Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Paskelbta internete 2017 Gegužė 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Abstraktus
Tikslai/hipotezė
Maistinių riebalų persivalgymas sukelia žmonių ir graužikų nutukimą. Naujausi tyrimai su žmonėmis ir graužikais parodė, kad priklausomybė nuo riebalų turi bendrą mechanizmą, kaip ir priklausomybė nuo alkoholio, nikotino ir narkotikų, kalbant apie smegenų atlygio sistemų disfunkciją. Buvo pabrėžta, kad riebi dieta (HFD) susilpnina dopamino D2 receptorių (D2R) signalus striatumoje, kuris yra pagrindinis smegenų atlygio sistemos reguliatorius, todėl atsiranda hedoninis persivalgymas. Anksčiau pranešėme, kad rudiesiems ryžiams būdinga bioaktyvi sudedamoji dalis γ-orizanolis sumažino pirmenybę HFD per pagumburio kontrolę. Todėl ištyrėme galimybę, kad γ-orizanolis moduliuotų pelių smegenų atlygio sistemos funkcionavimą.
Metodai
C57BL/6J pelių patinai, maitinami HFD, buvo gydomi per burną γ-orizanoliu ir buvo įvertintas D2R signalizacijoje dalyvaujančių molekulių striatalinis lygis. Buvo ištirtas γ-orizanolio poveikis D2R promotoriaus DNR metilinimui ir vėlesniems mitybos riebalų pasirinkimo pokyčiams. Be to, buvo ištirtas 5-aza-2′-deoksicitidino, stipraus DNR metiltransferazių (DNMT) inhibitoriaus, poveikis maisto pasirinkimui, D2R signalizacijai ir DNMT lygiui striatumoje. γ-orizanolio slopinamasis poveikis DNMT aktyvumui buvo fermentiškai įvertintas in vitro.
rezultatai
Pelių, maitinamų HFD, striatume D2R gamyba sumažėjo dėl D2R promotoriaus srities DNR metilinimo padidėjimo. Geriamasis γ-orizanolio vartojimas sumažino DNMT ekspresiją ir aktyvumą, taip atkurdamas D2R lygį striatumoje. Farmakologinis DNMT slopinimas 5-aza-2′-deoksicitidinu taip pat pagerino pirmenybę maistiniams riebalams. Remiantis šiais duomenimis, fermentiniai in vitro tyrimai parodė, kad γ-orizanolis slopina DNMT aktyvumą.
Išvados/aiškinimas
Mes parodėme, kad γ-orizanolis pagerina HFD sukeltą D2R promotoriaus srities DNR hipermetilinimą pelių striatumoje. Mūsų eksperimentinė paradigma pabrėžia, kad γ-oryzanol yra daug žadanti medžiaga nuo nutukimo, turinti išskirtinę savybę būti nauju epigenetiniu moduliatoriumi.
Elektroninė papildoma medžiaga
Internetinėje šio straipsnio versijoje (doi:10.1007/s00125-017-4305-4) yra recenzuotos, bet neredaguotos papildomos medžiagos, kuri yra prieinama įgaliotiems vartotojams.
Įvadas
Nutukusių asmenų persivalgymas turi bent iš dalies bendrų mechanizmų, susijusių su priklausomybe nuo alkoholio, nikotino ir narkotinių medžiagų.1]. Be pagumburio ir hormonų apetito reguliavimo, smegenų atlygio sistema, ypač dopamino receptorių signalizacija, yra glaudžiai susijusi su priklausomybe ar hedonišku maitinimosi elgesiu.2]. Ankstesnis tyrimas su žiurkėmis parodė, kad striatalinio dopamino D2 receptorių (D2R) numušimas dėl lentiviruso sukelto trumpo plaukų segtuko, trukdančio RNR, greitai sukėlė į priklausomybę panašų atlygio trūkumą ir į prievartą panašų maisto ieškojimą.3]. Dėl sumažėjusio D2R tankio nugaros striatumas mažiau reaguoja į maisto atlygį, palyginti su liesomis kontrolinėmis grupėmis nutukusiems žmonėms ir graužikams.3-5]. Remiantis šia sąvoka, TaqIA alelis ANKK1 geno lokusas (koduojantis DRD2/ankirino kartojimą ir kinazės domeną, kuriame yra 1), kuris mažina striatalinę D2R gamybą, yra susijęs su nutukusiu žmonių fenotipu [6], o svorio netekimo po bariatrinės operacijos pasekmės yra susijusios su padidėjusiu striato D2R tankiu [7]. Šie duomenys tvirtai rodo striatalinio D2R, kaip naujo terapinio taikinio nutukimo gydymui, svarbą. Tačiau kai kurie sukurti vaistai, kurie veikė smegenų atlygio sistemą, sukėlė didelį neigiamą poveikį, įskaitant rimtas psichikos problemas, dėl kurių jie galiausiai buvo pašalinti iš klinikų [8].
