Ghrelin receptorių (GHS-R1A) antagonistas susilpnina morfino naudingas savybes ir padidina opioidų peptidų lygį pelių atlyginimų zonose (2015)

Ūmus ir lėtinis priklausomybę sukeliančių vaistų poveikis daro didelę įtaką mezolimbų dopamino sistemai, kuri yra svarbi smegenų atlygio sistemų grandinė (Nestler, 2005). Šis poveikis buvo pasiūlytas bent iš dalies paremti priklausomybės nuo narkotikų vystymąsi (Wise, 2004). Priklausomybė nuo narkotikų sukelia įvairų žalingą poveikį asmeniui ir visuomenei, todėl būtina imtis naujų farmakologinių intervencijų, gydančių šią didelę visuomenės sveikatos problemą (Koob ir Le Moal, 2001). Aiškinant signalizacijos sistemas, tarpininkaujančias priklausomybę sukeliančiuose vaistuose suaktyvinti mezolimbinę dopamino sistemą, galima nustatyti unikalias vaistų vartojimo sutrikimų gydymo strategijas.

Tyrimai parodė, kad įprasti neurobiologiniai mechanizmai reguliuoja maisto ir priklausomybę sukeliančių vaistų vartojimą ir atlygį (Morganstern et al., 2011), teigdami, kad maistą reguliuojančių žarnyno ir smegenų peptidų, tokių kaip grelinas, vaidmuo apima atlygį. Iš pradžių buvo parodyta, kad ghrelinas išskiria augimo hormoną (Kojima ir kt., 1999) ir sukelia žiurkių adipoziškumą (Tschop et al., 2000). Iki šiol yra gerai žinoma, kad ghrelin padidina suvartojamo maisto kiekį, alkį, taip pat skatina apetitą per pagumburio grandinės (apžvalgą žr. Egecioglu ir kt. (2011)). Be pagumburio, grelino receptoriai (GHS-R1A) yra išreikšti su atlygiu susijusiose srityse, tokiose kaip amygdala, striatum, prefrontalinė žievė, ventralinė tegmentalinė sritis (VTA) ir hipokampas (apžvalgą žr. Engel ir Jerlhag (2014)), o tai reiškia, kad fiziologinis grelino vaidmuo pranoksta energijos homoeostazės reguliavimą. Iš tiesų, buvo įrodyta, kad oreksigeninis peptidas grelinas yra mezolimbinės dopamino sistemos aktyvatorius, taip pat pelno atlygio, motyvacijos ir alkoholio, nikotino, amfetamino ir kokaino vartojimo reguliatorius (apžvalgą žr. Engel ir Jerlhag (2014)).

Opioidai, kaip ir kiti priklausomybę sukeliantys vaistai, aktyvina mezolimbinę dopamino sistemą, sukeldami kaupiamąjį dopamino išsiskyrimą per μ- ir / arba δ-opioidinių receptorių aktyvacija branduolio akumuliatoriuose (NAc) (Hirose ir kt., 2005, Murakawa ir kt., 2004, Yoshida ir kt., 1999) ir VTA, greičiausiai mažinant GABA - dopamino neuronų (Johnson and North, 1992) slopinimas. Be to, kaupiamieji κ-opioidiniai receptoriai reguliuoja mezolimbinės dopamino sistemos aktyvumą (Chefer et al., 2005, Spanagel et al., 1992). Pakartotinis opioidų poveikis sukelia adaptacinius kelių neurotransmiterių, įskaitant opioidinius peptidus, pokyčius apdovanojimo vietose, kurios prisideda prie priklausomybės vystymosi (De Vries ir Shippenberg, 2002). Žiurkėms dėl farmakologinio GHS-R1A slopinimo susilpnėja morfino sukeltas akumuliacinis dopamino išsiskyrimas ir stereotipinis elgesys (Sustkova-Fiserova ir kt., 2014). Šios eksperimento serijos pirmosios dalies tikslas buvo ištirti GHS-R1A antagonisto JMV2959 ūminį poveikį morfino gebėjimui sukelti lokomotorinę stimuliaciją, kaupiamąjį dopamino išsiskyrimą ir sąlygotosios vietos pelėms pasirinkimą. Antrosios šio tyrimo dalies tikslas buvo įvertinti pakartotinio gydymo JMV2959 arba ghrelin poveikį opioidinių peptidų (Met-enkefalinas-Arg⁶Phe⁷ (MEAP), dynorfinas B (DynB) ir Leu-enkefalinas-Argas⁶ (LeuArg)) srityse, susijusiose su atlygiu, įskaitant amygdalą, striatumą, priešfrontalinę žievę, VTA ir hipokampą.

