Skirtinga dopamino dinamika mokymuisi ir motyvacijai (2019)

Dopamino projekcija iš ventralinio tegmentalio ploto (VTA) į branduolio branduolį (NAc) yra labai svarbi motyvacijai dirbti dėl atlygio ir atlygio siekiančio mokymosi. Neaišku, kaip dopaminas palaiko abi funkcijas. Dopamino ląstelių padidėjimas gali užkoduoti prognozavimo klaidas, kurios yra gyvybiškai svarbūs prisitaikymo elgesio skaičiavimo teorijų mokymosi signalai. Priešingai, dopamino išsiskyrimas padidėja, kai gyvūnai artėja prie atlygio, atspindėdami lūkesčius dėl atlygio. Šis neatitikimas gali atspindėti elgesio užduočių skirtumus, lėtesnius dopamino ląstelių pokyčius ar nuo šuolio nepriklausomą dopamino išsiskyrimo moduliaciją. Čia mes palyginame nustatytų VTA dopamino ląstelių padidėjimą su NAc dopamino išsiskyrimu atliekant tą pačią sprendimo užduotį. Žodžiai, rodantys būsimą atlygį, padidino ir spyglius, ir išleidimą. Tačiau NAc šerdies dopamino išsiskyrimas taip pat buvo dinamiškai besikeičiantis atlygio lūkesčiai, be atitinkamų VTA dopamino ląstelių pokyčių. Mūsų rezultatai rodo esminį skirtumą, kaip reguliuojamas dopamino išsiskyrimas, norint pasiekti aiškias funkcijas: transliuojami sprogimo signalai skatina mokymąsi, o vietinė kontrolė skatina motyvaciją.

Dopaminas yra gerai susijęs su „atlygiu“, bet kaip tiksliai? Viena funkcija - mokytis iš netikėtų apdovanojimų. Trumpas dopamino ląstelių šaudymo padidėjimas koduoja atlyginimų prognozavimo klaidas (RPE)^1,2,3- mokymosi signalai, skirti optimizuoti būsimą motyvuotą elgesį. Dopamino manipuliacijos gali paveikti mokymąsi taip, lyg jos keistų RPE^4,5,6, tačiau jie taip pat turi įtakos motyvuotam elgesiui, lyg dopaminas signalizuotų už atlygį (vertę)⁵. Be to, NAc dopaminas didėja motyvuoto požiūrio metu, atitinkantis dopamino kodavimo vertę^7,8,9,10,11.

Su keliomis išimtimis^2,12,13vidurinio smegenų dopamino deginimas buvo ištirtas klasikinio kondicionavimo metu galvijų fiksuotuose gyvūnuose^3,14, skirtingai nei pirmtako dopamino išsiskyrimas. Todėl palyginome deginimą su išleidimu tomis pačiomis sąlygomis. Mes nustatėme VTA dopamino neuronus, naudojant optogenetinį žymėjimą^3,13. Norint išmatuoti NAc dopamino išsiskyrimą, naudojome tris nepriklausomus metodus - mikrodializę, voltammetriją ir optinį jutiklį dLight¹⁵— Su konvergenciniais rezultatais. Mūsų pirminė išvada yra ta, kad nors RPE skalės VTA dopamino spygliuočių plyšiai suteikia staigius dopamino išsiskyrimo pokyčius, tinkamus mokymuisi, atskiri NAc dopamino svyravimai, susiję su motyvacija, atsiranda nepriklausomai nuo VTA dopamino ląstelių degimo.

Mes mokėme žiurkes operanto „bandito“ užduotyje⁵ (Pav. 1a, b). Kiekvieno bandymo metu nosies kišimo angos apšvietimas („Šviesa įjungta“) paskatino artėti ir įeiti („Į centrą“). Praėjus skirtingam laikymo laikotarpiui (0.5–1.5 s), baltas triukšmas („Go cue“) paskatino žiurkę atsitraukti („Center-out“) ir iškišti gretimą uostą („Side-in“). Atlyginamų bandymų metu šį „Side-in“ įvykį lydėjo maisto bunkerio paspaudimas, kuris paskatino žiurkę kreiptis į maisto uostą („Food-port-in“), kad surinktų cukraus granules. Kairieji ir dešinieji pasirinkimai buvo apdovanoti nepriklausomomis tikimybėmis, kurios kartais be perspėjimo keitėsi. Kai žiurkės dažniau gavo atlygį, jos buvo labiau motyvuotos atlikti užduotį. Tai buvo akivaizdu dėl jų „delsos“ - laiko tarpo tarp apšvietimo ir įėjimo į centrą-kuris buvo jautrus ankstesnių kelių bandymų rezultatams (Išplėstiniai duomenys. 1) ir tokiu būdu sumažintas atvirkščiai su atlygio norma (Pav. 1b).

a, Banditų užduočių įvykiai. b, Seanso pavyzdys. Viršutinė eilutė, atlygio tikimybė kiekviename bloke (kairėje: dešinėje); antra eilutė, erkės nurodo kiekvieno bandymo rezultatą (aukštas, apdovanotas; trumpas, neatlyginamas); trečia eilutė: nesandarus integratorius įvertina atlygio normą (juoda) ir latentinio bėgimo vidurkį (žalsvai mėlyna spalva; apversto žurnalo skalė); apatinė eilutė, NAc šerdies dopaminas toje pačioje sesijoje (1 min. mėginiai). DA, dopaminas. c, Viršutinė, mikrodializės vieta vidurinėje priekinėje žievėje ir striatume (taip pat žr. 1). n = 51 zondo vieta iš 12 žiurkių, kiekviena su 2 mikrodializės zondais, kurie buvo nuleisti tarp seansų. Juostos spalva rodo koreliaciją tarp dopamino ir atlygio normos. ACC, priekinė cingulinė žievė; dPL, nugaros prelimbinė žievė; vPL, ventralinė prelimbinė žievė; IL, infralimbinė žievė; DMS, nugaros-medialinis striatumas. Vidutinės vidutinės kryžminės korelogramos tarp dopamino ir atlygio normos. Raudonos juostos nurodo 99% pasikliovimo intervalą iš sumaišytų laiko eilučių. Apatinė dalis, ryšys tarp neurocheminių medžiagų ir atlygio normos (daugybinė regresija). NA, noradrenalinas; 5-HT, serotoninas; ACh, acetilcholinas; GABA, γ-amino sviesto rūgštis; Glu, glutamatas; NM, normetadrenalinas; DOPAC, 3,4-dihidroksifenilacto rūgštis; 3-MT, 3-metoksitiraminas; HVA, homovanilo rūgštis; 5-HIAA, 5-hidroksiindolacto rūgštis. d, Blokų perėjimų poveikis atlygio normai (kairėje), latentinei (vidurinei) ir NAc šerdies dopaminai (dešinėje). Perėjimai buvo suskirstyti pagal tai, ar padidėjo patyręs atlygio lygis (n = 25) arba sumažėjo (n = 33). Duomenys yra iš visų 14 seansų, kurių metu buvo matuojamas NAc pagrindinis dopaminas (po vieną žiurkę, sujungiant naujų ir anksčiau praneštų duomenų duomenis⁵ gyvūnai) ir braižomi kaip vidurkis ± sem e, Kompozitiniai dopamino ir atlygio normų koreliacijų žemėlapiai.n = 19 žiurkių, 33 seansai, 58 zondo vietos). Smegenų atlaso apybraižos šiame paveiksle buvo atkurtos gavus Paxinos ir Watson, 2005 m⁵¹.

Pilno dydžio vaizdas

Mes anksčiau pranešėme⁵ koreliacija tarp NAc dopamino išsiskyrimo ir atlygio normos, atitinkanti mesolimbinio dopamino motyvacinį vaidmenį¹⁶. Čia pirmiausia siekėme nustatyti, ar šie ryšiai yra stebimi visuose pirmtako tiksluose, atitinkančiuose „globaliai transliuojamą“ dopamino signalizaciją¹⁷arba yra tik tam tikruose rajonuose. Be to, manėme, kad ši dopamino dinamika skirsis tarp striatumo ir žievės, nes šios struktūros turi skirtingą dopamino įsisavinimo ir skaidymo kinetiką¹⁸ ir gali naudoti dopamino skirtingoms funkcijoms^19,20.

