Cdk5 fosforilatai Dopamino D2 receptorius ir silpnina signalizaciją (2013)

Komentarai: Pasirodo, kad Cdk5 sukelia dopamino D2 receptorių reguliavimą. Nuostabu, kad vertimo faktorius deltafosb skatina Cdk5 gamybą. Bottom line Deltafosb vaidina svarbų vaidmenį tiek jautrinant, tiek desensibilizuojant


Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Abstraktus

Dopamino D2 receptorius (DRD2) yra pagrindinis receptorius, kuris tarpininkauja su dopamino susijusiais smegenų funkcijomis, tokiomis kaip nuotaiką, atlygį ir emocijas. Ciklinui priklausanti kinazė 5 (Cdk5) yra prolino nukreipta serino / treonino kinazė, kurios funkcija yra susijusi su smegenų atlygio grandine. Šiame tyrime atskleidėme, kad serino 321 likučiai (S321) trečioje intracelulinėje DRD2 linijoje (D2i3) yra nauja Cdk5 reguliavimo vieta. D5i321 buvo pastebėtas S2 priklausomas fosforilinimas pagal Cdk3. in vitro ir ląstelių kultūros sistemas.

Mes taip pat pastebėjome, kad S321 fosforilinimas pablogino DRD2 agonistų stimuliuojamą paviršiaus ekspresiją ir sumažino G baltymų sujungimą su DRD2. Be to, žemiau esančio cAMP kelias buvo paveiktas heterologinėje sistemoje ir pirminėse neuroninėse kultūrose iš p35 išstumtų embrionų, galbūt dėl ​​sumažėjusio DRD2 aktyvumo. Šie rezultatai rodo, kad S5 sukeltas Cdk321 fosforilinimas slopina DRD2 funkciją ir suteikia naują reguliavimo mechanizmą dopamino signalizavimui.

skaičiai

12

citavimo: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 fosforilatai Dopamino D2 receptorius ir silpnina signalizaciją pasroviui. PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Redaktorius: James Porter, Šiaurės Dakotos universitetas, Jungtinės Amerikos Valstijos

Gauta: Gegužės 20, 2013; Priimta: 14, 2013; Paskelbta: Gruodis 31, 2013

Autorinės teisės: © 2013 Jeong et al. Tai atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal „Creative Commons“ priskyrimo licencija, kuris leidžia neribotai naudoti, platinti ir atgaminti bet kokioje terpėje, jei įskaitomas originalus autorius ir šaltinis.

Finansavimas: Šis darbas buvo paremtas Korėjos vyriausybės (NRF) parama (NRF-2012R1A2A2A01012923A2012 ir NRF-1R4A1028200A2012), taip pat remiama pagal tarptautinio bendradarbiavimo programą, kurią valdo Korėjos NRF (2K1A2033117A2031) ir Korėjos smegenų tyrimų institutas (KBRI) MSIP pagrindinė mokslinių tyrimų programa (415-2004). SKP buvo 2006 ir XNUMX Nacionalinio šizofrenijos ir depresijos tyrimų aljanso (NARSAD) jaunųjų tyrėjų apdovanojimų gavėjas. Finansuotojai neturėjo jokio vaidmens studijų planavimo, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimo skelbti ar rengti rankraštį.

Konkuruojantys interesai: Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojančių interesų.

Įvadas

Dopamino signalizacija yra susijusi su įvairiomis smegenų funkcijomis, įskaitant motorinį koordinavimą, nuotaikų kontrolės ir atlygio mechanizmus [1]. Pagrindinis dopamino signalizacijos komponentas stuburiniuose gyvūnuose yra striatriškų vidutinių spygliuočių neuronų (MSN), kurie selektyviai išreiškia dopamino receptorių pogrupį ir gauna dopaminerginį įnašą daugiausia iš ventralinės tegmentalinės zonos (VTA) ir materia nigra (SN) [2]. Dopamino receptoriai yra su G baltymu susieti receptoriai (GPCR) su septyniais transmembraniniais domenais ir susideda iš dviejų potipių, D1 tipo ir D2 tipo receptoriai, kurie tarpininkauja dopamino signalizacijos \ t [1]. Pavyzdžiui, dopamino D1 tipo receptoriai (D1, D5) aktyvina adenililo ciklazę per Gαs ir padidinti intraveninį cAMP lygį, tačiau dopamino D2 tipo receptoriai (D2, D3, D4) slopina adenililo ciklazę per Gαi ir mažina cAMP intracelulinį lygį [1], [3].

Tarp dopamino receptorių D2 receptorius (DRD2) yra susijęs su daugelio pagrindinių psichikos sutrikimų, įskaitant šizofreniją ir narkomaniją, patofiziologija. [4], todėl daugelis antipsichozinių vaistų yra bent iš dalies nukreipti į DRD2. Taip pat žinoma, kad DRD2 aktyvumas gerai siejasi su piktnaudžiavimo narkotikų elgesio pasekmėmis gyvūnų modeliuose [5]. Antidepresantai ir nuotaikos stabilizatoriaus veiksmingumas taip pat buvo susiję su DRD2 ląstelių paviršiaus ekspresijos arba PKA, ERK ir GSK3 tarpininkaujančių intracelulinių signalizacijos pokyčiais [1], [4], [6]. Nepaisant šių svarbių DRD2 vaidmenų smegenyse, išsamūs reguliavimo mechanizmai, suteikiantys DRD2 savybių heterogeniškumą ir sudėtingumą, nėra visiškai suprantami.

Suderinus įrodymų eilutes matyti, kad DRD2 aktyvumo koregavimas yra susijęs su daugeliu postransliacinių modifikacijų. Didelė DRD2 glikozilacija buvo nustatyta ankstyvosiose fotofinansinio ženklinimo studijose [7]ir disulfidinių jungčių formavimasis DRD2 taip pat buvo nustatytas kaip svarbus ligandų surišimo pakeitimas [8]. Be to, iš pradžių DRD2 fosforilinimo vietos buvo nustatytos in vitro tyrimas su radioizotopais, suteikiant įvairiems kinazėms skirtus įvairius reguliavimo kelius [9]. Iš tiesų, baltymų kinazė C (PKC) reguliuoja DRD2 tarpininkaujantį ląstelinio kalcio mobilizavimą ir moduliuoja DRD2 ir citoskeletinių baltymų sąveiką [10]. Fosforilinimas pagal GPCR kinazę 2 (GRK2) reguliuoja DRD2 agonistų sukeltus rezensitacijos modelius [11].

Ciklino priklausoma kinazė 5 (Cdk5) yra prolino nukreipta serino / treonino kinazė, kuri turi ypatingą aktyvumą dėl smegenų specifinės jo aktyvatorių ekspresijos, p35 ir p39 [12]. Cdk5 dalyvauja įvairiuose neuronų procesuose, įskaitant neuronų migraciją ir axoną, o Cdk5 ir p35 null pelės rodo kortikos sluoksnio defektus [13]. Pastaruoju metu buvo įrodyta, kad WAVE1 ir ephexin fosforilinimas Cdk5 reguliuoja dendritinių stuburo morfogenezę. [14]. Be to, Cdk5 taip pat reguliuoja NMDA receptorių, NR2B ir NR2A sukeltų NMDA srovių paviršiaus ekspresijos lygius [15], [16]. Pažymėtina, kad keletas įrodymų rodo, kad Cdk5 ir dopamino sistema yra glaudžiai susiję. Cdk5 fosforilina tirozino hidroksilazę (TH), reguliuodama jo stabilumą ir taip palaikydama dopaminerginę homeostazę [17]. Postinaptiniuose neuronuose, kai Cdk75 fosforilina dopamino ir ciklinio AMP reguliuojamo fosfoproteino-32kD T32 liekaną, ji gali slopinti PKA aktyvumą ir tokiu būdu antagonizuoti dopamino DRD5 tarpinį PKA signalizavimą [18]. Įdomu tai, kad, kai kokainas, netiesioginis dopamino receptorių agonistas, yra skiriamas chroniškai žiurkėms, mRNR ir baltymų koncentracija Cdk5 padidėja vidutinio spyglių neuronuose. [19]. Atrodo, kad Cdk5 dalyvauja vaistų sukeltose sinaptinėse adaptacijose. Šiame tyrime parodyta funkcinė DRD2 ir Cdk5 sąveika, kuri dar labiau plečia Cdk5 vaidmenį dopamino signalizacijoje.

