΔFosB (³²P-osFosB) ត្រូវបានរកឃើញដោយស្វ័យប្រវត្តិកម្ម (បន្ទះខាងលើ) ។ សរុបΔFosBនៅក្នុងថ្នាំដែលមិនមែនជាសារធាតុប្រឆាំងនឹងអុកស៊ីតកម្មត្រូវបានរកឃើញដោយប្រព័ន្ធការពាររាងកាយ (បន្ទះបាត) ។ ក្នុងនាមជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមានការការពារភាពស៊ាំរបស់សត្វដែលត្រូវបានគេព្យាបាលដោយខ្មាស់អៀននិងមិនមែនអាយហ្គីជីត្រូវបានបង្ហាញ។ B, ទីតាំង phosphorylation បេក្ខជននិង kinases ដែលមានពិន្ទុព្យាករណ៍ដែលត្រូវគ្នាសម្រាប់លំដាប់ប្រូតេអ៊ីនកណ្តុរ wereFosB ត្រូវបានទទួលដោយការវិភាគជីវសាស្ត្រ។ គេហទំព័របេក្ខជនដែលមានពិន្ទុព្យាករណ៍ខ្ពស់ជាងនេះត្រូវបានគូសបញ្ជាក់នៅក្នុងលំដាប់ប្រូតេអ៊ីននិងត្រូវបានរាយនៅក្នុងតារាង។ ដែនភ្ជាប់ឌីអិនអេ (មូលដ្ឋាន) និងហ្សីនហ្សីនមានដិតនៅក្នុងលំដាប់ប្រូតេអ៊ីន។ C, D, phFosB phosphorylation ត្រូវបានបង្កើនដោយអេសភីអេសអេស។ C, ³²កម្រិត P-ΔFosBក្នុង immunoprecipitates ពីចំណិតរាងពងក្រពើពីមុខមានស្លាកថាអវត្តមាន (Ctr) ឬវត្តមាននៃ 100 ng / ml OA (ក្រាហ្វនិងបន្ទះខាងលើ) ត្រូវបានរកឃើញដោយស្វ័យប្រវត្តិកម្ម។ បន្ទះខាងក្រោមបង្ហាញពីចំនួនសរុបΔFosBដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង immunoprecipitates ពីចំណិតដែលមិនបានដាក់ដោយ immunoblotting ។ D, កោសិកា PC12 ត្រូវបានឆ្លងមេរោគ HSV-osFosB ឬ HSV-LacZ (វ៉ិចទ័រ) និងដាក់ស្លាកមេតាណុលជាមួយ ³²PH₃PO₄ អវត្ដមាន (Ctr) ឬវត្តមាននៃ 100 ng / ml OA ។ ³²កម្រិត P-ΔFosBនៅក្នុង immunoprecipitates ត្រូវបានរកឃើញដោយស្វ័យប្រវត្តិកម្ម (ក្រាហ្វិចបន្ទះខាងលើ) ។ បន្ទះខាងក្រោមបង្ហាញពីចំនួនសរុបΔFosBដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងឡាស៊ែរកោសិកាដោយប្រើប្រព័ន្ធការពាររាងកាយ។

ជាជំហានដំបូងឆ្ពោះទៅរកភាពរីកចំរើនដែលគីនៀសនិងកន្លែងដែលពាក់ព័ន្ធនឹងផូស្វ័រយើងបានដាក់លំដាប់អាស៊ីដអាមីណូរបស់វាទៅនឹងការវិភាគជីវគីមីជាច្រើន។ នេះបានបង្ហាញថាទោះបីជាΔFosBមិនមានទីតាំងបេក្ខជន Tyr phosphorylation ក៏ដោយក៏វាមានផ្ទុកនូវការព្រមព្រៀងផូផិនឃ្វីនជាច្រើនរួមទាំងគេហទំព័រ CaMKII ចំនួន ៣ កន្លែង CK2 ចំនួន ៣ និងគេហទំព័រ PKC ចំនួនពីរដែលមានពិន្ទុព្យាករណ៍ផូស្វ័រខ្ពស់ (រូបភព។ 2B) ។ ប្រសិនបើដូចដែលបានព្យាករណ៍តាមរយៈជីវព័ត៌មានវិទ្យាΔFosBមានតែផូស្វ័រនៅលើសំណល់ Ser ឬ Thr បន្ទាប់មកសារធាតុ phosphorylation របស់វាគួរតែត្រូវបានបំរែបំរួលយ៉ាងខ្លាំងដោយសកម្មភាពរបស់ផូស្វាតស៊ែរ / ភី។ ដើម្បីសាកល្បងសម្មតិកម្មនេះយើងដាក់ស្លាកចំណិតផ្នែកខាងមុខជាមួយ។ ³²P-orthophosphate នៅក្នុងវត្តមានឬអវត្តមាននៃអូអេដែលជាសារធាតុទប់ស្កាត់ប្រូតេអ៊ីន phosphatase ប្រូតេអ៊ីន Ser / Thr ។ ដូចដែលបានបង្ហាញនៅក្នុង។ រូបភាព 2C, OA បណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំង (∼2.5 ដង) ។ ³²P-ΔFosB។ វាក៏បណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងតិចតួចនៃកម្រិត totalFosB ដែលស្របនឹងរបាយការណ៍មុនដែលភ្ជាប់ឥទ្ធិពលនៃសារជាតិបង្កមហារីករបស់អូអាទៅនឹងសមត្ថភាពរបស់វាក្នុងការជម្រុញហ្សែនដំបូងភ្លាមៗជាច្រើនរួមមានប្រូតេអ៊ីនហ្វុស។Miller et al ។ , 1998; Choe et al ។ , 2004) ។ លទ្ធផលសុទ្ធគឺជាការកើនឡើងជាទូទៅគួរឱ្យកត់សម្គាល់ (∼60%) នៅក្នុងកម្រិត phosphorylated ΔFosB។

បន្ទាប់មកយើងបានស៊ើបអង្កេតថាតើនៅក្នុង PC12 កោសិកាដែលអាចប្រើបានក្នុងការសាកល្បងពិសោធន៍ΔFosBបានបង្ហាញលំនាំផូស្វ័រស្រដៀងនឹងកោសិកាដែលមើលឃើញនៅក្នុងខួរក្បាលដែរឬទេ។ យើងបានសម្តែងΔFosBនៅក្នុងកោសិកា PC12 តាមរយៈការឆ្លងជាមួយ HSV-osFosB និងដាក់ស្លាកកោសិកាជាមួយ ³²P-orthophosphate នៅក្នុងវត្តមានឬអវត្តមានរបស់អូ។ ការបញ្ចេញមតិនិងភាពស៊ាំរបស់ប្រូតេអ៊ីនទទួលបានជោគជ័យពីកោសិកាដែលឆ្លងមេរោគ HSV-osFosB ត្រូវបានបង្ហាញដោយវត្តមានទាំងនៅក្នុងវ៉ាក់សាំងអ៊ីដ្រូប៊ុល (រូបភព។ 2D, បន្ទះបាត) និង autoradiograph (បន្ទះខាងលើ) នៃក្រុមតន្រ្តី ∼35 kDa ដែលអវត្តមាននៅក្នុងកោសិកាដែលមានវ៉ិចទ័រ។ ដូចដែលបានសង្កេតនៅក្នុងខួរក្បាលអូអូបានបណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងតិចតួចនូវកំរិត totalFosB ប៉ុន្តែមានការកើនឡើងខ្ពស់ជាង (ប្រហែលពីរដង) ។ ³²P-ΔFosB, ជាលទ្ធផលនៅក្នុងការកើនឡើងសុទ្ធ (∼50%) នៅក្នុង osphFosB phosphorylation ។ លើសពីនេះទៅទៀតស្របទៅនឹងការព្យាករណ៍ជីវសាស្ត្រការព្យាបាលកោសិកា PC12 ជាមួយនឹងថ្នាំ Tyr phosphatase inhibitor មិនបណ្តាលឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុង ³²កម្រិត P-ΔFosB (ទិន្នន័យមិនបានបង្ហាញ) ។ ការរកឃើញទាំងនេះបានបង្ហាញថាΔFosBត្រូវបានផូស្វ័រនៅលើសំណល់ Ser និង / ឬ Thr នៅក្នុងខួរក្បាលនិងនៅក្នុងកោសិកា PC12 និងបានបញ្ជាក់ថាជាប្រព័ន្ធវប្បធម៌កោសិកាល្អដែលត្រូវសិក្សាបន្ថែមអំពីទម្រង់ផូស្វ័រនិងការរិចរិលរបស់ΔFosB។