Naudojant mikrodializę su didelio efektyvumo skysčių chromatografija - masių spektrometrija (HPLC – MS), mes apžiūrėjome medialinę priekinę žievę ir striatumą. 1c, Išplėstiniai duomenys. 1). Mes vienu metu tyrėme 21 neurotransmiterius ir metabolitus 1 min. Laiko skiriamuoju gebu ir panaudojome regresiją, kad lygintume chemines laiko eilutes su elgesio kintamaisiais (Išplėstiniai duomenys Fig. 2).

Mes atkartojome koreliaciją tarp atlygio normos ir NAc dopamino - priešingai nei kiti neurotransmiteriai. 1c, d). Tačiau šis ryšys buvo lokalizuotas prie NAc branduolio ir nelaikė NAc apvalkalu arba nugaros-medialiniu striatumu. Priešingai mūsų hipotezei, mes stebėjome panašų erdvinį modelį priekinėje žievėje: dopamino išsiskyrimas koreliavo su atlygio norma ventralinėje prelimbinėje žievėje, bet ne daugiau nugaros ar ventraliuose subregionuose (Fig. 1c, e). Nors netikėtai, šie dvigubi vertės dopamino išsiskyrimo dvigubi „taškeliai“ turi intriguojančią lygiagrečią žmogaus neurografiją: nuo kraujo deguonies kiekio priklausomas signalas koreliuoja su subjektyvia verte, ypač NAc ir ventralinėje – medialinėje prefrontalinėje žievėje²¹.

Toliau aptarėme, ar šis motyvacijos sukeltas priešakinis dopaminas atsiranda kintantį vidutinio smegenų dopamino ląstelių deginimą. NAc šerdis gauna dopamino įvestį iš šoninių VTA dalių (VTA-l)^6,22,23. Galvos fiksuotose pelėse VTA-l dopamino neuronai, kaip teigiama, turi vienodus RPE panašius atsakus į sąlyginius stimulus³. Norėdami įrašyti VTA-l dopamino ląsteles, mes užkrėtėme VTA su adeno asocijuotu virusu (AAV), priklausomai nuo Cre-priklausomos kanchodopsiino (AAV-DIO-ChR2) ekspresijos žiurkėms, kurios ekspresuoja Cre rekombinazę pagal tirozino hidroksilazės (TH) promotorių (žr. Metodai). Optrodes (Pav. 2a, b) įrašyti vieno bloko atsakymai į trumpus mėlynojo lazerio impulsus (1 pav.). 2c, Išplėstiniai duomenys Fig. 3, 4, Papildomas pav. 1). Mes nustatėme 27 gerai izoliuotas VTA-l ląsteles su patikimais trumpojo latenso šuoliais ir nustatėme jas kaip dopamino neuronus.

a, Kairė, optrodo schema su 16 tetrodų, esančių aplink 200 µm skersmens optinį pluoštą. Dešinėje, optrodo išdėstymo šoninėje VTA pavyzdys. Svarstyklė, 1 mm. Raudonasis, dopamino ląstelių žymeklis tirozino hidroksilazė; žalia, ChR2 – EYFP; geltona, sutampa. Apie visas paskirties vietas žr. Išplėstinių duomenų pav. 3. b, VTA dopamino ląstelių šuoliai. Raudonos juostos nurodo aptiktas spragas ir šuolių skaičių kiekviename sprogime (žr Metodai). Mastelis, 0.5 s, 0.5 mV. c, Pavyzdinis neurono atsakas į lazerinius impulsus, kurių trukmė yra ilgesnė. d, Sesijos apimties šaudymo sparta prieš smaigalio plotį (pusiau maksimaliai) kiekvienai VTA ląstelei. Mėlynos, pažymėtos dopamino ląstelės; violetinė, atskira numanomų ne dopamino neuronų grupė. Vidutinės bangos formos pavyzdžiai (neigiama įtampa aukštyn). e, VTA dopamino neurono šaudymo dažnis (mėlynos spalvos; 1 min. Dėžės) bandito užduoties metu. Latentiniai (žalsvai mėlyni) kovariai su atlygio norma, tačiau šaudymo norma nėra. f, Visų VTA neuronų (mėlynos, dopamino, purpurinės, ne dopamino, pilkos, neklasifikuojamos) degimo sparta mažuose ir aukšto atlygio tarifuose. Nė vienas neparodė reikšmingų skirtumų (Wilcoxon pasirašytas rango testas, naudojant 1-min dėžes, visi P > 0.05, pakoregavus kelis palyginimus). g, Vidutinė kryžminė koreliacija tarp dopamino ląstelių šaudymo ir atlygio rodiklio neturi reikšmingų ryšių. h, Dopamino šaudymo greičio analizė blokų perėjimuose (tas pats formatas kaip Fig. 1d). n = 95 atlygis didėja, 76 mažėja. i. Inter-spike intervalų pasiskirstymas (kairieji) ir smaigalys (dešinėje) nekeičiamas tarp aukštesnių ir mažesnių atlygio normų blokų (Kolmogorovo – Smirnovo statistika: ISI, 0.138, P = 0.92; serijos, 0.165, P = 0.63 XNUMX).

Pilno dydžio vaizdas

Visi dopamino neuronai buvo toniškai aktyvūs, jų apšaudymo dažnis buvo palyginti mažas (vidutiniškai 7.7 Hz, diapazonas 3.7–12.9 Hz; palyginti su visais VTA-l neuronais, užfiksuotais kartu su dopamino ląstelėmis, P <0.001 vienos uodegos Manno – Whitney testas). Jie taip pat turėjo ilgesnės trukmės smailių bangų formas (P <5 × 10^-6bandymas), nors ir buvo išimčių (Fig. 2d), kuris patvirtina, kad bangos formos trukmė yra nepakankamas dopamino ląstelių žymeklis in vivo^3,24. Atskiras VTA-l neuronų klasteris (n = 38, iš tų pačių seansų) su trumpa bangos forma ir didesniu šaudymo dažniu (> 20 Hz; vidurkis 41.3 Hz, diapazonas 20.1–97.1 Hz) be žymėtų dopamino ląstelių. Manome, kad šios greičiau šaudančios ląstelės yra GABAerginės ir (arba) glutamaterginės^3,25ir toliau nurodykite juos kaip „ne dopaminą“.

Tą pačią dopamino ląstelę įrašėme keliais elgesio uždaviniais. VTA-l dopamino ląstelės stipriai reagavo į atsitiktinai parinktus maisto bunkerių paspaudimus ir palaipsniui mažiau stipriai, kai šie paspaudimai buvo labiau nuspėjami ankstesniais ženklais (išplėstiniai duomenys. 5). Tai atitinka kanoninį RPE panašų kodavimą, kurį atlieka dopamino ląstelės Pavlovijos užduotyse^2,3,26.

Remiantis anestezuotų gyvūnų įrodymais, anksčiau buvo teigiama, kad pakitusi dopamino koncentracija, išmatuota mikrodializėmis, atsiranda dėl dopamino ląstelių toninio šaudymo greičio pokyčių²⁷ ir / arba aktyvių ir neaktyvių dopamino neuronų santykis²⁸. Tačiau bandito užduotyje toninis dopamino ląstelių šaudymas kiekviename bandymų bloke buvo abejingas už atlygio normą. 2e, g). Nebuvo reikšmingų atskirų dopamino ląstelių ar kitų VTA-l neuronų degimo spartų pokyčių tarp aukšto ir žemesnio atlygio blokų. 2f, h; taip pat žr. ²⁹ suderintų rezultatų su pelėmis, kurios yra fiksuotos į galvą). Taip pat nebuvo bendro pokyčio greičio, kuriuo dopamino ląstelės užgniaužtų šuolius, pav. 2i). Be to, nenustatėme jokių dopamino ląstelių, perjungiančių tarp aktyvių ir neaktyvių būsenų. Dopamino ląstelių, praleistų neaktyviomis (ilgas tarpspaudų intervalas), dalis buvo labai maža ir nepasikeitė tarp aukštesnio ir žemesnio atlygio blokų (pav. 2i).