Medžiagos ir metodai

Antikūnai

Anti-triušio serumai buvo užauginti prieš peptidus, turinčius trečiosios intradeliulinės DRD321 linijos (D321i2) linijinės linijos 2 (pS3). Fosfopeptidas, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), buvo panaudotas peptidui konjuguotai kolonijai afininiam gryninimui (20401, PIERCE). Anti-pS321 antikūnas buvo praturtintas afininio valymo sistema pagal gamintojo nurodymus. Išgrynintas fosfo-antikūnas buvo laikomas PBS su 0.1% natrio azidu ir 0.1% želatina. Anti-pelės anti-Cdk5 antikūnas (sc-249) ir anti-triušio anti-p35 antikūnas (sc-820) buvo naudojami Cdk5 / p35 Western blotavimui ir imunocitochemijai. DRD9996-GFP imunoprecipitacijai ir Western blotavimui buvo naudojamas anti-pelės anti-GFP antikūnas (sc-2). Anti-triušio anti-FLAG antikūnas (sc-807), anti-triušis anti-HA antikūnas (sc-805), anti-pelės anti-GST antikūnas (sc-138) ir anti-GAP anti-GAPDH antikūnas (sc-32293). XNUMX) įsigyti iš „Santa Cruz Biotechnology“.

gyvūnai

P35 knockout pelė buvo natūra dr. Katsuhiko Mikoshiba dovanėlė RIKEN Brain Science Institute Japonijoje ir buvo naudojama pirminės neuronų kultūrai. Gruntų rinkiniai genotipui nustatyti buvo 5′- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC ir 5′-TCCATCT GCACGAGACTAGT, kaip aprašyta anksčiau [20]. ICR pelės ir Sprague Dawley žiurkės buvo naudojamos smegenų lizato paruošimui. Visos gyvūnų procedūros buvo patvirtintos Pohango mokslo ir technologijų universiteto instituto gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitete.

Plazmidės konstrukcijos

Buvo naudojamas žmogaus DRD2 ilgas izoforma EGFP-N1 plazmidiniame vektoriuje ir trečioji intraceliulinė DRD2 linija (212 – 373 aminorūgščių liekanos, įskaitant 29 papildomas aminorūgščių liekanas, kurios yra unikalios DRD2 ilgo izoforma) plazmidiniame vektoriuje. Žmogaus Cdk2 buvo įterptas į pCMV-HA plazmidės vektorių ir žmogaus p5 buvo įterptas į pcDNA 35 plazmidės vektorių. Žmogaus Cdk3.1 buvo įdėtas po citomegaloviruso (CMV) promotoriaus kartu su žmogaus p5 PCDNA 35 vektoriuje, kad gautų dvigubos ekspresijos konstrukciją (Cdk3.1 / p5) imunocitochemijai, receptorių internalizacijos tyrimui, [35S] -GTPγS surišimo tyrimas, radioligandų surišimo tyrimas ir cAMP fermento imunologinis tyrimas.

In Vitro Kinazės tyrimas

IP ryšys in vitro kinazės tyrimas buvo atliktas taip. Vienos visos pelės smegenys buvo lizuojamos 3 mL eritrocitų lizės buferyje (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40), naudojant Dounce homogenizatoriaus smūgius, kad gautų homogenizuotus smegenų lizatus . Lizatai buvo inkubuojami ant ledo 20 min., Ultragarsu ir centrifuguojami 30 × g už 10 min. Supernatantai buvo imunopretipituoti anti-triušio anti-p35 antikūnu, kad gautų aktyvų Cdk5 / p35 kompleksą. Cdk5 / p35 kompleksas ir išgrynintas GST sulietas baltymas buvo sumaišyti su adenozino 5'-trifosfatu, [y-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) ir inkubuojama kinazės buferyje (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) 1 h kambario temperatūroje [18], [21]. Išvalytas Cdk5 / p25 kompleksas (14 – 516, Millipore) taip pat buvo naudojamas in vitro kaip aprašyta aukščiau. 2 × mėginio pakrovimo buferis buvo pridėtas prie reakcijos mišinio ir virinamas 100 ° C temperatūroje. Tuomet mėginiai buvo paveikti SDS-PAGE ir džiovintas gelis buvo įvertintas autoradiografija.

Skysčių chromatografija (LC) -Maso spektrometrija (MS) / MS analizė

Rekombinantinis GST-D2i3 baltymas buvo analizuojamas LC-MS / MS, prijungus IP ryšį in vitro kinazės tyrimas. Mes atlikome LC-MS / MS duomenų peptidų identifikavimą naudojant X !! Tandem (versija Dec-01-2008). Kiekviena RAW duomenų byla pirmą kartą buvo konvertuota į mzXML, naudojant trans-proteominį vamzdyną (TPP; 4.3 versija). Tada MS / MS nuskaito konvertuotose mzXMLs buvo atlikta paieška pagal UniProt pelės baltymų sekos duomenų bazę (išleidimą 2010_07), įskaitant GST-D2i3 seką, naudojant X !! Tandem. Leistinasis nuokrypis buvo nustatytas 3 Da pirmtakams ir 2 Da fragmentų jonams. Buvo naudojamas fermento specifiškumas trippsinui. Kysteino (57.021 Da) karbamidometilinimo, metionino oksidacijos (15.995 Da), asparagino (0.987 Da) ir serino fosforilinimo (79.966 Da) oksidacijos metu buvo naudojamos kintamos modifikacijos parinktys.

Imunoprecipitacija

Imunoprecipitacija buvo atlikta ląstelių lizatuose ELB lizės buferyje. Anti-GFP antikūnas buvo pridėtas prie lizatų ir inkubuotas 3 h temperatūroje 4 ° C temperatūroje. Imunokompleksai buvo išgryninti naudojant baltymų-A agarozę. Kietos nuosėdos buvo inkubuojamos su SDS mėginio pakrovimo buferiu 30 min., Esant 37 ° C temperatūrai, ir paveiktos SDS-PAGE ir Western blot.

GST ištraukimo tyrimas

10 µg išgryninto GST ir GST – D2i3 buvo inkubuojami su žiurkės smegenų lizatu 1.5 h, esant 4 ° C. Buvo pridėta 30 µL glutationo (GSH) konjuguotų Sepharose 4B granulių (17-0756-01, GE Healthcare), subalansuota lizės buferiu, ir inkubuota papildomai 1 h. Karoliukai buvo renkami centrifuguojant 2,000 ×g ir skalaujami lizės buferiu 4 kartus [22], [23]. Nuosėdos buvo analizuojamos Western blotting, naudojant anti-Cdk5 ir anti-p35 antikūnus.

