PLoS One ". 2013 Nov 25, 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
Šaltinis
Tokijo metropolijos universitetas, Tokijas, Japonija, Elgesio fiziologijos laboratorija.
Abstraktus
Fizinis pratimas pagerina įvairius hipokampo funkcijos aspektus. Pagal idėją, kad neuronų aktyvumas yra esminis veiksnys skatinant neuronų funkcijas, ankstesnė literatūra nuosekliai parodė, kad ūminės pratimų bangos sukelia neuroninį aktyvavimą hipokampe. Pakartotiniai aktyvinimo stimulai lemia transkripcijos faktoriaus ΔFosB kaupimąsi, kuris tarpininkauja ilgalaikiam neuroniniam plastiškumui.
Šiame tyrime ištyrėme hipotezę, kad ilgalaikis savanoriškas ratų važiavimas sukelia ΔFosB ekspresiją hipokampe ir ištyrė visus galimus regiono specifinius efektus hippokampo laukuose palei dorso-ventralinę ašį. Vyriškos C57BL / 6 pelės buvo laikomos su važiuokle arba be jo 4 savaitėms. Ilgalaikis ratų valdymas žymiai padidino FosB / ΔFosB imunoreaktyvumą visuose hippokampo regionuose, išmatuotuose (pvz., DG, CA1 ir CA3 abiejose srityse, tiek dorsalinėje, tiek ventralinėje hipokampe). Rezultatai patvirtino, kad ratų važiavimas sukėlė specifinę FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo išraišką žievėje, o tai rodo, kad vienodas FosB / ΔFosB padidėjimas hipokampe nėra nespecifinė važiavimo pasekmė. Western blot duomenys parodė, kad padidėjęs hippokampo FosB / ΔFosB imunoreaktyvumas pirmiausia buvo padidėjęs ΔFosB. Šie rezultatai rodo, kad ilgalaikis fizinis pratimas yra stiprus ΔFosB indukcijos sukėlėjas per visą hipokampą, o tai paaiškina, kodėl pratimai gali pagerinti tiek nugaros, tiek ventralinės hipokampo priklausomas funkcijas. Įdomu tai, kad FosB / ΔFosB ekspresija GD buvo teigiamai koreliuojama su dvigubos linijos-imunoreaktyviųjų (ty, nesubrendusių) neuronų skaičiumi.
Nors mechanizmai, kuriais AFosB tarpininkauja fizinio krūvio sukeliamai neurogenezei, vis dar yra neaiškūs, šie duomenys reiškia, kad fizinio krūvio sukelta neurogenezė yra bent jau priklausoma nuo aktyvumo. Apskritai, mūsų dabartiniai rezultatai rodo, kad ΔFosB yra naujas molekulinis taikinys, susijęs su pratimų sukeltu hipokampo plastiškumu.
Įvadas
Pratimai suteikia įvairios naudos molekuliniams, struktūriniams ir funkciniams hipokampo aspektams graužikams [1,2] kai kurie iš jų buvo paremti žmogaus tyrimais [3,4]. Tačiau mechanizmai, kuriais grindžiami pratimų sukeltos hipokampo plastiškumo pokyčiai, nėra pakankamai suprantami. Ankstesnė literatūra nuolat parodė, kad pratimai sukelia hippokampo neuronų aktyvavimą graužikams. Imunohistocheminiai tyrimai, naudojantys c-Fos, laikinojo neuroninio aktyvinimo žymeklį, parodė, kad tiek priverstinis, tiek savanoriškas padidėjusio c-Fos ekspresijos rodiklis graužikų hipokampo dentate gyrus (DG), CA1 ir CA3 srityse [5-7]. Be to, ankstesnis tyrimas, naudojant lazerio-Doplerio srauto matricą (LDF), parodė, kad lengvasis važiavimo takas veikia padidėjusį regioninį smegenų kraujotaką (rCBF), alternatyvų neuronų aktyvavimo žymeklį, žiurkės CA1 srityje.8]. Imunohistocheminiai tyrimai įgalina išsamias specifines regionines analizes po treniruotės, o LDF leidžia realiuoju laiku stebėti rCBF lokalizuotoje srityje treniruotės metu. Nepaisant kiekvieno tyrimo privalumų ir apribojimų, šie tyrimai taip pat parodė ūminių treniruočių poveikį hipokampo neuronų aktyvumui. Šie rezultatai rodo mechanizmą, pagal kurį ilgalaikis reguliarus mankštinimas skatina hipokampo plastiškumą, pakartotinai sukeldamas neuronų aktyvavimą [9].
