Dopamino D2 receptoriai priklausomybei priklausančioje atlygio disfunkcijoje ir kompulsinis valgymas nutukusioms žiurkėms (2010)

Komentaras: Šis tyrimas rodo, kad kai gyvūnui suteikiama neribota prieiga, stiprus natūralus stiprintuvas (labai stimuliuojantis maistas) gali sukelti D2 receptorių sumažėjimą. Šis sumažėjimas buvo pastebėtas beveik visoms žiurkėms ir įvyko gana greitai. Kai buvo pašalintas „labai skanus“ maistas, žiurkės atsisakė valgyti įprastą maistą. Žiurkės ir toliau persivalgė (kai galėjo), nepaisant elektros šoko sujungimo su „labai skanaus“ maisto vartojimu.

• Visas tyrimas

Nat Neurosci. 2010 gegužė; 13(5): 635-641. Paskelbta internete 2010 kovas 28. doi:  10.1038 / nn.2519

Abstraktus

Mes nustatėme, kad nutukimo vystymasis buvo susijęs su laipsniškai blogėjančiu nervų atlygio atsako trūkumu. Panašūs atlygio homeostazės pokyčiai, kuriuos sukelia kokainas ar heroinas, yra laikomi labai svarbiais, skatinančiais perėjimą nuo atsitiktinio prie priverstinio narkotikų vartojimo. Atitinkamai, mes aptikome nutukusių, bet ne liesų žiurkių į kompulsyvų panašų maitinimosi elgesį, išmatuotą kaip skanų maisto vartojimą, kuris buvo atsparus aversyvaus sąlyginio dirgiklio sutrikimams. Nutukusių žiurkių striataliniai dopamino D2 receptoriai (D2R) buvo sumažėję, kaip buvo pranešta nuo narkotikų priklausomiems žmonėms. Be to, lentiviruso sukeltas striatalinių D2R numušimas greitai paspartino į priklausomybę panašaus atlygio trūkumo atsiradimą ir į kompulsinį panašaus maisto ieškojimą žiurkėms, turinčioms platesnę prieigą prie skanaus riebaus maisto. Šie duomenys rodo, kad per didelis skanaus maisto vartojimas sukelia į priklausomybę panašias neuroadaptyvias reakcijas smegenų atlygio grandinėse ir skatina kompulsinio valgymo vystymąsi. Todėl bendri hedoniniai mechanizmai gali būti nutukimo ir priklausomybės nuo narkotikų pagrindas.

Įvadas

Maitinimą įtakoja malonumas ir atlygis, o atlygio už maistą gavimas gali stipriai paskatinti vartojimą1, 2. Vis dėlto hedoniniai mechanizmai, prisidedantys prie nutukimo, lieka menkai suprantami. Hiperfaginiams žmonėms, turintiems įgimtą leptino trūkumą, aktyvumas nugaros ir ventraliniame striatumoje, kurie yra pagrindinės smegenų atlygio grandinių sudedamosios dalys, pastebimai padidėja reaguojant į maisto vaizdus3, o pakaitinė leptino terapija susilpnina ir striatalinį aktyvumą, ir jų pačių praneštą „mėgimą“ maistu3. . Tai rodo, kad striatumas yra svarbus šėrimo elgesio hedoniniuose aspektuose. Neseniai buvo įrodyta, kad nutukusių asmenų striatumo aktyvacija, reaguojant į labai skanų maistą, yra silpnesnė, palyginti su liesomis kontrolėmis4. Be to, nugaros striatumo hipofunkcija ir ilgalaikis svorio padidėjimas yra ryškiausias asmenims, turintiems DRD2 – ANKK1 geno lokuso TaqIA alelį, dėl kurio sumažėja D2R ekspresija juostoje ir, kaip buvo įrodyta, asmenys yra linkę į priklausomybės nuo medžiagų sutrikimus4, 5 Dėl šių ir panašių pastebėjimų buvo pasiūlyta, kad atlygio apdorojimo trūkumas gali būti svarbus nutukimo išsivystymo rizikos veiksnys ir kad nutukę asmenys gali priverstinai vartoti skanų maistą, kad kompensuotų mažą jautrumą atlygiui6. Pažymėtina, kad neaišku, ar atlygio apdorojimo trūkumai yra konstituciniai ir yra prieš nutukimą, ar per didelis skanaus maisto vartojimas gali sukelti atlygio disfunkciją ir taip prisidėti prie dietos sukelto nutukimo.

Ypatinga antsvorio ir nutukusių asmenų savybė yra ta, kad jie ir toliau persivalgo, nepaisant gerai žinomų neigiamų pasekmių sveikatai ir socialiniams poreikiams. Iš tiesų, daugelis antsvorio turinčių asmenų išreiškia norą apriboti savo maisto vartojimą, tačiau stengiasi kontroliuoti savo suvartojamą kiekį ir pakartotinai suvartoja daugiau nei jiems reikia energijos7, 8. Maitinimo elgsenos, nejautrus neigiamiems rezultatams, vystymasis yra analogiškas pastebėtam priverstiniam narkotikų vartojimui. narkomanams, o tai taip pat yra atspari neigiamoms pasekmėms9. Čia mes ištyrėme išplėstinės prieigos prie skanios riebios dietos poveikį žiurkių smegenų atlygio sistemų jautrumui. Taip pat ištyrėme ryšį tarp dietos sukeltos hedoninės disreguliacijos ir kompulsinio maisto ieškojimo atsiradimo. Galiausiai, mes ištyrėme striatalinių D2R vaidmenį šiose priklausomybę primenančiose elgesio reakcijose.

Į priklausomybę panašus atlygio trūkumas nutukusioms žiurkėms

Norėdami patikrinti apribotos ar ilgos prieigos prie skanios riebios dietos poveikį, paruošėme Wistar žiurkių patinus (300–350 g) su bipoliniu stimuliuojančiu elektrodu šoninėje pagumburio dalyje ir 10–14 dienų treniravome juos atskiru bandymu. srovės slenksčio smegenų stimuliavimo atlygio (BSR) procedūra, kol bus nustatyti stabilūs atlygio slenksčiai4. Atliekant BSR procedūrą, žiurkės energingai reaguoja, kad gautų naudingą elektrinį savęs stimuliavimą per viduje esantį stimuliuojantį elektrodą su minimaliu stimuliacijos intensyvumu, kuris palaiko savęs stimuliavimo elgesį, vadinamą atlygio slenksčiu10. Kadangi atlygio slenksčiai išlieka stabilūs ir nesikeičia ilgą laiką pradinėmis sąlygomis, ši procedūra yra jautrus smegenų atlygio sistemų atsako matas. Nustačius stabilias BSR ribas (apibrėžtas kaip <10% slenksčių kitimas per tris seansus iš eilės), mes suskirstėme žiurkes į tris grupes, kurių vidutinis kūno svoris ar atlygio slenksčiai tarp grupių nesiskyrė. Trims grupėms buvo suteikta skirtinga prieiga prie „kavinės tipo“ dietos, kurią sudaro skanus, daug energijos turintis maistas, lengvai prieinamas žmonėms (žr. „Internetiniai metodai“). Žiurkės turėjo 0 val. (tik valgančios žiurkės; n = 9), 1 val. (ribotos prieigos žiurkės; n = 11) arba 18–23 valandas (išplėstinės prieigos žiurkės; n = 11) galėjo gauti dietos per dieną. 40 dienų iš eilės. Yra žinoma, kad valgyklos dietos sukelia dietos sukeltą žiurkių nutukimą11. Visos žiurkės taip pat turėjo galimybę ad libitum gauti standartinį laboratorinį maistą, užregistravus atlygio slenksčius, svorio padidėjimą ir suvartojamų kalorijų kiekį.