Imunocitochemija

Transfekcinės HEK 293 ląstelės ir striatų neuronai, kultivuojami dangteliuose, buvo plaunami vieną kartą fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) ir fiksuojami panardinant į šaltą 4% paraformaldehidą / PBS 30 min. Pirminis antikūnas buvo praskiestas blokuojančiame tirpale (2% arklių serumas ir 1% Triton X-100 PBS). Antraeiliais antikūnais buvo naudojamas Alexafluor-647 konjuguotas anti-pelės antikūnas (A20990, Invitrogen) ir Alexafluor-568 konjuguotas anti-triušio antikūnas (A11011, Invitrogen). Hoechst buvo naudojamas branduolių dažymui. Vaizdai gauti konfokalinėje mikroskopijoje (Olympus, FluoView-1000).

Receptoriaus internalizavimo tyrimas

24 h po transfekcijos ląstelės buvo apdorotos 1 µM ​​chinpiroliu (Q102, Sigma) 30 min ir 90 min. Ląstelės pakartotinai suspenduotos 37 mL šaltoje PBS ir kiekvienai reakcijai buvo panaudotos 2 µL alikvotinės dalys. Vaistų gydymas buvo atliekamas kambario temperatūroje 200 h, esant tokioms koncentracijoms; 3 nM [3H] -spiperonas (NET-565, PerkinElmer), 3 µM ​​sulpiridas (895, TOCRIS), 10 µM ​​haloperidolis (H1512, Sigma). Hidrofobiškas [3H] -spiperonas buvo naudojamas visų išreikštų receptorių žymėjimui ir hidrofilinis sulpiridas buvo naudojamas pakeisti membraninį receptorių surišimą [3H] -spiperono signalai. Su membranomis susiję receptorių signalai buvo apskaičiuoti atimant ląstelių ląstelių receptorių vertes iš visų išreikštų receptorių verčių. Ląstelės filtruojamos ant GF / B (Millipore) filtro ir plaunamos 3 kartus skalbimo buferiu (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtrai išdžiovinti ir liekamasis radioaktyvumas buvo matuojamas skysto scintiliavimo skaitikliu [24].

Ląstelių membranos paruošimas

Sudėtingos ląstelės 100 mm kultūrų induose po transfekcijos buvo plaunamos ledu šaltu PBS ir surinktos 1 mL HME buferyje (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA). Homogenizuoti lizatai buvo centrifuguoti 500 × g 15 min, o supernatantai vėliau centrifuguojami 36,000 × g 30 min. Tyrimams buvo panaudotos granulės, suspenduotos HME buferyje.

[35S] -GTPγS rišimo testas

Ląstelių membranos frakcijos iš anksto inkubuojamos su 1 µM ​​chinpiroliu (Q102, Sigma) tyrimo buferyje (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2100 mM NaCl, 1 mM EDTA ir 0.01 mM BVP) 10 min. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) buvo pridėta prie galutinės 3 nM koncentracijos 30 µL ir toliau inkubuota 90 min. 170 µL ledo šalto buferio (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2ir 0.1 mM GTP), siekiant sustabdyti reakciją. Membranos filtruojamos ant GF / B filtro (Millipore) ir plaunamos 3 kartus skalbimo buferiu (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtrai buvo išdžiovinti ir radioaktyvumas buvo matuojamas naudojant scintiliacijos skaitiklį [25], [26].

Radioligando rišimo tyrimas

Paruoštos ląstelių membranos buvo inkubuojamos su 0.01 nM [3H] -spiperonas (NET-565, PerkinElmer) ir didėjančios chinpirolo (Q102, Sigma) koncentracijos 30 min bandymo buferyje (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membranos filtruojamos ant GF / B filtro (Millipore) ir plaunamos 3 kartus skalbimo buferiu (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reakcija buvo nutraukta greitu filtravimu per GF / C filtrus. Likutinis radioaktyvumas buvo matuojamas skysto scintiliavimo skaitikliu [27]-[29].

cAMP fermento imunologinis tyrimas

Transfekuotos HEK 293 ląstelės 10 h buvo iš anksto apdorotos 6520 µM ​​rolipramu (R1, Sigma), o po to 0.1 min. Pirminiai kultivuoti striatrijos neuronai buvo gydomi 6886 µM ​​rolipramu 102 h, o po to 30 µM ​​dopamino 10 h. [22]. Ląstelių lizatai buvo pagaminti naudojant 0.1 M HCl ir cAMP lygiai buvo nustatyti naudojant cAMP fermento imunologinio tyrimo rinkinį (Sapphire Bioscience) pagal gamintojo nurodymus.

Pirminis kultivuotas stralinis neuronas

Striatų sritis buvo išskirta iš pelių embrioninių smegenų (E15). Išardytas audinys buvo disocijuojamas minimalioje būtinoje terpėje (MEM) (11095, Invitrogen), turinčiame 0.25% trippsiną (T4549-100, Sigma) ir 0.1% DNazę I 6 min., Esant 37 ° C. Ląstelės vėl suspenduotos dengimo terpėje (MEM su 0.01 M HEPES (pH 7.4) ir 10% (tūrio / tūrio) arklio serumu (16050-122, GIBCO)). Neuronai buvo kultivuojami 7 dienomis in vitro (DIV 7) MEM su B27 papildymu (17504-044, Invitrogen) prieš naudojant cAMP fermento imunologinius tyrimus.

rezultatai

Cdk5 fosforilatai Serinas 321 trečioje intraceliulinėje DRD2 kilpoje in vitro

Norėdami nustatyti naujus Cdk5 substratus, atlikome sistemingą paiešką naudojant (S / T) PX (K / H / R) kaip Cdk5 atpažinimo konsensuso sekas [30] ir identifikavo DRD2 kaip kandidato substratą. Konsensuso seka, įskaitant seriną 321, yra trečioje intraceliulinėje DRD2 (D2i3) kilpoje, kurioje dalyvauja įvairūs reguliavimo mechanizmai. [3], [10], [11]. Ši seka yra evoliuciškai konservuota DRD2 stuburiniuose gyvūnuose, o tai reiškia funkcinę liekanos svarbą.1A).

miniatiūrų

1 pav. Cdk5 fosforilina seriną 321 trečioje intracelulinėje DRD2 kilpoje in vitro.