Buvo naudojamos suaugusiųjų, lytinių lytinių brendimo amžiaus, amžiaus vyrų MRT pelės (8 – 12 savaičių ir 25 – 40 g kūno svorio; Charles River, Sulzfeld, Vokietija). Trumpai tariant, visos pelės buvo apgyvendintos grupėje ir palaikomos 12 / 12 h šviesos / tamsos cikle (lemputės įsijungė septyniais rytais). Buvo tiekiamas vanduo iš čiaupo ir maistas (normalus čiau; Harlan Teklad, Norfolkas, Anglija) ad libitum, išskyrus eksperimento metu. Naujos pelės buvo naudojamos kiekvienam atskiram elgesio tyrimui, taip pat opioidų peptidų analizei. Eksperimentams pritarė Švedijos etinis gyvūnų tyrimų komitetas Geteborge. Buvo stengiamasi kuo labiau sumažinti gyvūnų kančias ir sumažinti naudojamų gyvūnų skaičių. Visiems gyvūnams buvo leista aklimatizuotis mažiausiai savaitę prieš eksperimentų pradžią.

Morfino hidrochloridas („Apoteksbolaget Sahlgrenska“ ligoninė; Geteborgas, Švedija) buvo ištirpintas tirpiklyje (0.9% natrio chlorido tirpalas) ir prieš pradedant eksperimentą buvo švirkštas ip 20 mg / kg 10 doze. Ši dozė buvo pasirinkta, nes mažesnė dozė (10 mg / kg, ip) nesukėlė lokomotorinės stimuliacijos mūsų pelėms (duomenys nepateikti). Pasirinkta JMV6 dozė (2959 mg / kg, ip) (sintezuota Instituto des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR5247, CNRS, Montpellier 1 ir 2 universitetuose, Prancūzija), prieš tai buvo nustatyta GHS-R1A antagonistė ​​ir buvo nedarė įtakos lokomotoriniam aktyvumui, kaupiamajam dopamino išsiskyrimui ir sąlygotai vietai pelėms (Jerlhag et al., 2009). JMV2959 buvo ištirpintas tirpiklyje (0.9% natrio chlorido tirpalas) ir visada buvo skiriamas prieš dvidešimt minučių iki morfino ekspozicijos arba dekapitacijos opioidų peptidų kiekiui analizuoti. Pasirinkta JMV2959 dozė neturėjo įtakos pelių elgsenai jokiame eksperimente. Atliekant elgesio testus, JMV2959 buvo skiriamas ūmiai, nes mūsų atkaklūs tyrimai rodo, kad viena JMV2959 injekcija susilpnina vaisto sukeltą atlygį (apžvalgą žr. Engel ir Jerlhag (2014)). JMV2959 buvo skiriamas subchroniškai penkias kitas dienas opioidinio peptido analizei, siekiant padidinti galimybę nustatyti tvirtą poveikį. Be to, pakartotinėmis injekcijomis išvengsite galimo ūmaus injekcijos streso poveikio peptidams. Acilintas žiurkės grelinas (Bionuclear; Bromma, Švedija) buvo praskiestas 0.9% natrio chloridu ir parodyta, kad pasirinkta ghrelino dozė (0.33 mg / kg, ip) pelėms (Jerlhag, 2008) sukelia naudą. Visoms su narkotikais susijusioms problemoms spręsti buvo naudojamas subalansuotas dizainas.