VTA – NAc dopamino projekcijos anatomija buvo intensyviai tiriama^6,22,23, tačiau, atsižvelgiant į šį akivaizdų funkcinį neatitikimą tarp šaudymo ir išleidimo, mes dar kartą patvirtinome, kad įrašome iš teisingos VTA dalies. Mažos retrogrado žymeklio choleros toksino B (CTb) injekcijos į NAc branduolį leido tankiai žymėti TH⁺ neuronai toje pačioje VTA-l zonoje kaip ir mūsų optrodiniai įrašai (Išplėstiniai duomenys. 3). Apytikslėje įrašymo zonoje 21% TH⁺ ląstelės taip pat buvo CTb⁺, ir tai greičiausiai bus nuvertinta NAc šerdies projekcinių VTA-l dopamino ląstelių frakcija, nes mūsų žymeklio injekcijos ne visiškai užpildė NAc šerdį. Taigi, mūsų pavyzdys n = 27 pažymėtos VTA dopamino ląstelės (be to, dar daug nepažymėtų ląstelių) beveik neabejotinai apima NAc šerdį projektuojančius neuronus. Galiausiai papildomoje žiurkėje mes užfiksavome dvi pažymėtas VTA-l dopamino ląsteles, selektyviai įpurškę AAV į NAc šerdį (Išplėstiniai duomenys Fig. 3). Abi retrogradiškai užkrėstos ląstelės turėjo šaudymo modelius, kurie visais atžvilgiais buvo labai panašūs į kitas žymėtas dopamino ląsteles, įskaitant tonizuojančių šaudymo pokyčių su skirtingu atlygio rodikliu trūkumą (Papildomas 1 pav). Darome išvadą, kad tonizuojančių VTA-l dopamino ląstelių šaudymo pokyčiai neatsako už motyvaciją, susijusią su išankstinio dopamino išsiskyrimu.

Ar NAc dopamino išskyrimas seka atlygio normą per se, kaip siūloma kai kuriose teorijose³⁰, ar tai yra koreliacija, kurią lemia dopamino išsiskyrimo dinaminiai svyravimai, kurie pernelyg greitai išsprendžiami mikrodializėje? Mes teigėme, kad pastaroji galimybė yra pagrįsta voltammetrijos duomenimis⁵, tačiau prašė patvirtinimo naudojant nepriklausomą dopamino išsiskyrimo matą, kuris gali apimti skirtingus terminus. Genetiškai koduotų optinių dopamino rodiklių dLight1 rinkinys sukurtas įterpiant cirkuliariai permutuotą GFP į dopamino D1 receptorius.¹⁵. Dopamino rišimas sukelia labai specifinį fluorescencijos padidėjimą (1 pav.). 3a). Mes įvedėme AAV į NAc, kad išreikštume dLight1.1 (keturios patvirtintos NAc vietos iš trijų žiurkių) arba šviesesnį variantą dLight1.3b (šešios patikrintos NAc vietos iš keturių žiurkių) ir stebėta fluorescencija skaidulinės fotometrijos būdu. Mes stebėjome aiškius NAc dopamino atsakymus į Pavlovijos atlygio nuspėjamuosius užuominas, panašiai kaip VTA dopamino ląstelių deginimas (išplėstiniai duomenys. 5).

a, DLight1.3b fluorescencijos atsakas. Dopamino titravimas (n = 15 dominančių regionų (IG)) ir noradrenalino (n = 9). Pagrindinė figūra, vonioje naudojami neuromediatoriai (visi n = 12 IG). Jo, histamino. b, Sample bandit sesija, įskaitant normalizuotą NAc dLight1.3b signalą (1-min dėžės). c, „DLight“ signalas keičiasi su blokų perėjimais. n = 35 atlygio norma didėja, 45 mažėja. d, Kryžminė koreliacija tarp dLight ir atlygio normos. e, Glaudesnis ekrano užtamsintos dalies vaizdas b. Rodyklės: juodos, į nosį į vidų; šviesiai raudona, „Side-in“ (apdovanota); šviesiai mėlyna, „Side-in“ (neatlyginta); tamsiai raudona, „Food-port-in“ (apdovanota); tamsiai mėlyna, „Food-port-in“ (neatlyginta). Kitos eilutės: nesandarus integratorius įvertina atlygio normą; dLight esant mažai skiriamajai gebai (1 min); dšviesa didele skiriamąja geba (50 Hz, žalia; penkių taškų mediana filtruota, juoda); modelio būsenos vertės (žalsvai mėlynos spalvos); ir RPE (purpurinė). Po kelių neatlygintinų bandymų valstybinės vertės tyrimo pradžioje yra mažos, tada atlygio pristatymas sukelia teigiamą RPE ir kartu staigiai padidėja dopaminas. Iš eilės apdovanoti bandymai sumažina RPE, tačiau padidina valstybės vertes, kartu su padidėjusiu dopamino kiekiu. f, Trumpos laiko skersinės koreliacijos rodo glaudų ryšį tarp dLight ir vertės bei mažesnių santykių su RPE. g, Tyrimo metu koreliacijos tarp modelio kintamųjų ir „dLight“ su skirtingais atsilikimais; Koreliacija su verte ir RPE stipriausia, kai dLight yra maždaug 0.3 s vėliau. h, Visose sesijose maksimali koreliacija buvo didesnė už RPE ar atlygio normą.

Pilno dydžio vaizdas

Bandito užduočiai mes pirmiausia išnagrinėjome dLight signalą 1 min. 3b) palyginimui su mikrodialize. Mes vėl matėme aiškų ryšį tarp NAc dopamino išsiskyrimo ir atlygio normos, tiek kryžminio koreliacijos, tiek blokų perėjimų analizės atžvilgiu. 3c, d). Toliau atidžiau išnagrinėjome, kaip kyla šis ryšys. Užuot lėtai svyravęs nuo minutės laiko, „dLight“ signalas parodė labai dinamiškus svyravimus kiekviename bandyme ir tarp jų. 3e). Palyginome šiuos svyravimus su momentinėmis valstybės vertėmis ir RPE, apskaičiuotais pagal stiprinimo-mokymosi modelį (pusiau Markovo sprendimo procesas).⁵). Kaip anksčiau buvo pranešta naudojant voltammetriją⁵, momentinis momentas NAc dopaminas parodė stiprią koreliaciją su būsenomis (Pav. 3f), matomas kaip bandomųjų bandymų metu, kai tikimasi atlygio. 3e). Taip pat matėme trumpalaikį padidėjimą su mažiau tikėtinais atlygio pristatymais, atitinkančiais RPE (apžvelgta toliau). Kiekvienoje „dLight“ sesijoje dopaminas parodė stipresnę koreliaciją su vertėmis, nei nei RPE, nei už atlygio normą. 3h, Išplėstiniai duomenys. 6). Koreliacijos tiek su būsenos reikšmėmis, tiek su RPE buvo maksimalios, atsižvelgiant į dLight signalą ~ 0.3 s vėliau, atitiko trumpą vėlavimą, kurį sukėlė neuronų signalų apdorojimas ir jutiklio atsako laikas (Fig. 3g; su voltamperija, pranešėme apie 0.4–0.5 s atsilikimą)⁵.