Epigenetinės modifikacijos yra labai svarbios ne tik vystymuisi ir diferenciacijai, bet ir todėl, kad jos atsiranda dėl aplinkos pokyčių, įskaitant mitybą ir gyvenimo būdą.9]. DNR metilinimas yra pagrindinis epigenetinis įvykis, užtikrinantis genų ekspresijos stabilumą.9]. Žiurkių patelei vartojant daug riebalų turinčią dietą (HFD) iš kartos į kartą keičiasi DNR metilinimas centrinėje palikuonių atlygio sistemoje, todėl jaunikliai per daug suvartoja HFD.10]. Visų pirma, DNR metiltransferazės (DNMT) atlieka svarbų vaidmenį reguliuojant tiek maitinimosi elgesį, tiek fizinį aktyvumą.10, 11], o tai rodo, kad DNMT gali būti perspektyvūs terapiniai taikiniai nutukimo ir diabeto sindromo gydymui. Svarbu tai, kad kai kurios natūralios maisto medžiagos, įskaitant kavos rūgštį ir epigalokatechiną, veikia kaip DNMT inhibitoriai.12, 13].
Neseniai parodėme, kad bioaktyvus, rudiesiems ryžiams būdingas komponentas γ-orizanolis, ferulo rūgšties esterio ir kelių fitosterolių mišinys, sumažina pirmenybę maistui gauti, nes sumažina pagumburio endoplazminio tinklo (ER) stresą.14]. Pelėms ir triušiams per burną pavartotas γ-orizanolis greitai absorbuojamas iš žarnyno ir daugiausia pasiskirsto smegenyse.15, 16]. Apibendrinant šias išvadas, natūralūs maisto produktai, veikiantys centrinę nervų sistemą, galėtų būti alternatyva saugiam nutukimo sutrikusiam maitinimosi elgesiui pagerinti. Šiame kontekste išbandėme hipotezę, kad γ-orizanolis pakeis DNR metilinimo būseną smegenų atlygio sistemoje, todėl pelėms susilpnėtų HFD pirmenybė.
Metodai
Gyvūnai
Septynių savaičių amžiaus C57BL/6J pelių patinai, gauti iš Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japonija), buvo laikomi (3–4 narve) be specifinių patogenų 24 °C temperatūroje, 12 h/12 h šviesoje. tamsus ciklas. Po savaitės aklimatizacijos 8 savaičių pelių svoris buvo suderintas ir suskirstytos į dvi ar tris grupes, kad būtų atliktas kiekvienas eksperimentas. Pelėms buvo leista laisvai prieiti prie maisto ir vandens. Visi eksperimentai su gyvūnais buvo patvirtinti Ryukyus universiteto Eksperimentų su gyvūnais etikos komiteto (Nr. 5352, 5718 ir 5943).
γ-orizanolio ir 5-aza-2′-deoksicitidino skyrimas
Norint įvertinti pirmenybę HFD, γ-orizanolis (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonija) 8 savaičių amžiaus pelėms buvo sušvirkštas zondu per maisto pasirinkimo testą, kaip aprašyta anksčiau.14, 17]. Kitų eksperimentų metu granulių pavidalu buvo pagamintas HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, JAV), turintis 0.4% γ-orizanolio. Dietos sudedamosios dalys pateiktos elektroninės papildomos medžiagos (ESM) lentelėje 1. Po 12 savaičių maitinimo audiniai buvo paimti iš striatumo ir pagumburio. Kasdien suvartojama γ-orizanolio norma, apskaičiuota pagal vidutinį pelių suvartojamą maistą, buvo maždaug 320 μg/g kūno svorio. γ-orizanolio dozės buvo nustatytos taip, kaip aprašyta anksčiau [14]. 5-aza-2′-deoksicitidinas (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) buvo švirkščiamas į pilvaplėvės ertmę (0.25 μg/g kūno svorio) tris kartus per savaitę 12 savaičių.18].
Pirmenybės maistiniams riebalams įvertinimas
Norint įvertinti maisto riebalų pirmenybę, maisto testuose buvo galima pasirinkti tarp čiaudo ir HFD (D12450B ir D12451; tyrimų dietos), kaip aprašyta anksčiau [14]. Dietos komponentai pateikti ESM lentelėje 1. Trumpai tariant, pelėms buvo leista laisvai prieiti prie chow ir HFD. Chow ir HFD suvartojimas buvo matuojamas kas savaitę ir analizuojamas, ar keičiasi mitybos riebalai. HFD pirmenybė buvo apskaičiuota pagal formulę: HFD pirmenybė = [(HFD suvartojimas / bendras maisto suvartojimas) × 100].