Ankstesni tyrimai parodė, kad morfinas sukelia lokomotorinę stimuliaciją graužikams (Wise ir Bozarth, 1987). Lokomotorinis aktyvumas buvo užregistruotas aštuoniose garso slopinamose, ventiliuojamose ir silpnai apšviestose lokomotorių dėžėse (420 × 420 × 200 mm, Kungsbacka mät-och reglerteknik AB; Fjärås, Švedija). 5–5 eilutės fotoelementų pluoštų, dėžutės grindų lygyje sukuriant fotoelementų aptikimą, kompiuterine sistema leido užregistruoti pelių aktyvumą. Lokomotorinis aktyvumas buvo apibrėžtas kaip sukauptas naujų fotoelementų pluoštų skaičius, pertrauktas per 60-min. Visuose eksperimentuose pelėms buvo leista įprasti prie lokomotorinio aktyvumo langelio valandą prieš vaisto vartojimą. Tarp įpratimų nė vienoje iš gydymo grupių skirtumų nebuvo (duomenys nepateikti).

Pirmoje eksperimentų serijoje buvo tiriamas JMV2959 (6 mg / kg, ip) poveikis morfino sukeltai (20 mg / kg, ip) lokomotorinei stimuliacijai. JMV2959 buvo sušvirkštas 20 min. Iki morfino, o aktyvumo registracija prasidėjo praėjus dešimčiai minučių po paskutinės injekcijos. Kiekviena pelė gavo vieną gydymo derinį (nešiklis / nešiklis, JMV2959 / nešiklis, morfinas / nešiklis arba JMV2959 / morfinas; n= 8 vienam gydymo deriniui) ir buvo atliekamas tik vienas eksperimentinis tyrimas.

Norint įvertinti JMV2959 poveikį teigiamam morfino poveikiui naujose pelėse, buvo atlikti kondicionuoti vietos pasirinkimo testai pelėms, kaip aprašyta anksčiau (Jerlhag, 2008). Trumpai tariant, buvo naudojamas dviejų kamerų CPP aparatas su 45 lx apšvietimu ir aiškiais vaizdiniais bei liečiamaisiais ženklais. Vieną skyrių apibrėžė juodos ir baltos dryžuotos sienos ir tamsios laminuotos grindys, o kitame buvo baltai dažytos medinės grindys ir medinės tekstūros sienos. Procedūrą sudarė išankstinis kondicionavimas (1 diena), kondicionavimas (2 – 5 dienomis) ir kondicionavimas (6 diena). Atliekant pirminį kondicionavimą, pelėms buvo įšvirkšta tirpalo ip. Ir įdėta į kamerą, kuriai 20 min. Metu buvo suteikta laisva prieiga prie abiejų skyrių, kad būtų galima nustatyti pradinę vietos (arba šono) pirmenybę. Kondicionavimas (20 min. Per seansą) buvo atliktas naudojant šališką procedūrą, kurios metu morfinas (20 mg / kg) buvo suporuotas su mažiausiai pageidaujamu skyriumi ir nešikliu su pageidaujamu skyriumi. Visoms pelėms kiekvieną dieną buvo sušvirkščiama viena morfino, taip pat nešiklio, injekcijos buvo keičiamos nuo ryto iki popietės, atsižvelgiant į balanso planą. Kondicionuojant peles (n= 16) buvo sušvirkšta JMV2959 (6 mg / kg, ip) arba tokiu pačiu tūriu tirpiklio tirpalo ir 20 min vėliau padėta ant vidurinės linijos tarp dviejų skyrių, laisvai prieinant prie abiejų skyrių 20 min (sukuriant šias gydymo grupes; Morph-Veh ir Morph-JMV2959).

Sąlygos vietoje pirmenybė buvo apskaičiuota kaip bendro laiko, praleisto kartu su vaistais,% skirtumas (t.y. mažiausiai pageidaujamas) skyrius per kondicionavimą ir išankstinį kondicionavimą.