Transkripcijos faktorius ΔFosB, sutrumpintas pilno ilgio FosB splice izoforma, yra sukeltas įvairių tipų pakartotinių dirgiklių tipuose tam tikruose smegenų regionuose, kur jis palaipsniui kaupiasi dėl savo unikalaus stabilumo (savaitės pusėjimo trukmės) [10-12]. Vis daugiau įrodymų rodo, kad padidėjęs ΔFosB kiekis tarpininkauja ilgalaikiam nervų ir elgesio plastiškumui, susijusiam su konkrečiais stimulais [11,13]. Pavyzdžiui, lėtinis piktnaudžiavimo narkotikų, pvz., Kokaino ir morfino, vartojimas dažniausiai padidina ΔFosB ekspresiją branduolyje accumbens, kuris yra vienas iš molekulinių mechanizmų, didinančių jautrumą šiems vaistams. [11,14,15]. Spanašiai kaip ir kiti atlyginimai, įskaitant didelį riebalų kiekį turinčią dietą ir seksualinę patirtį [16,17], lBe to, savanoriškas ratų važiavimas per laikotarpį padidino FosB / ΔFosB imunoreaktyvumą žiurkių branduoliuose, o tai rodo, kad savanoriškas važiavimas yra natūralus atlygis graužikams [18,19]. Tačiau, mūsų žiniomis, nė vienoje literatūroje neišnagrinėta, ar pakartotinis fizinio krūvio poveikis sukelia ΔFosB ekspresiją hipokampe. Kadangi pratimas sukelia neuroninį aktyvavimą hipokampe, hipotetėme, kad ilgalaikis savanoriškas ratas taip pat sukeltų ΔFosB išraišką hipokampe. Nors tikslūs mechanizmai, kuriais ΔFosB reguliuoja hipokampo plastiškumą, lieka neaiškūs, tyrimai parodė, kad pelėms, kurioms trūksta \ t fosB genas rodo sutrikusią hipokampo neurogenezę ir padidėjusį depresiją panašų elgesį [20,21]. IŽinoma, manoma, kad pratimas sustiprina neurogenezę ir turi antidepresantų savybes [22-25]. If Mūsų hipotezė yra teisinga, ΔFosB būtų naujas galimas molekulinis tikslinis tarpininkas, skatinantis pratimų sukeltą hipokampo plastiškumą.
Hipokampas turi anatominį ir funkcinį gradientą išilginėje (dorso-ventralinio) ašyje [26]. Dorsalinis hipokampas vaidina pagrindinį vaidmenį erdviniame mokymesi ir atmintyje [27,28], o ventralinis hipokampas pirmiausia dalyvauja reguliuojant emocinį elgesį [29,30]. Be to, tyrimai parodė, kad fiziologiniai stimulai sukelia skirtingus c-Fos ekspresijos modelius hipokampo nugaros ir venos dalyse [31-33]. Kadangi mankšta pagerina tiek nugaros [34-37] ir ventralinės hipokampo priklausomos funkcijos [24,25,38], svarbu išnagrinėti, ar ilgalaikis savanoriškas darbas sukelia specifinę ΔFosB ekspresiją hipokampe.
Pagrindinė šio tyrimo hipotezė buvo ta, kad ilgalaikis savanoriškas ratų veikimas sukeltų ΔFosB ekspresiją pelės hipokampe. Šią hipotezę ištyrė FosB / ΔFosB imunohistochemija nugaros ir ventralinės hipokampo pogrupiuose, DG, CA1 ir CA3, ypatingą dėmesį skiriant konkrečiai regiono specifinei indukcijai. Rezultatai buvo patvirtinti Western blotting, kuris buvo naudojamas identifikuoti fosB hippocampus sukeltų genų produktų. Mes taip pat ištyrėme regionui būdingos FosB / ΔFosB indukcijos žievę, kad išvengtume galimybės, kad ilgalaikis fizinis aktyvumas padidintų FosB / ΔFosB imunoreaktyvumą smegenyse. Galiausiai buvo ištirtas koreliacinis ryšys tarp FosB / ΔFosB ekspresijos ir neurogenezės, kaip pirmasis žingsnis siekiant ieškoti pratimų sukeltos ΔFosB indukcijos funkcinių pasekmių reguliuojant hipokampo plastiškumą.
Medžiagos ir metodai
1: Gyvūnai ir etikos pareiškimas
Iš komercinio selekcininko (SLC, Shizuoka, Japonija) buvo įsigyta dvidešimt vyrų C57BL / 6 pelių (8 savaitės). Eksperimentui 1 buvo naudojamos dešimties pelių, o kitos 10 - eksperimentui 2. Pelės buvo laikomos kontroliuojamomis temperatūromis (22 – 24 ° C) ir šviesa (12 / 12-h šviesos / tamsos ciklas, šviesa įsijungė 0500) ir buvo aprūpintos maistu ir vandeniu ad libitum. Visos eksperimentinės procedūros buvo patvirtintos Tokijo metropolijos universiteto Gyvūnų eksperimentinės etikos komiteto.
Kiekviename eksperimente, atvykus, pelės buvo atsitiktinai priskiriamos arba kontrolinei grupei (Control, n = 5), arba veikiančiai grupei (Runner, n = 5). Pirmąją savaitę visos pelės buvo laikomos standartiniuose plastikiniuose narvuose grupėse (5 pelės / narvas) pradinei aklimatizacijai. Tada „Runner“ pelės buvo perkeltos į narvelį, turintį važiavimo ratą (ENV-046, Med Associate Inc., Gruzija, VT, JAV). Kadangi žinoma, kad socialinė izoliacija slopina pratimų sukeltą neurogenezę hipokampe [39], Runner pelės buvo laikomos kaip grupė (5 pelės / narvas) papildomoms 4 savaitėms. Kiekvieną rytą buvo užregistruotas ratų sukimosi skaičius ir kas savaitę buvo matuojamas kūno svoris (g).