Toliau palyginome dopamino ląstelių šaudymą ir paleidome aplink bandito užduočių įvykius. Išoriniai stimulai „Light-on“, „Go-cue“ ir apdovanoti „Side-in“ („maisto-bunkerio spustelėjimai“) kiekvienas sukėlė greitą šaudymą (Pav. 4a). Šie atsakymai buvo pastebėti daugelyje dopamino ląstelių (1 pav.). 4c), nors santykinis atsakymų į skirtingus užuominas dydis kintamas nuo ląstelės (Papildomas pav. 1). NAc dLight signalas taip pat greitai ir patikimai reagavo į kiekvieną iš šių svarbiausių ženklų (Fig. 4b, c), atitinkantis dopamino ląstelių švaistymą, kuris vairuoja dopamino išsiskyrimą.

a, VTA-l dopamino ląstelių aktyvumas pagal įvykį. Į viršų, į vieną reprezentacinę ląstelę suriškite rastrus; apatinis, vidutinis smaigalys (n = 29). Visose plokštėse klaidų juostos nurodo ± sem b, Įvykio suderinta NAc dLight. Į viršų, atstovaujama sesija; apačioje, vidutinis (n = 10), normalizuotas iki didžiausio apdovanoto „Side-in“ atsako. Visame šiame paveiksle „dLight“ signalai rodomi lyginant su 2-ųjų „bazinės“ epocha, pasibaigiančia 1 s prieš „Center-in“. Užrašų padidėjimas (rodyklės) prieš pat „Center-in“ ir „Food-port-in“. c, Dopamino ląstelių kaupiamieji laiko pasiskirstymai (kietas; n = 29), dLight (brūkšninis; n = 10), padidinti po nurodymų (maišymo testas, palyginti su pradiniu, 10,000 XNUMX maišymų, P <0.01, pakoreguoti keli palyginimai). Šviečiant, įtraukiamos tik <1 s vėlavimo trukmės; už „Side-in“ tik apdovanotus bandymus. Vidutinės vėlavimo trukmės (nuo sigmoidinio tinkamumo): Šviečia, įsijungia 152 ms, dLight 266 ms; Ženkite, iššaudant 67 ms, „dLight“ 212 ms; Šone, šaudymas 85 ms, dLight 129 ms. Ne dopamino ląstelės paprastai buvo abejingos užuominų atsiradimui (išplėstiniai duomenys 8). d, Išskirtinis cue-provokuotas, su požiūriu susijęs dopamino išsiskyrimas. Dopamino ląstelių šaudymas į viršų,n = 29); vidutinis, vidutinis dLight (n = 10); apačia, voltmetrija (n = 6), normalizuotas iki didžiausio trumpojo delsos šviesos įsijungimo. Kairieji skydai, delsos <1 s, dešinės, delsos> 2 s. Duomenys sulygiuojami ant „Šviesa įjungta“ (vientisa) arba „Į centrą“ (taškuota); raudona brūkšninė linija, vidutinė latencija. Esant ilgesnėms delsoms, šaudymas šalia „Center-in“ nedidėja, tačiau dLight ir voltamperometrija rodo ryškų padidėjimą. e, Sklaidos sklypas, lyginant didžiausius signalus, suderintus su šviesos įjungimu (y ašies) arba „Center-in“x ašis). Kiekvienai ląstelei prie sesijos prijungtos eilutės nurodo duomenis apie skirtingus delsos intervalus (<1 s,> 2 s). Dopamino šaudymas (viršuje) nuosekliai rodo apšvietimo reakciją atliekant trumpo delsos bandymus (dvipusė dispersijos analizė (ANOVA), derinimas × latentinė sąveika, F = 7.47, P = 0.0008). „dLight“ (vidurinis), voltamperijos (apačios) signalai yra nuosekliai geriau išlyginti su „Center-in“ (dvipusis ANOVA „dLight“: lygiavimas × latentinė sąveika, F = 9.28, P = 0.0043 XNUMX). f, Dopaminas padidėja artėjimo metu, kiekybiškai įvertinamas kaip rampos kampas (žr Metodai). Apskritimai nurodo atskiras dopamino ląsteles (n = 29), „dLight“ sesijos (n = 10 XNUMX).

Pilno dydžio vaizdas

Mes taip pat matėme, kad padidėjo NAc dopamino išsiskyrimas, nes žiurkės priartėjo prie starto uosto (prieš pat „Center-in“) ir maisto uostą (prieš pat maisto portą). Tai puikiai atitinka plačią voltammetrijos literatūrą, rodančią, kad motyvuotą požiūrį į elgesį lydi greitas NAc branduolio dopamino padidėjimas^{5,7,8,9,10,11}. Tačiau šiais laikais VTA-l dopamino ląstelių populiacija nedidino atitinkamo degimo padidėjimo (Fig. 4a; žr. Išplėstiniai duomenys. 7 papildomų palyginimų, įskaitant ir ne dopamino ląsteles).

Kad geriau atsiribotume nuo dopingo aktyvumo, susijusio su ženklu, ir su požiūriu susijusio dopamino aktyvumo, bandymus išskyrėme pagal trumpą (<1 s) ir ilgą (> 2 s) latenciją (XNUMX pav.). 4d, e). Dopamino ląstelių šaudymo padidėjimas buvo pastoviai užfiksuotas prie „Cue“ pradžios „Light-on“, ypač trumpalaikių tyrimų metu. Visi „25“ dopamino ląstelės, turinčios reikšmingą šaudymo greitį, po šviesos įjungimo buvo geriau suderintos su šviesos įjungimu nei „Center-in“. 4e). Priešingai, NAc dopamino išsiskyrimo didėjimas prieš centrą buvo skirtingas nuo dueino sukeltos dopamino išsiskyrimo (Fig. 4d, e). dLight signalai nuosekliai padidėjo iki centrinio įjungimo ilgų latentinių bandymų (dešimties iš dešimties sesijų) ir prieš maitinimo prievadą (devyni iš dešimties sesijų), be atitinkamo dopamino šaudymo padidėjimo. 4f).

Galiausiai mes apsvarstėme, kaip su įvykiu susiję dopamino signalai priklauso nuo paskutinės atlygio istorijos. Pradžioje kiekvieno tyrimo metu dopamino ląstelių deginimas nepriklausė nuo atlygio normos. 5a), nepaisant atlygio normos įtakos motyvacijai (1 pav.). 5b). Vėliau fazinis atsakas į atlygio ženklą „Side-in“ buvo patikimai stipresnis, kai atlygio norma buvo mažesnė (XNUMX pav.). 5a), atitinkantis teigiamą RPE kodavimą. Kai šis atlygio užrašas buvo praleistas, dopamino ląstelės pristabdė šaudymą, nors neigiamų RPE kodavimas buvo daug silpnesnis arba jo nėra, ar jis buvo tiriamas populiacijos lygiu (Fig. 5a, b) arba kaip atskirus langelius (Išplėstiniai duomenys. 8). Anksčiau buvo pasiūlyta, kad neigiamos RPE būtų koduojamos dopamino pauzių trukmės metu³¹, tačiau tai pastebėta tik 2 iš 29 atskirų neuronų. Panašūs rezultatai buvo gauti, jei atlygio lūkesčiai buvo įvertinti kitais būdais, įskaitant bandomuosius mokymosi sustiprinimo modelius (aktorius-kritikas ir Q-mokymasis) arba tiesiog suskaičiuojant naujausius atlygius (Išplėstiniai duomenys. 8).

a, Dopamino ląstelių viršutinės, vidutinės degimo spartos (n = 29) sulygintas su „Side-in“, suskirstytas pagal atlygio normą (tercilės, apskaičiuojamos kiekvienai langelei atskirai). Prieš „Side-in“ veikla nėra priklausoma nuo lūkesčių. Po „Side-in“ apdovanojimų (raudonos) ir neapdovanotų (mėlynų) bandymai rodomi atskirai. Maisto spustelėjimo atsakas yra stipresnis, kai atlygio norma yra maža, atitinka teigiamų RPE kodavimą. Apatinė dalis atskirų dopamino ląstelių, kurių šaudymo dažnis kiekvieną akimirką labai skiriasi nuo atlygio normos (maišymo testas, P <0.01, pakoreguoti keli palyginimai). Erkių žymės viršuje nurodo laikus, kai ši dalis buvo žymiai didesnė už atsitiktinumą (binominis, P <0.01). Po „Side-in“ tikrinamos tik neigiamos koreliacijos, tai yra potencialus RPE kodavimas. b, Regresijos sklypai seansams su įrašytomis dopamino ląstelėmis, parodant paskutinio atlygio istorijos poveikį (log) latentui (viršuje) ir dopamino spikavimui. Žvaigždės nurodo reikšmingus regresijos svorius (t-testas, P <0.05). Per 0.5 s prieš einant užuominą (kol žiurkė turi palaikyti tvirtą nosį, kad būtų tęsiamas bandymas), atlygio istorija (viduryje) neturi įtakos dopamino šuoliams. Tai pasikeis, kai paaiškės rezultatas (apačioje; įvertinant aktyvumo smailę ar mažiausią vietą per 0.5 s po „Side-in“), bet tik dėl atlyginamų tyrimų. c, d, Panašiai kaip ir pirmiau, išskyrus „dLight“ (normalizuotas iki didžiausio atsako į šalį). Dopamino išsiskyrimas patikimai apskaičiuojamas pagal atlygio normą dar prieš šoną.