Žiurkių, turinčių ilgesnę prieigą prie valgyklos dietos, svoris žymiai padidėjo, palyginti su grupėmis, kuriose buvo tik maistas arba ribota prieiga (1a pav.). Ribotos prieigos žiurkių svoris taip pat turėjo tendenciją didėti, palyginti su žiurkėmis, kurios tik maitinamos, tačiau šis poveikis nepasiekė statistinio reikšmingumo. Nutukimo išsivystymas išplėstinės prieigos žiurkėms buvo glaudžiai susijęs su blogėjančiu smegenų atlygio funkcijos trūkumu, atsispindinčiu laipsniškai didėjančiomis BSR slenksčiais (1b pav.). Kadangi BSR atsako delsos skirtumų tarp trijų grupių nepastebėta (papildomas 1 pav.), elgsenos trūkumai negali paaiškinti šio stebėjimo. Buvo pranešta apie panašų smegenų atlygio funkcijos trūkumą žiurkėms, kurios ilgą laiką, bet neapsiribojo, gali savarankiškai švirkšti į veną kokaino ar heroino12, 13, 14. Taigi ilgesnė galimybė gauti skanaus riebaus maisto gali sukelti į priklausomybę panašų smegenų atlygio funkcijos trūkumą. , laikomas svarbiu motyvacijos šaltiniu, kuris gali paskatinti persivalgymą ir prisidėti prie nutukimo vystymosi1, 6.

1 paveikslas: Svorio padidėjimas ir atlygio disfunkcija žiurkėms, turinčioms išplėstinę prieigą prie valgyklos dietos.

a) Vidutinis (± sem) svorio padidėjimas žiurkėms, turinčioms tik maistą, ribotą prieigą ir išplėstą prieigą (prieiga × dienos sąveika: F39,702 = 7.9, P < 0.0001; *P < 0.05, palyginti su grupe, kuriai leidžiama tik valgyti, post hoc testas). (b) Vidutinis (± sem) procentinis pokytis nuo pradinių atlygio slenksčių (prieigos × laiko sąveika: F78,1092 = 1.7, P < 0.0005; *P < 0.05, palyginti su grupe, kurioje buvo tik maistas, post hoc testas).

Išsamiai išnagrinėję šėrimo elgesį (2 pav.), nustatėme, kad bendras paros kalorijų kiekis buvo panašus tarp žiurkių, kurios maitina tik maistą, ir ribojamą prieigą (2a, d pav.). Priešingai, bendras kalorijų suvartojimas žiurkėms, turinčioms išplėstą prieigą, buvo beveik dvigubai didesnis nei žiurkių, turinčių ribotą prieigą ir tik šeriamų žiurkių (2a, d pav.). Nors riboto patekimo ir tik šeriamos žiurkės išlaikė maždaug tokį patį dienos kalorijų kiekį (2a, d pav.), ribotos prieigos žiurkės gaudavo tik ~ 33 % savo dienos kalorijų iš čiaudo (2b, d pav.), o tai rodo, kad Jie šėrimo įpročiai buvo panašūs į persivalgymą ir suvartojo ~ 66 % savo dienos kalorijų normos per 1 val. maitinimosi dietą15 (2d pav.). Išplėstinės prieigos žiurkės gaudavo tik nedidelę dalį (~5 %) viso suvartojamų kalorijų iš čiaudo (2b pav.); jie vartojo beveik vien kavinės dietą (2d pav.). Ribotos ir išplėstinės prieigos grupėse mitybos pirmenybės pokytis taip pat atsispindėjo žymiai padidėjusiame riebalų suvartojime, palyginti su žiurkėmis, maitinančiomis tik maistą (2c pav. ir 2 papildomas pav.). Remiantis ankstesnėmis ataskaitomis16, buvo tendencija, kad žiurkių, turinčių didelę prieigą prie kavinės, valgymas laikui bėgant mažėjo. Tai gali reikšti, kad laikui bėgant išsivysto tolerancija maisto produktų, pateikiamų kaip valgyklos dietos dalis, skoniui. Nepaisant to, šios žiurkės nuolat teikė pirmenybę kavinės dietai, o ne standartiniam maistui (papildomas 3 pav.). Šie duomenys rodo, kad ilgesnė, bet neapribota prieiga prie skanios riebios dietos sukelia priklausomybę primenantį atlygio deficitą, persivalgymą ir homeostatinės energijos balanso praradimą. Priešingai, ribota prieiga prie skanaus maisto sukelia į persivalgymą panašius vartojimo modelius, tačiau nepažeidžia homeostatinės energijos balanso ar smegenų atlygio funkcijos. Tačiau gali būti, kad apribota prieiga prie valgyklos dietos daugiau nei 40 dienų iš eilės sukeltų didelį svorio padidėjimą ir smegenų atlygio funkcijos sutrikimą.

2 pav. Žiurkių, turinčių platesnę prieigą prie valgyklos dietos, vartojimo modeliai.

a) Vidutinis (± sem) dienos kalorijų suvartojimas žiurkėms, turinčioms tik maistą, ribotos prieigos ir išplėstinės prieigos × laiko sąveika: F1,324 = 100.6, P < 0.0001; *P < 18,324, palyginti su tik čiaudo grupe, post hoc testas). (b) Vidutinis dienos kalorijų suvartojimas (± sem) iš čiaudo (prieiga: F7.8 0.0001 = 18,324, P < 4.6; laikas: F0.0001 0.05 = 2,504, P < 349.1; prieigos × laiko sąveika: F0.0001 18,504 = 5.9, P < 0.0001; *P < 36,504, palyginti su tik čiaudo grupe, post hoc testu). c) Vidutinis dienos kalorijų suvartojimas (± sem) iš riebalų (prieiga: F3.52 0.0001 = 0.05, P < 2,486; laikas: F118.7 0.0001 = 18,486, P < 8.8; prieigos × laiko sąveika: F0.0001 36,486 = 6.2, P < 0.0001; *P < 0.05, palyginti su tik čiaudo grupe, post hoc testu). d) Vidutinio (± sem) bendro suvartojamų kalorijų ir kalorijų, suvartotų tik iš maisto, palyginimas per visą 40 dienų prieigos laikotarpį (prieiga: F2,54 = 25.0, P < 0.0001; kalorijų šaltinis: F2,54 = 1235.2, P < 0.0001; prieiga × kalorijų šaltinio sąveika: F2,54 = 485.7, P < 0.0001; ***P < 0.001, palyginti su bendru kalorijų kiekiu tik čiaudo grupėje, ###P < 0.001, palyginti su bendru kalorijų kiekiu ta pati žiurkių grupė, post hoc testas).

Po 40 dienų žiurkėms nebebuvo leista gauti skanaus maisto, bet ir toliau ad libitum prieiga prie standartinio laboratorinio maisto. Per šį priverstinį „abstinencijos“ laikotarpį kasdien įvertinome atlygio slenksčius ir čiaudo suvartojimą. Atlygio slenksčių padidėjimas išliko mažiausiai 2 savaites žiurkėms, turinčioms ilgos prieigos, kai jos nebeturėjo galimybės gauti skanios dietos (3a pav.). Tai prieštarauja santykinai laikinam (~ 48 val.) atlygio funkcijos trūkumui, apie kurį pranešta žiurkėms, kurios susilaikė nuo savarankiškai vartojamo kokaino13. Per šį abstinencijos laikotarpį taip pat pastebimai sumažėjo suvartojamų kalorijų kiekis (3b pav.) ir laipsniškas kūno masės sumažėjimas (3c pav.) išplėstinės prieigos žiurkėms ir mažesniu mastu ribotos prieigos žiurkėms. Ankstesnės ataskaitos11, 15. Po 14 dienų abstinencijos žiurkės buvo nužudytos, o elektrodų padėtis buvo nustatyta dažant krezilo violetine spalva (3d pav.).

3 paveikslas: Nuolatinis atlygio disfunkcija ir hipofagija abstinencijos metu žiurkėms, turinčioms ilgesnę prieigą prie valgyklos dietos.

a) vidutinis procentinis pokytis nuo pradinių atlygio slenksčių (± sem) susilaikant nuo skanios riebios dietos (prieiga: F2,112 = 3.7, P < 0.05; laikas: F4,112 = 2.3, P > 0.05; *P < 0.05, palyginti su tik čiau grupe, post hoc testas). b) Vidutinis suvartojamų kalorijų kiekis (± sem) paskutinę riebios dietos vartojimo dieną (pradinis lygis) ir per 14 dienų abstinencijos, kai buvo galima valgyti tik standartinį maistą (prieiga: F2,168 = 41.7, P < 0.0001) ; laikas: F6,168 = 65.6, P < 0.0001; prieigos × laiko sąveika: F12,168 = 38.3, P < 0.0001; *P < 0.05, palyginti su grupe, kurioje buvo tik čiau, post hoc testas). c) Vidutinio kūno svorio (± sem) pokytis, palyginti su kūno svoriu paskutinę riebios dietos vartojimo dieną (pradinis) ir per 14 dienų abstinencijos, kai buvo galima gauti tik standartinį maistą (prieiga: F1,126). = 37.2, P < 0.0001; laikas: F7,126 = 3.1, P < 0.01; prieigos × laiko sąveika: F7,126 = 40.9, P < 0.0001; *P < 0.05, palyginti su grupe, kurioje buvo tik maistas, post hoc testas). (d) BSR stimuliuojančių elektrodų vietos histologinė rekonstrukcija tik čiaudo (trikampiai), ribotos prieigos (kvadratai) ir išplėstinės prieigos (apskritimai) žiurkių šoniniame pagumburyje.