CK2 ប៉ុន្តែមិនមានផូស្វ័រផូស្វ័រ CaFosB ទេ។ នៅក្នុង vitro

ដូចដែលបានរៀបរាប់ខាងលើការវិភាគនៃលំដាប់អាស៊ីតអាមីណូអាបូរប៊ីកបានបង្ហាញពិន្ទុព្យាករណ៍ខ្ពស់សម្រាប់តំបន់ផូស្វ័រ CK2, PKC និង CaMKII ។ ដើម្បីកំណត់ថាតើគីណាហ្សិនទាំងនេះមួយណាអាចផូស្វ័រហ្វ័រ - ហ្វុសប៊ីយើងបានធ្វើស៊េរី។ នៅក្នុង vitro ប្រតិកម្ម phosphorylation ដោយប្រើ kinases ដែលបានបន្សុតនិងបន្សំបន្សំΔFosB។ ដូចដែលបានបង្ហាញនៅក្នុង។ រូបភាព 3Aក្នុងចំណោម kinases បេក្ខជនទាំងបីមានតែ CK2 phosphorylated ΔFosBក្នុងលក្ខណៈសំខាន់។ លើសពីនេះទៀត kinases ផ្សេងទៀតជាច្រើនត្រូវបានសាកល្បង (ឧទាហរណ៍ GSK3 និង p70S6K) ប៉ុន្តែបានបរាជ័យក្នុងការ phosphorylate ΔFosBយ៉ាងខ្លាំង (ទិន្នន័យមិនបានបង្ហាញ) ។ ចរិកលក្ខណៈបន្ថែមនៃប្រតិកម្ម CK2 ដោយការវិភាគវគ្គសិក្សាបានបង្ហាញថាគីនីណាសនេះអាចជួយជំរុញការដាក់បញ្ចូលផូស្វាម័រ ∼0.5 ម៉ូលក្នុងមួយម៉ូលនៃΔFosB (រូបភព។ 3B) ។ ការពិតដែលថា CK2 អាច phosphorylate ΔFosB។ នៅក្នុង vitro ចំពោះវិក័យប័ត្រដែលមានច្រើន (∼50%) គឺជាប្រតិកម្មដែលទាក់ទងទៅនឹងសរីរវិទ្យា។ បន្ទាប់មកយើងបានសិក្សាពីប្រវត្តិនៃប្រតិកម្មនេះដោយដាក់បញ្ចូល CK2 នៅក្នុងវត្តមាននៃការបង្កើនចំនួន purFosB ដែលបានបន្សុតហើយយើងបានកំណត់ថាផូស្វ័រ CK2 phosphorylates aFosB ជាមួយ V_{អតិបរមា} នៃ 5.8 pmol ·នាទី។^-1 ·μg។^-1 នៃអង់ស៊ីម, ក K_M នៃ 18.4 μm, និង a ។ k_ឆ្មា នៃ 0.2 / វិនាទី (រូបភព។ 3C) ។ តម្លៃដែលទទួលបានសម្រាប់ប៉ារ៉ាម៉ែត្រនៃការធ្វើចលនាទាំងនេះគាំទ្រដល់ភាពជាប់ទាក់ទងខាងសរីរវិទ្យានៃប្រតិកម្មនេះ។ ឧទាហរណ៍ K_M នៃ CK2 សម្រាប់ DARPP32, មួយនៃស្រទាប់ខាងក្រោមដែលគេស្គាល់ថាល្អបំផុតគឺ 3.4 μm, និង k_ឆ្មា គឺ ∼0.3 / វិនាទី (ហ្គីរ៉ាហល et al ។ , 1989 ។); នេះ K_M សម្រាប់ជួរ ATP ចាប់ពី ∼10 – 40 μm (ក្រុមហ៊ុន Cochet et al ។ , 1983 ។; Silva-Neto et al ។ , 2002 ។) ហើយនោះសម្រាប់ casein មានចាប់ពី ∼10 – 50 μm (Meggio et al ។ , 1977 ។; Pyerin et al ។ , 1987 ។) ។ រួមគ្នាទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថាΔFosBគឺជាស្រទាប់ខាងក្រោមនៃប៉ាណូស៊ីសម្រាប់ស៊ីខេអេស។ នៅក្នុង vitro.

មើលកំណែធំជាងនេះ:

ទាញយកជាស្លាយ PowerPoint

រូបភាព 3 ។

CK2 ប៉ុន្តែមិនមានផូស្វ័រផូស្វ័រ CaFosB ទេ។ នៅក្នុង vitro។ ផលិតផលស្វ័យប្រវត្តិកម្ម (បន្ទះខាងលើ) បង្ហាញពីផលិតផល phosphorylated ហើយជែលដែលមានស្នាមប្រឡាក់ជែល (បន្ទះខាងក្រោម) បង្ហាញវត្តមានសរុបΔFosBក្នុងប្រតិកម្ម។ A, អ្នករួមផ្សំបន្សុទ្ធកម្ម ifiedFosB ត្រូវបានទទួលរង នៅក្នុង vitro phosphorylation ដោយ kinases បេក្ខជនផ្សេងៗគ្នា (បីត្រូវបានបង្ហាញ) ។ B, វគ្គសិក្សាពេលវេលានិងការវិភាគ stoichiometric បង្ហាញថា CK2 អាច phosphorylate ΔFosB។ នៅក្នុង vitro ជាមួយ stoichiometry នៃ ∼50% ។ C, ការវិភាគបែប Kinetic នៃប្រតិកម្ម CK2 បានបង្ហាញថាΔFosBគឺជា fide បូណា។ នៅក្នុង vitro ស្រទាប់ខាងក្រោម។ ការកំណត់លីនេអ៊ែរនៃប្រតិកម្មត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងគ្រោងទ្វេដង (ខាងក្រោម) ប៉ុន្តែប៉ារ៉ាម៉ែត្រគីណូទិកត្រូវបានគេយកចេញពីខ្សែកោងម៉ៃឃឺស - មីធេន (ខាងលើ) ។

CK2 ធ្វើត្រាប់តាមផូស្វ័រនិងស្ថេរភាពΔFosBនៅក្នុងកោសិកាដែលនៅដដែល។

ដើម្បីវាយតម្លៃភាពពាក់ព័ន្ធខាងសរីរវិទ្យានៃផូស្វ័រ Phosphorylation របស់អេខេខេអេសប៊ីយើងបានធ្វើការប្រៀបធៀបផូស្វ័រហ្វ្រីដ្យូតប្រៀបធៀបដោយប្រើផែនទី នៅក្នុង vitro phosphorylated និង PC12-cell-phosphorylated ΔFosB។ បន្ទាប់ពីអេសឌីអេសភីអេសភីសនិងជែលស៊ីលីននៃ។ ³²P-ΔFosB (ពី នៅក្នុង vitro ប្រតិកម្មឬពីប្រព័ន្ធភាពស៊ាំ។ ³²កោសិកាដែលមានស្លាក P) ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានរំលាយជាមួយ trypsin ហើយផូស្វ័រលទ្ធផលត្រូវបានបំបែកជាពីរវិមាត្រ។ ការវិភាគនេះបានបង្ហាញថាផូស្វ័រសំខាន់ពីប្រតិកម្ម CK2 បានបង្រួបបង្រួមជាមួយផូស្វ័រសំខាន់មួយក្នុងចំណោមពីរផូស្វ័រពីΔFosB phosphorylated ក្នុងកោសិកា PC12 ។រូបភព។ 4A) ចំណែកឯ phosphopeptides ដែលបណ្តាលមកពីប្រតិកម្ម PKC ឬ CaMKII (ទិន្នន័យមិនបានបង្ហាញ) មិនបានធ្វើទេ។ មានផូស្វ័រផូផូផេតទី ២ មានវត្តមាននៅក្នុងផែនទីពីកោសិកា PC12 ប៉ុន្តែដោយសារអសមត្ថភាពរបស់គីនីសណាមួយយើងបានសាកល្បងបង្កើតផូស្វ័រដូចគ្នា។ នៅក្នុង vitroបច្ចុប្បន្ននេះយើងមិនដឹងថាតើផូស្វ័រផូស្វ័រទី ២ មានកន្លែងផូស្វ័រខុសពីផូស្វ័រផ្សេងទៀតឬថាតើវាតំណាងឱ្យពពួកផូស្វ័រសាកល្បងមានផ្ទុកសារធាតុផូស្វ័រដូចគ្នាដែរឬទេ។

មើលកំណែធំជាងនេះ:

ទាញយកជាស្លាយ PowerPoint

រូបភាព 4 ។

CK2 ធ្វើត្រាប់តាមផូស្វ័រនិងស្ថេរភាពΔFosBនៅក្នុងកោសិកាដែលនៅដដែល។ A, CK2 ប៉ុន្តែមិនមែនភីខេខេស៊ីហាក់ដូចជាផូស្វ័រអេសហ្វ - ប៊ីនៅក្នុងកោសិកា។ ផែនទី phosphopeptide វិមាត្រពីររបស់ΔFosB phosphorylated ដោយ CK2 ឬ PKC នៅក្នុង vitro ឬដោយកោសិកា PC12 នៅដដែល។ ព្រួញបង្ហាញពីការបង្រួបបង្រួមនៃ peptide CK2-phosphorylated ប៉ុន្តែមិនមែន PKC-phosphorylated ដែលមានមួយនៃផូស្វ័រ phosphopeptides ΔFosBដែលទទួលបានពីកោសិកា PC12 ។ B, osphFosB phosphorylation នៅក្នុងកោសិកា PC12 ត្រូវបានកើនឡើងដោយការព្យាបាលកោសិកាជាមួយនឹងមេជីវិតឈ្មោល CK2 សកម្ម (អេសភី) និងថយចុះដោយការព្យាបាលដោយប្រើអេសភីអេសប៊ីអេសប៊ីស៊ី។ ផ្ទុយទៅវិញ osphFosB phosphorylation នៅក្នុងកោសិកា PC2 មិនត្រូវបានប៉ះពាល់ដោយការព្យាបាលដោយប្រើទាំង PKC សកម្ម (PMA) ឬ PKC inhibitor calphostin-C (Calph) ទេ។ អ្នកតំណាង autoradiogram (បន្ទះខាងលើ) និង immunoblot (បន្ទះបាត) ត្រូវបានបង្ហាញ។ C-F, ផលប៉ះពាល់នៃសកម្មភាព CK2 លើស្ថេរភាពΔFosB។ តួលេខបង្ហាញពីវគ្គសិក្សាពេលវេលា (និងអ្នកតំណាង autoradiogram) នៃការរិចរិលរបស់ΔFosB។ កោសិកា PC12 បង្ហាញបណ្តោះអាសន្នΔFosBត្រូវបានគេធ្វើពិសោធន៍ដោយជីពចរដេញតាមដែលអវត្តមានឬវត្តមាននៃ CK2 inhibitor DRB (អវត្តមាន) ។C), មេជីវិតសកម្ម CK2D) ឬអ្នកទប់ស្កាត់ kinase ដែលមានវិសាលគមទូលំទូលាយ H-8 (E) ដែលត្រូវបានប្រើដើម្បីគ្រប់គ្រងសម្រាប់ផលប៉ះពាល់ដែលមិនសមហេតុសមផលរបស់ឌីប៊ី។ F, ប្រសិទ្ធភាពនៃការផ្តួលរំលំធាតុរងកាតាលីករនៃ CK2 លើស្ថេរភាពΔFosB។ កោសិកា PC12 ត្រូវបានឆ្លងដោយអេសអរអេអេអេអេអេអេអេអិនអេ (ស៊ីអរ) ឬស៊ីអរអិនដែលផ្តោតលើសត្វកណ្តុរCK2αនិងស៊ីអិចអេស X ក្រោយមកក្រោយមកបានឆ្លងដោយផ្លាស្មា asmFosB ។ បន្ទះខាងលើបង្ហាញពីវ៉ាក់សាំងអ៊ីដ្រូហ្សែលនៃកោសិកាទាំងមូលដែលបង្ហាញពីផលប៉ះពាល់នៃកម្រិត CK24 siRNA នៅលើកម្រិតប្រូតេអ៊ីន CK2 និងΔFosB។ វ៉ាក់សាំងដែលត្រូវគ្នាសម្រាប់ tub-tubulin ត្រូវបានបង្ហាញជាឧបករណ៍បញ្ជាផ្ទុក។