Pilno dydžio vaizdas

Dopamino išsiskyrimas „Side-in“ taip pat parodė aiškų, trumpalaikį teigiamų RPE, bet ne neigiamų RPE kodavimą. 5c, d). Šis dLight atsakas buvo šiek tiek uždelstas ir pailgėjo, lyginant su šaudymu, atitinkančiu išsiskyrimo ir atpirkimo laiką³², tačiau išliko antrinis reiškinys. Tačiau, skirtingai nuo šaudymo, kiekvienos bandymo pradžioje dLight signalai buvo didesni, kai buvo apdovanoti paskutiniai bandymai. 5c), atitinka vertės kodavimą. Mes stebėjome šią priklausomybę nuo atlygio istorijos net tada, kai žiurkė aktyviai nejudėjo, bet laukdama „Go“ ženklo, centre uoste palaikė nosį. 5d). Apskritai, darome išvadą, kad NAc dopamino išsiskyrimas atspindi abu atsakus ir atlygio lūkesčius, ir kad tik pirmieji gali būti gerai įvertinti VTA-l dopamino ląstelių degimo metu.

VTA-l yra pagrindinis dopamino šaltinis NAc branduoliui^6,23,24. VTA-l dopamino ląstelės, įskaitant tuos, kurie projektuojasi į NAc branduolį, nuolat rodo RPE koduojančius sprogimus^3,12. Manoma, kad VTA sprogimai yra ypač svarbūs vairuojant NAc dopaminą³², ir iš tikrųjų mes nustatėme, kad „Cue-evoked VTA“ sprogimai buvo suderinti su NAc išleidimu. Tačiau mes taip pat nustatėme NAc dopamino išsiskyrimo, susijusio su VTA-l dopamino ląstelių deginimu, vertės, susijusios su ilgais (toniniais) arba trumpais (faziniais) laiko intervalais. Kiti dopamino pogrupiai gali turėti skirtingus signalus^13,33,34, ir mes negalime atmesti galimybės, kad šaudant iš čia neužfiksuotomis dopamino ląstelių populiacijomis, susidaro su verte susijęs dopaminas NAc šerdyje. Tačiau per įvairius tyrimus niekada nebuvo pranešta apie su vertybe susijusį šaudymą naudojant dopamino ląsteles. Mūsų rezultatai rodo, kad NAc dopamino dinamika yra kontroliuojama skirtingais būdais, skirtingu laiku ir skirtingoms funkcijoms, ir kad dopamino ląstelių registravimas yra svarbus, bet nepakankamas dopamino signalams suprasti³⁵.

Išsiskyrimą nuo dopamino terminalų stipriai veikia vietiniai, nespecifiniai mechanizmai^{36,37,38,39,40}. Pavyzdžiui, NAc dopamino išsiskyrimas yra moduliuotas bazolateriniu amygdalu, net jei VTA spikavimas yra farmakologiškai slopinamas.^41,42. Jau dešimtmečius pastebėta, kad vietinė dopamino išsiskyrimo kontrolė gali pasiekti skirtingas funkcijas nei dopamino ląstelių spiksuojantys^36,43, tačiau tai nebuvo įtraukta į teorines dopamino nuomones. Skirtingi striatyviniai subregionai prisideda prie įvairių tipų sprendimų ir gali turėti įtakos jų pačių dopamino išsiskyrimui pagal poreikį⁴⁴. Belieka nustatyti, kiek lokalizuota gali būti ši dopamino išsiskyrimo kontrolė. Vienas iš 3 būdų, kuriais mes matavome dopamino išsiskyrimą, yra tas apribojimas, kad visi jie imami bent 100 µm erdvinėje skalėje, tuo tarpu in vivo mikroskopija rodo, kad dopamino išsiskyrimas gali būti nevienalytis esant žymiai mažesnėms skalėms¹⁵.

Mūsų rezultatai nepalaiko jokio atskiro toninio dopamino signalo, galinčio paskatinti dopamino motyvacinį poveikį. Vietoj to, jei matuojama lėtai (su mikrodialyze), greitai matuojant (esant voltammetrijai ar dLight), dopamino pokyčiai, kurie matomi lėtai (su mikrodializės būdu). Be to, mūsų ir kitų identifikuotų VTA dopamino ląstelių įrašai³⁰ pateikti tvirtus įrodymus prieš šią idėją²⁹ kad tonizuojančių dopamino ląstelių šaudymo varikliai keičia toninius pokyčius dopamino išsiskyrime. Nors tonizuojantį šaudymą gali pakeisti pakitimai ar vaistų manipuliacijos²⁸, mes nežinome apie nuolatinius šaudymo greičio pokyčius atliekant bet kokią elgesio užduotį. Laukiant motyvaciškai svarbių įvykių, šaudymas gali trukti žemyn maždaug 1 s trukmės laikotarpiu^45,46. Tačiau šis nuosmukis yra priešingas tam, ko reikia norint padidinti dopamino išsiskyrimą su atlygio lūkesčiais, ir labiau prilygsta trumpalaikių neigiamų prognozių klaidų sekai⁴⁷. Nors ilgalaikiai signalai, koduojantys nuolatinį atlygio normą, gali būti skaičiuojant naudingi³⁰vietoj dopamino yra greitai kintančių klaidų ir vertės signalų. Vis dar įmanoma, kad tolesni signalai būtų apskaičiuojami vėlesniame etape, intraceliuliniais signalizacijos keliais, esančiais pasroviui nuo dopamino receptorių.

Daugelis grupių pastebėjo, kad dopamino išsiskyrimas padidėja, nes žiurkės patiria naudą^{5,7,8,9,10,11}, atitinka kodavimo didėjančius atlygio lūkesčius. Kai kurie teigė, kad šios dopamino rampos tiesiog atspindi RPE, manydamos, kad žiurkės greitai užmiršta vertes⁴⁸ arba kad jie turi deformuotą valstybės reprezentacijų rinkinį⁴⁹. Pastaroji idėja nepatvirtinta mūsų pastaboje, kad perėjimas nuo bandymų iki bandymo greitai keičiamas remiantis atnaujintais atlyginimų lūkesčiais, tampa stipresnis per trumpą eilės eilučių seką, o RPE panašūs atsakymai į užuominas tampa silpnesni (pav. 3e). Apskritai, bet kokia teorija, kurioje dopaminas perduoda tik RPE (mokymosi signalus), negali būti labai gerai pagrįstas ryšys tarp nuolatinės mesolimbinės dopamino ir motyvacijos¹⁶. NAc branduolys nėra būtinas aukštos kvalifikacijos atsakams į sąlyginius dirgiklius, tačiau jis yra ypač svarbus sprendžiant laiko reikalaujančius darbus, kad gautų atlygį⁵⁰. Atrodo, kad NAc branduolio dopaminas suteikia esminį dinaminį signalą, kaip verta skirti laiko ir pastangų darbui^5,44, nors šis signalas nėra VTA dopamino ląstelių degimo metu.