Nutukusių žiurkių striataliniai D2R: vaidmuo atlygio deficite

Toliau išbandėme hipotezę, kad per didelis skanios kavinės dietos vartojimas gali sumažinti striato D2R tankį ir taip prisidėti prie į priklausomybę panašaus atlygio hipojautrumo išsivystymo. Naujai žiurkių, turinčių tik maistą, ribotos prieigos ir išplėstinės prieigos žiurkių grupei, buvo leista maitinti valgyklą tol, kol statistiškai reikšmingai nepadidėjo išplėstinės prieigos žiurkių kūno svoris, palyginti su tik čiaudo grupe (P < 0.05 4a pav.). Pranešama, kad stipriai glikozilintos (~ 70 kDa) su membrana surištos D2R formos striatinė ekspresija buvo mažesnė žiurkėms, turinčioms išplėstinę prieigą, nei žiurkių, turinčių ribotą prieigą arba tik maitinimą (4b pav.; žr. internetinius metodus). Kai kiekvienos prieigos grupės žiurkes suskirstėme į du pogrupius pagal vidutinį kūno svorio pasiskirstymą (lengvą ar sunkųjį), nustatėme aiškų atvirkštinį ryšį tarp kūno svorio ir juostinio D2R ekspresijos (4a, c pav.). Neaptikome statistiškai reikšmingo neglikozilinto nesubrendusio (~39 kDa) ir vidutiniškai glikozilinto citoplazminio (~51 kDa) D2R formų ekspresijos sumažėjimo (papildomas 4 pav.)17, o tai rodo, kad ilgos prieigos žiurkėms tikriausiai yra D2R ekspresija. reguliuojami potranskripcijos mechanizmais.

4 pav. Svorio padidėjimas yra atvirkščiai susijęs su striataliniu D2R lygiu.

a) Tik čiaudo, ribotos prieigos ir išplėstinės prieigos žiurkės buvo suskirstytos į dvi grupes pagal prieigos sąlygą, remiantis vidutiniu kūno svorio padalijimu: lengvos (L) arba sunkios (H). ( b ) Visas striatalinis kompleksas buvo paimtas iš visų žiurkių ir D2R lygiai kiekvienoje grupėje, išmatuoti Western blot metodu. Su membrana susijusi D2R juosta buvo atskirta esant 70 kDa, o baltymų įkrovimo kontrolė rodoma žemiau (β-aktinas, 43 kDa). Viso ilgio imunoblotai pavaizduoti papildomame 12 paveiksle. (c) Santykiniai D2R kiekiai tik šeriamų, ribotos prieigos ir išplėstinės prieigos žiurkių striatumoje buvo kiekybiškai įvertinti densitometrijos metodu (F2,6 = 5.2, P < 0.05, pagrindinis). prieigos efektas; *P < 0.05 ir **P < 0.01, palyginti su tik chow-L grupe).

Be to, norėdami patikrinti dietos sukelto striatalinio D2R sumažėjimo funkcinę svarbą smegenų atlygio funkcijai, sukūrėme ir patvirtinome lentivirusinį vektorių, kuris pristatytų trumpą plaukų segtuką trukdančią RNR (shRNR), kad numuštų D2R (Lenti-D2Rsh; 5 pav.). 5 ir papildomas 2 pav.). Žiurkių, gydytų Lenti-D14Rsh, atlygio slenksčiai pradėjo didėti beveik iš karto po to, kai joms buvo leista pratęsti prieigą prie valgyklos dietos, o atlygio slenksčiai išliko nepakitę ilgos prieigos žiurkėms, gydomoms tuščiu lentiviruso vektoriumi (Lenti-control) per palyginti trumpą laikotarpį. galimybės laikytis kavinės dietos (6 d; 6a pav.). Abiejų žiurkių grupių atsako delsos nepakito, o tai rodo, kad šis poveikis nebuvo antrinis dėl užduočių atlikimo trūkumų (papildomas 2 pav.). Atlygio slenksčiai taip pat nepakito žiurkėms, kurios buvo gydomos Lenti-D6Rsh arba Lenti-control ir kurios turėjo galimybę valgyti tik per tą patį laikotarpį (XNUMXb pav.).

Slenksčiai išliko nuolat aukšti per papildomas 15 dienų abstinencijos, kai visos žiurkės turėjo prieigą tik prie standartinio maisto (papildomas 7 pav.). Todėl striatalinio D2R numušimas padidino pažeidžiamumą dėl dietos sukeltos atlygio hipofunkcijos, bet nepakeitė pradinio smegenų atlygio sistemų aktyvumo.

5 pav. Lentiviruso sukeltas striatalinės D2R ekspresijos slopinimas.

a ) Grafinis striatalinių sričių, kuriose Lenti-D2Rsh buvo pernelyg išreikštas, vaizdas. Žali apskritimai kairiajame striataliniame pusrutulyje žymi vietas, į kurias buvo nukreiptos virusinės infuzijos. Žalias dažymas dešiniajame striataliniame pusrutulyje yra reprezentatyvus imunocheminis dažymas žaliam fluorescenciniam baltymui (GFP) iš Lenti-D2Rsh žiurkės smegenų. b ) Reprezentatyvus sumažėjusios D2R ekspresijos imunoblotas Lenti-D2Rsh žiurkių striatumoje. Viso ilgio imunoblotai pavaizduoti papildomame 13 paveiksle. (c) Santykiniai D2R kiekiai Lenti-kontrolinės ir Lenti-D2Rsh žiurkių striatumoje, kiekybiškai įvertinti densitometrijos metodu (*P < 0.05, palyginti su Lenti kontroline grupe, post hoc testu). ). ( d ) Lenti-D2Rsh vektoriaus striatumo glialinių ląstelių infekcija nebuvo aptikta. Žalias dažymas yra GFP nuo viruso; raudona yra astrocitų žymeklis glial fibrillary acidic protein (GFAP); ląstelių branduoliai yra paryškinti DAPI dažymu mėlyna spalva. Baltos rodyklės rodo lokalizuotą gliozės sritį, kuri randama tik viruso injekcijos vietoje striatum, o ne aplinkiniuose audiniuose, į kuriuos virusas pasklido. Net ir šioje srityje nė vienas astrocitas nėra teigiamas GFP. Geltonos rodyklės padidintame vaizde pabrėžia tipiškus GFP neigiamus astrocitus, kurie buvo aptikti. (e) Didelis neuronų infekcijos lygis striatumoje dėl Lenti-D2Rsh vektoriaus. Žalias dažymas yra GFP nuo viruso; raudona yra neuronų branduolio žymeklis NeuN; ląstelių branduoliai yra paryškinti DAPI dažymu mėlyna spalva. Geltonos rodyklės padidintame vaizde pabrėžia GFP teigiamus ir NeuN teigiamus neuronus striatumoje. ( f ) Virusiniu būdu užkrėsto (GFP teigiamo) neurono Lenti-D2Rsh žiurkių striatum didesnio padidinimo vaizdas, rodantis tipiškas vidutinių dygliuotų neuronų morfologines ypatybes.

6 paveikslas: Striatalinio D2R numušimas padidina žiurkių, turinčių ilgesnę prieigą prie valgyklos dietos, pažeidžiamumą, kad būtų atlyginta už disfunkciją.