Bisulfito sekos nustatymas DNR metilinimui
DNR buvo išgryninta naudojant DNeasy Blood & Tissue rinkinį (QIAGEN, Tokijas, Japonija). DNR tirpalas buvo sumaišytas su šviežiai paruoštu 3 mol/l NaOH, inkubuojamas 37 °C temperatūroje 15 min. ir pridedamas prie 5.3 mol/l karbamido, 1.7 mol/l natrio bisulfito ir 4.9 mmol/l hidrochinono. Tirpalas buvo denatūruojamas 15 ciklų 95 °C temperatūroje 30 s ir inkubuojamas 50 °C temperatūroje 15 min.19]. Bisulfitu apdorota DNR buvo išgryninta naudojant MinElute PCR valymo rinkinį (QIAGEN) ir amplifikuota PGR naudojant KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix PCR rinkinį (KAPA Biosystems, Woburn, MA, JAV) ir pradmenis aplink D2R promotoriaus srities CpG vietą. . Pradmenų sekos buvo tokios: priekinis pradmuo, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3′; atvirkštinis gruntas, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3′. Tada adapterių sekos buvo pridėtos ir išvalytos naudojant Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, JAV). Tada mėginiai buvo sujungti ir įkelti į GS Junior (Roche Diagnostics, Tokijas, Japonija), kad būtų galima nustatyti seką pagal gamintojo protokolą. Metilinimo lygis buvo išreikštas metilintų citozinų procentine dalimi visose citozinų liekanose.
DNMT aktyvumo tyrimas
DNMT fermentinio aktyvumo tyrimas buvo atliktas naudojant EpiQuik DNR metiltransferazės aktyvumo / slopinimo tyrimo rinkinį (Epigentek Group, Bruklinas, NY, JAV) ir EPIgeneous Methyltransferase Assay rinkinį (Cisbio Japan, Chiba, Japonija) pagal gamintojo protokolus.
Norint įvertinti kiekvieno junginio slopinamąjį aktyvumą DNR metilinimui, susidarymui S- adenozil-l-homocisteinas (SAH) buvo išmatuotas dalyvaujant kiekvienam junginiui (20 μmol/l atrankos tyrimams), S-adenozilmetioninas (SAM; 10 μmol/l) ir DNMT substratas (4 ng/μl) 37°C temperatūroje 90 min. Norint įvertinti Michaelis-Menten kinetiką, DNMT1 (20 μmol/l) buvo inkubuojamas su γ-orizanoliu, SAM (5 μmol/l) ir nurodyta poli dI-dC koncentracija 37°C temperatūroje 90 min. DNMT3a (100 μmol/l) ir DNMT3b (100 μmol/l) buvo inkubuojami su γ-orizanoliu, SAM (5 μmol/l) ir nurodyta poli dG·dC koncentracija 37°C temperatūroje 120 min. Tyrimai buvo atlikti keturiais egzemplioriais. Ekstrahuotas baltymas (0.75 mg/ml) buvo inkubuojamas su SAM (5 μmol/l), poli dI-dC (5 μg/ml) ir poli dG·dC (5 μg/ml) 40 °C temperatūroje 120 min. Išmatuotas SAH susidarymas.
Su estrogenais susijęs receptorių-γ aktyvumo tyrimas
Galimas antagonistinis γ-orizanolio aktyvumas su estrogenu susijusiam receptoriui-γ (ERRγ) buvo įvertintas naudojant žmogaus estrogenų receptorių gama reporterio tyrimo sistemą (INDIGO Bioscience, State College, PA, JAV) pagal gamintojo protokolą. Trumpai tariant, ne žmogaus žinduolių reporterių ląstelės, konstituciškai ekspresuojančios aktyvų ERRγ, buvo veikiamos nurodytomis kiekvieno junginio koncentracijomis 24 valandas trimis egzemplioriais.
Western blotting
Tai buvo atlikta taip, kaip aprašyta anksčiau [20] su antikūnais prieš D2R (1:500, triušis), dopamino transporterį (DAT; 1:500, triušis), tirozino hidroksilazę (TH; 1:1000, triušis) (AB5084P, AB1591P ir AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, JAV), signalo keitiklis ir transkripcijos 3α (STAT3α; 1:1000, triušis), DNMT1 (1:1000, triušis), DNMT3a (1:1000, triušis) (nr. 8768, 5032 ir 3598; ląstelių signalizacijos technologija, aktyvatorius). Tokijas, Japonija), DNMT3b (1 μg/ml, triušis), ERRγ (1:1000, triušis) ir β-aktinas (1:10,000 16049, pelė) (ab128930, ab6276 ir abXNUMX; Abcam, Kembridžas, MA, JAV).