(A) Amino rūgščių sekos derinimas, parodantis DRD2 konservuotus regionus iš įvairių rūšių (tamsesniais). Galimą Cdk5 fosforilinimo vietą žymi žvaigždute. (B) IP susieta in vitro kinazės tyrimas su rekombinaciniais GST-D2i3 ir GST-D2i3 mutantiniais proteinais. Kinazės reakcijoms buvo naudojamas Cdk5 / p35 kompleksas, praturtintas nuo pelės smegenų ekstrakto anti-p35 imunopresipitacija. Rodomas fosforilintų baltymų autoradiografas ir Coomassie briliantinis to paties gelio dažymas. Rodyklė rodo, kad radioaktyvusis signalas, atitinkantis GST-D2i3, ir atvira rodyklė rodo radioaktyvius signalus iš p35. (C) D2i3 fosforilinto peptido fragmento MS / MS spektras. Teoriniai fragmentacijos modeliai parodomi žemiau spektro. Tarp visų fragmentų jonų, aptikti y- ir b-jonai žymimi spektre. Y6 ir y7 jonai stipriai rodo serino 321 fosforilinimą. (D) In vitro kinazės tyrimas su išgrynintu Cdk5 / GST-p25 kompleksu, naudojant GST-D2i3 ir GST-D2i3 mutantinius baltymus. Fosforilinti baltymai buvo parodyti autoradiografe kartu su Coomassie briliantu mėlynu dažymu. Rodyklė rodo, kad radioaktyvusis signalas, atitinkantis GST-D2i3, ir atvira rodyklė rodo radioaktyvius signalus iš GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Norėdami įvertinti „Cdk5“ pajėgumą fosforinti D2i3, atlikome IP ryšį in vitro kinazės tyrimai, naudojant aktyvųjį Cdk5 / p35 kompleksą, praturtintą iš pelės smegenų lizato p35 imunoprecipitacija su išgrynintais rekombinantiniais GST-D2i3 (aminorūgščių liekanomis 212 – 373) baltymai, kaip substratai. Išgrynintuose GST-D2i3 ir GST-D2i3 S297A baltymuose mes stebėjome fosforilinimo signalus, tačiau signalas žymiai sumažėjo naudojant GST-D2i3 S321A (1B). Siekiant dar labiau patikrinti serino 321 fosforilinimą GST-D2i3, atlikome LC-MS / MS analizę iš IP susietų in vitro kinazės tyrimai, naudojant LTQ XL masių spektrometriją. Nuosekliai atsigavo fosfopeptidai, atitinkantys fosfo-serino 321 peptidų masę (1C). Atsižvelgiant į tai, kad nuo duomenų priklausomas įsigijimas LC-MS / MS analizės metu yra linkęs aptikti gausius mėginius [31], šie duomenys rodo, kad serino 321 liekana yra dominuojanti Cdk5 fosforilinimo vieta D2i3 regione. Parodyti tiesioginį serino 321 fosforilinimą GST-D2i3 Cdk5, in vitro atliktas kinazės tyrimas, naudojant išgrynintą Cdk5 / GST-p25 kompleksą su išgrynintais rekombinantiniais GST-D2i3 baltymais. GST-D2i3, kuriame nebuvo GST-D2i3 S321A, nustatėme reikšmingą fosforilinimo signalą (1D pav). Kartu šie rezultatai rodo, kad D2i3 S321 liekana yra pirmenybė Cdk5 sukeltam fosforilinimui.

Cdk5 fosforilatai serinas 321 į trečiąjį intradeliulinį DRD2 kilpą ląstelėse

Norint nustatyti serino 321 fosforilinimą, mes padidinome antikūną, specifinį fosfo-serinui 321 (pS321). Pavyzdžiai iš IP susietų in vitro kinazės tyrimas buvo analizuojamas Western blotting naudojant anti-pS321 antikūną. „Blots“ parodė, kad kinazės reakcijoje, kuri priklausė nuo GST-D2i3, nustatyta atskira juosta.2A). Siekiant patikrinti galimą serino 321 fosforilinimą DRD2, Cdk5 ląstelėse, anti-GFP imunoprecipitatai iš HEK 293 ląstelių, ekspresuojančių DRD2-GFP ir DRD2 S321A-GFP su arba be HA-Cdk5 ir p35, buvo analizuojami Western blotting naudojant anti-GFP ir anti-pS321 antikūnai. Anti-GFP antikūnų, kurie, kaip žinoma, dėl pernelyg didelio DRD2 glikozilinimo, signalai yra matomi tik esant DRD2-GFP ir anti-pS321 antikūnai aptiko panašius DRD2 signalus tik su Cdk5 / p35 bendro išraiška (2B) [7]. Toliau patikrinti serino 321 fosforilinimą pagal Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) ir mutantinę D2i3 formą (FLAG-D2i3 S321A). FLAG-D2i3 ir FLAG-D2i3 S321A, ekspresuoti su HA-Cdk5 ir p35 arba be jų HEK 293 ląstelėse, buvo analizuojami SDS-gel judėjimo permainų tyrimu. Buvo pastebėtas reikšmingas Cdk5 priklausomas mobilumo poslinkis FLAG-D2i3, bet ne FLAG-D2i3 S321A (2C). Taip pat įvertinome DRD2 fosforilinimo lygį Ser321 agonistinės stimuliacijos metu. HEK 293 ląstelės, ekspresuojančios DRD2-GFP ir Cdk5 / p35 kompleksą, buvo stimuliuojamos chinpiroliu, o anti-GFP imunopretipitatai iš ląstelių lizatų buvo analizuojami Western blotting naudojant anti-GFP ir anti-pS321 antikūnus. Mes nustatėme, kad Cdk5 tarpininkaujamas DRD2 fosforilinimas Ser321 nepaveikė agonistinės stimuliacijos, kuri pasirodo kitokia nei GRK ir PKC sukeltos fosforilacijos (2D pav) [32], [33]. Kartu šie rezultatai rodo, kad Cdk5 gali fosforilinti DRD321 serino 2 likučius ląstelių aplinkoje.

miniatiūrų

2 pav. Cdk5 fosforilina seriną 321 trečioje intracelulinėje DRD2 linijoje ląstelėse.

Serino 5 Cdk321 tarpininkaujamas fosforilinimas buvo analizuojamas naudojant anti-pS321 antikūną. (A) Su IP susiję pavyzdžiai in vitro kinazės tyrimas, naudojant GST-D2i3 baltymus, buvo analizuojamas Western blotting (WB) su nurodytais antikūnais. Rodyklės rodo GST-D2i3. (B) DRD2-GFP ir DRD2 S321A-GFP buvo ekspresuoti su HA-Cdk5 ir p35 arba be jų HEK 293 ląstelėse. Anti-GFP imunoprecipitatai buvo analizuojami Western blotting naudojant anti-GFP ir anti-pS321 antikūnus. Kronšteinas rodo DRD2 signalus ir atvira rodyklė nurodo nespecifinius signalus iš anti-GFP imunoprecipitatų. „% input“ yra viso lizato tūrio procentas IP reakcijai. Silpni endogeniniai Cdk5 signalai buvo pažymėti žvaigždutėmis. (C) Gelio judėjimo permainų tyrimas. HEK 293 ląstelės, transfekuotos kaip nurodyta, buvo analizuojamos Western blotting. (D) Transfekcuotos HEK 293 ląstelės buvo apdorotos chinpiroliu ir anti-GFP imunoprecipitatai buvo analizuojami Western blotting su anti-GFP ir anti-pS321 antikūnais. Atviroji rodyklė nurodo nespecifinius signalus iš anti-GFP imunoprecipitatų.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 kompleksas ir DRD2 yra fiziškai susiję

Ištyrėme galimą fizinę sąveiką tarp Cdk5 / p35 komplekso ir DRD2, nes žinoma, kad daugelis Cdk5 substratų yra fiziškai susiję su Cdk5 / p35 kompleksu [23], [34], [35]. Pirma, atliktas GST išskleidimo eksperimentas. Išgrynintas rekombinantinis GST-D2i3 baltymas buvo inkubuojamas su žiurkės smegenų lizatu, o GST išskleidžiamieji nuosėdos buvo analizuojamos Western blotting. Kaip parodyta 3Aendogeniški Cdk5 ir p35 buvo nustatyti išskleidžiamuosiuose nuosėdose, nurodant fizinę sąveiką tarp DRD2 ir Cdk5 / p35 komplekso (3A). Be to, HA-Cdk5 ir p35 buvo aptikti anti-GFP imunoprecipitatuose iš HEK 293 ląstelių lizatų, ekspresuojančių DRD2-GFP ir Cdk5 / p35 (3B). Be to, atlikome imunocitochemines analizes ir stebėjome, kad DRD2-GFP, HA-Cdk5 ir p35 rodo reikšmingus bendro lokalizacijos signalus HEK 293 ląstelių membraninėje srityje (3C, viršutinės plokštės). Taip pat tyrėme DRD2 ir Cdk5 / p35 bendrojo lokalizaciją neuronų kontekste. Nuosekliai, DRD2-GFP taip pat parodė reikšmingą bendrą lokalizaciją su endogeniniu Cdk5 ir p35 kultivuojamuose striatrijos neuronuose (DIV7), toliau palaikydama funkcines sąsajas tarp DRD2 ir Cdk5 / p35 (3C, apatinės plokštės). Rezultatai rodo, kad DRD2 ir Cdk5 / p35 gali sudaryti kompleksą ir tokiu būdu paremti požiūrį, kad DRD2 yra fiziologinis Cdk5 substratas.

miniatiūrų

3 pav. Cdk5 / p35 gali sudaryti kompleksą su DRD2.