2: eksperimentas 1. FosB / ΔFosB ekspresijos ir hipokampo neurogenezės imunohistocheminis tyrimas
2.1: Perfuzija ir audinių apdorojimas
Ryte (0900 – 1100) po paskutinės važiavimo laikotarpio dienos pelės buvo giliai anestezuotos pentobarbitalio natrio druska ir transkardiškai perfuzuojamos šaltu druskos tirpalu. Smegenys buvo greitai pašalintos ir po fiksavimo 4% paraformaldehidu 0.1 M fosfatinio buferio tirpale (PBS, pH 7.4) per naktį. Po to smegenys buvo apsaugotos nuo 30% sacharozės PBS ir užšaldytos iki tolesnio apdorojimo. Pusrutulio koronalinės smegenų sekcijos (40 μm) buvo gautos naudojant šaldantį mikrotomą ir surenkamos PBS su natrio azidu 0.01%.
2.2: imunohistochemija
FosB / ΔFosB imunodažui atsitiktinai buvo atrinkta viena iš šešių sekcijų sekcijų serija. Dublecortino (DCX), nesubrendusių neuronų, įvertintų neurogenezei įvertinti, žymėjimui buvo naudojama gretima serija.40,41]. Sumažinus endogeninį peroksidazės aktyvumą su 1% H2O2 PBS, laisvai plūduriuojančios sekcijos buvo iš anksto inkubuojamos su blokuojančiu tirpalu, kuriame yra 10% normalaus arklio serumo PBS 2 h. Po skalavimo PBS, sekcijos buvo inkubuojamos su triušio polikloniniu pan-FosB antikūnu (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), praskiestų PBS su 0.5% Triton X-100 ir 0.5% BSA (PBST -BSA) 24 h esant 4 ° C. Kita sekcijų sekcija buvo inkubuota su ožkų polikloniniu anti-DCX antikūnu (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) PBST-BSA 48 h, esant 4 ° C. Sekcijos buvo toliau inkubuojamos su atitinkamu biotinilinto antriniu antikūnu (anti-triušio IgG, 1: 1000, AP182B; anti-ožkų IgG, 1: 1000, AP180B, abu antikūnai iš EMD Millipore, Billerica, MA, JAV) PBST-BSA 2 h kambario temperatūroje. Po to sekcijos buvo apdorojamos Avidin-biotino-peroksidazės kompleksu (Vectastain ABC peroksidazės rinkiniu, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, USA), naudojant 90 min. Galiausiai antigenai buvo vizualizuoti 0.02% 3,3-diaminobenzidinu (DAB) 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6), turinčiame 0.01% H2O2. FosB / ΔFosB imunodažui reakcija buvo sustiprinta nikelio amonio sulfatu. DCX dažymui ląstelių branduoliai buvo dažyti Nissl dažymu. Skiltelės buvo sumontuotos ant želatinos dengtų skaidrių ir uždėti dangteliai.
2.3: FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo kiekybinis nustatymas naudojant vaizdo slenkstį
Pan-FosB antikūnas, naudojamas šiame tyrime, buvo iškeltas prieš vidinį FosB ir ΔFosB N-galinės srities bendrą regioną, todėl negali būti diskriminuojamos tarp dviejų izoformų. Todėl imuninės spalvos struktūros buvo apibūdintos kaip FosB / ΔFosB imunoreaktyvios (FosB / ΔFosB-ir) branduolys. Dėl objektyvaus aklai kiekybinio nustatymo skaidiniai buvo koduojami prieš analizę. Pelės smegenų atlasas [42] buvo naudojamas identifikuoti šių dominuojančių regionų (ROI) vietą: DG (3 sekcijų) granulių ląstelių sluoksnis (GCL), CA1 (3 sekcijų) piramidinis ląstelių sluoksnis ir CA3 (2 – 3 sekcijos) (uždarytas iki -2.2 mm nuo bregmos); DG (2 sekcijos), CA1 (2 sekcijos) ir CA3 (2 sekcijos) ventralinėje hipokampe (uždarytos iki -3.4 mm nuo bregmos) (4 pav, kairėn). Caudalių sekcijose yra tiek hipokampo nugaros, tiek ventraliosios dalys, tačiau ventralinė dalis buvo skirta. DG, suprapiramidiniai (DGsp) ir infrapiramidiniai (DGip) peiliai buvo analizuojami atskirai. Motorinė žievė (2 – 3 sekcijos, uždarytos iki -0.6 mm nuo bregmos), somatosensorinė statinės žievė (2 – 3 sekcijos, uždarytos -0.6 mm nuo bregmos), regos žievė (3 sekcijos, uždarytos iki -2.9 mm nuo bregma), taip pat išanalizuotos ausinės žievės (3 sekcijos, uždarytos iki -2.9 mm nuo bregmos) ir kvapo lemputė (3 sekcijos, uždarytos iki + 4.3 mm nuo bregmos).6 pav, kairėn).