(a) Vidutinis (± sem) procentinis pokytis nuo pradinio atlygio slenksčio Lenti-control ir Lenti-D2Rsh žiurkėms, kurios 14 dienų iš eilės pratęsė galimybę valgyti kavinėje (virusas: F1,156 = 5.9, P < 0.05; laikas: F13,156 = 2.2, P < 0.05; viruso × laiko sąveika: F13,156 = 2.2, P < 0.05; #P < 0.05, sąveikos efektas). (b) Vidutinis (± sem) procentinis pokytis nuo pradinio atlygio slenksčio Lenti-control ir Lenti-D2Rsh žiurkėms, kurios turėjo prieigą tik prie maisto. (c) Vidutinis (± sem) žiurkių suvartojamų kalorijų kiekis per 14 d. tik valgymo arba pratęstas prieiga (prieiga: F2,28 = 135.6, ***P < 0.0001). (d) Vidutinis (± sem) svorio padidėjimas per 14 d. tik valgymo arba pratęstos prieigos (prieiga: F2,28 = 96.4, P < 0.0001; ***P < 0.001, pagrindinis prieigos poveikis).

Mes nustatėme, kad suvartojamų kalorijų kiekis (6c pav.) ir svorio padidėjimas (6d pav.) buvo panašūs Lenti-D2Rsh ir atitinkamose Lenti-kontrolinėse grupėse tik čiaudo arba išplėstinės prieigos sąlygomis (papildomi 8 ir 9 pav.). Taigi, striatalinis D2R numušimas nepakeitė nei valgyklos dietos, nei bendro kalorijų kiekio, kai skanus maistas buvo laisvai prieinamas.

Nutukusių žiurkių kompulsinis valgymas: striatalinio D2R vaidmuo

Toliau išbandėme hipotezę, kad žiurkėms, turinčioms platesnę prieigą prie valgyklos dietos, gali atsirasti į kompulsinį valgymą panašus valgymas ir kad striatalinio D2R signalizacijos trūkumas gali prisidėti prie šio poveikio. Naujai žiurkių grupei, kurioms leidžiama tik valgyti, ribotos prieigos ir išplėstinės prieigos, buvo leista valgyti valgyklą > 40 d., kol statistiškai reikšmingai padidėjo prailgintų žiurkių svoris (P < 0.05, palyginti su žiurkėmis, kurioms leidžiama tik valgyti; duomenys ne parodyta). Tada visoms trims žiurkių grupėms buvo leista tik 30 minučių per dieną prie valgyklos dietos 5–7 dienas operacinėje kameroje, kol buvo pasiektas stabilus suvartojimas (apibrėžta kaip <10% dienos suvartojimo kitimas). Pusė žiurkių kiekvienoje prieigos sąlygoje buvo veikiama šviesa (sąlyginis stimulas), suporuotas su smūgiais pėdomis (nubausta grupė), o likusios kiekvienos grupės žiurkės buvo veikiamos signalo šviesos, nesant pėdos smūgio (nebaudžiama grupė). ). Bandymo dieną ištyrėme vien tik šviesos šviesos poveikį skanaus maisto vartojimui (7 pav.; žr. internetinius metodus). Mes nustatėme, kad vidutinis kalorijų suvartojimas per 30 minučių pradinius seansus buvo didesnis žiurkėms, turinčioms tik maistą ir ribotą prieigą, nei žiurkių, kurių prieiga yra išplėsta (7a, b pav.). Tai rodo, kad tik šeriamos ir ribotos prieigos žiurkės valgė skanų maistą per 30 minučių trukmės prieigos seansus, o tai atspindi faktas, kad šios žiurkės suvartodavo ~ 40–50 % savo dienos kalorijų normos, paprastai ~ 100 kCal. šių užsiėmimų metu (7a,b pav.). Priešingai, ilgos prieigos žiurkės atrodo atsparios šiam persivalgymui panašaus maitinimosi elgesiui, galbūt dėl ​​to, kad jų beveik neribotos galimybės gauti skanaus maisto daugiau nei 40 dienų iš eilės buvo nustatyti valgymo modeliai, kurie buvo gana nelankstūs keisti. Bandymo dieną nepastebėjome statistiškai reikšmingo signalo šviesos atkūrimo poveikio maisto vartojimui nebaudžiamoms žiurkėms iš tik šėlimo, ribotos prieigos arba išplėstinės prieigos grupių, palyginti su suvartojimu pradiniu laikotarpiu (7a pav.). Todėl vien tik signalinė lemputė neturėjo motyvacinės reikšmės. Nubaustoms žiurkėms šoko suporuota signalinė lemputė žymiai sumažino skanaus maisto suvartojimą žiurkėms, kurioms leidžiama valgyti tik maistą ir ribotą prieigą. Tačiau žiurkių, turinčių didelę prieigą, skoningam maistui signalo lemputė neturėjo jokios įtakos, o tai rodo, kad jų vartojimas buvo nejautrus nepalankioms aplinkos ženklams, prognozuojantiems nelaimę. Pradinis energijos suvartojimas išplėstinės prieigos žiurkėms buvo mažesnis nei kitose grupėse. Tačiau, kadangi čiaudo suvartojimas panašiais laikotarpiais buvo daug mažesnis (7d pav.), mažai tikėtina, kad tai reiškia „grindų efektą“, kuris supainioja mūsų išvadas. Kartu mūsų duomenys patvirtina idėją, kad žiurkėms, turinčioms ilgą prieigą, gali pasireikšti į kompulsyvą panašus valgymo elgesys, panašus į priverstinį kokaino vartojimą, pastebėtą žiurkėms, kurios ilgą laiką vartojo vaistą18.

7 pav. Į kompulsinį atsaką į skanų maistą.

a) Vidutinis (± sem) skanaus maisto suvartojimas nebaudžiamoms žiurkėms per 30 minučių pradinius seansus ir bandymo dieną, kai žiurkės buvo veikiamos neutraliu sąlyginiu dirgikliu, kuris anksčiau nebuvo susietas su kenksmingu pėdų šoku (prieiga: F2,20). = 5.2, P < 0.05; #P < 0.05, palyginti su žiurkėmis, kurios maitina tik maistą). (b) Vidutinis (± sem) skanaus maisto suvartojimas nubaustoms žiurkėms per 30 minučių pradinius seansus ir bandymo dieną, kai žiurkės buvo veikiamos sąlyginiu dirgikliu, kuris anksčiau buvo susietas su kenksmingu pėdų šoku (prieiga: F2,21 = 3.9). , P < 0.05; užuomina: F1,21 = 8.6, P < 0.01; prieiga × signalo sąveika: F2,21 = 4.7, P < 0.05; *P < 0.05, palyginti su suvartojimu per pradinį seansą, #P < 0.05, palyginti su žiurkės, maitinančios tik maistą). (c) Vidutinis (± sem) skanaus maisto suvartojimas per 30 minučių pradines sesijas ir bandymo dieną su Lenti-control ir Lenti-D2Rsh žiurkėmis, kurios anksčiau turėjo tik maitinimą arba ilgesnę prieigą prie valgyklos dietos (pažyma: F1,26, 29.7 = 0.0001, P < 0.05; *P < 0.01, **P < 30, palyginti su vartojimu pradinių seansų metu, post hoc testu). d) Vidutinis (± sem) šėriaus suvartojimas per 2 minučių pradines sesijas ir bandymo dieną su Lenti-control ir Lenti-D1,26Rsh žiurkėmis, kurios anksčiau turėjo tik maistą arba pratęsė galimybę valgyti valgykloje (pavyzdys: F44.9 = 0.0001, P < 0.05; *P < 0.01, **P < XNUMX, palyginti su vartojimu pradinių seansų metu, post hoc testu).