(A) GST išskleidimo tyrimas, naudojant išgrynintą rekombinantinį GST-D2i3 baltymą su žiurkių smegenų ekstraktu. GST išskleidžiamieji nuosėdos buvo tiriamos Western blotting analize. „Karoliukas“ reiškia ištraukiamą nuosėdą be GST baltymų. (B) DRD2 ir Cdk5 / p35 komplekso imunoprecipitacija. Anti-GFP IP iš transfekuotų ląstelių lizatų buvo atliktas Western blotting analize. Kronšteinas rodo DRD2 signalus ir atvira rodyklė nurodo nespecifinius signalus iš anti-GFP imunoprecipitatų. Į dešinę taip pat rodomas per didelės ekspozicijos įvestis. (C) DRD2 ir Cdk5 / p35 imunocitocheminės analizės. HEK 293 ląstelės, ekspresuojančios DRD2-GFP ir Cdk5 / p35, buvo nudažytos anti-Cdk5 ir anti-p35 antikūnais (viršutinėmis plokštėmis). DRD2-GFP buvo ekspresuotas vien tik kultivuojamuose striatų neuronuose ir dažomas anti-Cdk5 ir anti-p35 antikūnais (apatinėmis plokštėmis). Hoechst buvo naudojamas branduolių dažymui. Skalės juosta yra 5 µm. Visi vaizdai buvo gauti naudojant konfokalinę mikroskopiją (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

DRD5 Cdk2 tarpininkaujamas fosforilinimas slopina receptorių aktyvumą

Buvo pranešta, kad fosforilinimas moduliuoja kritines GPCR savybes, pvz., G baltymų susiejimą, receptorių internalizaciją, intracelulinę lokalizaciją ir susiejimą su moduliatoriaus proteinais. [9], [11], [24]. Gonistų sukeltas receptorių internalizavimas yra kritinis reguliavimo signalų perdavimo procesas. Ištyrėme Cdk5 tarpininkaujantį DRD2 moduliavimą. HEK 293 ląstelės, ekspresuojančios DRD2-GFP ir DRD2 S321A-GFP su arba be Cdk5 / p35, buvo inkubuojamos su 1 µM ​​chinpiroliu, norint paskatinti agonistų stimuliuojamą DRD2 internalizaciją (4A). [3H] -spiperono signalai, išreiškiantys DRD2-GFP ekspresuojančias ląsteles, žymiai sumažėjo 30 min chinpirolo gydymo metu ir atkuriami 90 min. Įdomu, [3H] -spiperono signalai DRD2-GFP ir Cdk5 / p35 ekspresuojančioms ląstelėms taip pat buvo sumažinti 30 min quinpirole gydymo metu, tačiau 90 min.4A, antrasis skyrius). Iš kitos pusės, [3H] -spiperono signalai DRD2 S321A-GFP ekspresuojančioms ląstelėms sumažėjo 30 min ir atgavo 90 min., Nepriklausomai nuo bendro ekspresijos su Cdk5 / p35. Ankstesni tyrimai parodė, kad internalizuotas DRD2 sugrįžta atgal į plazmos membraną po ilgos agonistinės stimuliacijos [11]. Tmanoma, kad DRD5 sukeltas fosforilinimas Cdk2 yra susijęs su resensibilizacijos procesais po agonistų sukeltos DRD2 internalizacijos.

miniatiūrų

4 pav. Cdk5 sukeltas fosforilinimas susilpnina DRD2 paviršiaus ekspresiją ir signalizaciją pasroviui.

(A) DRD2 paviršiaus išraiška, išmatuota pagal [3H] -spiperono surišimo tyrimas. Transfekuotos HEK293 ląstelės buvo stimuliuojamos 1 µM ​​chinpiroliu nurodytu laiku ir nuimamos, po to 3 nM [3H] -spiperono gydymas 3 val. Buvo išmatuotas radioaktyvumas ir apskaičiuoti paviršiaus signalai. Klaidų juostos rodo vidurkį ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; vienkryptis ANOVA su Dunnett post hoc testu: palyginkite visas kolonas su kontroline kolona). (B) [35S] -GTPγS surišimo tyrimas. Ląstelių membranos buvo pagamintos iš ląstelių, transfekuotų kaip nurodyta. Membraniniai preparatai buvo inkubuojami su 1 µM ​​quinpirole, po to 3 nM [35S] -GTPγS 90 min. Klaidų juostos rodo vidurkį ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; vienpusis ANOVA su Bonferroni post hoc testu: palyginkite visas stulpelių poras). (C) Kvinpirolio konkurencija [3H] -spiperono surišimo tyrimas. Membraniniai preparatai iš transfekuotų ląstelių buvo inkubuojami su 0.01 nM [3H] -spiperonas ir didėjančios chinpirolio koncentracijos 30 min. Netiesinė regresija buvo gauta „GraphPad“. Klaidų juostos nurodo vidurkį ± SE (n = 3). (D) cAMP fermento imuniniai tyrimai transfekuotose HEK 293 ląstelėse. Transfekuotos ląstelės buvo iš anksto apdorotos 10 µM rolipramu 1 valandą, o po to 0.1 min. Kartu apdorotos 30 µM forskolinu ir didėjančia chinpirolio koncentracija. Netiesinė regresija buvo gauta „GraphPad“. Klaidų juostos rodo vidurkį ± SE (n = 4; ** p <0.01; dvipusis t-testai). (E) Kultūriniai striatrijos neuronai iš laukinio tipo ir p35 išmuštų embrionų (DIV 7) buvo gydomi 10 µM ​​rolipramu 1 h, po to 1 µM ​​dopamino 1 h. Klaidų juostos reiškia vidurkį ± SE (n = 4; **p<0.01; dviejų uodegų t-testai).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Mes taip pat įvertinome galimą agonistų stimuliuojamo G baltymo sujungimo su DRD2, susijusio su Cdk5 sukeltu fosforilinimu, pasikeitimą naudojant [35S] -GTPγS surišimo tyrimas [25], [26]. DRD2-GFP ir DRD2 S321A-GFP su arba be Cdk5 / p35 buvo išreikšti HEK 293 ląstelėse. Membranos buvo paruoštos ir stimuliuojamos 1 µM ​​kvinpiroliu ir toliau leista [35S] -GTPγS įtraukimas. DRD2-GFP ir Cdk5 / p35 ekspresuojančios ląstelių membranos žymiai pablogėjo [35S] -GTPγS jungtis, palyginti su visomis kitomis ląstelių membranomis (4B). Šie rezultatai rodo, kad Cdk5-medijuotas fosforilinimas žemyn reguliuoja agonistų stimuliuojamą G baltymų prisijungimą prie DRD2.