Kiekvieno ROI skaitmeniniai vaizdai (2070 × 1548 pikseliai) buvo paimti naudojant optinį mikroskopą (BX-51, Olympus, Tokijas, Japonija), turinčią CCD kamerą (DP-73, Olympus) ir vaizdo programinę įrangą (cellSens, Olympus). objektyvo lęšio padidinimas buvo 10 × hippokampo ROI ir 4 × žievės ROI. Siekiant nustatyti vidutinio stiprumo FosB / ΔFosB imunoreaktyvumą (1D – G pav), naudojant iš anksto keletą sekcijų, abu vaizdo gavimo nustatymai (šviesos intensyvumas, lauko sustabdymo dydis, ekspozicijos laikas ir baltos spalvos balansas) ir kiekvieno RGB komponento slenksčio lygiai buvo optimizuoti hipokampo ir žievės ROI. Toliau atlikta analizė atlikta optimizuotomis sąlygomis (1). ROI buvo pasirinkta netaisyklingos formos daugiakampiu (Pav. 1A, B) (2). Vaizdas buvo ribotas, kuris FosB / ΔFosB-ir branduolius pavertė raudona spalva (1C-G pav) (3). Tada% ROI buvo automatiškai apskaičiuota taip:% ROI = (konvertuotas plotas (raudona spalva) / bendra ROI sritis) × 100.
Norėdami patvirtinti šią vaizdo slenksčio analizę, 20 regionai buvo atsitiktinai parinkti iš skirtingų smegenų sričių, turinčių skirtingus regiono dydžius. Be vaizdo slenksčio kiekybinio nustatymo, FosB / ΔFosB-ir branduolių skaičius pasirinktuose regionuose buvo skaičiuojamas rankiniu būdu ir FosB / ΔFosB-ir branduolių tankis buvo gautas dalijant FosB / ΔFosB-ir branduolių skaičių pagal išmatuotą plotas (mm2).
2.4: DCX-ir nesubrendusių neuronų kiekio nustatymas dentato gyrus
DCX-ir nesubrendę neuronai DG Runner pelių pelėse buvo gausūs ir sutampa, todėl buvo sunku tiksliai suskaičiuoti atskirą DCX-ir soma skaičių naudojant optinį mikroskopą. Tačiau ankstesniame tyrime „Sholl“ morfologinio įvertinimo analizė parodė, kad kiekvienas DCX-ir neuronas vidutiniškai turi vieną dendritą, kai matuojamas soma 40 μm.43]. Todėl buvo parengta tokia pirminė analizė, leidžianti nustatyti regionui būdingą DCX-ir neuronų kiekybinį nustatymą.
- (1) GCL vaizdas buvo vaizduojamas kompiuterio ekrane naudojant vaizdo gavimo programinę įrangą ir 40 × objektyvo objektyvą (2). Tiesioginiame vaizde, GCL viduryje, buvo sudarytas linijos segmentas (150 ± 0.1 μm) (2 pav) (3). Pakeitus židinio gylį, buvo skaičiuojamas kartų linijos, kertančios DCX-ir dendrites, skaičius (4). ROI (dorsalinis DGsp, dDGsp; dorsalinis DGip, dDGip; ventralinis DGsp, vDGsp; ventralinis DGip, vDGip) atitiko regionus, kuriuose buvo išanalizuotas FosB / ΔFosB imunoreaktyvumas (5). Kiekvienoje ROI, 2 – 3 linijos segmentai buvo paimti iš kiekvienos sekcijos, o perėjimų skaičius buvo apskaičiuotas pagal 2 – 3 sekcijas per pelę. Kadangi GCL storis yra maždaug 60 – 80 μm, kryžmių skaičius turėtų atspindėti analizuojamų ribotame regione esančių DCX-ir neuronų skaičių.
Tipinis DCX-ir nesubrendusių neuronų vaizdas ir linijos segmentas (150 ± 0.1 μm), padengtas skaičiuojant pervažų su DCX-ir dendritais skaičių.
3. Eksperimentuokite 2. FosB / ΔFosB izoformos, kurią sukelia ratas, identifikavimas
3.1: Perfuzija ir audinių apdorojimas
Papildoma pelių kohorta buvo traktuojama kaip nurodyta pirmiau eksperimente 1. Po 4 savaičių veikimo, pelės buvo transcardialiai perfuzuotos šaltu fiziologiniu tirpalu, esant giliai anestezijai. Hippokampas buvo greitai išpjautas ir užšaldytas skystu azotu, ir laikomas -80 ° C temperatūroje. Kiekvienos pelės hippokampis buvo homogenizuotas RIPA buferyje (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% natrio deoksikolatas, 0.1% SDS, # 8990, Thermo Scientific, IL, USA), kurių sudėtyje yra proteazės. inhibitoriai (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Vokietija). Lizatai buvo centrifuguojami 15 min., Esant 5000 rpm, esant 4 ° C temperatūrai, ir supernatantai surinkti. Baltymų koncentracijos buvo išmatuotos BCA baltymų analizės rinkiniu (#23227, Thermo Scientific, IL, JAV).