Atsižvelgiant į tai, kad JMV2959 susilpnina morfino sukeltą lokomotorinę stimuliaciją ir sąlygoja pirmenybę pelėms, JMV2959 (6 mg / kg, ip) poveikis morfino sukeltai (20 mg / kg, ip) kaupiamajai dopamino atpalaidavimui buvo ištirtas naudojant in vivo mikrodializė laisvai judančioms pelėms. Tarpląstelinio dopamino lygio matavimui pelėms buvo implantuojamas vienašalis mikrodializės zondas, esantis akumuliatoriaus branduolyje. Todėl pelės buvo anestezuojamos izofluranu (Isofluran Baxter; Univentor 400 Anesthesia Unit, Univentor Ldt., Zejtun, Malta), įdėtos į stereotaksinį rėmą (David Kopf Instruments; Tujunga, CA, JAV) ir laikomos ant kaitinimo padėklo, kad būtų išvengta hipotermija. Vietiniam anestetikui buvo naudojamas ksilocino adrenalinas (5 μg / ml; Pfizer Inic; Niujorkas, JAV), o bet kokiems galimiems skausmams malšinti buvo naudojamas karprofenas (Rimadyl, 5 mg / kg ip) (Astra Zeneca; Geteborgas, Švedija). Kaukolės kaulas buvo atidengtas, buvo išgręžta viena skylė zondui ir viena tvirtinimo varžtui. Zondas atsitiktine tvarka buvo keičiamas į kairę arba į dešinę smegenų pusę. Branduolio branduoliams (Franklin ir Paxinos, 1.5) buvo naudojamos 0.7 mm koordinatės priešais bregmą, ± 4.7 šoninės vidurio linijos atžvilgiu ir 1997 mm žemiau smegenų paviršiaus paviršiaus. Atskleistas dializės membranos galas (20,000 kDa, atkirtas 310 / 220 μm, HOSPAL, Gambro, Lund, Švedija), buvo 1 mm. Visi zondai buvo chirurginiu būdu implantuoti prieš dvi dienas iki eksperimento. Po operacijos pelės buvo laikomos atskiruose narvuose iki bandymo dienos (Macrolon III).

Testo dieną zondas buvo prijungtas prie mikroperfuzijos siurblio (U-864 švirkšto pompos; AgnThós AB) ir perfuzuojamas Ringerio tirpalu greičiu 1.5 μl / min. Po valandos įpratimo prie mikrodializės, perfuzijos mėginiai buvo imami kas 20 min. Pradinis dopamino lygis buvo apibrėžtas kaip trijų iš eilės mėginių vidurkis prieš pirmąjį vaisto / nešiklio poveikį, o kaupiamojo dopamino padidėjimas buvo apskaičiuotas kaip procentinis padidėjimas, palyginti su pradiniu. Atlikus pradinius mėginius (nuo –40 min. Iki 0 min.), Pelėms buvo sušvirkšta JMV2959 arba nešiklis (esant 0 min.), Po kurio buvo suleistas morfinas arba nešiklis (esant 20 min.). Po šių vaistų skyrimo buvo paimti papildomi aštuoni 20 min. Pavyzdžiai. Bendrai šios gydymo grupės (n= 8 kiekvienoje grupėje) buvo sukurti: transporto priemonė – transporto priemonė („Veh – Veh“), transporto priemonė – morfinas („Vehicle – Morph“), „JMV2959“ („JMV2959-Veh“) ir „JMV2959“ - morfinas („JMV2959-Morph“).

Dopamino kiekis dialize buvo nustatytas HPLC metodu, naudojant elektrocheminį aptikimą. Siurblys (Gyncotec P580A; Kovalent AB; V. Frölunda, Švedija), jonų mainų kolonėlė (2.0 × 100 mm, Prodigy 3 μm SA; Skandinaviska GeneTec AB; Kungsbacka, Švedija) ir detektorius (Antec Decade; Antec Leyden; Zoeterwoude). , Nyderlandai), su VT-03 srauto elementu (Antec Leyden). Judrioji fazė (pH 5.6), susidedanti iš sulfonrūgšties 10 mM, citrinos rūgšties 200 mM, natrio citrato 200 mM, 10% EDTA, 30% MeOH, buvo vakuuminiu būdu filtruojama naudojant 0.2 μm membraninį filtrą (GH Polypro; PALL Gelman laboratorija; Lundas, Švedija). Judančioji fazė buvo tiekiama 0.2 ml / min srauto greičiu, praleidžiant degazatorių (Kovalent AB), o analitė oksiduojama esant + 0.4 V.