Be to, konkuruojantis „quinpirole“ [3H] -spiperono surišimo tyrimai buvo atlikti siekiant ištirti bet kokį galimą agonistinės-afiniteto pokytį DRD2, naudojant Cdk5 sukeltą fosforilinimą. Konkurencinis [3H] -spiperonas, kai buvo apdorota didėjančios chinpirolio koncentracijos į membraninį preparatą nuo transfekto, buvo išmatuota. Konkurencinis chinpirolo ir [3H] -spiperonas ne DRD2-GFP ir DRD2 S321A-GFP padarė panašų logKi reikšmės (-9.789 DRD2-GFP; -9.691 DRD2 S321A-GFP), nurodant, kad ligos ir DRD2 afinitetas nėra reikšmingai paveiktas Cdk5 medijuojamo fosforilinimo metu DRD2 (4C).

Cdk5 tarpininkaujantis fosforilinimas Žemyn reguliuoja DRD2-cAMP signalizavimo kelią

Be to, ištyrėme, ar Cdk2 DRD5 modifikacija veikia pasroviui kylančius signalizacijos kelius. Mes stebėjome DRD2-medijuojamą forskolino stimuliuojamos cAMP gamybos inhibiciją adenililo ciklazėje ląstelėse, ekspresuojančiose DRD2-GFP ir DRD2 S321A-GFP, naudojant cAMP fermento imunologinę analizę. DRD2 ekspresuojančios ląstelės, priklausomai nuo dozės, atsako į chinpirolą parodė sumažėjusį cAMP lygį. Pažymėtina, kad Cdk5 / p35 bendro ekspresija žymiai sumažino maksimalią cAMP susidarymo slopinimą (4D, kairysis skydas). Kita vertus, DRD2 S321A-GFP ekspresuojančiose ląstelėse, cAMP formacijos buvo veiksmingai slopinamos reaguojant į gydymą chinpiroliu, nepriklausomai nuo Cdk5 / p35 ekspresijos (4D, dešinysis skydelis). Šie rezultatai rodo, kad DRD5 sukeltas Cdk2 fosforilinimas susilpnina DRD2 slopinamąjį aktyvumą cAMP signalizacijos kelyje. Norėdami dar labiau patvirtinti reiškinius fiziologiškai reikšmingesnėje aplinkoje, mes panaudojome pirminius kultivuotus neuronus iš išardytų embrionų, trūkstamų p35, esminio Cdk5 aktyvatoriaus. Pirminiai kultivuoti striatrijos neuronai buvo gydomi 1 µM ​​dopamino ir analizuojami cAMP fermento imunologiniu tyrimu. Neuronai iš p35 knockout pelių parodė sumažėjusius cAMP lygius, lyginant su laukinio tipo neuronais, stimuliuojant dopaminu (4E). TApibendrinant buvo padaryta išvada, kad DRD5 sukeltas Cdk2 fosforilinimas sumažina DRD2 sukelto cAMP kelio slopinamąjį toną.

Diskusija

Nustatėme DRD2 kaip naują Cdk5 substratą. Atrodo, kad fosforilinimas slopina DRD2 paviršiaus ekspresiją, paveikdamas DRD2 likimą po receptoriaus internalizacijos, taip sumažindamas DRD2 Gi- prijungimas ir cAMP kelias. Kadangi fosforilinimo liekana S321 egzistuoja tiek DRD2 ilgose, tiek trumpose izoformose, šiame tyrime siūlomas mechanizmas gali būti bendras DRD2 signalizacijos reguliavimo būdas..

DRD2 vidutinio dydžio smilkalų neuronuose ne tik buvo laikomas pagrindiniu dopamino receptorių potipiu, bet taip pat buvo pripažintas jautriu prieinamumo pokyčiams reaguojant į aplinkos stimulus. Iš esmės buvo tiriamas DRD2 agonistų sukeltas desensibilizavimas ir resensibilizacija [11], [24]. Visų pirma, daugelis tyrimų parodė, kad lėtinio psichostimuliatoriaus poveikio, pvz., Kokaino ir amfetamino, kurie padidina ekstraląstelinį dopamino lygį striatų sinapse, poveikį lydi dinaminiai DRD2 pokyčiai po sintetinių pokyčių. [36]. Iš tiesų, žinoma, kad lėtiniai kokaino vartotojai sumažino DRD2 koncentraciją striatų srityje, o DRD2 prieinamumas branduoliuose accumbens (NAcc) rodo neigiamą koreliaciją su narkotikų paieškos ir sustiprinimo elgesiu pelėms ir primatams. [37]-[39]. Šie duomenys rodo, kad DRD2 funkcionalumas yra labai jautrus adaptyviam arba kompensaciniam reguliavimui, reaguojant į įvairius stimulus, įskaitant lėtinį vaisto poveikį. Mūsų rezultatai rodo, kad S321 likučiai trečioje intracelulinėje DRD2 linijoje gali būti fosforilinami Cdk5, o tai sąlygoja DRD2 slopinančio poveikio cAMP kelią sumažėjimą. Ši sąveika siūlo naują reguliavimo mechanizmą, susijusį su Cdk5 dopaminoceptiniuose neuronuose, kurie gali būti susiję su DRD2 paviršiaus prieinamumo dinaminiu pobūdžiu.

Pažymėtina, kad žinoma, kad Cdk5 yra pagrindinis komponentas tarpininkaujant adaptuotiems neuronų aplinkos pokyčiams. Pavyzdžiui, struktūriniai ir funkciniai dendritinių stuburo pokyčiai limbinės grandinės neuronuose yra viena iš pasikartojančių psichostimuliantų pasekmių pasekmių. [40]. Šiuos pokyčius lydi įvairūs molekuliniai pokyčiai, įskaitant cAMP atsako elemento surišimo baltymo (CREB) ir AFosB, transkripcijos faktorių, kurie turi ilgalaikį reguliavimą, reaguojant į lėtinį kokaino vartojimą, indukciją. [41], [42]. Svarbu tai, kad Cdk5 yra ΔFosB tikslas [19], ir daugelis kritinių komponentų, susijusių su dendritine stuburo dinamika, pvz., PSD-95, p21 aktyvuota kinazė (PAK), β-kateninas ir spinofilinas, buvo pateikti kaip Cdk5 substratai [43]-[46]. Nuosekliai, genetiškai ar farmakologiškai apdorojant Cdk5 aktyvumą, atsiranda dendritinių stuburo morfologijos ir elgesio reakcijų į kokainą pokyčiai, lemiantys kritinius Cdk5 vaidmenis molekuliniuose ir morfologiniuose mesolimbinių grandinių pokyčiuose. [47], [48]. Mūsų rezultatai, rodantys, kad DRD2 yra naujas Cdk5 tikslas, suteikia papildomą įžvalgą dopamino sistemos adaptaciniams pokyčiams reaguojant į lėtines vaistų ekspozicijas dėl to, kad po to, kai FdBB-medijuojantis Cdk5 reguliavimas padidėja, gali atsirasti toninis DRD2 fosforilinimo padidėjimas . Be to, žinoma, kad DRD2 veikia daugelį ląstelių procesų, įskaitant cAMP ir MAP kinazės takų reguliavimą ir transkripcijos įvykius [42], [49]. Taigi šio tyrimo rezultatai gali ne tik atspindėti tiesioginį DRD2 reguliavimą Cdk5, bet ir pateikti naują požiūrį į dopamino sistemos adaptuojamą atsaką į lėtinį vaisto poveikį.