3.2: Western blotting
Vienodas baltymų kiekis (30 μg / juostos) buvo elektroforezuojamas 10% poliakrilamido gelyje, po to perkeltas į PVDF membraną (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, JAV). Nespecifinis surišimas buvo blokuojamas iš anksto inkubuojant 1 h membraną TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20), turinčio 3% BSA. Membrana buvo inkubuota su Pan-FosB antikūnu (1: 1000), kuris buvo naudojamas anksčiau imunohistochemijai, ištirpintas TBST, turinčiame 3% BSA. Po plovimo TBST, membrana buvo inkubuojama su HRP konjuguotu anti-triušio IgG antikūnu (1: 5000 TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) kambario temperatūroje 1 h. Po plovimo TBST, baltymų juostos buvo vizualizuojamos inkubuojant su Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, JAV) ir užfiksuotos naudojant Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Tada membrana buvo pakrauta kontroliuojant anti-gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) antikūną (#2275, 1: 5000, TBS-T, Trevigen, MD, USA). Baltymų juostų optinis tankis buvo kiekybiškai įvertintas naudojant „Image-J“ ir normalizuotas iki GAPDH lygio.
4: statistinė analizė
Pelės kūno svorio pokyčiai buvo analizuojami dvikrypčiais pakartotiniais matavimais ANOVA (grupė × laikas). Siekiant nustatyti statistinius skirtumus tarp grupių (Control vs Runner), buvo naudojamas nesusijęs t-testas. Pearsono koreliacijos analizė buvo naudojama patvirtinti FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo analizę (rankinis skaičiavimas vs vaizdo slenksčio nustatymas) ir ištirti ryšį tarp FosB / ΔFosB ekspresijos lygio ir DCX sankryžų skaičiaus GD. Duomenys pateikti kaip vidurkis ± SEM. Nustatyta statistinės reikšmės riba P <0.05.
rezultatai
1: kūno svoris ir važiavimo atstumas eksperimentuose 1 ir 2
1 ir 2 eksperimentuose kontrolinių ir bėgių pelių kūno svorio pokyčiai sujungti ir parodyti 3 pav. Dvikrypčiai pakartotiniai matavimai ANOVA parodė reikšmingą sąveiką (grupė × laikas, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) ir pagrindinis grupės poveikis F(1, 18) = 6.07, P <0.05), o tai rodo žymiai mažesnį Runner pelių kūno svorį. Narvo bėgimo atstumas parodytas Lentelė 1. Nors kiekvienos pelės tikslus atstumas buvo neaiškus, nes pelės buvo laikomos kartu, reguliarus stebėjimas patvirtino, kad visos pelės dažnai atliko ratą. Eksperimento 2 bėgelių pelės buvo ilgesnės nei eksperimente 1, tačiau vidutinis važiavimo atstumas (m / diena / narvas) buvo nuoseklus visuose eksperimentuose.
2: FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo kiekybinio įvertinimo patvirtinimas naudojant vaizdo slenkstį
FosB / ΔFosB-ir plotas, gautas vaizdo slenksčiu, ir FosB / ΔFosB-ir branduolių, gautų rankiniu skaičiavimu, tankis buvo reikšmingas (r = 0.941, P <00001, 4 pav).
3: FosB / ΔFosB imunoreaktyvumas hipokampe
FosB / ΔFosB imuninės spalvos reprezentatyvūs vaizdai nugaros ir pilvo hippokampo pogrupiuose buvo parodyti 5 pav. Visose analizuotose ROI, FosB / ΔFosB imunoreaktyvumas Runner pelėse (5 pav, dešinėje) buvo kokybiškai aukštesnis už kontrolinių pelių \ t5 pav, centras). Paleidėjų pelėse kiekybinė analizė parodė, kad FosB / ΔFosB-ir plotas žymiai padidėjo tiek nugaros (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) ir ventralinio hipokampo polaukius (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; 6 pav).
4: FosB / ΔFosB imunoreaktyvumas žievėje
FosB / ΔFosB imuninės spalvos reprezentatyvūs vaizdai žievės ROI rodomi 7 pav. Kiekybinė analizė atskleidė priklausomus nuo regiono pokyčius FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo ilgalaikėje veikloje8 pav). Runner pelėse FosB / ΔFosB-ir sritis buvo žymiai didesnė motorinėje žievėje (P <0.05) ir somatosensorinės statinės žievės (P <0.05), bet ne regos žievėje (P = 0.662) arba kvapo lemputė (P = 0.523). Garsinėje žievėje FosB / ΔFosB-ir plotas siekė didėjančių pelių (Runner) pelių (P = 0.105).
5: Neurogenezė
Atvaizduojami DCX imuninės spalvos vaizdai 9 pav. Dorsal hipokampe, DCX imunoreaktyvumas Runner pelėms (9 pav, dešinėje) buvo kokybiškai didesnis nei kontrolinių pelių (9 pav, kairėn). Palyginti su nugaros hippokampu, DCX imunoreaktyvumas ventralinėje hipokampe buvo silpnesnis tiek kontrolinėse, tiek bėgikų pelėse. Runner pelėse kryžkelių skaičius buvo žymiai didesnis dDGsp (P <0.01) ir dDGip (P <0.01; 10 pav). Vėžinio hipokampo atveju pervažų skaičius bėgikų pelėse buvo padidintas, tačiau tarp grupių nebuvo reikšmingų skirtumų (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; 10 pav).