Galiausiai, mes ištyrėme su bausme susieto sąlyginio stimulo poveikį maisto suvartojimui Lenti-control ir Lenti-D2Rsh žiurkėms, kurios anksčiau turėjo galimybę valgyti tik maitinimą arba išplėstą prieigą prie valgyklos dietos (žiurkės iš 6 pav.). Mes nustatėme, kad pradinis skanaus maisto suvartojimas per 30 minučių pradines sesijas buvo panašiai didelis (~ 40 kCal) visose keturiose grupėse (7c pav.). Be to, bendras kasdienis maisto suvartojimas (namų narve) buvo panašus visose keturiose žiurkių grupėse kondicionavimo seansų metu ir bandymo dieną (papildomas 10 pav.). Todėl 14 d., prieš valgydami valgyklą, nepakako, kad būtų užblokuotas persivalgymo elgesys, panašus į tą, kuris buvo stebimas žiurkėms, kurios turėjo daugiau nei 40 d. prieigą prie valgyklos dietos (7a, b pav.). Aversyvus šviesos dirgiklis sutrikdė skanaus maisto suvartojimą Lenti-control ir Lenti-D2Rsh žiurkėms, kurios anksčiau turėjo prieigą tik prie valgymo (7c pav.). Panašiai aversinis sąlyginis dirgiklis sutrikdė skanų maistą Lenti kontrolinėse žiurkėse, kurios anksčiau turėjo 14 dienų ilgesnę prieigą prie valgyklos dietos. Priešingai, aversyvus sąlyginis stimulas neturėjo įtakos skanaus maisto vartojimui Lenti-D2Rsh žiurkėms, kurios anksčiau turėjo 14 dienų ilgesnę prieigą prie valgyklos dietos (7c pav.). Šioms žiurkėms BSR slenksčiai išliko žymiai aukštesni, kai buvo užfiksuoti praėjus 48 valandoms po bandymo sesijos, o kitose trijose žiurkių grupėse slenksčiai išliko stabilūs ir nepakitę.

(papildomas 11 pav.). Norėdami patikrinti, ar Lenti-D2Rsh išplėstinės prieigos žiurkių atsparumas sąlyginio dirgiklio sukeltam skanaus maisto suvartojimo slopinimui nebuvo antrinis dėl klasikinių kondicionavimo procesų sutrikimų, išbandėme aversinio sąlyginio dirgiklio poveikį mažiau skanaus standartinio maisto vartojimui. visos keturios žiurkių grupės. Priešingai nei valgant skanų maistą, mes nustatėme, kad visos keturios žiurkių grupės per 2 minučių pradinius seansus vartojo mažai maisto (~ 30 kCal) (7d pav.) ir visose keturiose grupėse valgymas buvo sutrikdytas. panašaus dydžio veikiant aversyviam sąlyginiam dirgikliui (7d pav.). Šie duomenys rodo, kad striatalinių D2R numušimas žymiai pagreitino į kompulsinį skanaus maisto valgymą, tačiau tik žiurkėms, kurioms anksčiau buvo suteikta daugiau galimybių. Be to, kadangi kompulsyvus valgymas buvo aptiktas tik Lenti-D2Rsh žiurkėms, kurioms buvo padidintos BSR slenkstinės ribos, dietos sukelta atlygio hipofunkcija gali būti būtinas prievartos maisto ieškojimo prielaidas.

Diskusija

Lengva prieiga prie skanaus riebaus maisto laikoma svarbiu aplinkos rizikos veiksniu nutukimui19. Mes nustatėme, kad ilgesnė prieiga prie labai skanios kavinės tipo dietos lėmė žiurkių persivalgymą ir svorio padidėjimą bei laipsniško BSR slenksčio didėjimą. Šį poveikį BSR slenksčiams galima paaiškinti laipsniškai mažėjančiu smegenų atlygio grandinių reagavimu, aiškinimu, atitinkančiu faktą, kad maisto apribojimas ir svorio netekimas gali padidėti20, o ūmus permaitinimas gali laikinai sumažėti21, reaguodamas į BSR žiurkėms. Šis atradimas yra darbo išplėtimas, rodantis, kad ūmus žiurkių permaitinimas per intragastrinį šėrimo vamzdelį21 ir skrandžio išsipūtimas arba gliukagono infuzija į veną, imituojanti po valgio sotumo jausmą22, 23, 24, sumažina atsaką už atlygį už šoninį pagumburio BSR ir padidina pasibjaurėjimą panašią reakciją į stimuliavimas25. Ankstesnis darbas taip pat parodė, kad pakartotinai maitinant žiurkes per intragastrinius zondelius, kol jų svoris padidėja ~ 200 g, taip pat sumažėja atsako į BSR dažnis, o šis poveikis išlieka tol, kol kūno svoris normalizuojasi23. Kaip ir šiuose žiurkių radiniuose, kačių atsaką į šoninį pagumburio BSR slopino ankstesnis maitinimas iki soties26, o tai rodo, kad smegenų atlygio funkcijos ir medžiagų apykaitos būklės sąveika yra išsaugota, todėl tikėtina, kad ji taip pat pasireikš ir žmonėms. Lengva prieiti prie valgyklų tipo dietos ir dėl to persivalgymas žmonių yra laikomas svarbiu aplinkos veiksniu, prisidedančiu prie dabartinės nutukimo epidemijos Vakarų visuomenėse19. Mūsų duomenys rodo, kad atlygio hipofunkcija atsiranda žiurkėms, kurios savo noru persivalgo skanią valgyklą, panašią į tą, kurią valgo žmonės, ir kad šis poveikis vis blogėja, kai jos priauga daugiau svorio. Pažymėtina, kad visų žiurkių, kurių atlygio slenkstis padidėjo ≥20%, BSR elektrodai buvo ~ 500 μm atstumu nuo fornix dorsolaterinio. Su atlygiu susijusių neuronų jautrumą šioje srityje padidina maisto ribojimas tokiu būdu, kuris yra jautrus riebalų kilmės hormonui leptinui, ir šis smegenų regionas laikomas svarbiu atlygio už maistą substratu27. Todėl smegenų grandines, reguliuojančias maisto hedoniką, slopina povalgio signalai, numatantys sotumo jausmą. Tai atitinka naujausius žmogaus vaizdavimo tyrimus, rodančius, kad skrandžio pūtimas28 ir žarnų kilmės po valgio faktoriaus peptidas YY3-36 (PYY)29 moduliuoja smegenų sričių aktyvumą. dalyvauja apdorojant atlygį. Be to, atlygio sistemas taip pat slopina per didelis svorio padidėjimas. Naujausi pranešimai rodo, kad cirkuliuojantis leptinas, pagrindinis energijos balanso reguliatorius, gali prasiskverbti į smegenų audinius ir slopinti atlygio grandinių veiklą3, 27, 30, 31.

Antsvorio turinčių žiurkių atlygio trūkumas gali atspindėti priešingai prisitaikantį smegenų atlygio grandinių pradinio jautrumo sumažėjimą, kad būtų išvengta pernelyg didelio jų stimuliavimo skaniu maistu. Tokia dietos sukelta atlygio hipofunkcija gali prisidėti prie nutukimo vystymosi, padidindama motyvaciją vartoti didelį atlygį turinčias „nutukusį“ dietas, kad būtų išvengta arba sušvelninta ši neigiamo atlygio būsena6, 32. Tai gali lemti hipofagiją, kurią stebėjome ilgesnės prieigos metu. žiurkėms ir mažesniu mastu ribotos prieigos žiurkėms, kai buvo pašalintas skanus maistas ir buvo galima gauti tik mažiau skanų maistą. Toks scenarijus taip pat atitinka duomenis, gautus iš žmogaus smegenų vaizdavimo tyrimų, kuriuose neryškus striatumo aktyvavimas reaguojant į labai skanų maistą, ypač asmenims, turintiems genetinių polimorfizmų, kurie, kaip manoma, mažina striatalinę D2R ekspresiją, yra susijęs su ilgalaikiu svorio padidėjimu4. Neaišku, ar toks nutukusių asmenų jautrumas atlygiui pasireiškė prieš nutukimo atsiradimą ir yra susijęs tik su genetiniais veiksniais („atlygio trūkumo sindromas“), ar persivalgymas gali sutrikdyti atlygio apdorojimą. Mūsų duomenys rodo, kad platesnė prieiga prie skanaus daug energijos turinčio maisto ir vėlesnis persivalgymas sumažina jautrumą, todėl gali būti svarbus hedoninis mechanizmas, skatinantis nutukimo vystymąsi. Panaši atlygio disfunkcija, kaip čia aprašyta nutukusioms žiurkėms, taip pat aptikta žiurkėms, kurios anksčiau ilgą laiką buvo vartojusios į veną kokaino ar heroino, bet ne toms, kurių prieiga buvo ribota12, 13, 14. Be to, perėjimas nuo Manoma, kad atsitiktinis ar kompulsinis narkotikų ieškojimas atsiranda dėl bandymo sušvelninti nuolatinį sumažėjusį atlygį, kurį sukelia šis narkotikų sukeltas atlygio sutrikimas12, 32, 33. Taigi, mūsų duomenys rodo, kad nutukimas ir priklausomybė nuo narkotikų gali turėti bendrų hedoninių mechanizmų.