Baigę mikrodializės eksperimentus, pelės buvo nukaulintos, o zondai buvo perfuzuoti dangaus mėlynos spalvos pontaminatu 6BX, kad būtų lengviau nustatyti zondo buvimą. Smegenys buvo sumontuotos ant vibroslice prietaiso (752 M Vibroslice; Campden Instruments Ltd., Loughborough, JK) ir supjaustytos 50 μm dalimis. Zondo vieta buvo nustatyta atliekant bendrą stebėjimą, naudojant šviesos mikroskopiją. Buvo patikrinta tiksli zondo padėtis (Franklin ir Paxinos, 1997) ir atliekant statistinę analizę buvo naudojamos tik pelės, turinčios teisingą vietą.

Buvo ištirtas gydymo JMV2959 poveikis MEAP, DynB ir LeuArg lygiams srityse, susijusiose su atlygiu. Pelėms buvo suleista JMV2959 (6 mg / kg, ip, n= 8) arba lygus tūris transporto priemonės (ip, n= 8) penkias vėlesnes dienas. 20 min. Po paskutinės injekcijos pelės buvo paaukotos ir surinktos šių pelių smegenys. Atskirai pelėms buvo sušvirkšta arba ghrelin (0.33 mg / kg, ip, n= 8) arba lygus tūris transporto priemonės (ip, n= 8) penkias vėlesnes dienas. Po penkių minučių po paskutinės injekcijos pelės buvo paaukotos ir surinktos šių pelių smegenys. Amygdala, striatum, priešfrontalinė žievė, VTA ir hipokampas buvo greitai išpjaustyti ir nedelsiant supilami ant sauso ledo, o po to laikomi –80 ° C temperatūroje iki tolesnio perdirbimo.

Homogenizacijos ir peptidų ekstrahavimo procedūros vyko pagal standartinę procedūrą, anksčiau išsamiai aprašytą (Nylander ir kt., 1997). Trumpai tariant, į sušalusius mėginius buvo įpilama karšto (95 ° C) acto rūgšties (1 M). Mėginiai kaitinami vandens vonioje (95 ° C) 5 min., Atšaldomi ant ledo ir homogenizuojami naudojant Branson Sonifier (Danbury, CT, JAV). Homogenatas buvo pakartotinai pašildytas 95 ° C temperatūroje 5 min ir atvėsintas ant ledo, prieš centrifuguojant 15 min, esant 4 ° C ir 12,074 ×g centrifugoje Beckman GS-15R (Fullerton, CA, JAV). Ekstraktai buvo toliau gryninami pagal anksčiau aprašytą procedūrą (Nylander ir kt., 1997). Surinktos dvi frakcijos: III frakcija (Leu-Arg ir MEAP) ir V frakcija (DynB). Mėginiai buvo džiovinami vakuuminėje centrifugoje („Savant SpeedVac Plus SC210A“; „Thermo Scientific Inc.“, Waltham, MA, JAV) ir iki peptidų analizės buvo laikomi šaldiklyje (–20 ° C).

Imunoreaktyvūs (ir) DynB, LeuArg ir MEAP lygiai buvo išanalizuoti gerai nusistovėjusiais radioimuniniais tyrimais, o protokolai buvo išsamiai aprašyti kitur (Nylander et al., 1997). Atliekant DynB tyrimą, ožkų anti-triušio IgG (GARGG; Bachem, Bubendorf, Šveicarija) buvo naudojamas atskirti laisvą ir antikūnų surištą peptidą. Galutiniame 113: 1 praskiedime buvo naudojamas Dyn antiserumas (600000 +). Kryžminis reaktyvumas su dideliu Dyn buvo 100%, o su DynB (1 – 29) 1%. Kryžminio reagavimo su kitais opioidiniais peptidais nepastebėta. Atliekant LeuArg ir MEAP tyrimus, laisvojo ir antikūno surišto peptido atskyrimui buvo naudojama medžio anglies suspensija. LeuArg antiserumui (91: 6D +, galutiniam skiedimui 1: 60000) kryžminis reaktyvumas buvo mažesnis nei 0.01% Leu-enkefalinui ir MEAP, 0.02% DynB, 0.04% DynA ir 0.08% alfa-neoendorfinui. Galutiniame 90: 3 1 praskiedime buvo naudojamas MEAP antiserumas 160: 000D (II). Kryžminis reaktyvumas su Met-enkefalinu, Met-enkefalinu-Arg⁶, Met-enkefalinas-Argas⁶gly⁷Leu⁸, Leu-enkefalinas ir Leu-enkefalinas-Argas⁶ buvo <0.1%