Kiekybinė realaus laiko PGR
Genų ekspresija buvo ištirta, kaip aprašyta anksčiau [14]. mRNR lygis buvo normalizuotas iki Rn18s (18S rRNR). Pradmenų rinkiniai, naudojami kiekybinėms realaus laiko PGR analizėms, yra apibendrinti ESM lentelėje 2.
Statistinė analizė
Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. Kai taikytina, buvo naudojama vienpusė ANOVA ir kartotinių matavimų ANOVA, po kurios buvo atlikti keli palyginimo testai (Bonferroni-Dunn metodas). Studentės t testas buvo naudojamas dviejų grupių skirtumams analizuoti. Skirtumai buvo laikomi reikšmingais p <0.05.
rezultatai
Farmakologinis DNMT slopinimas 5-aza-dC sumažino pelių pirmenybę mitybos riebalams
Pelėms, maitinamoms HFD, DNR metilinimas D2R promotoriaus srityje striatumoje buvo žymiai padidintas, palyginti su pelėmis, maitinamomis čiaudo dieta (XNUMX pav.). (1a pav.).1a). Kita vertus, pagumburio DNR metilinimas D2R promotoriaus srityje buvo akivaizdžiai didesnis nei striatum, laikantis čiaudo dietos (p < 0.01) (Pav. (1a, 1 pava, f) ir jo nepakeitė HFD (1 pav.). (1f pav.).1f). Pelėms, maitinamoms HFD, padidintas DNR metilinimas D2R promotoriaus srityje striatumoje buvo normalizuotas apdorojant 5-aza-dC, stipriu DNMT inhibitoriumi (XNUMX pav.). (1a pav.).1a). Priešingai, DNR metilinimas D2R promotoriaus srityje pagumburyje nebuvo reikšmingai pakeistas gydant 5-aza-dC (XNUMX pav.). (1f pav.).1f). 20 savaičių amžiaus pelių patinų, 12 savaičių šeriamų HFD, striatumoje reikšmingai sumažėjo D2R mRNR ir baltymų kiekis (XNUMX pav.). (1b,1 pavb, k, l). Priešingai, dopamino D1 receptorių lygiai (D1Rs, koduoja Drd1), kurie veikia priešingai nei D2R adenililciklazę ir cAMP tarpininkaujamą tarpląstelinį signalizavimą, nepakito (XNUMX pav.). (1c pav.).1c). Be to, nepakito kitų su D2R signalizavimu susijusių molekulių, tokių kaip TH ir DAT, lygiai mRNR ir (arba) baltymų lygiu (XNUMX pav.). (1d, 1 pavd, e, k, m). Kita vertus, nepastebėta jokių akivaizdžių pagumburio pokyčių, įskaitant D2R (XNUMX pav.). (1g pav.–m).1g–m). Pažymėtina, kad D2R ir TH baltymų kiekis pagumburyje buvo daug mažesnis nei striatum (XNUMX pav.). (1l,1 pavl, m), galbūt atspindinti santykinę dopamino receptorių signalizacijos svarbą smegenų atlygio sistemoje, palyginti su pagumburiu.
Norint ištirti, ar DNR metilinimas D2R promotoriaus regione pakeis pirmenybę dietiniams riebalams, buvo analizuojamas 5-aza-dC gydytų pelių maitinimosi elgesys. Kaip ir tikėtasi, 5-aza-dC žymiai padidino D2R mRNR ir baltymų kiekį HFD maitinamų pelių striatumoje (XNUMX pav.). (1b,1 pavb, k, l). Kita vertus, nebuvo jokio poveikio lygiams Drd1, Th ir Slc6a3 (koduojantis DAT) striatumoje arba jo lygiuose Drd2, Drd1, Th ir Slc6a3 pagumburyje (pav. (1c–e, 1 pavc–e, g–m). Kadangi nešikliu gydytos pelės pirmenybę teikė HFD, 5-aza-dC gydytų pelių pirmenybė HFD buvo žymiai sumažinta (88% nešikliu gydytų pelių verčių) (XNUMX pav.). (1n pav.).1n). Todėl gydymas 5-aza-dC sumažino kūno svorio padidėjimą (XNUMX pav.). (11 pavo).
γ-orizanolis sumažina DNMT kiekį HFD maitinamų pelių striatumoje
Kaip jau pranešėme [14], γ-orizanolio davimas pelių patinams per zondą žymiai sumažino pirmenybę HFD (93 % nešikliu gydytų pelių verčių) (XNUMX pav.). (2a pav.), 2a), todėl akivaizdžiai sumažėja kūno svorio padidėjimas (1 pav.). (2b pav.).2b). Todėl ištyrėme galimą γ-orizanolio poveikį epigenetiniam D2R moduliavimui striatumoje.