6: FosB / ΔFosB ekspresijos ir neurogenezės koreliacija
Buvo atlikta koreliacijos analizė tarp FosB / ΔFosB-ir srities ir DCX sankryžų skaičiaus (11 pav). Kadangi kiekvienas duomenų rinkinys (pvz., Dorsalinis DGsp kontrolinėse pelėse) susideda tik iš 5 porų, analizė pirmą kartą buvo atlikta su visomis 40 poromis. Įdomu tai, kad tarp FosB / ΔFosB-ir ir DCX sankryžų buvo reikšminga koreliacija (r = 0.885, P <0.0001). Be to, reikšminga koreliacija taip pat nustatyta, kai nugaros generalinis direktoratas (r = 0.762, P <0.05) ir ventralinis generalinis direktoratas (r = 0.816, P <0.01) buvo analizuojami atskirai.
7: FosB / ΔFosB izoformų, sukeltų ilgalaikio veikimo, identifikavimas
Galiausiai, siekiant nustatyti. \ T fosB Hipokampe sukeltas geno produktas, reaguojant į ilgalaikį veikimą, hippokampis iš papildomos pelių kohortos buvo nukreiptas į vakarų blotą naudojant tą patį pan-FosB antikūną. Keletas 35 – 37 kDa juostų, atstovaujančių modifikuotas ΔFosB izoformas [44], buvo žymiai padidintos „Runner“ ir „Control“ pelėms (12 pav, P <0.01). Kita vertus, 48 kDa FosB izoformos nebuvo galima aptikti nė vienoje grupėje. Kita juosta, silpnai matoma virš 25 kDa, tikriausiai atspindi Δ2ΔFosB izoformą (27 kDa). Buvo dvi kitos juostos, didesnės nei 50 kDa ir 37 kDa, kurios greičiausiai buvo dėl nespecifinio prisijungimo. Kiekybiškai įvertinus, šiose ne ΔFosB juostose skirtumų tarp grupių nerasta (duomenys neskelbtini).
Diskusija
Apibendrinant, šis tyrimas pirmą kartą atliko imunohistocheminę analizę 1 tyrimui), ar ilgalaikis savanoriškas ratas sukelia FosB / ΔFosB ekspresiją hipokampe; ir 2), ar regionui būdingas atsakas egzistuoja palei jo dorso-ventralinę ašį.
Keturių savaičių savanoriško rato važiavimas sukėlė reikšmingą FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo padidėjimą visuose analizuojamuose hipokampo regionuose (pvz., DG, CA1 ir CA3 ir hippokampo doralinės, ir ventraliosios dalys). Patvirtinome, kad 35 – 37kDa ΔFosB izoforma buvo pagrindinė fosB geno produktas, kaupiantis reaguojant į ilgalaikį veikimą. Šie rezultatai aiškiai patvirtina hipotezę, kad ilgalaikis reguliarus fizinis krūvis yra galingas ΔFosB indukcijos sukėlėjas per visą hipokampą ir kad jo indukcija gali būti naujas molekulinis mechanizmas, kuris naudojasi įvairiomis priklausomomis nuo nugaros ir (arba) skilvelio hipokampo funkcijomis.
1: FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo kiekybinio įvertinimo patvirtinimas ir apribojimai naudojant vaizdo slenkstį
Šiame tyrime buvo patvirtintas vaizdo slenksčio metodas, plačiai naudojamas imunohistocheminiuose tyrimuose tikslinių ląstelių skaičiui skaičiuoti ir ląstelių morfologijos įvertinimui, atsižvelgiant į specifinį FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo kiekybinį nustatymą [15,45,46]. Buvo įrodyta reikšminga koreliacija tarp FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo lygių, apskaičiuotų pagal vaizdo slenksčius ir rankiniu skaičiavimu.4 pav). Kadangi tankis ir sutapimas neleido skaičiuoti FosB / ΔFosB-ir branduolių skaičiaus labai tankiose vietose, parodyta koreliacija reiškia tik vaizdo slenksčio metodo tikslumą, kai FosB / ΔFosB-ir plotai sudaro <~ 40% visos IG srityje. Todėl reikia atidžiai interpretuoti FosB / ΔFosB-ir sritis,> 40% viso IG ploto.
Visų pirma, Runner pelių generaliniame direktorate (4 pav), FosB / ΔFosB ekspresija buvo labai paskatinta ratų veikimu ir dauguma FosB / ΔFosB-ir branduolių sutapo. Šiose srityse padidėjusi FosB / ΔFosB ekspresijos indukcija lemia didesnį išraišką, nepriklausomai nuo naudojamo kiekybinio nustatymo metodo (vaizdo slenksčio arba rankinio skaičiavimo). Tačiau, nepaisant nepakankamo įvertinimo rizikos, svarbu pažymėti, kad šis tyrimas sėkmingai parodė didelį FosB / ΔFosB-ir ploto padidėjimą bėgikų GD. Tai rodo, kad metodologiniai apribojimai nekenkia mūsų išvadoms. Vietoj to, potencialus nepakankamas įvertinimas padidina išvadą, kad ilgalaikis FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo padidėjimas hipokampe.