Bendras pagrindinis gydymo poveikis pelių lokomotoriniam aktyvumui buvo nustatytas po sisteminio morfino (20 mg / kg) ir JMV2959 (6 mg / kg) (F (3,27) = 7.409) vartojimo. P= 0.0009; n= „8“ - „Veh – Veh“, „JMV2959-Veh“, „JMV2959-Morph“ ir n= 7 (Veh-Morph). Kaip parodyta 1 pavA, atlikus posthoko analizę, paaiškėjo, kad išankstinis gydymas viena JMV2959 injekcija (P<0.001) reikšmingai susilpnino morfino sukeltą judėjimo stimuliaciją (P<0.01 transporto priemonė – transporto priemonė vs Transportas – Morfas). Pasirinkta JMV2959 dozė neturėjo įtakos lokomotoriniam aktyvumui, palyginti su gydymu nešikliu (P> 0.05). Transporto priemonėmis ir JMV2959-morhpine gydytų pelių judėjimo aktyvumo atsakas nebuvo skirtingas (P> 0.05).

  

1 pav

GHS-R1A antagonistas JMV2959 silpnina morfino sukeltą lokomotorinę stimuliaciją, kaupiamąjį dopamino išsiskyrimą ir sąlygotas vietas pelėms. (A) Morfino sukeltos (20 mg / kg ip) lokomotorinės stimuliacijos buvo susilpnintos viena injekcija JMV2959 (6 mg / kg ip) (n= 7 – 8 kiekvienoje grupėje; **P<0.01, ***P<0.001 vienpusis ANOVA, po kurio atliktas Bonferroni post-hoc testas). (B) Morfino sukeltas (20 mg / kg ip) būklės pasirinkimas (CPP) buvo susilpnintas ūmine vienkartine JMV2959 (6 mg / kg ip) injekcija pelėms (n= 8 kiekvienoje grupėje, *P<0.05, neporinis t-testas). (C) Pirmiausia mes įrodėme reikšmingą morfino (20 mg / kg ip) poveikį dopamino išsiskyrimui padidinti, palyginti su gydymu nešikliu (laiko intervalas 40–180 minP<0.001), transporto priemonė vs Transportas – Morfas). Kaip parodyta (C) parengiamuoju gydymu JMV2959 (6 mg / kg ip), sumažino morfino sukeltą dopamino išsiskyrimo padidėjimą, palyginti su išankstiniu nešiklio paruošimu, laiko intervalais 40 – 100 ir 140 – 180 min (^##P<0.01, ^{# # #}P <0.001, JMV2959-Morph, palyginti su Veh – Morph gydymu). Pasirinkta JMV2959 dozė neturėjo reikšmingo poveikio gumbų dopamino išsiskyrimui, palyginti su gydymu nešikliu bet kuriuo laiko tarpu (P> 0.05, transporto priemonė vs JMV2959-Vehicle). JMV2959 sumažino, bet ne visiškai užblokavo, morfino sukeltą kaupiamąjį dopamino išsiskyrimą su laiko tarpu 60 – 140 (*).P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, JMV2959-Morph, palyginti su Veh – Morph gydymu). Rodyklės nurodo JMV2959, transporto priemonės ir morfino injekcijos laiko taškus. Duomenys išanalizuoti naudojant dvipusį ANOVA, po kurio atliktas Bonferroni post-hoc testas (n= 8 kiekvienoje grupėje). „Vehicle – veh“ (kvadratas), „Veh – Morph“ (rombas), „JMV2959-veh“ (trikampis), „JMV2959-Morph“ (apskritimas). Visos vertės reiškia vidurkį ± SEM.

Peržiūrėti didelį vaizdą | Peržiūrėti „Hi-Res“ vaizdą | Atsisiųskite „PowerPoint Slide“

Morfino sukeltą (20 mg / kg) (Morph-Veh) sąlygotos vietos pasirinkimą žymiai sušvelnino ūmi vienkartinė JMV2959 (6 mg / kg) (Morph-JMV2959) injekcija dieną po kondicionavimo (P= 0.025, n= 8 kiekvienoje grupėje; 1 pavB).