Sumažėjęs striatalinės D2R ekspresijos reguliavimas yra pastebimas neuroadaptyvinis atsakas į per didelį skanaus maisto vartojimą. Iš tiesų, antsvorio turintiems asmenims2, 4 ir graužikams34, 35 pastebimas striatalinio D36R tankio sumažėjimas. Ir atvirkščiai, nervine anoreksija sergančių asmenų D2R37 yra padidėjęs, o nutukusių asmenų svorio netekimas po bariatrinės (skrandžio šuntavimo) operacijos yra susijęs su padidėjusį striatalinį D2R. . Dėl genų polimorfizmo, vadinamo TaqIA A28 aleliu, sumažėja striato D1R tankis, o šį alelį turintys asmenys yra per daug nutukusiose populiacijose2. TaqIA alelis taip pat padidina pažeidžiamumą priklausomybei nuo alkoholio, opioidų ir psichomotorinių stimuliatorių4. Todėl striatalinio D38R tankio sumažėjimas, atsirandantis dėl konstitucinių genetinių veiksnių arba dėl persivalgymo, gali prisidėti prie neurobiologinių nutukimo mechanizmų. Mes nustatėme, kad 2 kDa D70R izoformos, kuri, kaip manoma, atspindi su membrana susijusį D2R, lygiai buvo atvirkščiai susiję su kūno svoriu žiurkėms, priklausančioms tik maisto, ribotos prieigos ir išplėstinės prieigos grupės (2 pav.). Dėl striatalinės D4R ekspresijos, labiausiai pastebimos dorsolaterinėje juostoje (2 pav.), BSR slenksčiai padidėjo beveik iš karto po valgio dietos. Dėl to sumažėjusi striatinė D5R ekspresija greitai paspartino atlygio hipofunkcijos atsiradimą žiurkėms, turinčioms platesnę prieigą prie labai skanaus maisto, o tai atitinka žmogaus smegenų vaizdavimo duomenis, rodančius, kad striatalinio D2R tankio trūkumas prisideda prie atlygio nutukusių asmenų hipofunkcijos2.

Trys Lenti-D2Rsh žiurkių savybės taip pat vertos dėmesio. Pirma, nors striatalinis D2R numušimas kartu su išplėstine prieiga prie skanios dietos padidino BSR slenksčius, šių žiurkių kalorijų suvartojimas ar svorio padidėjimas, palyginti su kontrolinėmis žiurkėmis, nesiskyrė. Tai gali atspindėti faktą, kad žiurkės turėjo tik 14 dienų galimybę valgyti valgykloje; ilgesni prieigos laikotarpiai galėjo lemti didesnį svorio padidėjimą laikui bėgant, panašiai kaip ir didesnis jautrumas svorio padidėjimui, pastebėtas žmonėms, turintiems striatalinio D2R signalizacijos trūkumą4. Tačiau privalumas, apribojus prieigą prie valgyklos dietos iki 14 dienų, yra tas, kad numuštos žiurkės, turinčios išplėstą prieigą, buvo vienintelė grupė, kuriai buvo padidėjęs BSR slenkstis, ir tai leido mums įvertinti galimą atlygio hipofunkcijos vaidmenį kompulsinio sindromo vystymuisi. valgyti (žr. žemiau). Antra, BSR slenksčiai išliko stabilūs ir nepakito numuštoms žiurkėms, kurios turėjo prieigą tik prie čiaudo. Tai rodo, kad vien sumažėjusios striatalinės D2R ekspresijos nepakako, kad sukeltų atlygio hipojautrumą; vietoj to atrodė, kad tai sąveikauja su per dideliu skanaus maisto vartojimu, kad paspartintų šios sumažėjusio jautrumo atlygiui būsenos atsiradimą. Todėl kiti adaptyvūs atsakai smegenų atlygio grandinėse gali sukelti žiurkių, turinčių ilgesnę prieigą prie valgyklos dietos, hipojautrumą. Turėdami tai omenyje, pažymime, kad D2R agonistas bromokriptinas sumažina cirkuliuojančio leptino kiekį39, o leptinas bent iš dalies slopina maitinimąsi, nes slopina striato sritis, kurios kontroliuoja hedoninį atsaką į maistą3, 30, 31. Taigi gali būti, kad sumažėjęs striatalinis D2R, reaguodamas į didėjantį kūno svorį, padidina leptino signalizaciją ir taip sustiprina šio adipokino slopinamąjį poveikį smegenų atlygio sistemoms. Galiausiai pažymime, kad mes nukreipėme savo lentivirusinius vektorius į dorsolaterinį striatumą. Tai visų pirma buvo dėl techninių priežasčių, nes šoninis kaniulių išdėstymas viruso patekimui į striatumą leido taip pat pritaikyti viduje esantį pagumburio stimuliuojantį elektrodą BSR slenksčiui nustatyti. Taigi gali būti, kad D2R nukreipimas į numušimą kitose striatumo srityse, ypač dorsomedial ir ventralinėse srityse (branduolys accumbens šerdyje ir apvalkale), galėjo padidinti BSR slenksčius net ir nesant skanios dietos.

Dorsolaterinis striatumas buvo labai susijęs su stimulo ir atsako įpročio tipo mokymusi, o tai atsispindi visiško elgesio, kuris yra nejautrus devalvacijai, vystymasis, prieš tai maitinant iki soties arba susiejant su kenksmingais dirgikliais40. Nukreipdami daugiausia į dorsolaterinį striatumą, galėjome numušti D2R populiacijas, kurios reguliuoja žiurkės pažeidžiamumą į kompulsinį valgymą. Atsižvelgiant į striatalinio D2R vaidmenį kompulsyviame elgesyje, žmogaus DRD2 – ANKK1 geno lokuso TaqIA alelis, dėl kurio atsiranda mažas D2R tankis5, slopina striato aktyvaciją reaguojant į skanų maistą4 ir padidina pažeidžiamumą nutukimui4. mokymosi vengti veiksmų, turinčių neigiamų pasekmių, trūkumai41. Slopinamojo elgesio, kuris gali turėti neigiamų pasekmių, kontrolės praradimas yra būdingas nutukimo ir priklausomybės nuo narkotikų požymis, kai visiškas elgesys išlieka nepaisant neigiamų socialinių, sveikatos ar finansinių pasekmių. Žiurkių, kurios anksčiau vartojo daug narkotikų, kokaino vartojimo elgesys gali tapti nelankstus ir atsparus neigiamam sąlyginiam dirgikliui, kuris numato neigiamą rezultatą (pėdos šoką)18. Panašiai pelės, kurioms anksčiau buvo suteikta skani riebi dieta, daugiau laiko praleis priešingoje aplinkoje (šviesiai apšviestoje), kad gautų skanų maistą, nei pelės, kurios neturėjo tokios dietos patirties42. Mes nustatėme, kad skanaus maisto vartojimas žiurkėms, turinčioms platesnę prieigą prie kavinės dietos, buvo panašiai nejautrus aversiniam sąlyginiam stimului. Atsižvelgiant į striatalinių D2R vaidmenį šiame reiškinyje, į kompulsinį valgymą buvo rasta D2R numuštų žiurkių, kurios anksčiau turėjo 14 dienų pratęstą prieigą prie valgyklos dietos, bet ne kontrolinėse grupėse. Žvelgiant iš nervų grandinės perspektyvos, išplėstinė prieiga prie skanaus maisto gali sukelti kortikostrialinių takų plastiškumą, todėl gyvūnai tampa labiau pažeidžiami į kompulsinį elgesį, o striatalinio D2R signalo trūkumas sustiprina šį procesą. Iš tiesų, sumažėjęs striatalinis D2R tankis nutukusiems asmenims yra susijęs su sumažėjusiu metabolizmu prefrontalinėje ir orbitofrontalinėje žievės srityse43, kurios slopina elgesį44.