Gyvūnai

Visas gyvūnų procedūras patvirtino Mičigano universitetas arba Kalifornijos universiteto San Francisko instituciniai gyvūnų naudojimo ir priežiūros komitetai. Žiurkių patinai (300–500 g, laukinio tipo Long-Evans arba TH-Cre⁺ su ilgo evanso fone⁵²) buvo palaikomi atvirkštiniame 12: 12 šviesoje: tamsiame cikle ir išbandyta tamsoje fazėje. Žiurkės buvo šiek tiek maistui netekusios, kasdien vartojant 15 g standartinės laboratorinės žiurkės šunį, be maisto atlygio, uždirbto užduoties atlikimo metu. Nebuvo atliktas mėginio dydžio išankstinis apskaičiavimas. Tyrėjai nebuvo apakinti paskirstant eksperimentus ir rezultatų vertinimą.

elgsena

Išankstinis paruošimas ir bandymai buvo atlikti kompiuterio valdomose „Med Associates“ operantų kamerose (plačiausioje vietoje - 25 cm × 30 cm), kurių kiekvienoje buvo penkių skylių nosies kišeninė sienelė, kaip aprašyta anksčiau.⁵. Banditų užduočių sesijos naudojo šiuos parametrus: blokų ilgiai buvo 35-45 bandymai, atsitiktinai parinkti kiekvienam blokui; laikymo laikotarpis prieš „Go cue“ buvo 500 – 1,500 ms (vienodas paskirstymas); kairiojo ir dešiniojo atlygio tikimybės buvo 10, 50 ir 90% (elektrofiziologijai, fotometrijai, voltammetrijai ir anksčiau praneštoms mikrodializės žiurkėms).⁵) arba 20, 50 ir 80% (naujai pranešta apie mikrodializės žiurkes).

Dabartinė atlyginimų norma buvo apskaičiuota naudojant laiko pagrindu veikiančią nutekėjimo integratorių⁵³. Apdovanojimo norma buvo padidinta kiekvieną kartą, kai buvo gautas atlygis, ir sumažėjo eksponentiškai pagal parametrą, nustatytą parametru τ (laikas, per kurį atlyginimo norma sumažėja ~ 63%, ty 1-1 / e). Visoms analizėms, τ buvo parinktas remiantis žiurkės elgesiu, maksimaliai padidinant (neigiamą) koreliaciją tarp atlygio normos ir žurnalo (latentinio) kiekvienoje sesijoje. Ryšys tarp pirmtako dopamino ir atlygio normos nebuvo labai jautrus šiam pasirinkimui τ (Išplėstiniai duomenys. 1).

Norėdami klasifikuoti blokų perėjimus kaip „didėjančius“ arba „mažinančius“ atlygio normą, mes palyginome vidutinį lėtos integratoriaus atlygio normą paskutiniame bloko 5 min. Iki vidutinio atlygio normos pirmojo kito bloko 8 min.

Žiurkės, naudojamos elektrofiziologijai ir fotometrijai, taip pat atliko Pavlovo priartėjimo užduotį toje pačioje operantų kameroje su įjungtu namų apšvietimu visos sesijos metu. Trys klausos ženklai (2 kHz, 5 kHz ir 9 kHz) buvo susieti su skirtinga maisto tiekimo tikimybe (atsverta žiurkėms). Žodžiai buvo grojami kaip tonas (100 ms įjungtas, 50 ms išjungtas), kurio bendra trukmė buvo 2.6 s, o po to vėlavo 500 ms. Žodžiai ir nenuspėjami atlygio pristatymai buvo pristatyti pseudo atsitiktine tvarka su kintamu tarpdisciplininiu intervalu (15–30 s, vienodas paskirstymas).

Mikrodializė

Chirurgija

Žiurkės buvo implantuotos dvišaliu pagrindu su kanapes (CMA, 830 9024) žievėje ir striatume. Viena grupė (n = 8) gavo vieną kreipiamąją kaniulę, nukreiptą į prelimbinę ir infralimbinę žievę (anteroposterior (AP) +3.2 mm, mediolateralinė (ML) 0.6 mm, palyginti su bregma, ir dorsoventralinę (DV) 1.4 mm žemiau smegenų paviršiaus), o kitą - nukreiptą į dorsomedial striatum ir nucleus accumbens priešingame pusrutulyje (AP +1.3, ML 1.9 ir DV 3.4). Abu implantai buvo kampuoti 5 laipsnių atstumu vienas nuo kito palei rostralinę – uodeginę plokštumą. Antroji grupė (n = 4) gavo vieną kreipiamąją kaniulę, nukreipiančią į priekinę cingulinę žievę (AP +1.6, ML 0.8 ir DV 0.8), o kitą - taikinį accumbens (šerdis / apvalkalas priešingame pusrutulyje AP +1.6, ML 1.4 ir DV 5.5 (n = 2) arba AP +1.6, ML 1.9 ir DV 5.7 (n = 2). Implantų šonai buvo atsveriami žiurkėms. Gyvūnams buvo leista pasveikti vieną savaitę prieš perkvalifikuojant.

Chemikalai

Vanduo, metanolis ir acetonitrilas judriosioms fazėms buvo Burdick & Jackson HPLC klasės, įsigyti iš VWR (Radnor). Visos kitos cheminės medžiagos buvo įsigytos iš Sigma Aldrich, nebent būtų nurodyta kitaip. Dirbtinis smegenų skystis (aCSF) sudarė 145 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 1.40 mM CaCl₂, 1.01 mM MgSO₄, 1.55 mM Na₂HPO₄ ir 0.45 mM NaH₂PO₄, pakoregavo pH iki 7.4 su NaOH. Siekiant sumažinti analitų oksidaciją, pridedama askorbo rūgšties (250 nM galutinė koncentracija).

Mėginių surinkimas ir HPLC-MS

Bandymo dieną gyvūnai buvo patalpinti į operacinę kamerą su apšvietimu. Individualiai pagaminti koncentriniai poliakrilnitrilo membranos mikrodializės zondai (1-mm dializuojantis AN69 membrana; Hospal) buvo įterpti dvišaliu būdu į orientacinę kaniulę ir nuolat perfuzuoti (Chemyx, Fusion 400) su aCSF 2 µl / min. 90 min. Po 5-min bazinės kolekcijos nuleidžiamas namų apšvietimas, todėl gyvūnas pasiekė bandito užduotį. Mėginių ėmimas buvo tęsiamas 1 min. Intervalais, o mėginiai buvo iš karto derivatizuoti⁵⁴ su 1.5 µl natrio karbonato, 100 mM; 1.5 µl benzoilchlorido (2% (t / t) benzoilchlorido acetonitrile); ir 1.5 µl izotopiniu būdu pažymėto vidinio etalono mišinio, praskiesto 50% (t / t) acetonitrilu, kuriame yra 1% (t / t) sieros rūgšties, ir užpilta deuteruotu ACh ir cholinu (C / D / N izotopais) iki galutinės 20 nM. Mėginių serijų rinkimas keitėsi dviem zondais 30 sek. Intervalais kiekviename iš 26 seansų, išskyrus vieną seansą, kurio metu nulūžusi membrana sudarė tik vieną seriją (iš viso 51 mėginių serija). Mėginiai buvo analizuojami naudojant „Thermo Scientific“ UHPLC sistemas („Accela“ arba „Vanquish Horizon“, sujungtus su „Quantum Ultra“ trigubo kvadrupolio masių spektrometru, turinčiu HESI II ESI zondą), veikiančius kelių reakcijų stebėjime. Penkių mikrolitrų mėginiai buvo sušvirkšti į „Phenomenex core-shell bifenyl Kinetex HPLC“ kolonėlę (2.1 mm × 100 mm). Judrioji A fazė buvo 10 mM amonio formiatas su 0.15% skruzdžių rūgštimi, o judrioji B fazė buvo acetonitrilas. Judriosios fazės eliuacijos gradientas buvo 450 µl / min tokiu būdu: pradinis, 0% B; 0.01 min., 19% B; 1 min., 26% B; 1.5 min., 75% B; 2.5 min., 100% B; 3 min., 100% B; 3.1 min., 5% B; ir 3.5 min., 5 proc. B. „Thermo Xcalibur QuanBrowser“ („Thermo Fisher Scientific“) buvo naudojamas automatiškai apdoroti ir integruoti smailes. Kiekviena iš> 100,000 XNUMX smailių buvo vizualiai patikrinta atskirai, kad būtų užtikrinta tinkama integracija.