2: vienodas ΔFosB indukcija hipokampe per ilgalaikį veikimą
Hipokampas turi anatominius ir funkcinius gradientus išilginėje ašyje [26], todėl šiame tyrime FosB / ΔFosB imunoreaktyvumas hipokampo nugaros ir ventralinėse dalyse buvo analizuojamas atskirai. Duomenys parodė, kad ilgalaikis vienodos FosB / ΔFosB ekspresijos padidėjimas visose matuojamose hipokampo ROI. Šis vienodas FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo indukcija gali būti nesukurta dėl sisteminių metabolinių pokyčių, susijusių su ilgalaikiu veikimu. Tačiau svarbu atkreipti dėmesį į tai, kad žievėje buvo specifinis FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo padidėjimas. Šį rezultatą patvirtina naujausi duomenys, rodantys, kad ūminis bėgimo tako bėgimas padidino regioninį smegenų kraujotaką hipokampe, bet ne kvapo lempoje [8]. Be to, Rhodes et al. (2003) parodė, kad 7 dienų savanoriško rato, veikiančio sukeltą c-Fos ekspresiją, ir hipokampo (CA2 nebuvo matuojamas) ir CA3 / 1, ir jutimo žievėje, bet ne regėjimo žievėje [47]. Kartu šie tyrimai rodo, kad vienoda FosB / ΔFosB ekspresijos indukcija hipokampe nėra specifinė ilgalaikio veikimo pasekmė. Įdomu tai, kad Hawley et al. neseniai pranešė, kad lėtinis nenuspėjamas stresas padidino FosB / ΔFosB ekspresiją nugaros, bet ne žarnyno, žiurkių hipokampo generaliniame direktorate [48]. Atlikus tolesnį tyrimą, atskiri FosB / ΔFosB indukcijos modeliai, pvz., Tie, kuriuos sukelia fizinis krūvis arba stresas, suteiks nuolatinį įžvalgą nuo stimulo priklausomo poveikio hipokampui.
Žinoma, kad šiame tyrime naudojamas pirminis pan-FosB antikūnas atpažįsta visas FosB baltymų izoformas. Vakarų blotavimo analizėje nustatėme, kad vienintelės hipokampe padidėjusios izoformos po ilgalaikio veikimo buvo modifikuotos ΔFosB (35 – 37 kDa) izoformos, vienintelės stabilios izoformos tarp Fos šeimos baltymų [11]. Ši išvada atitinka ankstesnį darbą, naudojant Pan-Fos antikūną, siekiant parodyti, kad 35 – 37 kDa ΔFosB yra dominuojantis Fos šeimos baltymas, sukeltas priekinės žievės lėtinio streso metu [44]. Taigi ilgainiui sukeltas hippokampo FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo padidėjimas greičiausiai atspindi ΔFosB lygį.
Mažiau žinoma apie regiono specifinį fizinio krūvio poveikį hipokampo molekuliniams ir struktūriniams aspektams. Tačiau daugelis elgsenos tyrimų rodo didelį pratimų sukeltų patobulinimų potencialą tiek nugaros, tiek ventralinės hipokampo funkcijose. Įrodyta, kad pratimas pagerina erdvinį mokymąsi ir atmintį [34-38] ir erdvinis bei kontekstinis apdorojimas daugiausia priklauso nuo nugaros hippokampo [27,28]. Priešingai, taip pat žinoma, kad treniruotės pasižymi anksiolitinėmis ir antidepresinėmis savybėmis [24,25,38] ir šiuos emocinius atsakus daugiausia reguliuoja ventralinis hipokampas [29,30]. Šiame tyrime nustatyta vienoda ΔFosB indukcija ilgalaikiu veikimu rodo, kad per visą hipokampą įvyko tam tikra neuroplastinių pokyčių forma. Tai paaiškintų, kodėl mankšta gali paveikti tiek nuo nugaros, tiek nuo vidurinės hippokampo priklausomos funkcijos.
3: specifinė pratimų sukeltos neurogenezės analizė
Taip pat vis daugiau dėmesio buvo skiriama neurogenezės funkcinei disociacijai tarp nugaros ir pilvo hipokampo [49]. Šiame tyrime, pasinaudojant DCX-ir nesubrendusių neuronų morfologinėmis savybėmis [43], suskaičiavome DCX-ir dendritų sankirtų ir linijos segmento, ištraukto išilgai GCL vidurio, skaičių. Šis matavimas nepateikė viso DCX-ir neuronų skaičiaus GD, tačiau tai leido konkrečiam regionui nustatyti kiekybinį įvertinimą, reikalingą koreliacijos analizei atlikti su FosB / ΔFosB ekspresijos duomenimis (žr. Toliau). Ilgalaikio veikimo metu DCX-ir neuronų skaičius pastebimai padidėjo nugaros, bet ne ventraliniame, DG. Tai rodo, kad mankšta gali būti stimuliuojanti neurogenezę dorsaloje, palyginti su vidurine GD dalimi. Tačiau ankstesniuose tyrimuose buvo pateikti prieštaringi rezultatai, kai ratų važiavimas padidino neurogenezę tiek nugaros, tiek viduriniame GD [50,51]. Šiame tyrime DCX-ir kryžmių skaičius ventraliniame generaliniame direktorate dažniausiai didėjo, nors mažas imties dydis (5 pelės kiekvienai grupei) galėjo riboti gebėjimą aptikti statistiškai reikšmingą skirtumą tarp grupių. Todėl tikėtina, kad per anksti neįmanoma atmesti galimybės, kad savanoriškas ratų važiavimas gali paskatinti ventralinę hipokampo neurogenezę. Tolimesni išsamūs tyrimai yra būtini norint suprasti pratimų sukeltos neurogenezės regioninį specifiškumą dėl jo daugiapakopio proceso (ląstelių proliferacijos, diferenciacijos, migracijos ir išlikimo).