ដើម្បីដោះស្រាយភាពពាក់ព័ន្ធខាងសរីរវិទ្យានៃ CK2 ជា kFosB kinase យើងព្យាបាល cellsFosB- បង្ហាញកោសិកា PC12 ជាមួយថ្នាំពីរដែលសំរួលសកម្មភាព CK2 ។ ដូចដែលបានបង្ហាញនៅក្នុង។ រូបភាព 4B, osphFosB phosphorylation ត្រូវបានថយចុះដោយការព្យាបាលនៃកោសិកា PC12 ជាមួយនឹងសារធាតុទប់ស្កាត់ CK2 ដែលអាចរំលាយបានដោយកោសិកា។Meggio et al ។ , 1990 ។; Szyszka et al ។ , 1995 ។) និងត្រូវបានបង្កើនដោយការព្យាបាលជាមួយនឹងប៉ូលីមេទីលដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថាជាសកម្មជនស៊ីខេស៊ីធីអេសដ៏ខ្លាំងក្លា (ក្រុមហ៊ុន Cochet និង Chambaz, 1983 ។; Meggio et al ។ , 1983 ។) ។ ផ្ទុយទៅវិញការព្យាបាលកោសិកា PC12 ជាមួយ PKC inhibitor calphostin-C (Kobayashi et al ។ , 1989; Tamaoki et al ។ , 1990 ។) ឬ PMA សកម្មជន PMA (Schmidt និង Hecker, 1975 ។; Beh et al ។ , 1989 ។) មិនបានបណ្តាលឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុង osphFosB phosphorylation ទេ។ ក្នុងករណី PMA មានការកើនឡើងបន្តិចបន្តួច (និងមិនសំខាន់) ។ ³²P-ΔFosBអាចត្រូវបានរាប់បញ្ចូលដោយការកើនឡើងនូវកំរិតΔFosBសរុបដែលបណ្តាលមកពីថ្នាំនេះ។ តាមពិតវាត្រូវបានគេរាយការណ៍ថា phorbol esters នាំអោយមានការបញ្ចេញមតិប្រូតេអ៊ីនគ្រួសារជាច្រើនរួមមាន FosB (Yoza et al ។ , 1992 ។; Suh et al ។ , 2004 ។) ។ លើសពីនេះទៀតការព្យាបាលកោសិកាដោយប្រើ CaMKII inhibitor ដែលអាចបញ្ចោញកោសិកាជាក់លាក់បាន (m-AIP)Ishida និង Fujisawa, 1995 ។; Stevens et al ។ , 1999 ។) ក៏មិនបណ្តាលឱ្យមានការថយចុះ osphFosB phosphorylation (ទិន្នន័យមិនត្រូវបានបង្ហាញ) ។ រួមគ្នាលទ្ធផលទាំងនេះគឺស្របនឹងរបស់យើង។ នៅក្នុង vitro ការរកឃើញនិងបង្ហាញថានៅក្នុងកោសិកាដដែលΔFosBទំនងជាត្រូវបានផូស្វ័រដោយ CK2 ប៉ុន្តែមិនមែន PKC ឬ CaMKII ទេ។ ការពិតដែលថាការហាមឃាត់ CK2 មិនរារាំងទាំងស្រុង osphFosB phosphorylation បង្ហាញពីអត្ថិភាពនៃកន្លែង phosphorylation បន្ថែមនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីន។

បន្ទាប់យើងពិនិត្យមើលថាតើ CK2 ដើរតួក្នុងការផ្លាស់ប្តូរ ofFosB ហើយដោយហេតុនេះស្ថេរភាពរបស់វា។ ដល់ទីបញ្ចប់នេះយើងបានធ្វើការពិសោធន៍ជីពចរដោយប្រើកោសិកា PC12 ដែលបង្ហាញដោយΔFosBដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយប្រើទាំង CK2 inhibitor ឬសកម្ម CK2 ដែលត្រូវបានប្រើក្នុងការសិក្សា phosphorylation ។ ដូចដែលបានបង្ហាញនៅក្នុង។ រូបភាព 4Cការព្យាបាលកោសិកាដោយប្រើប្រដាប់ទប់ CK2 DRB មានឥទ្ធិពលគួរឱ្យកត់សម្គាល់លើអត្រាវេននៃអ័រហ្វូប៊ីបដែលបង្ហាញពីការផ្លាស់ប្តូររាងរាងខ្សែកោងការរិចរិលរបស់វាពីប៊ីផិចសាកទៅខ្សែកោងដែលនៅជិតនឹងការពុកផុយស្រួយ។ ផ្ទុយទៅវិញវត្តមានរបស់មេជីវិតឈ្មោល CK2 សកម្មបង្កឱ្យមានការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃអត្រារិចរិលរបស់ΔFosBដែលនាំឱ្យមានការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនក្នុងកំឡុងពេលប៉ុន្មានម៉ោងដំបូងនៃការដេញតាម (រូបភព។ 4D).

ដូចគ្នានឹងសកម្មជន kinase និងអ្នករារាំងជាច្រើន, មេជីវិតឈ្មោលនិង DRB អាចមានឥទ្ធិពលមេតាប៉ូលីសនៅខាងក្រៅម៉ូឌុលនៃសកម្មភាព CK2 ។ តាមពិត DRB ត្រូវបានគេបង្ហាញថារារាំងកត្តាចម្លង IIH (TFIIH) - ពាក់ព័ន្ធនឹង kinase (Yankulov et al ។ , 1995 ។) ដែលបណ្តាលឱ្យមានការហាមឃាត់ការផ្ទេរសំឡេងដែលសម្របសម្រួលដោយ RNA polymerase II ។ ដោយសារតែឥទ្ធិពលនេះអាចប៉ះពាល់ដល់ស្ថេរភាពរបស់ΔFosBយើងបានវិភាគពីផលប៉ះពាល់នៃសារធាតុគីនីណារារាំងអេជអាយអេសអេចអេសអេស (Hidaka និង Kobayashi, 1992 ។) នៅលើΔFosBវេននៅការផ្តោតអារម្មណ៍ (200 knownm) ត្រូវបានគេស្គាល់ថារារាំង kinase ដែលទាក់ទងនឹង TFIIH ប៉ុន្តែមិនមែន CK2 (Yankulov et al ។ , 1995 ។) ។ ដូចបានបង្ហាញ រូបភាព 4E, ការព្យាបាលជាមួយអេជអេចអេសអេចមិនប៉ះពាល់ដល់អត្រាវេននៃΔFosBទេ។ លទ្ធផលស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេទទួលបានជាមួយ H-8 ដែលជាសារធាតុរារាំង kinase វិសាលគមទូលំទូលាយមួយផ្សេងទៀតដែលត្រូវបានប្រើនៅកំហាប់ដែលរារាំងការប្រើ kinase ដែលទាក់ទងនឹង TFIIH ប៉ុន្តែមិនមែន CK7 (ទិន្នន័យមិនបានបង្ហាញ) ។ ទិន្នន័យទាំងនេះគាំទ្រការបកស្រាយបន្ថែមទៀតថាការកាត់បន្ថយស្ថេរភាពΔFosBដែលបណ្តាលមកពី DRB ទំនងជាបណ្តាលមកពីការហាមឃាត់ CK2 ។