Pažymėtina, kad į kompulsyvą panašus skanaus maisto vartojimas buvo aptiktas tik žiurkėms, kurios anksčiau turėjo daugiau galimybių valgyti kavinėje, o ne kontrolinėse žiurkėse, kurios pratęsė galimybę valgyti kavinėje tą patį laikotarpį, nei žiurkėms, kurios anksčiau valgė kavinę. tik čiaudo prieiga. Pagrindinis skirtumas tarp numuštų žiurkių, turinčių anksčiau pratęstą prieigą, ir kitų grupių buvo jų nuolat pakilusios BSR slenksčiai. Tai gali atspindėti bendras neurobiologines atlygio hipofunkcijos kilmę ir į kompulsinį valgymą, kurie yra laikinai sutampantys, tačiau nepriklausomi reiškiniai. Kita vertus, dietos sukelta atlygio hipofunkcija gali būti neigiamo sustiprinimo substratas, kuris palengvina į kompulsinį valgymą panašaus valgymo vystymąsi14, 32, 33. Kad ir kokie būtų pagrindiniai mechanizmai, mūsų išvados rodo, kad nutukusiems žmonėms gali pasireikšti į priklausomybę panašus kompulsinis atsakas į skanų maistą. žiurkėms ir rodo, kad striatalinio D2R signalizacijos trūkumas padidina pažeidžiamumą šio elgesio vystymuisi.

Apibendrinant, mes nustatėme, kad per didelis smegenų atlygio sistemų stimuliavimas, per daug vartojant skanų, daug energijos turintį maistą, sukelia gilų atlygio jautrumo būseną ir į kompulsinį valgymą. Šios nutukusių žiurkių netinkamos elgsenos reakcijos tikriausiai atsiranda dėl dietos sukelto striatalinio D2R signalo trūkumo. Per didelis piktnaudžiavimo narkotikų vartojimas taip pat sumažina striatalų D2R tankį, sukelia gilų atlygio hipofunkcijos būseną ir skatina į kompulsinį narkotikų vartojimo elgesį. Todėl mūsų išvados patvirtina ankstesnius darbus4, 19, 42, 45, 46, 47, nurodant, kad nutukimas ir priklausomybė nuo narkotikų gali atsirasti dėl panašių neuroadaptyvių reakcijų smegenų atlygio grandinėse.

Metodai

Žiurkės.

Wistar žiurkių patinai, kurie eksperimento pradžioje svėrė 300–350 g, buvo gauti iš Charles River. Atvykusios žiurkės buvo laikomos atskirai pastovioje temperatūroje 12 valandų šviesos ir tamsos ciklu (šviesa įjungiama 2200 val.). Visą eksperimento laiką žiurkėms buvo leista ad libitum gauti standartinio laboratorinio maisto ir vandens. Visas procedūras patvirtino Scripps Floridos institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas, o žiurkės buvo gydomos pagal Nacionalinių sveikatos institutų nustatytas gaires dėl gyvūnų priežiūros principų.

Chirurginės procedūros.

Žiurkės, paruoštos su BSR stimuliuojančiais elektrodais, pirmiausia buvo anestezuotos įkvėpus 1–3% izoflurano deguonyje ir išdėstytos stereotaksiniame rėmelyje (Kopf). Bipoliniai BSR elektrodai (11 mm ilgio) buvo implantuoti į užpakalinį šoninį pagumburį (anteroposterior, -0.5 mm nuo bregmos; vidurinis, ±1.7 mm nuo vidurinės linijos; dorsoventralinis, 8.3 mm nuo kietojo kūno; smilkinio strypas buvo sureguliuotas iki 5 mm virš interaurinės linijos )47. Žiurkėms, kurioms buvo sušvirkštas virusas, taip pat buvo paruoštos dvišalės kreipiančiosios kaniulės (23 dydžio, 14 mm ilgio), esančios virš striatumo (priekinis užpakalinis, 2.8 mm nuo bregmos; vidurinis, ± 3.1 mm nuo vidurinės linijos; dorsoventralinis, -2.4 mm nuo kietosios žarnos)48 ir užpildytos. su 14 mm stiletais. Keturi nerūdijančio plieno kaukolės varžtai ir dantų akrilas laikė elektrodą ir kaniules savo vietoje. Chirurginė žaizda buvo gydoma vietiniais antibiotikais kartą per 12 valandų 5 dienas po operacijos. Žiurkėms buvo leista atsigauti po operacijos 7–10 dienų, o po to buvo apmokytos BSR slenksčio procedūros.

BSR procedūra.

Žiurkės buvo mokomos reaguoti į BSR stimuliaciją pagal atskirą bandomąją srovės slenksčio procedūrą, panašią į aprašytą kitur10, 14. Trumpai tariant, BSR srovės lygiai buvo keičiami kintamomis mažėjančiomis ir didėjančiomis serijomis 5 μA žingsniais. Kiekvienoje bandymo sesijoje buvo pateiktos keturios kintamos mažėjančios / didėjančios serijos. Kiekvienos serijos slenkstis buvo apibrėžtas kaip vidurio taškas tarp dviejų iš eilės einančių srovės stiprumų, į kuriuos žiurkės reagavo bent trijuose iš penkių bandymų, ir dviejų iš eilės einančių srovės stiprumų, į kuriuos žiurkės nereagavo trijuose ar daugiau iš penkių bandymų. Bendra sesijos riba buvo apibrėžta kaip keturių atskirų serijų slenksčių vidurkis. Kiekviena bandymo sesija truko maždaug 30 minučių. Stabilios BSR slenksčiai buvo apibrėžti kaip ≤10% slenksčių kitimas per 5 dienas iš eilės, paprastai nustatomi po 10–14 dienų treniruotės. Kiekvienos bandymo sesijos atsako delsa buvo apibrėžta kaip visų bandymų, kurių metu buvo gautas teigiamas atsakas, vidutinis atsako delsos laikas.

Virusinis pakavimas ir pristatymas.

Trumpo plaukų segtuko RNR buvo pristatyta ir konstituciškai išreikšta naudojant pRNAT-U6.2/Lenti vektorių sistemą (GenScript). Virusinės dalelės buvo paruoštos pagal gamintojo protokolą. Trumpai tariant, HEK 293FT ląstelės buvo transfekuotos vektoriumi, kuriame yra shRNR intarpas (5′-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-3′) arba tuščias vektorius, plius ViraPower Packaging Mix (h ViraPower Packaging Mix, pakeistas In72 after24). Tada supernatantas buvo surinktas ir sukoncentruotas ultracentrifuguojant (76,755 32 g, Beckman Coulter SW 90 TI rotorius, 4 min., 80 ° C), o viruso titras buvo nustatytas rūšiuojant ląsteles, suaktyvintas fluorescencija pagal gamintojo instrukcijas. Virusas buvo padalytas į alikvotas ir iki panaudojimo laikomas nuo šviesos apsaugotose dėžutėse –XNUMX °C temperatūroje.

Žiurkės, kurių BSR slenksčiai buvo stabilūs, gavo dvišales viruso injekcijas trijose kiekvieno smegenų pusrutulio striatumo vietose (2 μl vienai injekcijai, 1 μl min–1, 1 min tarp injekcijų, iš viso šešios injekcijos vienai žiurkei). Prieš atnaujinant BSR slenksčio vertinimą, žiurkėms buvo leista bent 2–3 dienas atsigauti po intrastrialinių injekcijų. Kasdienis BSR slenksčio vertinimas buvo tęsiamas 33 dienas po viruso injekcijų, siekiant užtikrinti, kad būtų pasiektas maksimalus striatalinis D2R numušimas prieš leidžiant žiurkėms valgyti kavinės dietą. Per šias 2 dienas nebuvo jokių BSR slenksčių skirtumų tarp Lenti-control ir Lenti-D33Rsh žiurkių (duomenys nerodomi).

Imunoblotingas.