Autoriaus įnašai

Suprojektuoti ir suprojektuoti eksperimentai: JJ YUP DH SKP. Atlikti eksperimentai: JJ YUP DKK YK. Analizuojami duomenys: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Įtraukti reagentai / medžiagos / analizės įrankiai: YHS. Parašė dokumentą: JJ SKP.

Nuorodos

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) Dopamino receptoriai: nuo struktūros iki veikimo. Physiol Rev 78: 189 – 225.
  2. 2. Išminčius RA (2002) Smegenų atlygio schema: įžvalgos iš nepagrįstų paskatų. Neuronas 36: 229 – 240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. Žiūrėti straipsnį
  4. PubMed / NCBI
  5. "Google Scholar"
  6. Žiūrėti straipsnį
  7. PubMed / NCBI
  8. "Google Scholar"
  9. Žiūrėti straipsnį
  10. PubMed / NCBI
  11. "Google Scholar"
  12. Žiūrėti straipsnį
  13. PubMed / NCBI
  14. "Google Scholar"
  15. Žiūrėti straipsnį
  16. PubMed / NCBI
  17. "Google Scholar"
  18. Žiūrėti straipsnį
  19. PubMed / NCBI
  20. "Google Scholar"
  21. Žiūrėti straipsnį
  22. PubMed / NCBI
  23. "Google Scholar"
  24. Žiūrėti straipsnį
  25. PubMed / NCBI
  26. "Google Scholar"
  27. Žiūrėti straipsnį
  28. PubMed / NCBI
  29. "Google Scholar"
  30. Žiūrėti straipsnį
  31. PubMed / NCBI
  32. "Google Scholar"
  33. Žiūrėti straipsnį
  34. PubMed / NCBI
  35. "Google Scholar"
  36. Žiūrėti straipsnį
  37. PubMed / NCBI
  38. "Google Scholar"
  39. Žiūrėti straipsnį
  40. PubMed / NCBI
  41. "Google Scholar"
  42. Žiūrėti straipsnį
  43. PubMed / NCBI
  44. "Google Scholar"
  45. Žiūrėti straipsnį
  46. PubMed / NCBI
  47. "Google Scholar"
  48. Žiūrėti straipsnį
  49. PubMed / NCBI
  50. "Google Scholar"
  51. Žiūrėti straipsnį
  52. PubMed / NCBI
  53. "Google Scholar"
  54. Žiūrėti straipsnį
  55. PubMed / NCBI
  56. "Google Scholar"
  57. Žiūrėti straipsnį
  58. PubMed / NCBI
  59. "Google Scholar"
  60. Žiūrėti straipsnį
  61. PubMed / NCBI
  62. "Google Scholar"
  63. Žiūrėti straipsnį
  64. PubMed / NCBI
  65. "Google Scholar"
  66. Žiūrėti straipsnį
  67. PubMed / NCBI
  68. "Google Scholar"
  69. Žiūrėti straipsnį
  70. PubMed / NCBI
  71. "Google Scholar"
  72. Žiūrėti straipsnį
  73. PubMed / NCBI
  74. "Google Scholar"
  75. Žiūrėti straipsnį
  76. PubMed / NCBI
  77. "Google Scholar"
  78. Žiūrėti straipsnį
  79. PubMed / NCBI
  80. "Google Scholar"
  81. Žiūrėti straipsnį
  82. PubMed / NCBI
  83. "Google Scholar"
  84. Žiūrėti straipsnį
  85. PubMed / NCBI
  86. "Google Scholar"
  87. Žiūrėti straipsnį
  88. PubMed / NCBI
  89. "Google Scholar"
  90. Žiūrėti straipsnį
  91. PubMed / NCBI
  92. "Google Scholar"
  93. Žiūrėti straipsnį
  94. PubMed / NCBI
  95. "Google Scholar"
  96. Žiūrėti straipsnį
  97. PubMed / NCBI
  98. "Google Scholar"
  99. Žiūrėti straipsnį
  100. PubMed / NCBI
  101. "Google Scholar"
  102. Žiūrėti straipsnį
  103. PubMed / NCBI
  104. "Google Scholar"
  105. Žiūrėti straipsnį
  106. PubMed / NCBI
  107. "Google Scholar"
  108. Žiūrėti straipsnį
  109. PubMed / NCBI
  110. "Google Scholar"
  111. Žiūrėti straipsnį
  112. PubMed / NCBI
  113. "Google Scholar"
  114. Žiūrėti straipsnį
  115. PubMed / NCBI
  116. "Google Scholar"
  117. Žiūrėti straipsnį
  118. PubMed / NCBI
  119. "Google Scholar"
  120. Žiūrėti straipsnį
  121. PubMed / NCBI
  122. "Google Scholar"
  123. Žiūrėti straipsnį
  124. PubMed / NCBI
  125. "Google Scholar"
  126. Žiūrėti straipsnį
  127. PubMed / NCBI
  128. "Google Scholar"
  129. Žiūrėti straipsnį
  130. PubMed / NCBI
  131. "Google Scholar"
  132. Žiūrėti straipsnį
  133. PubMed / NCBI
  134. "Google Scholar"
  135. Žiūrėti straipsnį
  136. PubMed / NCBI
  137. "Google Scholar"
  138. Žiūrėti straipsnį
  139. PubMed / NCBI
  140. "Google Scholar"
  141. Žiūrėti straipsnį
  142. PubMed / NCBI
  143. "Google Scholar"
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) dopamino receptorių signalizacija. J Recept Signal Transduct Res 24: 165 – 205. doi: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B ir kt. (2008) Galimas postdopamino D2 receptorių signalizacijos komponentų dalyvavimas šizofrenijos patofiziologijoje. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197 – 205. doi: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (2002) Dopamino D2 tipo receptorių vaidmuo savarankiškai vartojant kokainą: tyrimai su D2 receptoriaus mutantinėmis pelėmis ir naujais D2 receptorių antagonistais. J Neurosci 22: 2977 – 2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA ir kt. (2012) Valproatas keičia dopamino signalizaciją kartu su Par-4 baltymų ekspresija. PLoS One 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) Diferencinė glikozilacija ir intracelulinė prekyba ilgoms ir trumpoms D2 dopamino receptorių izoformoms. J Biol Chem 270: 29819 – 29824. doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Reader TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992) Specifinė [3H] raclopido jungtis prie neostrialiųjų dopamino D2 receptorių: disulfido ir sulfhidrilo grupių vaidmuo. Neurochem Res 17: 749 – 759. doi: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR ir kt. (1994) Žmogaus D2L dopamino receptoriaus fosforilinimas ir palmitoilinimas Sf9 ląstelėse. J Neurochem 63: 1589 – 1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) Dopamino D (2) receptorių signalizacijos moduliavimas pagal aktino surišantį baltymą (ABP-280). Mol Pharmacol 57: 446 – 452.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (2010) Agonisto sukelta endocitozė ir receptorių fosforilinimas tarpininkauja dopamino D (2) receptorių resensibilizacijai. Mol Endocrinol 24: 574 – 586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 yra ciklino priklausomos kinazės 5 neuronui specifinis reguliavimo subvienetas. Gamta 371: 419 – 423. doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) CDK5 dešimtmetis. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749 – 759. doi: 10.1038 / 35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Ciklinui priklausanti kinazė 5 jungia ekstraląstelinius žymenis su aktino citozeletu dendritinių stuburo vystymosi metu. „Cell Adh Migr 1“: 110 – 112. doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) Cdk5 aktyvacija sukelia hipokampo CA1 ląstelių mirtį tiesiogiai fosforilinant NMDA receptorius. Nat Neurosci 6: 1039 – 1047. doi: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 reguliuoja tirozino 1472 NR2B fosforilinimą ir NMDA receptorių paviršiaus ekspresiją. J Neurosci 28: 415 – 424. doi: 10.1523 / etcurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Ciklinui priklausanti kinazė 5 fosforilina tirozino hidroksilazės seriną 31 ir reguliuoja jo stabilumą. J Biol Chem 279: 54487 – 54493. doi: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, et al. (1999) DARPP-32 fosforilinimas Cdk5 moduliuoja dopamino signalizaciją neuronuose. Gamta 402: 669 – 671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A ir kt. (2001) Lėtinio kokaino poveikio reguliuoja neuroninis baltymas Cdk5. Gamta 410: 376 – 380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, et al. (2001) Ciklino priklausomos kinazės 5 / p35 ir Reelin / Dab1 sinergetinis indėlis į žievės neuronų pozicionavimą besivystančioje pelės smegenyse. Proc Natl Acad Sci JAV 98: 2764 – 2769. doi: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Ciklinui priklausanti kinazė 5 fosforilina postsinaptinio tankio baltymo PSD-95 N-galinį domeną neuronuose. J Neurosci 24: 865 – 876. doi: 10.1523 / etcurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Luke MP, Affar el B, et al. (2005) Par-4 jungia dopamino signalizaciją ir depresiją. Ląstelė 122: 275 – 287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, et al. (2000) NUDEL yra naujas Cdk5 substratas, susijęs su LIS1 ir citoplazminiu dyneinu. Neuronas 28: 697 – 711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS, et al. (2001) Dopamino D2 ir D3 receptorių diferencinis reguliavimas, susietas su G baltymų prijungtais receptorių kinazėmis ir beta-arrestinais. J Biol Chem 276: 37409 – 37414. doi: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) A1 adenozino ir D2 dopamino receptorių diferencinis atjungimas suraminu ir didemetiluotu suraminu (NF037). Mol Pharmacol 53: 808 – 818.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, et al. (2000) Kalmodulino prijungimas prie D2-dopamino receptoriaus sumažina receptorių signalizaciją, sustabdydamas G baltymo aktyvinimo jungiklį. J Biol Chem 275: 32672 – 32680. doi: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. SJ sąrašas, Seeman P (1981) Dopamino ir serotonino receptorių komponentų [3H] spiperono surišimas su žiurkių smegenų regionais. Proc Natl Acad Sci JAV 78: 2620 – 2624. doi: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, Strange PG (1998) agonistinis poveikis D2 (ilgiems) dopamino receptoriams: ligandų surišimas ir funkciniai tyrimai. Br J Pharmacol 124: 978 – 984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) Dopaminas išskiria [3H] domperidoną iš dopamino D2 receptoriaus didelių afinitetinių vietų, bet ne [3H] raclopride arba [3H] spiperonas izotoninėje terpėje: poveikis žmogaus pozronų emisijos tomografijai. „Synapse 49“: „209 – 215“. doi: 10.1002 / syn.10232
  171. 30. „Obenauer JC“, „Cantley LC“, „Yaffe MB“ (2003) „Scansite 2.0“: plataus masto ląstelių signalizacijos sąveikos prognozavimas naudojant trumpus sekos motyvus. Nukleino rūgštys Res 31: 3635 – 3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) Atsitiktinės atrankos ir santykinio baltymų gausos šaulių proteomikoje įvertinimo modelis. Analinis Chem 76: 4193 – 4201. doi: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999) Dopamino D2 receptorių sekvestracija priklauso nuo G-baltymų sujungtų receptorių kinazių 2 arba 5 ekspresijos. Eur J Biochem 260: 112 – 119. doi: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) Baltymų kinazė C tarpininkauja D2 dopamino receptoriaus fosforilinimui, desensibilizacijai ir prekybai jais. J Biol Chem 279: 49533 – 49541. doi: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, et al. (2011) Cdk5 tarpininkaujama endofilino B1 fosforilacija reikalinga autofagijai sukelti Parkinsono ligos modeliuose. Nat Cell Biol 13: 568 – 579. doi: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (2001) p35 / cdk5 jungiasi ir fosforilina beta-kateniną ir reguliuoja beta-katenino / presenilino-1 sąveiką. Eur J Neurosci 13: 241 – 247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) Dopamino hipotezė dėl kokaino stiprinimo savybių. Tendencijos Neurosci 14: 299 – 302. doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY ir kt. (1990) Lėtinio kokaino piktnaudžiavimo poveikiu postsinaptiniams dopamino receptoriams. Aš esu psichiatrija 147: 719 – 724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE ir kt. (2007) Nucleus accumbens D2 / 3 receptoriai prognozuoja impulsyvumą ir kokaino sustiprinimą. Mokslas 315: 1267 – 1270. doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL ir kt. (2006) dopamino D2 receptorių PET tyrimas per chronišką kokaino savarankišką vartojimą beždžionėms. Nat Neurosci 9: 1050 – 1056. doi: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Robinson TE, Kolb B (1997) Nuolatinės struktūrinės modifikacijos branduolių accumbens ir prefrono žievės neuronuose, gautos iš ankstesnės amfetamino patirties. J Neurosci 17: 8491 – 8497.
  182. 41. Robinson TE, Kolb B (1999) Dendritų ir dendritinių stuburo morfologijos pokyčiai branduolyje accumbens ir prefrontalinėje žievėje po pakartotinio gydymo amfetaminu ar kokainu. Eur J Neurosci 11: 1598 – 1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) CREB ir DeltaFosB geno ekspresijos ir kokaino atlygio reguliavimas. Nat Neurosci 6: 1208 – 1215. doi: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA ir kt. (2000) Spinofilinas reguliuoja dendritinių stuburo formavimąsi ir funkciją. Proc Natl Acad Sci JAV 97: 9287 – 9292. doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Modulinis postinaptinio tankio-95 klasterių pervežimas ir sąsaja su stabiliais stuburo pirmtakais ankstyvo žievės neuronų vystymosi metu. J Neurosci 21: 9325 – 9333.
  186. 45. Murazė S, Mosser E, Schuman EM (2002) Depolarizacija skatina beta-kateniną į neuroninius stuburus, skatinančius sinaptinės struktūros ir funkcijos pokyčius. Neuronas 35: 91 – 105. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK ir kt. (2004) Pakitusi žievės sinaptinė morfologija ir sutrikusi atminties konsolidacija prieš specifines dominuojančias neigiamas PAK transgenines peles. Neuronas 42: 773 – 787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ, et al. (2007) Cdk5 moduliuoja kokaino atlygį, motyvaciją ir striatalų nervų susijaudinimą. J Neurosci 27: 12967 – 12976. doi: 10.1523 / etcurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW, et al. (2008) Cdk5 striatyvinis reguliavimas keičia lokomotorinį atsaką į kokainą, motorinį mokymąsi ir dendritinę morfologiją. Proc Natl Acad Sci JAV 105: 18561 – 18566. doi: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) Naujų jungčių kūrimas: ERK / MAP kinazės signalizacijos vaidmuo neuroniniame plastikume. Neuronas 23: 11 – 14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3