Analizė

Visi neurocheminės koncentracijos duomenys buvo išlyginti trijų taškų judančiu vidurkiu (y′ = [0.25 × (y−1) + 0.5y + 0.25 × (y+ 1)]) ir zkiekvienos sesijos rezultatas normalizuotas, kad būtų lengviau palyginti tarp sesijų. Kiekvienam tiksliniam regionui buvo sukurta kryžminė korelograma kiekvienam seansui ir pavaizduotas seansų vidurkis. Kiekvieno subploto metu buvo sukurtos vieno procento patikimumo ribos, 100,000 0.05 kartų sumaišius vieną laiko eilutę ir sugeneravus kiekvienos sesijos koreliacijos koeficientų pasiskirstymą. Buvo sukurti keli regresijos modeliai, naudojant regresijos funkciją MATLAB, o neurocheminis rezultatas buvo kintamasis, o elgesio metrika - kaip nuspėjamasis. Regresijos koeficientai buvo nustatyti reikšmingai esant trims alfa lygiams (0.0005, 0.000005 ir 21), po Bonferroni korekcijos keliems palyginimams (alfa / (7 chemikalas × 9 regionai × 3 elgesio regresoriai)). Blokinių perėjimų analizei duomenys buvo susieti su XNUMX minučių epochomis, atsisakant mėginio, kuriame buvo perėjimo laikas.

Elektrofiziologija

Žiurkės (n = 25) buvo implantuoti specialiai suprojektuoti varomi optrodai, kurių kiekvienas susideda iš 16 tetrodų (pagamintų iš 12.5 µm nichromo vielos, „Sandvik“), priklijuotų ant 200 µm optinio pluošto šono ir tęsiasi iki 500 µm žemiau pluošto galiuko. Per tą pačią operaciją suleidome 1 µl AAV2 / 5-EF1a-DIO-ChR2 (H134R) -EYFP į šoninę VTA (AP 5.6, ML 0.8, DV 7.5) arba NAc šerdį (AP 1.6, ML 1.6, DV 6.4). . Plačiajuosčio (1–9,000 30,000 Hz) smegenų signalai buvo atrinkti (80 XNUMX mėginių per sekundę) naudojant „Intan“ skaitmenines antraštes. Kiekvienos įrašymo sesijos metu optrodai buvo nuleisti mažiausiai XNUMX µm. Individualūs vienetai buvo izoliuoti neprisijungus, naudojant „MountainSort“ MATLAB diegimą⁵⁵ po to kruopščiai tikrinama rankiniu būdu.

klasifikacija

Nustatyti, ar izoliuotas VTA-l vienetas buvo dopaminerginis (TH⁺), mes naudojome su stimuliu susijusį latentinį testą⁵⁶. Trumpai tariant, kiekvienos eksperimentinės sesijos pabaigoje sujungėme optrodą su lazeriniu diodu ir pristatėme įvairaus pločio ir dažnio šviesos impulsų traukinius. Kad vienetas būtų identifikuojamas kaip šviesos jautrumas, jis turėjo pasiekti reikšmingumo lygį P <0.001 5-ms ir 10-ms impulsų traukiniams. Mes taip pat palyginome šviesos sukeltas bangos formas (per 10 ms nuo lazerio impulso atsiradimo) su visos sesijos vidurkiais; visų šviesos sukeltų vienetų Pearsono koreliacijos koeficientas buvo> 0.9. Dopamino neuronai buvo sėkmingai užregistruoti iš keturių žiurkių su VTA-l AAV infuzijomis (IM657, 1 vnt .; IM1002, 3 vnt.; IM1003, 15 vnt .; IM1037, 9 vnt.) Ir vienos žiurkės su NAc šerdimi AAV (IM-1078, 2 vnt.). . Didžiausias plotis buvo apibrėžtas kaip didžiausio neigiamo sulygintos, vidutinės smailės bangos formos neigiamo komponento viso pločio ir pusės maksimalus. Nepažymėti VTA neuronai, kurių viso seanso šaudymo dažnis buvo> 20 Hz, o smailės plotis - <200 µs, buvo klasifikuojami kaip nedopamino ląstelės. Siekdami įsitikinti, kad lyginome dopamino ir ne dopamino ląsteles tuose pačiuose paregioniuose, analizavome tik ne dopamino ląsteles, užfiksuotas per sesijas su bent viena optiškai pažymėta dopamino ląstele.

Analizė

Spike sprogimai buvo nustatyti pagal įprastą „80 / 160 šablono“ metodą⁵⁷: kiekvieną kartą, kai įvyksta 80 ms ar mažesnis intervalų intervalas, šie ir vėlesni šuoliai laikomi serijos dalimi, kol bus 160 ms ar daugiau. Palyginus „tonizuojančio“ šaudymo ir atlygio normą, dopamino šuoliai buvo suskaičiuoti 1 minutės dėžėse. Norint ištirti greitesnius pokyčius, smaigalio tankio funkcijos buvo sukonstruotos konvuliuojant smaigalių traukinius su Gauso branduoliu su dispersija 20 ms. Norėdami nustatyti, kaip greitai neuronas reagavo į nurodytą signalą, mes panaudojome 40 ms talpos dėžes (slenkant 20 ms žingsniais) ir kiekvienai laiko dėžei naudojome maišymo testą (10,000 250 maišymų), palygindami šaudymo greitį po užuominos pradžios ir šaudymo greitį XNUMX ms prieš pat užuominą. Pirmoji šiukšliadėžė, kurioje šaudymo sparta buvo žymiai didelė (P <0.01, pakoregavus kelis palyginimus), didesnis nei pradinis šaudymas buvo laikomas atsakymo laiku.

Didžiausias degimo greitis buvo apskaičiuotas kaip maksimalus (Gauso lyginimas) kiekvieno bandymo šaudymo greitis 250-ms lange po šoninio įėjimo už atlygį, o slėnis buvo apskaičiuotas kaip minimalus šaudymo greitis 2 langelyje, pradedant vieną sekundę po šoninio bandymo.

Apskaičiuojant rampos kampą artėjimo tūpimo metu, mes išlyginome vidutinius šaudymo rodiklius su „50-ms“ Gauso branduoliu, nustatėme didžiausią / mažiausią gauto signalo reikšmę 0.5 lango lange prieš kiekvieną įvykį (centrinis arba maisto portas) ) ir išmatuotas pasirašytas kampas, jungiantis du kraštutinius. Palyginti šaudymo spartą „didelio“ ir „žemo“ atlygio blokuose, kiekvienai sesijai atlikome vidutinį vidutinio nuotėkio integratoriaus atlygio normos padalijimą kiekviename bloke.

Voltammetrija ir skaičiavimo modelis

Čia pateikiami greito nuskaitymo cikliniai voltammetrijos rezultatai iš naujo analizuoja anksčiau išsamiai pateiktus duomenis⁵. Valstybinės vertės ir atlyginimų prognozavimo klaidų teisiniai įvertinimai buvo apskaičiuoti naudojant pusiau Markovo sprendimų stiprinimo mokymosi modelį, tiksliai taip, kaip aprašyta anksčiau⁵.

Fotometrija

Naudojome virusinį metodą, norėdami išreikšti genetiškai koduotą optinį dopamino jutiklį dLight¹⁵. Taikant izoflurano anesteziją, 1 μl AAV9-CAG-dLight (1 × 10¹² virusų genomų ml; UC Daviso vektoriaus šerdis) lėtai (100 nl / min) buvo švirkščiama (Nanoject III, Drummond) per 30 µm stiklinę mikropipetę ventraliniame striatume dvišaliai (AP: 1.7 mm, ML: 1.7 mm, DV: –7.0 mm). Tos pačios operacijos metu buvo įdėti optiniai pluoštai (400 µm šerdis, 430 µm bendras skersmuo), pritvirtinti prie metalinės įvorės (Doric) (taikinio gylis 200 µm didesnis nei AAV) ir įtvirtinti vietoje. Duomenys buvo surinkti po trijų savaičių, kad būtų galima išreikšti „dLight“.