ដើម្បីបង្កើតតួនាទីរបស់ CK2 បន្ថែមទៀតនៅក្នុងចំណូលΔFosBយើងបានស៊ើបអង្កេតអំពីផលវិបាកនៃការធ្លាក់ចុះ CK2 តាមរយៈ siRNA ។ យើងបានធ្វើពិសោធន៍ទាំងនេះដោយប្រើកោសិកា PC12 ដែលត្រូវបានផ្ទេរដំបូងដោយការត្រួតពិនិត្យ (មិនចេះរីងស្ងួត) siRNA ឬ siRNA ដែលផ្តោតលើ mRNA នៃអនុធាតុកាតាលីករនៃកណ្តុរ CK2 (CK2α) និង 24 h ក្រោយមកឆ្លងជាមួយΔFosB។ ដូចដែលបានបង្ហាញនៅក្នុង។ រូបភាព 4F, ការបញ្ចូលជាមួយCK2α siRNA ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនិងជាពិសេសបានបំបាក់កំរិតប្រូតេអ៊ីនCK2αដោយមិនប៉ះពាល់ដល់កំរិតΔFosB (បន្ទះខាងលើ) ។ ការវិភាគជីពចរបានបង្ហាញថាការធ្លាក់ចុះ CK2 បណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃអត្រាប្តូរប្រាក់ΔFosBដូចដែលបានបង្ហាញដោយការថយចុះលឿននៃប្រូតេអ៊ីន។ ការពិតដែលរារាំងសកម្មភាព CK2 (មិនថាតាមរយៈការព្យាបាលដោយ DRB ឬ siRNA) បង្កើនចំណូលរបស់ΔFosBនិងជាលទ្ធផលនៃការបាត់សមាសធាតុដែលមានអត្រាយឺតនៃខ្សែកោងទ្វេភាគីចំណែកឯសកម្មភាព CK2 ជួយបង្កើនដំណាក់កាលយឺតនៃខ្សែកោងផ្តល់នូវការគាំទ្រយ៉ាងខ្លាំងសម្រាប់ គំនិតដែលថាខេខេស៊ីធីស៊ីដើរតួក្នុងការធ្វើនិយ័តកម្មស្ថេរភាពΔហ្វាសប៊ី។

phosphorylates CK2 osphFosB នៅលើ Ser27 ។

ដើម្បីចាប់ផ្តើមកំណត់ទីតាំងនៅលើ osphFosB phosphorylated ដោយ CK2 យើងបានធ្វើការវិភាគអាស៊ីត phospho-amino នៃសារធាតុបំប៉នΔFosB phosphorylated ដោយ CK2 នៅក្នុង vitro និងΔFosB phosphorylated នៅក្នុងកោសិកា PC12 ។ ការពិសោធន៍ទាំងនេះបានបង្ហាញថាក្នុងករណីទាំងពីរមានតែអាស៊ីតផូតូ - អាមីណូដែលត្រូវបានរកឃើញគឺផូហ្វ - ស៊ែរ (រូបភព។ 5A) ។ ការរកឃើញនេះរួមជាមួយកាំរស្មីធរណីមាត្រដែលទទួលបានសម្រាប់ស៊ីខេខេអេច។ នៅក្នុង vitro ប្រតិកម្មផូស្វ័រ (∼50%) (រូបភព។ 3B) និងវត្តមាននៃចំណុចសំខាន់តែមួយគត់នៅលើផែនទីផូស្វ័រផូស្វ័រ (CK2 phosphopeptide) (រូបភព។ 4A), បានបង្ហាញថាផូស្វ័រអេកូស៊ីខេស៊ីធីអេសនៃអេហ្វអេសប្រហែលជាត្រូវបានកំណត់ចំពោះសំណល់សៀរៀលតែមួយ។ ការសន្និដ្ឋាននេះគឺស្របជាមួយនឹងការវិភាគគេហទំព័រឯកទេសផូស្វ័រ (រូបភព។ 2B) ដែលបានព្យាករណ៍ពីសេរ៊ីបេក្ខជនតែម្នាក់គត់ពោលគឺ Ser27 សម្រាប់ CK2 ។ ការវិភាគតាមបែបពន្ធដារបានបង្ហាញថា Ser27 ត្រូវបានអភិរក្សយ៉ាងខ្លាំងតាមរយៈការវិវត្តន៍ក្នុងចំណោមសមាជិកគ្រួសារ Fos (រូបភព។ 5B) ដោយបង្ហាញថាវាអាចមានមុខងារសរីរវិទ្យាដ៏សំខាន់មួយ។

មើលកំណែធំជាងនេះ:

ទាញយកជាស្លាយ PowerPoint

រូបភាព 5 ។

CK2 Phosphorylates ΔFosBនៅលើ Ser27 ។ A, ការវិភាគអាស៊ីត Phosphoamino នៃ CK2-phosphorylated (នៅក្នុង vitro) និង PC12 cell-phosphorylated ΔFosBបង្ហាញថាក្នុងករណីទាំងពីរសារធាតុផូស្វ័រដែលនៅសល់សំខាន់គឺសេរ៉ា។ B, ការវិភាគប្រភេទសត្វឆ្លង FosB / osFosB អាស៊ីតអាមីណូបានបង្ហាញពីការអភិរក្សខ្ពស់នៃ Ser27 ក្នុងចំណោមសមាជិកគ្រួសារ Fos ពីមនុស្សរហូតដល់សត្វសេះបង្កង់ (បន្លិចងងឹត) ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយសំណល់អាសុីតនៅទីតាំង + 3 ដែលតំរូវការសំរាប់តំបន់ឯកភាព CK2 មិនត្រូវបានរក្សាទុកទេ (បន្លិចពន្លឺ) ។ C, កោសិកា HeLa ត្រូវបានចម្លងបណ្តោះអាសន្នជាមួយនឹងប្រភេទ wildFosB (WT) ឬ wildFosB ដែលមានបំរែបំរួលចំណុចដើម្បីជំនួស Ser27 ជាមួយអាឡា (S27A) ។ កោសិកាត្រូវបានដាក់ស្លាកមេតាប៉ូលីសជាមួយ។ ³²PH₃PO₄ និងត្រូវបានព្យាបាលដោយយានយន្តឬជាមួយមេជីវិតឈ្មោល (អេសភី) ដើម្បីធ្វើឱ្យ CK2 សកម្ម។ អ្នកតំណាង autoradiogram (បន្ទះខាងលើ) និង immunoblot (បន្ទះបាត) នៃវ៉ាក់សាំងការពារ opFosB ដែលទទួលបានត្រូវបានបង្ហាញ។ ភាពស៊ាំនៃកោសិការឆ្លង (វ៉ិចទ័រ) ត្រូវបានបង្ហាញ។

ដើម្បីកំណត់ថាតើ Ser27 ត្រូវបាន phosphorylated នៅក្នុងΔFosBយើងបានប្តូរសំណល់នេះទៅអាឡាហើយវិភាគផលវិបាកលើស្ថានភាពផូស្វ័រនៃប្រូតេអ៊ីន។ ដល់ទីបញ្ចប់នេះយើងបានប្រើកោសិកា HeLa (ដែលអាចត្រូវបានផ្ទេរដោយប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់) ដើម្បីបញ្ចោញបណ្តោះអាសន្នទាំង WT ឬ S27A mutant ΔFosB។ ប្រហែល 24 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការប្តូរកោសិកាត្រូវបានដាក់ស្លាកមេតាប៉ូលីសជាមួយ។ ³²P-orthophosphate និងកោសិកាទាំងមូលត្រូវបានរៀបចំ។ បន្ទាប់ពីភាពស៊ាំនឹងភាពស៊ាំនិងអេស។ អេស។ ភី - ភី។ ³²P-osFosB ត្រូវបានរកឃើញដោយស្វ័យប្រវត្តិកម្មស្វ័យប្រវត្តិនិង totalFosB សរុបដោយការការពារមិនឱ្យជ្រាប។ ដូចដែលបានបង្ហាញនៅក្នុង។ រូបភាព 5C (បន្ទះខាងក្រោម) ΔFosBមិនត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងកោសិកាដែលចម្លងតាមវ៉ិចទ័រចំណែកឯកោសិកាបានចម្លងជាមួយទាំង WT ឬ S27A mutant ΔFosBបានបង្ហាញប្រូតេអ៊ីនដោយជោគជ័យ។ យើងបានរកឃើញថាការផ្លាស់ប្តូរ S27A បណ្តាលឱ្យមានការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់ (∼30%) ។ ³²កម្រិត P-ΔFosB (រូបភព។ 5C, បន្ទះខាងលើនិងក្រាហ្វិច) ដែលបង្ហាញថានៅក្នុងកោសិការស់ΔFosBត្រូវបាន phosphorylated នៅលើ Ser27 ។ នៅក្នុងការខិតខំប្រឹងប្រែងដើម្បីកំណត់ថាតើនៅក្នុងកោសិកា Ser27 ពិតជាត្រូវបានផូស្វ័រដោយ CK2 យើងប្រៀបធៀបសមត្ថភាពរបស់មេជីវិតឈ្មោលសកម្មរបស់ខេខេស៊ីអេចដើម្បីធ្វើឱ្យផូស្វ័រនៃអេចធីនិងអេស៊ីអេសអេសអេស។ ដូចដែលយើងបានសង្កេតពីមុននៅក្នុងកោសិកា PC2 (រូបភព។ 4B), ការព្យាបាលនៃកោសិកាអេលឡាជាមួយមេជីវិតឈ្មោលមានការកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនូវផូស្វ័រនៃប្រូតេអ៊ីន WT ។ ការពិតដែលថាឥទ្ធិពលនេះត្រូវបានថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់ដោយការផ្លាស់ប្តូរ S27A (រូបភព។ 5C) គាំទ្រការបកស្រាយថា Ser27 នៅΔFosBគឺជាស្រទាប់ខាងក្រោមនៃសរីរវិទ្យាសម្រាប់ CK2 ។