Žinduolių organizme yra trys pagrindiniai DNMT – DNMT1, 3a ir 3b. DNMT1 palaiko DNR metilinimą, o DNMT3a ir 3b atlieka svarbų vaidmenį palengvinant de novo DNR metilinimą.21]. Norėdami ištirti galimą γ-orizanolio poveikį DNMT in vivo, įvertinome DNMT lygį HFD maitinamų pelių smegenyse. Nors HFD per se neturėjo įtakos DNMT mRNR ir baltymų lygiui nei juostoje, nei pagumburyje, papildymas γ-orizanoliu reikšmingai sumažino DNMT kiekį striatumoje, bet ne pagumburyje (1 pav.). (2c–e, 2 pavc–e, g–i, k–n). Šie duomenys padidina galimybę, kad γ-orizanolis gali reguliuoti DNMT lygius specifiniu striatumui. Panašiai 5-aza-dC žymiai sumažino DNMT3a ir 3b mRNR lygį, pirmiausia striatume (ESM Fig. 1Reklama).
Remiantis ankstesniu tyrimu, rodančiu, kad DNMT1 mRNR lygį bent iš dalies teigiamai reguliavo branduolinis receptorius ERRγ.22], ištyrėme galimą γ-orizanolio poveikį ERRγ aktyvumui. Ne žmogaus žinduolių ląstelėse, kurios konstituciškai ekspresuoja aktyvų ERRγ, 4-hidroksitamoksifenas, stiprus atvirkštinis ERRγ agonistas, žymiai sumažino ERRγ aktyvumą. Pažymėtina, kad γ-orizanolis iš dalies sumažino ERRγ aktyvumą (maždaug 40% sumažino įgimtą vertę) (XNUMX pav.). (3a pav.).3a). Svarbu tai, kad ERRγ buvo stipriai išreikštas striatume, bet ne pagumburyje (1 pav.). (3b–d pav.).3b–d). Priešingai nei striatumo atveju, γ-oryzanolis žymiai padidino DNMT1 baltymų kiekį tik pagumburyje (XNUMX pav.). (2k, 2 pavk, l). Šiuos rezultatus bent iš dalies galima paaiškinti mūsų atradimu, kad STAT3α, teigiamas DNMT1 lygio reguliatorius [23], buvo gausiai išreikštas pagumburyje, bet ne striatumoje (1 pav.). (33 pave–g).
Siekiant toliau įvertinti γ-orizanolio poveikį DNMT aktyvumui in vivo, SAH, šalutinio DNR metilinimo produkto ir taip pat stipraus DNMT inhibitoriaus, susidarymas buvo įvertintas γ-orizanoliu apdorotose pelėse, maitinamose HFD. Nebuvo jokių reikšmingų SAH susidarymo pokyčių nei striatumoje, nei pagumburyje tarp pelių, maitinamų HFD ir šeriamų maistu (1 pav.). (2f, 2 pavf, j). Pastebėtina, kad γ-orizanolis žymiai sumažino SAH susidarymą striatumoje (1 pav.). (2f pav.)2f), bet ne pagumburyje (1 pav.). (2j pav.),2j), o tai rodo, kad γ-orizanolis HFD maitinamose pelėse gali slopinti DNMT aktyvumą specifiniu būdu.
Fermentinės γ-orizanolio slopinamųjų savybių DNMT in vitro analizės
Toliau įvertinome γ-orizanolio poveikį DNMT aktyvumui in vitro. Buvo įvertintas γ-orizanolio, ferulo rūgšties, 5-aza-dC, haloperidolio (reprezentatyvaus D2R antagonisto), chinpirolio (reprezentatyvaus D2R agonisto) ir SAH slopinimas prieš DNMT. Kaip teigiama kontrolė, SAH stipriai susilpnino DNMT aktyvumą priklausomai nuo dozės (XNUMX pav.). (4a–f pav.).4a–f). Kaip ir tikėtasi, haloperidolis ir chinpirolis neturėjo įtakos DNMT veiklai (ESM pav. 2). Pastebėtina, kad γ-orizanolis reikšmingai slopino DNMT1 aktyvumą (IC50 = 3.2 μmol/l), 3a (IC50 = 22.3 μmol/l) ir 3b (maksimalus slopinimas 57 %) (pav. (4d–f pav.).4d–f). Priešingai, ferulo rūgšties, γ-orizanolio metabolito, slopinamasis aktyvumas buvo daug mažesnis nei γ-orizanolio (1 pav.). (44 pavd–f).