Žiurkės buvo nužudytos praėjus maždaug 1 valandai po to, kai jos reguliariai valgė valgyklą, o smegenys buvo greitai pašalintos. Smegenų pjūviai, kurių storis ~1–2 mm, buvo paruošti naudojant vainikinę smegenų matricą (1 mm pjūvio intervalas; Plastics One) ant ledo bloko, ir buvo paimti nugaros striatumo (bregma: ~ 2.2–0.26 mm) audinių štampai. Striatalinių audinių štampai buvo greitai surinkti, greitai užšaldyti ir iki naudojimo laikomi –80 °C temperatūroje. Atskiri mėginiai buvo atšildyti ant ledo ir vienodi kiekiai striatalinio audinio buvo sujungti pagal nuo svorio priklausomą vidutinį prieigos grupių padalijimą (7–10 žiurkių viename telkinyje). Prieš homogenizavimą audinys buvo resuspenduotas 500 μl lediniame RIPA buferyje (Thermo Scientific), kuriame yra natrio ortovanadato, 1 ir 2 fosfatazės kokteilio inhibitorių (Sigma-Aldrich), leupeptino ir pepstatino. Audinių lizatai buvo virti 10 minučių mėginio buferyje ir įkelti į 4–20% arba 10% Tris-glicino SDS gelius (Invitrogen). Baltymai buvo perkelti į nitroceliuliozės membranas, užblokuoti 1 valandą ~ 23–25 ° C temperatūroje (5% neriebaus sauso pieno ir 0.2, 20% Tween-7.4 PBS, pH 4, 2) ir inkubuojami pirminiame antikūne per naktį 1 ° C temperatūroje. Šie pirminiai antikūnai buvo atskiesti blokiniu tirpalu: D100R pelės monokloninis (Santa Cruz, 1:200) arba β-aktino pelės monokloninis (Santa Cruz, 1:2,000). Chemiliuminescencinis ECL reagentas buvo pridėtas po inkubacijos su krienų peroksidaze konjuguotais antriniais antikūnais (Amersham, 2:70 17). Subrendusi membrana susijusi D49DR (~ 43 kDa) XNUMX, XNUMX forma buvo normalizuota iki baltymų įkrovimo kontrolės (β-aktinas; XNUMX kDa) ir kiekybiškai įvertinta densitometrija, naudojant NIH Image J programinę įrangą.

Imunocheminė analizė.

Žiurkės buvo anestezuotos ir transkardiališkai perfuzuotos 4% paraformaldehidu PBS (pH 7.6). Smegenys buvo pašalintos, fiksuotos per naktį ir mažiausiai 30 valandas laikomos sacharozėje (7.4% tirpalas PBS, pH 72, 30). Užšaldytos audinių dalys (3 μm storio) buvo paimtos iš mikrotomo ir blokuojamos (5% BSA, 0.3% normalaus ožkos serumo ir 100, 1% Triton X-23 PBS) 25 valandą ~ 4–1 ° C temperatūroje. Į blokinį tirpalą buvo pridėta šių pirminių antikūnų ir inkubuojama per naktį 1,000 °C temperatūroje: viščiukas polikloninis prieš GFP (Abcam, 1:1,000 1); triušis monokloniškai GFAP (Millipore, 1,000:23 25); pelės monokloninės į NeuN (Millipore, 488:1 1,000). Pjūviai buvo inkubuojami su fluorescenciniais dažais konjuguotais antriniais antikūnais ~594–1 °C temperatūroje: dažai prieš vištieną – 1,000 nm (Jackson ImmunoResearch, 594:1 1000), anti-triušis – 61 nm dažai (Invitrogen, 2:10, 100). ) ir anti-pelės XNUMX nm dažai (Invitrogen, XNUMX:XNUMX). Sekcijos buvo sumontuotos su Vectashield montavimo laikmenomis, turinčiomis DAPI (Vector Labs), ir uždengtos. Vaizdai buvo padaryti naudojant Olympus BXXNUMX fluorescencinį mikroskopą (× XNUMX objektyvas) arba Olympus konfokalinį mikroskopą (× XNUMX ir × XNUMX objektyvų).

Maitinimo procedūra.

Žiurkės buvo laikomos atskirai ant popierinės patalynės (alfa pagalvėlės; Shepherd Specialty Papers), kad maisto produktai nebūtų sutepti biriomis patalynės medžiagomis. Kavinės racioną sudarė šoninė, dešra, sūrio pyragas, pyragas, glaistas ir šokoladas, kurie buvo individualiai pasverti prieš pateikiant juos žiurkėms. Kavinės dietiniai maisto produktai buvo pristatomi mažose metalinėse talpyklose. Visi maisto produktai, įskaitant standartinį laboratorinį maistą, buvo dar kartą pasverti pasibaigus šėrimui. Įvairių makroelementų kalorijų kiekis buvo apskaičiuotas pagal gamintojo pateiktą informaciją apie maistingumą.

Užuominos sukeltas maitinimosi elgesio slopinimas.

Maitinimo procedūros vyko garsą slopinančiose operantinėse kamerose, kurių matmenys buvo identiški tiems, kurie buvo naudojami BSR eksperimentuose. Žiurkės buvo patalpintos į operacinę kamerą ir 30 minučių turėjo prieigą prie valgyklos dietos arba maisto. Maisto produktai buvo pristatomi mažose metalinėse talpyklose. Visi maisto produktai buvo sveriami prieš ir po šėrimo seansų, kurie buvo atlikti įprastu žiurkių šėrimo laikotarpiu. Maisto suvartojimas buvo įvertintas suvartojus 45 mg čiaudo granules, kurių sudėtis buvo identiška žiurkių namų narvuose esančiai čiaudai. Tada žiurkėms buvo leista 30 minučių per dieną valgyti kavinės dietą, kol buvo pasiektas stabilus suvartojimas (apibrėžiamas kaip <10% dienos suvartojimo pokytis), reikalaujant 5–7 d. Stabilizavus skanaus maisto suvartojimą per šį pradinį laikotarpį, žiurkės kiekvienoje prieigos sąlygoje buvo suskirstytos į dvi grupes: nubaustos (gaunančios pėdų šoką) ir nebaudžiamos (nepatyrusios pėdos šoko). Tada žiurkėms buvo keturios kondicionavimo sesijos iš eilės toje pačioje operacinėje kameroje, kurioje anksčiau jos turėjo prieigą prie skanaus maisto. Per 30 minučių kondicionavimo seansus 10 minučių buvo įjungta signalinė lemputė (sąlyginis stimulas), išjungta 10 minučių ir vėl įjungta 10 minučių. Nubaustos žiurkės patyrė pėdų šoką tik tada, kai buvo rodoma lemputė (0.5, 1.0 mA 10, 1 s; 5 stimuliacijų su ~ 5 minutės intervalais). Nenubaustoms žiurkėms buvo įjungta signalinė lemputė tokiu pačiu būdu, bet be pėdos smūgio. Bandymo dieną, kitą dieną po paskutinio kondicionavimo seanso, nubaustų grupių žiurkės patyrė pertraukiamą pėdų šoką (iš viso penkias stimuliacijas), suporuotus su signalo lemputės aktyvavimu 30 minutes. Nenubaustos žiurkės vėl buvo veikiamos signalo šviesos, nesant pėdos smūgio. Pasibaigus 10 minučių bausmės laikotarpiui, visoms žiurkėms buvo leista prieiti prie skanaus maisto 10 minučių seansui, kai kondicionuotas stimulas buvo įjungtas su pertraukomis (10 minučių įjungta signalo lemputė, XNUMX minučių išjungta, XNUMX minučių įjungta).

Statistinės analizės.

Pradinės atlygio slenksčiai buvo apibrėžti kaip vidutinė slenkstinė vertė 5 dienas iki kiekvieno tiriamojo maitinimosi dietos. Atlygio slenksčiai buvo išreikšti procentiniu pokyčiu nuo pradinės slenksčio vertės. Duomenys apie pradinių atlygio slenksčių verčių procentą, svorio padidėjimą, kalorijų suvartojimą ir kalorijų suvartojimą iš riebalų buvo analizuojami naudojant dviejų faktorių kartotinių matavimų dispersijos analizę, naudojant prieigą (tik čiau, ribota prieiga arba išplėstinė prieiga), kalorijų šaltinį ( standartinė čiaudo arba kavinės dieta), virusas (Lenti-control arba Lenti-D2Rsh) ir užuomina (suporuotas arba nesusietas su bausme) kaip veiksniai tarp tiriamųjų, o laikas – kaip tiriamųjų veiksnys. Prireikus pagrindinis dispersijos analizės poveikis buvo toliau analizuojamas Bonferroni post hoc testais. Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant GraphPad Prism programinę įrangą.

Nuorodos

Nuorodos

Susirašinėjimas:

· Paulas J Kenny ([apsaugotas el. paštu])