Phosphorylation នៃ Ser27 ធ្វើនិយ័តកម្មស្ថេរភាពΔFosB។

ដោយបានបញ្ជាក់ថាស្ថេរភាពរបស់ΔFosBត្រូវបានថយចុះនៅពេលដែល CK2 ត្រូវបានរារាំងនិងពង្រឹងនៅពេល CK2 ត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្ម (រូបភព។ 4) ហើយនោះផូស្វ័រហ្វ្រីដ្យូមស៊ីខេខេស៊ីធីΔFosBនៅលើអេស។ អេស។ ស៊ី។ ធី (រូបភព។ 5) យើងបានព្យាករណ៍ថាការការពារផូស្វ័រនៃគេហទំព័រនេះគួរតែធ្វើឱ្យប្រូតេអ៊ីនមានស្ថេរភាព។ ការពិសោធន៍ Pulse-chase ធ្វើឡើងជាមួយកោសិកា HeLa បង្ហាញជាបណ្ដោះអាសន្នទាំងសារធាតុ WT ឬ S27A mutant ΔFosBបានបង្ហាញថាការប្តូរហ្សែន S27A បានបណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នូវអត្រានៃការរិចរិលរបស់ΔFosBនិងការថយចុះនៃប្រូតេអ៊ីននៅពាក់កណ្តាលជីវិតរបស់ប្រូតេអ៊ីន។ (រូបភព។ 6A) ។ បន្ទាប់មកយើងបានស៊ើបអង្កេតថាតើយន្តការបទបញ្ញត្តិនេះក៏កើតឡើងនៅក្នុងខ្សែកោសិការអេចអរអេសអិចដែរ។ ការពិសោធន៍ទាំងនេះបានបង្ហាញថាដូចដែលយើងបានសង្កេតឃើញនៅក្នុងកោសិកា HeLa ការផ្លាស់ប្តូរចំណុច S12A បណ្តាលឱ្យមានការថយចុះយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងពាក់កណ្តាលជីវិតរបស់ΔFosBនៅក្នុងកោសិកា PC27 (ពី ∼12 ដល់ ∼11 ម៉ោង) (រូបភព។ 6B) ។ ការពិតដែលថាអស្ថិរភាពនេះគឺប្រហាក់ប្រហែលនឹងមូលហេតុដែលបណ្តាលមកពីការហាមឃាត់ CK2 ឬការផ្តួលរំលំ (រូបភព។ 4) ផ្តល់នូវការគាំទ្របន្ថែមទៀតចំពោះគំនិតដែលថាផូស្វ័រស៊ីតេអេសអេសអេសអេសអេសប៊ីអេសប៊ីស៊ីធ្វើឱ្យស្ថេរភាពរបស់ regulFosB ។ ភ័ស្តុតាងបន្ថែមសម្រាប់តួនាទីកំណត់នៃផូស្វ័រ Ser2 phosphorylation លើការផ្លាស់ប្តូរប្រូតេអ៊ីនΔFosBត្រូវបានគេទទួលបានដោយប្រើផូស្វូម៉ីសេទិក Ser27 ទៅការផ្លាស់ប្តូរអេសភី (S27D) ។ ការផ្លាស់ប្តូរ S27D ត្រូវបានគេចាត់ទុកថាជា phosphomimetic ពីព្រោះវាដាក់ក្រុមដែលមានបញ្ហាអវិជ្ជមានយ៉ាងខ្លាំងនៅអាស៊ីតអាមីណូ 27 ហើយដោយផ្នែកខ្លះធ្វើត្រាប់តាមផូស្វ័រនៃ Ser27 ។ ដូចដែលបានបង្ហាញនៅក្នុង។ រូបភាព 6Cការផ្លាស់ប្តូរ S27D បណ្តាលឱ្យមានឥទ្ធិពលផ្ទុយនៃការផ្លាស់ប្តូរ S27A ហើយជាលទ្ធផលប្រូតេអ៊ីនមានស្ថេរភាពជាងប្រូតេអ៊ីន WT ។ ស្រដៀងគ្នានឹងប្រសិទ្ធិភាពដែលទទួលបានបន្ទាប់ពីការធ្វើឱ្យសកម្មរបស់ខេខេអេសអេច (រូបភព។ 4D) ការផ្លាស់ប្តូរ S27D បណ្តាលឱ្យមានការប្រមូលផ្តុំហើយដូច្នេះបង្កើនកម្រិតΔFosBក្នុងកំឡុងពេលម៉ោងដំបូងនៃការដេញតាម។

មើលកំណែធំជាងនេះ:

ទាញយកជាស្លាយ PowerPoint

រូបភាព 6 ។

Phosphorylation នៃ Ser27 គ្រប់គ្រងស្ថេរភាពរបស់ΔFosB។ A, C, ការវិភាគជីពចរ - បាសបង្ហាញពីផលប៉ះពាល់នៃផូស្វ័រ Ser27 លើអត្រាវេន ofFosB ។ ទម្រង់នៃការរិចរិលនិងការប៉ាន់ស្មានអាយុកាលពាក់កណ្តាលនៃប្រភេទΔFosB (WT), ប្រភេទ Ser27 ទៅអាល់អាហ្សែន (S27A) និងផូស្វូម៉ីមេទិក Ser27 ទៅអេសអេហ្សែន (S27D) ត្រូវបានបង្ហាញ។ ការរកឃើញដូចគ្នាត្រូវបានទទួលនៅក្នុងកោសិកាហេលឡា (A) និង PC12 កោសិកា (B, C).

phosphorylation Ser27 មានស្ថេរភាពΔFosBដោយការពារការរិចរិលរបស់វា។

ដើម្បីចាប់ផ្តើមធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវយន្តការដែល phosphorylation នៃ Ser27 មានស្ថេរភាពΔFosBយើងបានពិនិត្យសមត្ថភាពរបស់សារធាតុគីមីការពារប្រូហ្សេម MG132 (Palombella et al ។ , 1994 ។; Tsubuki et al ។ , 1996 ។) និងអ៊ីប៉ូហ្សូទីន (ហនដាដា et al ។ , 1992 ។; Kim et al ។ , 1999) ដើម្បីសំរួលអត្រាការរិចរឹលនៃ WT និង S27A mutant ΔFosB។ ការពិសោធន៍ជីពចរត្រូវបានធ្វើឡើងដោយប្រើកោសិកា PC12 ដែលឆ្លងវីរុស HSV ដែលបង្ហាញថាជា WT ឬ S27A ΔFosBនិងព្យាបាលដោយប្រើ DMSO ឬមួយក្នុងចំនោមសារធាតុពីរដែលការពារជាតិប្រូតេអ៊ីន។ ការពិសោធន៍ទាំងនេះបានបង្ហាញថាទោះបីជាអត្រានៃការរិចរឹសនៃប្រូតេអ៊ីន WT គឺមិនសមនឹងវត្តមាននៃអង់ស៊ីមប្រូសេស្តេរ៉ូនទាំងពីរនោះទេ (រូបភព។ 7A) នៃហ្សែន S27A គឺងាយនឹងថ្នាំទាំងនេះ (រូបភព។ 7B) ។ នេះបង្ហាញថាមិនដូចប្រូតេអ៊ីន WT ទេសារធាតុហ្សែន S27A គឺជាគោលដៅនៃការរិចរិលរបស់ប្រូតេអ៊ីន។ ជាការពិតណាស់ការព្យាបាលកោសិកាដោយប្រើ MG132 ឬ epoxomicin បញ្ច្រាស់យ៉ាងពេញលេញនូវឥទ្ធិពលនៃការផ្លាស់ប្តូរ S27A លើអត្រាការរិចរិលរបស់ΔFosBដែលបង្ហាញដោយការកើនឡើងនៃពាក់កណ្តាលជីវិតរបស់ហ្សែន S27A ពី ∼4 ដល់ ∼9 ម៉ោងសម្រាប់ MG132 និង ∼ 12 ម៉ោងសំរាប់អេប៉េត្រូម៉ីនទីន (រូបភព។ 7B) ។ ជាមួយគ្នានេះដែរការរកឃើញទាំងនេះបង្ហាញថាផូស្វ័រនៃΔFosBនៅលើ Ser27 ការពារប្រូតេអ៊ីនពីការរិចរិលរបស់ប្រូតេអ៊ីននិងដូច្នេះវាចាំបាច់សម្រាប់ស្ថេរភាពមិនធម្មតារបស់វា។

មើលកំណែធំជាងនេះ:

ទាញយកជាស្លាយ PowerPoint

រូបភាព 7 ។

Phosphorylation នៃ Ser27 មានស្ថេរភាពΔFosBដោយការពារការរិចរិលរបស់វា។ A, B, ការវិភាគជីពចរ - ឆៃជាមួយកោសិកាអេចភីអេសអិលដែលឆ្លង HSV ដែលបង្ហាញពីទម្រង់នៃការរិចរិលនិងការប៉ាន់ស្មានអាយុកាលពាក់កណ្តាលនៃប្រភេទ wildFosB ។A) ឬ S27A ΔFosB (B) នៅក្នុងអវត្ដមានឬវត្តមាននៃធាតុផ្សំនៃការការពារ proteasome ទាំងពីរ [MG132 និង epoxomicin (Epoxo)] ។ សូមកត់សម្គាល់ការពិតដែលថាគ្មានថ្នាំណាដែលមានឥទ្ធិពលគួរឱ្យកត់សម្គាល់ចំពោះការផ្លាស់ប្តូរប្រភេទ wildFosB ប្រភេទព្រៃចំណែកឯការព្យាបាលកោសិកាដោយប្រើប្រូសេស្តេរ៉ូនអាចបណ្តាលឱ្យមានស្ថេរភាពនៃ S27A ΔFosB។ Cដែលជាគំរូសម្រាប់តួនាទីរបស់ផូស្វ័រហ្វ័រអេសភីអេសក្នុងសមត្ថភាពΔFosBក្នុងការសម្របសម្រួលប្លាស្ទិចខួរក្បាលរយៈពេលវែង។ នៅពេលត្រូវបានបង្កើតឡើងផ្នែកមួយនៃΔFosBត្រូវបានធ្វើឱ្យមានស្ថេរភាពនៅក្នុងខួរក្បាលដោយផូស្វ័រស៊ីអេសអេសអេសអេសអេសអេសអេស។ នេះបណ្តាលឱ្យមានការកកកុញរបស់វាដែលជាលទ្ធផលបណ្តាលឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរយូរអង្វែងនៅក្នុងការបញ្ចេញហ្សែន។ ការផ្លាស់ប្តូរស្ថេរភាពទាំងនេះនៅក្នុងការបញ្ចេញហ្សែនរួមចំណែកដល់ការសម្របខ្លួនឥរិយាបថមានស្ថេរភាព។ ផ្ទុយទៅវិញការថយចុះកម្តៅនៃ S27 ដោយអេសភីអេសអេសភីអេសភីអេសនិង / ឬ PP2A បណ្តាលឱ្យមានអស្ថិរភាពនៃប្រូតេអ៊ីននិងដំណើរការរបស់វាដោយគ្រឿងម៉ាស៊ីន proteasomal ។

ផ្នែកមុន ផ្នែកបន្ទាប់

ការពិភាក្សា

នៅក្នុងការសិក្សានាពេលបច្ចុប្បន្ននេះយើងបង្ហាញថាΔFosBមានអាយុកាលពាក់កណ្តាល ∼10 ម៉ោងនៅក្នុងវប្បធម៌កោសិកាដែលធ្វើឱ្យវាមានស្ថេរភាពបើប្រៀបធៀបទៅនឹង FosB ដែលមានប្រវែងពេញលេញនិងកត្តាចម្លងដែលមិនអាចជៀសផុតបានដែលអាយុកាលពាក់កណ្តាលនៃវប្បធម៌កោសិកាអាចមានរយៈពេលខ្លី។ ដូចជាពីរបីនាទីហើយកម្រលើសពី 3 ម៉ោង។ (ហាន់និងអ៊ីស៊ីនម៉ាន, 1984 ។; Dobrazanski et al ។ , 1991 ។; Roberts និង Whitelaw, 1999 ។; Ferrara et al ។ , 2003 ។; Hirata et al ។ , 2004 ។) ។ លើសពីនេះទៀតយើងឃើញថាΔFosBត្រូវបាន phosphorylated នៅក្នុងខួរក្បាលហើយថា phosphorylation របស់វាគឺងាយនឹងអាស៊ីត PP1 / PP2A inhibitors អាស៊ីត okadaic ។ ការសិក្សាអំពីវប្បធម៌កោសិការបស់យើងបង្ហាញថាស្ថេរភាពΔFosBត្រូវបានតំរែតំរង់ដោយ CK2 ជាមួយនឹងសកម្មភាព CK2 ខ្ពស់ធ្វើអោយស្ថេរភាពប្រូតេអ៊ីន។ ចុងបញ្ចប់ការរកឃើញរបស់យើងបានបង្ហាញថា CK2 phosphorylates ΔFosBលើសេរ៉ូម N Terminus (S27) ដែលមានការអភិរក្សខ្ពស់និងបង្ហាញថាផូស្វ័រនៃអេស។ អេស។ ស៊ី។ ស៊ីការពារ protectsFosB ពីការរិចរិល proteasomal ។ ដូច្នេះយើងស្នើសុំគំរូមួយដែល phosphorylation នៃΔFosBនៅលើ S27 ដោយ CK27 គឺជាយន្តការគតិយុត្តិដ៏សំខាន់នៃចំណូលវេននៃΔFosB (រូបភព។ 7C) ។ ស្ថេរភាព phosphorylation- សំរបសំរួលនៃΔFosBគឺមានសារៈសំខាន់ជាមុខងារពីព្រោះការកើនឡើងកំរិតΔFosBនៅក្នុងតំបន់ខួរក្បាលជាក់លាក់ត្រូវបានបង្ហាញដើម្បីគ្រប់គ្រងដោយផ្ទាល់នូវហ្សែនណឺរ៉ូនជាច្រើន។ នៅក្នុង Vivo និងដើម្បីប្រើឥរិយាបទប្រកបដោយឥទ្ធិពលនៅក្នុងគំរូសត្វនៃជំងឺ neuropsychiatric ជាច្រើន (សូមមើលការណែនាំ) ។

ទោះបីជា phosphorylation គឺជាវិធីលឿននិងបញ្ច្រាសនៃការធ្វើនិយ័តកម្មសកម្មភាពប្រតិចារិកនៃកត្តាចម្លងជាក់លាក់ដូចជា CREB (ប្រូតេអ៊ីនភ្ជាប់ធាតុឆ្លើយតបរបស់ cAMP) (Bohmann, 1990 ។) ការធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវការរិចរិលនៃកត្តាប្រតិចារិកផ្តល់នូវទំរង់នៃបទប្បញ្ញត្តិដែលមានអនុភាពជាងDesterro et al ។ , 2000 ។) ។ កត្តាប្រតិចារិកដែលសកម្មភាពមុខងាររបស់ខ្លួនត្រូវបានកំណត់តាមកម្រិតនៃការរិចរិលរបស់ពួកគេរួមមានNFκB (Desterro et al ។ , 2000 ។), ស៊ី - Myc (Sears et al ។ , 1999 ។) និង c-Fos (Ferrara et al ។ , 2003 ។), ក្នុងចំណោមអ្នកដទៃ។ ក្នុងករណីជាច្រើនផូស្វ័រគឺជានិយតករសំខាន់នៃស្ថេរភាពនៃកត្តាចម្លងដូចបានបង្ហាញសម្រាប់គ - អេហ្វ (Okazaki និង Sagata, 1995 ។; Tsurumi et al ។ , 1995 ។) អង់ទីហ្សែនទាក់ទងនឹងអេសស្តូស - អេសអេចអេស (អេច - ស៊ីធីអេច) (Vial និង Marshall, 2003 ។), ហ្វារ៉ា -2 (Manabe et al ។ , 2001 ។), ស៊ី - មិថុនា (Fuchs et al ។ , 1996) ចូប៊ីប (Fuchs et al ។ , 1997), ATF2 (Fuchs et al ។ , 2000) និង p53 (Buschmann et al ។ , 2001 ។) ។ ការសិក្សារបស់យើងបន្ថែមΔFosBទៅក្នុងបញ្ជីនៃកត្តាប្រតិចារិកដែលសកម្មភាពមុខងាររបស់វាត្រូវបានគ្រប់គ្រងតាមរយៈស្ថេរភាពដែលពឹងផ្អែកលើផូស្វ័រ។

ស៊ីខេ ២ គឺជាគីនស៊ីសេនអេសដែលមានសកម្មភាពប្លែកនិងសកម្មដែលមាន> ស្រទាប់ខាងក្រោម ៣០០ ដែលត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណហើយមានជាប់ទាក់ទងនៅក្នុងដំណើរការជីវសាស្រ្តជាច្រើនរួមមានការស្លាប់និងការរស់រានមានជីវិតរបស់កោសិកា។លីមហ្វៀល, 2003 ។; យូហ្គ័រ et al ។ , 2004 ។) ការឆ្លើយតបស្ត្រេសកោសិកា (យ៉ាណាហ្គាវ៉ា et al ។ , 1997 ។; Kato et al ។ , 2003 ។) និងការជួសជុលឌីអិនអេនិងការកែលម្អក្រូមីទីល (Barz et al ។ , 2003 ។; Krohn et al ។ , 2003 ។) ។ ច្រើនជាងមួយភាគបីនៃស្រទាប់រងនៃស៊ីខេអេសអេចគឺជាប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងបទបញ្ជានៃការបញ្ចេញហ្សែន (Meggio និង Pinna, 2003 ។) ។ តាមពិត CK2 ត្រូវបានបង្ហាញថាជានុយក្លេអ៊ែរលេចធ្លោ (Krek et al ។ , 1992 ។) (សម្រាប់ការពិនិត្យមើលសូមមើល។ Yu et al ។ , 2001 ។) និងដើម្បីធ្វើអន្តរកម្មជាមួយដែនប៊ីហ្ស៊ីពនៃកត្តាប្រតិចារិកជាច្រើន (Yamaguchi et al ។ , 1998) ។ phosphorylation ដែលត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយ CK2 ក៏ត្រូវបានបង្ហាញផងដែរដើម្បីធ្វើឱ្យការរិចរិលថយចុះ (បង្កើនឬបន្ថយវា) នៃប្រូតេអ៊ីនជាច្រើនរួមទាំង IkB (Schwarz et al ។ , 1996 ។), ភីធីអិន (Torres និង Pulido, 2001 ។), កែវថតខននេនស៊ីន (Yin et al ។ , 2000) ប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹងក្រូមីញ៉ូម HMG1 (Wisniewski et al ។ , 1999 ។) និងកត្តាប្រតិចារិកជាច្រើនដូចជា HMGB (Stemmer et al ។ , 2002 ។), Myf-5 (រដូវរងារ et al ។ , 1997 ។) និង c-Myc (Channavajhala និង Seldin, 2002 ។) ។ CK2 គឺសំបូរទៅដោយខួរក្បាល (Alcazar et al ។ , 1988 ។; ហ្គីរ៉ាហល et al ។ , 1990 ។) និងសកម្មភាពរបស់វាត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់នៅក្នុងទិដ្ឋភាពជាច្រើននៃមុខងារខួរក្បាលរួមទាំងការរស់រាននៃប្រព័ន្ធប្រសាទ (ក្រុមហ៊ុន Boehning et al ។ , 2003 ។), ភាពខុសគ្នា (Nuthall et al ។ , 2004 ។) មុខងារឆានែលអ៊ីយ៉ុង (Jones និង Yakel, 2003 ។; Bildl et al ។ , 2004 ។) និងប្លាស្ទិកប្លាស្ទិកដ៏ខ្លាំងក្លានិងយូរអង្វែង (Diaz-Nido et al ។ , 1992 ។; Lieberman និង Mody, 1999 ។; Reikhardt et al ។ , 2003 ។).