Toliau tyrėme γ-orizanolio slopinančias savybes DNMT. Siekiant įvertinti γ-orizanolio slopinamąjį aktyvumą DNMT in vitro, buvo matuojamas SAH susidarymas. Duomenys apie SAH susidarymą DNMT tarpininkaujamo DNR metilinimo metu rodo įsotintą Michaelis – Menten kinetikos modelį tiek γ-orizanolio buvimui, tiek nebuvimui (1 pav.). (4g–i pav.).4g–i). DNMT1 tarpininkaujamo DNR metilinimo metu Eadie-Hofstee analizė parodė, kad γ-orizanolis neparodė jokio poveikio V daugiausia SAH susidarymo (nešiklis, 597 pmol/min; γ-orizanolis 2 μmol/l, 619 pmol/min; γ-orizanolis 20 μmol/l, 608 pmol/min), o γ-orizanolis akivaizdžiai padidino K m (transporto priemonė, 0.47 μg/ml; γ-orizanolis 2 μmol/l, 0.67 μg/ml; γ-orizanolis 20 μmol/l, 0.89 μg/ml) (Pav. (4j pav.).4j). Šie rezultatai rodo, kad γ-orizanolis bent iš dalies slopina DNMT1 konkurenciniu būdu. Kita vertus, DNMT3a ir 3b tarpininkaujamo DNR metilinimo atveju γ-orizanolis sumažino V daugiausia SAH susidarymo (DNMT3a: nešiklis, 85.3 pmol/min; γ-orizanolis 2 μmol/l, 63.1 pmol/min; γ-orizanolis 20 μmol/l, 42.5 pmol/min; DNMT3b: nešiklis, 42.3 pmol/min. -orizanolis 2 μmol/l; 28.0 pmol/min, γ-orizanolis 20 μmol/l, 15.0 pmol/min) ir panašiai K m šiai reakcijai (DNMT3a: nešiklis, 0.0086 μg/ml; γ-orizanolis 2 μmol/l, 0.0080 μg/ml; γ-orizanolis 20 μmol/l, 0.0058 μg/ml; DNMT3b: nešiklis, 0.0122 μg/ml; orizanolis 2 μmol/l, 0.0097 μg/ml; γ-orizanolis 20 μmol/l, 0.0060 μg/ml) (Pav. (4k, 4 pavk, l). Šie rezultatai rodo, kad γ-orizanolis bent iš dalies slopina DNMT3a ir 3b nekonkurenciniu būdu.
γ-orizanolis padidina D2R lygį HFD maitinamų pelių striatumoje
Toliau išbandėme galimybę, kad γ-orizanolis padidins striato D2R kiekį slopindamas DNMT. Pelėms, maitinamoms HFD, geriamasis γ-orizanolio vartojimas žymiai sumažino striatalinio DNR metilinimą D2Rs promotoriaus srityje (XNUMX pav.). (5a pav.), 5a), tuo tarpu pagumburyje to nepadarė (1 pav.). (5f pav.).5f). Remiantis šiais duomenimis, D2R mRNR ir baltymų lygiai buvo abipusiai padidinti (XNUMX pav.). (5b,5 pavb, g, k, l). Panašiai kaip duomenys apie gydymą 5-aza-dC (XNUMX pav.). (1 pav.), 1), akivaizdaus poveikio RNR ir baltymų lygiui nebuvo Drd1, Th ir Slc6a3 (DAT) striatumoje ir neturi jokio poveikio lygiui Drd1, Th ir Slc6a3 pagumburyje (pav. (5c–e, 5 pavc–e, h–k, m).
Ankstesni tyrimai parodė, kad D2R ir DNMT1 lygius reguliuoja ER stresas ir uždegimas, bent iš dalies per NF-κB.17, 24, 25]. Todėl ištyrėme su ER stresu susijusių ir su uždegimu susijusių genų lygius. Kaip buvo parodyta anksčiau [26], HFD padidino genų, koduojančių TNF-α, ekspresiją (Tnfa), monocitų chemoattraktanto baltymas-1 (MCP-1) (Ccl2), C/EBP homologinis baltymas (Pjaustyti), ER lokalizuotas DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) ir X-box surišančio baltymo 1 susijungimo forma (Xbp1s) pagumburyje, bet ne striatumoje (1 pav.). (6 pav.).6). Pažymėtina, kad HFD papildymas γ-orizanoliu žymiai sumažino padidintą ekspresiją Ccl2, Pjaustyti, Dnajb9 ir Xbp1s tik pagumburyje, bet ne striatumoje (1 pav.). (66 pav).