„DLight“ sužadinimo atveju mėlynos (470 nm) ir violetinės (405 nm; kontrolinės) šviesos diodai buvo sinusoidiškai moduliuojami skirtingais dažniais (atitinkamai 211 Hz ir 531 Hz).⁵⁸). Tiek sužadinimo, tiek emisijos signalai, perduodami per minikubų filtrus („Doric“), ir tūrinė fluorescencija buvo matuojama femtovatų detektoriumi („Newport“, modelis 2151), imant mėginius 10 kHz dažniu. Demoduliuojant gaunami atskiri 470 nm (dopamino) ir 405 nm (kontroliniai) signalai, kurie paskui buvo keičiami mažiausio kvadrato būdu⁵⁸. Frakcinis fluorescencijos signalas (dF/F) tada buvo apibrėžta kaip (470–405_fit) / 405_fit. Atliekant visas analizes, šis signalas buvo sumažintas iki 50 Hz ir išlygintas penkių taškų viduriniu filtru. 470 nm ir 405 nm signalų pateikimą atskirai žr. Išplėstiniai duomenys. 7.

Duomenys iš optinio pluošto padėties buvo įtraukti į analizę, jei pluošto antgalis buvo NAc, o fluorescencinis atsakas į bent vieną užduotį buvo z-> 1 balas. Šie kriterijai neįtraukė vienos žiurkės ir davė tris žiurkes / keturias vietas (IM1065 - kairė, IM1066 - dvišalis, IM1089 - dešinė), skirtą dLight1.1, ir keturias žiurkes / šešias vietas (IM1088 - dvišalis, IM1105 - dešinė, IM1106 - dvišalis, IM1107-dešinėje) „dLight1.3b“. Panašūs rezultatai buvo gauti dLight1.1 ir dLight1.3 (Išplėstiniai duomenys 7), todėl duomenys buvo sujungti.

Norint apskaičiuoti rampos kampą artėjimo tūpimo metu, mes nustatėme didžiausią / mažiausią gauto signalo reikšmę 0.5 lange prieš kiekvieną įvykį (centrinis arba maisto prievadas) ir matuojant pasirašytą kampą, jungiantį du kraštutinius.

DLight1.3b afinitetas ir molekulinė specifika

In vitro matavimai atlikti, kaip aprašyta anksčiau¹⁵. Trumpai tariant, HEK293T (ATCC CRL # 1573) ląstelės buvo kultivuojamos ir transfekuotos plazminėmis, koduojančiomis dlight1.3b, valdomą CMV promotoriumi, ir plaunamos HBSS (Life Technologies), papildyta Ca²⁺ (4mM) ir Mg²⁺ (2 mM) prieš vaizdą. Vaizdai buvo atlikti naudojant 40x aliejaus pagrindo objektą apverstame „Zeiss Observer LSN710“ konfokaliniame mikroskope, kurio bangos ilgis buvo 488 nm / 513 nm (sužadinimo / emisijos). Norint išbandyti jutiklio fluorescencijos reakcijas, atliekant mažiausiai du nepriklausomus eksperimentus, neurotransmiteriai buvo tiesiogiai pritaikyti vonioje, atliekant laiko intervalo vaizdą. Dopamino ir noradrenalino titravimas buvo gautas atlikus dešimt kartų serijinius praskiedimus, kad būtų pasiekta aštuonių skirtingų koncentracijų. Visi kiti neuromediatoriai buvo tiriami trimis nuosekliomis koncentracijomis (100 nM, 1 µM ir 10 µM). Visos neuromediatorių koncentracijos buvo gautos skiedžiant iš 1 mM pradinės koncentracijos HBSS, paruošto šviežio. Fidžyje buvo apskaičiuotas neapdorotas fluorescencijos intensyvumas, gaunant laiko intervalo vaizdą; kiekviena IG rankiniu būdu buvo nupiešta ant atskirų ląstelių membranos. Fluorescuojančio klostės pokytis (ΔF/F) buvo apskaičiuota kaip F pikas (vidutinis keturių kadrų fluorescencijos intensyvumas) - F bazinis (vidutiniškai keturių kadrų fluorescencijos intensyvumas prieš pridedant ligandus) /F bazinis. Grafikai ir statistinė analizė atlikti naudojant „GraphPad Prism 6“. Duomenų taškai buvo išanalizuoti naudojant vienai vietai būdingą surišimo kreivę K_d vertės. Dėžutėse, kuriose yra skardos ir skardinės, langelis apima 25% į 75% diapazoną, o šluostės - nuo mažiausios iki didžiausios vertės.

Ataskaitų suvestinė

Daugiau informacijos apie mokslinių tyrimų projektą galima rasti Gamtos tyrimų ataskaitų santrauka susiję su šiuo dokumentu.

Šiame tyrime naudojamas virusas AAV.Synapsin.dLight1.3b buvo deponuotas su Addgene (Nr. 125560; http://www.addgene.org). Visus duomenis bus galima rasti „Computational Research in Computational Neuroscience“ duomenų mainų svetainėje (https://doi.org/110.6080/K0VQ30V9).

Pasirinktinis MATLAB kodas prieinamas JDB prašymu

Leidėjo pastaba: "Springer" gamta išlieka neutrali dėl jurisdikcijos reikalavimų paskelbtuose žemėlapiuose ir institucinėse įstaigose.

Dėkojame P. Dayanui, H. Fieldsui, L. Frankui, C. Donaghuei ir T. Faustui už komentarus ankstyvojoje rankraščio versijoje, o V. Hetrick, R. Hashim ir T. Davidson - techninės pagalbos ir patarimų. Šį darbą palaikė Nacionalinis piktnaudžiavimo narkotikais institutas, Nacionalinis psichikos sveikatos institutas, Nacionalinis neurologinių sutrikimų ir insulto institutas, Mičigano universitetas, Ann Arboras ir Kalifornijos universitetas San Franciske.

Informacija apie peržiūrą

Gamta dėkoja Margaret Rice ir kitam anonimiškam recenzentui (-ams) už jų indėlį atliekant šio darbo tarpusavio vertinimą.

Autorius pažymi

1. Šie autoriai prisidėjo vienodai: Ali Mohebi, Jeffrey R. Pettibone

Narystė

1. Neurologijos katedra, Kalifornijos universitetas, San Franciskas, San Franciskas, CA, JAV

   • Ali Mohebi
   • , Jeffrey R. Pettibone
   •  & Joshua D. Berke

2. Browno universiteto Neurologijos katedra, Providence, RI, JAV

   • Arif A. Hamid

3. Mičigano universiteto Chemijos katedra, Ann Arbor, MI, JAV

   • Jenny-Marie T. Wong
   •  & Robertas T. Kennedy

4. Neurologijos studijų programa, Kalifornijos universitetas, San Franciskas, San Franciskas, Kalifornija, JAV

   • Leah T. Vinson
   •  & Joshua D. Berke

5. Kalifornijos universiteto, Davis, Davis, CA, JAV medicinos mokyklos biochemijos ir molekulinės medicinos katedra

   • Tommaso Patriarchi
   •  & Linas Tianas

6. Kalifornijos universitetas, San Franciskas, San Franciskas, JAV

   • Joshua D. Berke

Įmokos

AM atliko ir analizavo elektrofiziologiją ir fotometriją bei taikė skaičiavimo modelį. JRP atliko ir išanalizavo mikrodializę, padedant J.-MTW, o RTKAAH prižiūrėjo elgesio užduotį ir pradinį fotometrijos nustatymą, atliko voltammetriją. LTV atliko retrogradinį atsekimą ir analizę. TP ir LT sukūrė „dLight“ jutiklį ir pasidalino patirtimi. JDB sukūrė ir prižiūrėjo tyrimą ir parašė rankraštį.

Konkuruojantys interesai

Autoriai nerodo jokių konkuruojančių interesų.

Autorius susirašinėjimui

Susirašinėjimas su Joshua D. Berke.