ទោះបីជាមានភ័ស្តុតាងដែលកំពុងកើនឡើងនេះសម្រាប់តួនាទីរបស់ CK2 ក្នុងបទបញ្ជាមុខងារណឺរ៉ូនក៏ដោយក៏គេដឹងតិចតួចអំពីអ្វីដែលគ្រប់គ្រងសកម្មភាពរបស់វា។ CK2 ត្រូវបានគេគិតថាមានសកម្មភាពជាប្រចាំដោយមានបទប្បញ្ញត្តិសមត្ថភាពរបស់វាក្នុងការ phosphorylate ស្រទាប់ខាងក្រោមពឹងផ្អែកភាគច្រើនទៅលើការផ្លាស់ប្តូរក្នុងការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្ម intracellular របស់វា (ឧទាហរណ៍ស៊ីស៊ីតូសនិងនុយក្លេអ៊ែរ) (Ahmed និង Tawfic, 1994 ។; Yu et al ។ , 1999 ។) ។ ព័ត៌មាននេះបង្កើតឱ្យមានសំណួរសំខាន់មួយទាក់ទងនឹងសញ្ញាអ្វីដែលត្រូវបានទាមទារដើម្បីជំរុញការប្រមូលផ្តុំΔFosBនៅក្នុងខួរក្បាលបន្ទាប់ពីការរំញោចរ៉ាំរ៉ៃ (រូបភព។ 7C) ។ តម្រូវការមួយគឺការធ្វើឱ្យសកម្មម្តងហើយម្តងទៀតនៃឯកសារ fosB ហ្សែននិងការបង្កើត mFosB mRNA (Chen et al ។ , 1995) ។ ទិន្នន័យរបស់យើងបានបង្ហាញថាផូស្វ័រ CK2 ផូស្វ័រនៃΔFosBមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ស្ថេរភាពរបស់វាដោយបង្ហាញថាសញ្ញាទីពីរអាចត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ផលប៉ះពាល់រយៈពេលវែងរបស់ΔFosBលើការបង្ហាញហ្សែនដែលជាសញ្ញាមួយដែលរំញោចការ phosphorylation នៃប្រូតេអ៊ីនដោយ CK2 ។ នេះអាចពាក់ព័ន្ធនឹងការធ្វើឱ្យសកម្មនៃស៊ីខេអេសអេចដោយយន្តការដែលមិនស្គាល់ឬការផ្លាស់ទីលំនៅរបស់វាទៅស្នូល។ ម៉្យាងទៀត Phosphorylation CK2 phosphorylation នៃΔFosBអាចជាធាតុផ្សំដូចជាប្រូតេអ៊ីនΔFosBត្រូវបានបកប្រែឆ្លើយតបទៅនឹងការរំញោចនីមួយៗផ្នែកមួយរបស់វាទទួលបានផូស្វ័រនិងមានស្ថេរភាពដូច្នេះដោយមានការរំញោចម្តងហើយម្តងទៀតវាកកកុញទៅកម្រិតខ្ពស់នៃណឺរ៉ូនដែលរងផលប៉ះពាល់។

ការរកឃើញរបស់យើងបានបង្ហាញថា CK2 និង S27 ប្រហែលជាមិនមែនជាគីនីស្យូសនិងគេហទំព័រដែលទទួលខុសត្រូវចំពោះ osphFosB phosphorylation នោះទេព្រោះថាការទប់ស្កាត់ CK2 និងការផ្លាស់ប្តូរ S27A មិនអាចទប់ស្កាត់ Phosphorylation osphFosB បានឡើយ។ ដោយសញ្ញាណដូចគ្នាការពិតដែលការផ្លាស់ប្តូរ S27A បណ្តាលឱ្យមានការកាត់បន្ថយ 30% នៅក្នុង phospho-osFosB អះអាងថា S27 គឺជាទីតាំងផូស្វ័រដ៏សំខាន់មួយនៅលើប្រូតេអ៊ីន។ ទោះយ៉ាងណាយើងកំពុងស៊ើបអង្កេតទីតាំងគីណូតនិងផូស្វ័រដែលមានសារធាតុផូស្វ័រផ្សេងទៀតនៅលើΔFosB។ នៅទីបំផុតវាក៏សំខាន់ផងដែរដើម្បីធ្វើការវិភាគផូស្វ័រនៃអេស។ អេស។ ស៊ី។ ស៊ីនិងគេហទំព័រផូស្វ័រផ្សេងទៀតនៅក្នុងΔFosBក្នុងខួរក្បាល។ នៅក្នុង Vivo បន្ទាប់ពីប្រភេទផ្សេងៗនៃការរំញោចរ៉ាំរ៉ៃឧទាហរណ៍តាមរយៈការប្រើប្រាស់អង់ទីករម៉ាស់ត្រូទិកឬផូស្វ័រផូស្វ័រ។

ដូចដែលបានរៀបរាប់ខាងលើ S27 នៅក្នុងΔFosBត្រូវបានអភិរក្សយ៉ាងខ្លាំងនៅទូទាំងការវិវត្តន៍និងក្នុងចំណោមប្រូតេអ៊ីនគ្រួសារ Fos ផ្សេងទៀត។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយកន្លែងដែលមានការឯកភាពគ្នាសម្រាប់ CK2 មិនមែនទេ: ដូចដែលបានបង្ហាញនៅក្នុង។ រូបភាព 5Bមានតែ FosB / ΔFosB (និងហ្សែនហ្វីហ្វីហ្សែន) ប៉ុន្តែមិនមានស៊ីអេហ្វអេសឬអេហ្វអេសស៊ីអេចមានសំណល់អាសុីតនៅ + 2 ដែលជាកត្តាកំណត់សំខាន់នៃផូស្វ័រ CK3 (Marin et al ។ , 1986; Meggio et al ។ , 1994 ។) ។ ដូច្នេះកង្វះ phosphorylation CK2 នៅលើ S27 អាចពន្យល់ពីមូលហេតុដែលប្រូតេអ៊ីនគ្រួសារ Fos ផ្សេងទៀតមិនមានស្ថេរភាពដូចΔFosB។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយនេះមិនពន្យល់ថាហេតុអ្វីបានជា FosB ដែលមានប្រវែងពេញដែលមានតំបន់ឯកភាពរួម CK2 ដូចΔFosBមិនមានស្ថេរភាពស្រដៀងគ្នាទេ។ យើងមិនដឹងថា FosB ប្រវែងពេញត្រូវបានផូស្វ័រដោយ CK2 លើសំណល់ដែលបានអភិរក្សនេះទេ។ របាយការណ៍តែមួយគត់របស់អេសអូប៊ី (Skinner et al ។ , 1997 ។) និង c-Fos (Okazaki និង Sagata, 1995 ។; Chen et al ។ , 1996) phosphorylation ពិពណ៌នាអំពីទីតាំងនៅក្នុងតំបន់ស្ថានីយ C នៃប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះដែលអវត្តមាននៅក្នុងΔFosB។ ផូស្វ័រដែលមានសក្តានុពលនៃអេហ្វអេសប៊ីនិងប្រូតេអ៊ីនគ្រួសារហ្វុសផ្សេងទៀតដោយស៊ីខេខេស៊ីធីត្រូវការការស៊ើបអង្កេតដោយផ្ទាល់។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយទោះបីជាពួកគេត្រូវបានផូស្វ័រក៏ដោយក៏ក្រុមគ្រួសារប្រូតេអ៊ីនហ្វុសផ្សេងទៀតត្រូវបានគេដឹងថាមានគំនូរនៅឯពាក្យគរបស់ពួកគេដែលតម្រង់ប្រូតេអ៊ីនសម្រាប់ការរិចរិលយ៉ាងឆាប់រហ័ស (Papavassiliou et al ។ , 1992 ។; Jariel-Encontre et al ។ , 1997 ។; Acquaviva et al ។ , 2002 ។) ។ ឧទាហរណ៍វាត្រូវបានបង្ហាញថាការលាតសន្ធឹងនៃសំណល់ ∼21 ដែលមានវត្តមាននៅក្នុងអាយអេសប៊ីនៃប្រូតេអ៊ីនគ្រួសារទាំងអស់ប៉ុន្តែអវត្តមាននៅក្នុងΔFosBដើរតួជាដែនអស្ថិរភាពសម្រាប់ c-Fos (Acquaviva et al ។ , 2001 ។) ។ យើងបានរកឃើញថាទោះបីជាលំដាប់នេះស្រដៀងនឹងអស្ថិរភាពអេហ្វអូប៊ី (ប្រវែងពេញ) ក៏ដោយ។ខាឡិន et al ។ , 2004 ។) អវត្តមាននៃដែននេះនៅក្នុងΔFosBមិនរាប់បញ្ចូលទាំងស្ថេរភាពរបស់វាទេ។ ផ្ទុយទៅវិញការរួមបញ្ចូលគ្នានៃការអវត្តមាននៃដែនអេកថេនសនេះនិងផូស្វ័រសឺរអេសអិលអេសអេសហាក់ដូចជាមានភាពពេញលេញចំពោះភាពខុសគ្នាប្រហែលប្រាំដងនៃស្ថេរភាពរវាងΔFosBនិង FosB ។