Diskusija
Pagrindinė šio tyrimo išvada yra ta, kad γ-oryzanolis veikia kaip stiprus DNMT inhibitorius pelių striatumoje, taip bent iš dalies susilpnindamas pirmenybę HFD dėl epigenetinio striatalinio D2R moduliavimo. HFD maitinamų pelių striatumoje D2R lygis buvo žymiai sumažėjęs, o D1R, TH ir DAT lygiai nepasikeitė (XNUMX pav.). (1b–e, 1 pavb–e, k–m). Šie duomenys atitinka nuostatą, kad striatalinio D2R reguliavimo sutrikimas vaidina lemiamą vaidmenį suvokiant atlygį už maistą, kai yra HFD, todėl nutukusiems gyvūnams atsiranda hedoninis per didelis HFD vartojimas.3]. Šiame tyrime HFD maitinamų pelių gydymas 5-aza-dC žymiai padidino striatalinio D2R lygį (XNUMX pav.). (1b,1 pavb, k, l), galbūt sumažinus DNR metilinimo lygį D2R promotoriaus srityje (XNUMX pav.). (1a pav.), 1a), todėl sumažėjo pirmenybė maistiniams riebalams (1 pav.). (1n pav.).1n). Ši išvada taip pat patvirtina svarbų striatalinių D2R vaidmenį suvokiant atlygį už maistą, kai yra HFD.
Mūsų in vitro tyrimas parodė, kad γ-orizanolio slopinamasis aktyvumas prieš DNMT buvo akivaizdžiai stipresnis nei jo metabolito ferulo rūgšties (1 pav.). (4d–f pav.),4d – f), rodantis visos γ-orizanolio struktūros svarbą jo slopinančiam poveikiui DNMT. HFD maitinamų pelių tyrimai rodo, kad po geriamojo vartojimo γ-orizanolis pasiekia smegenis kaip visa struktūra ir sumažina DNMT lygį bei aktyvumą, pirmiausia juostoje, dėl to sumažėja DNR metilinimas promotoriaus srityje. D2R striatumoje. Be to, mūsų in vitro tyrimai parodė, kad γ-orizanolis veikia kaip dalinis ERRγ antagonistas, kuris pirmiausia tarnauja kaip teigiamas DNMT1 gamybos reguliatorius.22], todėl sumažėjo DNMT1 aktyvumas (XNUMX pav.). (3a pav.).3a). Pažymėtina, kad ERRγ buvo labai išreikštas pelių striatumoje, bet ne pagumburyje (1 pav.). (3b pav.).3b). Šie duomenys rodo, kad γ-orizanolis gali sumažinti DNMT1 mRNR lygį, bent iš dalies, slopindamas ERRγ. Priešingai nei striatumas, γ-orizanolis neturėjo jokio poveikio D2R lygiui HFD maitinamų pelių pagumburyje (XNUMX pav.). (5g, 5 pavg, k, l).
Kita vertus, mes parodėme, kad γ-oryzanolis žymiai padidino DNMT1 kiekį pagumburyje, bet ne striatumoje (XNUMX pav.). (2k, 2 pavk, l). Buvo įrodyta, kad STAT3 padidina DNMT1 kiekį piktybinėse T limfomos ląstelėse.23]. Pažymėtina, kad anksčiau įrodėme, kad γ-orizanolis žymiai padidino leptino sukeltą STAT3 fosforilinimą HFD maitinamų pelių pagumburyje.14]. Taip pat reikėtų pažymėti, kad STAT3α iš esmės buvo išreikštas pagumburyje, bet ne pelių striatumoje (XNUMX pav.). (3e–g pav.).3e–g). Šie duomenys vilioja spėlioti, kad akivaizdus γ-orizanolio poveikio DNMT1 lygiui tarp pagumburio ir striatumo skirtumas gali būti bent iš dalies susijęs su specifiniu STAT3α ir ERRγ kiekiu pelių smegenyse. Fig. (3b–g pav.).3b–g). Apskritai, atrodo, kad pelėms yra abipusis ERRγ ir STAT3α ekspresijos modelis tarp striatumo ir pagumburio. Todėl, remiantis mūsų rezultatais, pagrįsta spėlioti, kad striatumoje, kur ERRγ gamyba yra gausi, γ-orizanolis gali pirmiausia sumažinti DNMT1 mRNR lygį ir fermentų aktyvumą, kaip neigiamą ERRγ reguliatorių. Priešingai, pagumburyje, kur dominuoja STAT3α gamyba, γ-orizanolis gali pirmiausia padidinti DNMT1 lygį.
Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad striatalinio D2R signalo susilpnėjimas, kurį sukelia HFD, sutrikdo maitinimosi elgesį.3], o tai rodo galimą striatalinių DNMT slopinimo svarbą nutukimo gydymui. Kita vertus, ankstesnis tyrimas parodė galimybę, kad melanokortino receptoriaus 4 geno DNR metilinimo būsena, išreikšta specifiniuose pagumburio branduoliuose, gali modifikuoti transgeneracines nutukimo formas agouti gyvybingose geltonose pelėse.27]. Nors reikalingi tolesni tyrimai, siekiant išsiaiškinti pagrindinius mechanizmus, šie tyrimai rodo audinių, genų ir sekos specifinio DNR metilinimo svarbą HFD sukelto nutukimo patofiziologijoje.