4: pratimų sukeltos ΔFosB indukcijos funkcinės pasekmės, reguliuojančios hipokampo plastiškumą
Galiausiai, kaip pirmąjį žingsnį pripažįstant pratimų sukeltos ΔFosB indukcijos funkcines pasekmes hipokampe, mes išnagrinėjome FosB / ΔFosB imunoreaktyvumo ryšį su DCX-ir kryžmėmis tiek nugaros, tiek ventraliniame GD ir nustatėme reikšmingą, teigiamą koreliaciją tarp du kintamieji. Nors tikslūs mechanizmai, kuriais ΔFosB reguliuoja pratybų sukeltą neurogenezę, lieka neaiškūs, neseniai atliktas tyrimas parodė, kad fosB- nulinės pelės, kurių trūksta FosB, ΔFosB ir Δ2ΔFosB (visi fosB produktai), pasižymėjo bazinio hipokampo neurogenezės trūkumu, įskaitant sumažėjusį neuronų progenitorinių ląstelių proliferaciją, padidėjusį naujagimių neuronų migraciją ir nenormalias DG struktūras [20]. Tačiau šie pokyčiai nebuvo pastebėti fosB(d / d) pelėms, kurioms trūksta FosB, bet ne ΔFosB / Δ2ΔFosB. Įdomu tai, kad fosB- nulinės pelės, kai kurių su neurogenezėmis susijusių genų ekspresija, įskaitant Vgf (VGF nervų augimo faktorius indukuoja) ir. \ T gal (Galanino prepropeptidas) buvo sumažintas [20]. Kadangi VGF ir GAL yra sekrecinės molekulės, vienas pasiūlymas, kuriame yra pažadas, mano, kad ΔFosB ekspresuojantys neuronai gali reguliuoti neurogenezę per autokrininį / parakrininį aktyvumą [20].
Be to, reikėtų pažymėti, kad regionas, kuriame ΔFosB yra indukuotas einant erdviniu būdu, sutampa su regionu, kuriame neurogeninis aktyvumas yra didelis. Šis atradimas rodo, kad fizinio krūvio sukelta neurogenezė yra mažiausiai priklausoma nuo aktyvumo. Neuronų aktyvinimas yra labai svarbus palaikant ir gerinant centrinės nervų sistemos funkciją [9] per mechanizmus, įskaitant smegenų kilmės neurotrofinio faktoriaus (BDNF) ekspresiją ir išsiskyrimą [52,53], serumo insulino tipo augimo faktoriaus-1 (IGF-1) įsisavinimas per kraujo-smegenų barjerą [54,55], apoptozės slopinimas [56] ir mitochondrijų judrumo reguliavimas [57]. Taigi, šiame tyrime teigiama, kad ilgalaikis pratimas sukėlė pakartotinį neuronų aktyvavimą, matytį padidėjusioje ΔFosB ekspresijoje, kuri prisideda prie hipokampo plastiškumo didinimo, galbūt per šiuos aukščiau aprašytus mechanizmus.
Šiame tyrime tik įvertintas pratimų sukeltas neurogenezė ir jos sąsaja su FosB / ΔFosB ekspresija GD. Tačiau FosB / ΔFosB imunoreaktyvumas taip pat buvo sukeltas CA1 ir CA3 pakopose. Nors reikalingi tolesni tyrimai, siekiant geriau suprasti pratimų sukeltos ΔFosB išraiškos funkcinius vaidmenis šiuose pokalbių laukuose, ankstesnė literatūra suteikia perspektyvią galimybę. Guan ir kt. (2011) parodė, kad specifinė ciklino priklausomos kinazės 5 (Cdk5) abliacija CA1 arba CA3 piramidinėse neuronuose sumažino atminties konsolidavimą arba išgavimą,58]. Įdomu tai, kad Cdk5 yra ΔFosB [59] ir dalyvauja reguliuojant sinaptinį plastiškumą [60]. Todėl pratimų sukeltas ΔFosB ekspresija gali būti įtraukta į sinaptinio plastiškumo reguliavimą per Cdk5 aktyvavimą CA1 ir CA3 pakopose.
Išvada
Nors buvo žinoma, kad ūminės pratybos sukėlė tiesioginių ankstyvųjų genų baltymų ekspresiją hipokampe, šis tyrimas pateikia pirmuosius įrodymus, kad ilgalaikis reguliarus mankštinimas sukelia ΔFosB ekspresiją visame hipokampe. Thyra vienoda ΔFosB indukcija palaiko dabartinį supratimą, kad mankšta yra veiksminga nefarmakologinė intervencija, galinti pagerinti daugelį hippokampo funkcijų. Kartu su reikšminga koreliacija tarp FosB / ΔFosB ekspresijos ir neurogenezės šie duomenys yra provokuojantys ir rodo, kad reikia atlikti tolesnius tyrimus, apibrėžiančius ΔFosB vaidmenį tarpininkaujant pratimo poveikiui hipokampo funkcijai, įskaitant neurogenezę.
Finansavimo ataskaita
Nuorodos
;