ទោះបីជាការរិចរិលនៃប្រូតេអ៊ីនគ្រួសារអេហ្វសមានភាពស្មុគស្មាញនិងមិនយល់ពេញលេញក៏ដោយក៏ការថយចុះនៃប្រូតេអ៊ីន proteasomal ហាក់ដូចជាមាគ៌ាសំខាន់មួយដែលពាក់ព័ន្ធ (Salvat et al ។ , 1999 ។; Acquaviva et al ។ , 2002 ។; Ferrara et al ។ , 2003 ។) ។ ទិន្នន័យដែលបានបង្ហាញនៅទីនេះដែលអ្នករារាំង proteasomal មិនផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងខ្លាំងនូវអត្រានៃការរិចរិលរបស់ ,FosB ដោយជំទាស់ថាមិនដូចប្រូតេអ៊ីនគ្រួសារ Fos ដទៃទៀតΔFosBគេចចេញពីសារធាតុប្រូតេអ៊ីន 26S ហើយនេះដើរតួនាទីសំខាន់ក្នុងស្ថេរភាពរបស់វា។ ហេតុដូច្នេះហើយយើងស្នើសុំគ្រោងការណ៍មួយដែលស្ថេរភាពប្រសើរឡើងនៃΔFosBគឺអាចមកពីការរួមបញ្ចូលគ្នានៃកត្តាសំខាន់ពីរគឺៈ (1) អវត្តមាននៃដែនអស្ថិរភាព C - ស្ថានីយនិង (2) phosphorylation នៃ S27 ដោយ CK2 ។

សរុបសេចក្ដីមកការសិក្សានាពេលបច្ចុប្បន្ននេះផ្តល់នូវការយល់ដឹងផ្នែកមេកានិចអំពីមូលហេតុដែលΔFosBដែលជាផលិតផលនៃហ្សែនដំបូង។ fosBគឺមិនដូចសមាជិកគ្រួសារហ្វុសទាំងអស់ដែលជាប្រូតេអ៊ីនមានអាយុកាលយូរទេ។ ទោះបីជាប្រូតេអ៊ីនគ្រួសារហ្វុសផ្សេងទៀតត្រូវបានគេគិតថាអាចធ្វើសំរបសំរួលបានយ៉ាងលឿនប៉ុន្តែការបញ្ជូនឆ្លងចរន្តរំញោចជាបណ្តោះអាសន្ន (Morgan និង Curran, 1995 ។) ស្ថេរភាពដែលទាក់ទងនៃΔFosBផ្តល់ឱ្យវានូវសមត្ថភាពក្នុងការសម្រុះសម្រួលការផ្លាស់ប្តូរប្រតិចារិកយូរអង្វែងដែលបណ្តាលមកពីការរំញោចរ៉ាំរ៉ៃ។ នេះគាំទ្រដល់ទស្សនៈដែលថាΔFosBដើរតួជាម៉ូលេគុលម៉ូលេគុលដែលមានស្ថេរភាពនៅក្នុងខួរក្បាលផ្លាស់ប្តូរការឆ្លើយតបស្រួចស្រាវទៅជាការបន្សាំរ៉ាំរ៉ៃបន្តិចម្តង ៗ ។ ការកំណត់អត្តសញ្ញាណផូស្វ័រសឺរ៉ូអេសអេសអេសជាយន្តការកណ្តាលសម្រាប់ស្ថេរភាពΔFosBបើកចំណូលថ្មីសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍមធ្យោបាយធ្វើនិយ័តកម្មមុខងារ osFosB និងសម្រួលផលប៉ះពាល់រយៈពេលវែងរបស់វាលើប្លាស្ទិកសរសៃប្រសាទនិងអាកប្បកិរិយា។

ផ្នែកមុន ផ្នែកបន្ទាប់

លេខយោង

បានទទួលខែវិច្ឆិកា 21, 2005 ។
ការពិនិត្យឡើងវិញបានទទួលនៅខែកុម្ភៈ 21, 2006 ។
បានទទួលយកខែមេសា 2, 2006 ។

ការងារនេះត្រូវបានគាំទ្រដោយសម្ព័ន្ធភាពជាតិសម្រាប់ការស្រាវជ្រាវអំពីជំងឺហ្ស៊ីហ្សូហ្វីនៀនិងពានរង្វាន់អ្នកស៊ើបអង្កេតវ័យក្មេងផ្នែកជំងឺធ្លាក់ទឹកចិត្តដល់ភី។ អាយ។ អេ។ អេ។ អេ។ អិន។ អិនអិនអិនអិនអិនអិនអិនអិនអិនអិន។ សូមអរគុណលោកបណ្ឌិត James Bibb ដែលបានជួយគាត់។ នៅក្នុង vitro phosphorylation អះអាងថាវេជ្ជបណ្ឌិតមីង - ហួហានសម្រាប់ជំនួយរបស់គាត់ក្នុងការរៀបចំចំណិតខួរក្បាលដែលត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការដាក់ស្លាកមេតាប៉ូលីសនិងវេជ្ជបណ្ឌិតរ៉ាជែលណេសសម្រាប់ជំនួយរបស់នាងជាមួយនឹងការវេចខ្ចប់ HSVs ដែលត្រូវបានផ្សំ។
អាស័យដ្ឋានបច្ចុប្បន្នរបស់ G. Rudenko៖ វិទ្យាស្ថានវិទ្យាសាស្ត្រជីវិតនិងដេប៉ាតឺម៉ង់ឱសថសាស្ត្រ, សាកលវិទ្យាល័យមីឈីហ្គែន, ផ្លូវលេខ ២១០ វ៉េតថូវលេខ ៣១៦៣A, អានអានអាបឺ, មីអាយ ៤៨១០៩-២២១៦ ។
ការឆ្លើយឆ្លងគួរតែត្រូវបានផ្ញើទៅអេរិចជេនេស្ទឺរ, 5323 ហែនហេលមហាវិថី, ក្រុងដាឡាស, TX 75390-9070 ។ អ៊ីមែល៖ [អ៊ីមែលការពារ]

ផ្នែកមុន

ឯកសារយោង

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) ការកំណត់អត្តសញ្ញាណនៃគំនូរត្រីចក្រយានយន្ត C-ស្ថានីយដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការគ្រប់គ្រងការរិចរិលរបស់ប្រូតេអ៊ីនដែលមានល្បឿនលឿននៃស៊ី - អេសស្តូ - ស្កូស្ទីនក្នុងអំឡុងពេលផ្លាស់ប្តូរដំណាក់កាល G (0) -to-S ។ oncogene 20:7563-7572 ។

អរូបី

សេចក្តីផ្តើម

សំភារៈ​និង​វិធី​សា​ស្រ្ត

ខ្សែកោសិកាម៉ាំម៉ាននិងឌីអិនអេបង្កើត។

ការពិសោធន៍ជីពចរ។

សត្វនិងការព្យាបាលការប្រកាច់អេឡិចត្រូលីតរ៉ាំរ៉ៃ។

32 ការដាក់ស្លាកមេតាប៉ូលីស។

គីមីនិងការព្យាបាលវប្បធម៌កោសិកា។

opFosB ប្រព័ន្ធការពារភាពស៊ាំការការពាររាងកាយនិងការធ្វើស្វ័យប្រវត្តិ។

ការបញ្ចេញជាតិខ្លាញ់និងការបន្សុទ្ធសារធាតុបំប៉ន recomFosB ពីកោសិកាសត្វល្អិត។

in vitro ការសិក្សាផូស្វ័រ។

ផែនទី phosphopeptide វិមាត្រនិងការវិភាគអាស៊ីត phosphoamino ។

ផ្តួល CK2 si ដោយស៊ីអរអេអិន។

mutagenesis ដឹកនាំកន្លែង។

ជីវព័ត៌មានវិទ្យា។

បរិមាណទិន្នន័យការគណនានិងស្ថិតិ។

លទ្ធផល

ΔFosBគឺជាកត្តាចម្លងមិនទៀងទាត់។

ΔFosBគឺជា phosphoprotein នៅក្នុងខួរក្បាល។

CK2 ប៉ុន្តែមិនមានផូស្វ័រផូស្វ័រ CaFosB ទេ។ នៅក្នុង vitro

CK2 ធ្វើត្រាប់តាមផូស្វ័រនិងស្ថេរភាពΔFosBនៅក្នុងកោសិកាដែលនៅដដែល។

phosphorylates CK2 osphFosB នៅលើ Ser27 ។

Phosphorylation នៃ Ser27 ធ្វើនិយ័តកម្មស្ថេរភាពΔFosB។

phosphorylation Ser27 មានស្ថេរភាពΔFosBដោយការពារការរិចរិលរបស់វា។

ការពិភាក្សា

លេខយោង

ឯកសារយោង

អត្ថបទដកស្រង់អត្ថបទនេះ

តំណ​ភ្ជាប់​រហ័ស

សំភារៈនិងវិធីសាស្រ្ត

³² ការដាក់ស្លាកមេតាប៉ូលីស។

តំណភ្ជាប់រហ័ស