Neseniai pranešėme, kad HFD padidino D2R lygį pelių kasos salelėse [17, 24]. Tikėtina, kad tokį padidėjimą bent iš dalies lemia ER stresas ir uždegimas per NF-κB, nes D2R promotoriaus srityje yra keletas į NF-κB reaguojančių elementų.17, 24]. Be to, neseniai atliktas tyrimas parodė, kad TNF-α ir IL-1β padidina DNMT1 lygį ir aktyvumą HFD maitinamų pelių riebaliniame audinyje.25]. Svarbu tai, kad šis tyrimas parodė, kad HFD sukėlė ER stresą ir uždegimą, pirmiausia pagumburyje, bet ne striatumoje (1 pav.). (6 pav.).6). Išsamūs audinių, regiono ir vietos specifinio DNR metilinimo ir demetilinimo mechanizmai mūsų eksperimentinėje paradigmoje turi laukti tolesnio tyrimo.
Kartu su mūsų ankstesne ataskaita, rodančia, kad γ-orizanolis susilpnina pirmenybę HFD, reguliuodamas pelių ER stresą pagumburiu.14], γ-orizanolis taip pat yra unikali savybė, gerinanti tiek hedoninį, tiek metabolinį maitinimosi reguliavimo sutrikimą. Kadangi žinoma, kad kai kurie sukurti vaistai nuo nutukimo sukelia kritinį neigiamą poveikį [8], tikimasi, kad natūralų maistą pagrįstą požiūrį į smegenų atlygio sistemą galima saugiai gydyti nutukimo ir diabeto sindromu [16]. Šioje paradigmoje γ-orizanolis yra perspektyvus kandidatas prieš nutukimą, turintis išskirtinę savybę būti epigenetiniu moduliatoriumi.
Padėka
Esame dėkingi S. Okamoto (University of the Ryukyus, Japonija) už rankraščio recenzavimą. Dėkojame M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato ir C. Noguchi (Ryukyus universitetas, Japonija) už sekretoriato pagalbą.
Santrumpos
| 5-aza-dC | 5-aza-2'-deoksicitidinas |
| D1R | Dopamino D1 receptorius |
| D2R | Dopamino D2 receptorius |
| DAT | Dopamino transporteris |
| DNMT | DNR metiltransferazė |
| ER | Endoplazminis Tinklelis |
| ERR | Su estrogenais susijęs receptorius |
| HFD | Didelio riebalų dieta |
| SAH | S-Adenozil-l-homocisteinas |
| SAM | S-Adenozilo metioninas |
| STAT3α | Signalo keitiklis ir transkripcijos 3α aktyvatorius |
| TH | Tirozino hidroksilazė |
pastabos
Duomenų prieinamumas
Dabartinio tyrimo metu sugeneruotus ir (arba) analizuotus duomenų rinkinius pagrįstu prašymu gali gauti atitinkamas autorius.
Finansavimas
Šį darbą iš dalies rėmė Japonijos mokslo skatinimo draugija (JSPS; KAKENHI dotacijos numeriai 15K19520 ir 24591338), Mokslo, technologijų ir inovacijų taryba (CSTI), tarpministerinė strateginių inovacijų skatinimo programa. (SIP) „Technologijos naujos kartos žemės ūkiui, miškininkystei ir žuvininkystei kurti“, Lotte fondas, Japonijos taikomosios enzimologijos fondas, Naujosios energetikos ir pramonės technologijų plėtros organizacija (NEDO), gyvybės mokslų tinklo formavimo projektas (farmacijos sritis). ) (Okinavos prefektūra, Japonija) ir Okinavos prefektūros (Japonija) medicinos grupavimo skatinimo projektas kartu su Okinavos prefektūros dotacija pažangiajai medicinai skatinti (Okinavos prefektūra, Japonija).
Interesų dvilypumas
Autoriai pareiškia, kad su šiuo rankraščiu nesusijęs interesų dvilypumas.
Įnašo pareiškimas
CK ir HM sukūrė tyrimą. CK ir TK atliko eksperimentus ir analizavo duomenis. TK, CS-O, CT, MT, MM ir KA prisidėjo prie duomenų interpretavimo. CK ir HM parašė rankraštį. Visi autoriai prisidėjo prie duomenų interpretavimo. Visi autoriai prisijungė prie rankraščio peržiūros ir patvirtino galutinę jo versiją. HM yra šio darbo garantas, turėjo visišką prieigą prie visų duomenų ir prisiima visą atsakomybę už duomenų vientisumą ir duomenų analizės tikslumą.
Išnašos
Elektroninė papildoma medžiaga
Internetinėje šio straipsnio versijoje (doi:10.1007/s00125-017-4305-4) yra recenzuotos, bet neredaguotos papildomos medžiagos, kuri yra prieinama įgaliotiems vartotojams.
Nuorodos
;