Sukaupti dopamino mikrodializės matavimai pelėms parodė bendrą pagrindinį gydymo poveikį (F(3,33) = 24.15, P<0.0001), laikas F(11,308) = 7.05, P<0.0001) ir gydymo × laiko sąveika (F(11,308) = 8.63, P<0.0001) (1 pavC; n= 8 kiekvienoje grupėje). Morfinas padidino kaupiamąjį dopamino išsiskyrimą, palyginti su gydymu nešikliu, laiko intervalu 40 – 180 min (P<0.001). Kaip parodyta 1 pavC šis poveikis sumažėjo atlikus išankstinį gydymą JMV2959 laiko intervalais 40 – 80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) ir 160–180 min (P<0.001). JMV2959 sumažino, bet visiškai neužblokavo morfino sukelto pagumburio dopamino išsiskyrimo, nes 2959–60 laiko intervalais buvo skirtumas tarp gydymo nešikliu ir gydymo JMV80-morfinu (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) ir 160 min (P<0.05). Pasirinkta JMV2959 dozė neturėjo reikšmingo poveikio gumbų dopamino išsiskyrimui, palyginti su gydymu nešikliu bet kuriuo laiko tarpu (P> 0.05).

Šis tyrimas taip pat patvirtina hipotezę, kad oreksigeninio peptido fiziologinis vaidmuo apima atlygio reguliavimą. Iš tiesų, mes parodėme, kad periferinis GHS-R1A antagonisto paskyrimas silpnina morfino gebėjimą sukelti lokomotorinę stimuliaciją, padidinti NAc dopamino kiekį ir sukelti sąlygotos vietos pasirinkimą pelėms. Mes taip pat nustatėme, kad gydymas subchrominiu JMV2959, bet ne ghrelinu, padidino MEAP audinių lygį VTA, DynB hipokampe ir LeuArg striatumoje, pateikdamas pirmuosius įrodymus, kad ghrelin signalizuojanti galimybė reguliuoti armaciją gali būti susijusi su opioidiniais peptidais. .

Čia pateikti duomenys rodo, kad GHS-R1A antagonizmas veikia morfino gebėjimą suaktyvinti pelių mezolimbinę dopamino sistemą. Taigi išvados rodo, kad JMV2959 blokuoja morfino gebėjimą padidinti tarpląstelinio dopamino kiekį ląstelėje ir sukelti stereotipinį žiurkių elgesį (Sustkova-Fiserova ir kt., 2014). Patvirtinant, centrinis grelino vartojimas padidina lūžių tašką, bet ne aktyvių svirčių paspaudimų skaičių, progresyvaus santykio sustiprinimo grafike žiurkėms, kurios pačios vartoja heroiną (Maric ir kt., 2012). Teiginį, kad grelino signalizacija yra priklausomybė nuo narkotikų, dar labiau patvirtina išvados, rodančios, kad JMV2959 sumažina žiurkių suvartojimą ir motyvaciją vartoti alkoholį, o amfetamino, kokaino ir nikotino sukeltą atlygį blokuoja graužikų GHS-R1A antagonizmas ( apžvalgą žr. Engel ir Jerlhag (2014) ir kad grelino turinčių genų polimorfizmai yra susiję su alkoholio, rūkymo ir amfetamino vartojimu (apžvalgą žr. Engel ir Jerlhag (2014)).

Dabartiniai atradimų duomenys, rodantys padidėjusį opioidinių peptidų kiekį striatumoje, VTA ir hipokampyje po gydymo lėtiniu JMV2959, pirmą kartą rodo opioidinių peptidų ir ghrelino signalizacijos sąveiką. Endogeniniai opioidai yra susiję su teigiamu poveikiu, kurį sukelia ne tik opioidai, bet ir kiti narkotikai, skirti piktnaudžiavimui, ir natūralus atpildas, taip pat prisitaikymo procesuose, pastebimuose po pakartotinio narkotikų poveikio (Trigo ir kt., 2010, Van Ree ir kt., 2000). Iš tikrųjų mezolimbinės dopamino sistemos aktyvumą reguliuoja endogeniniai opioidai tiek VTA, tiek NAc lygyje (Hirose ir kt., 2005, Spanagel ir kt., 1992), ir buvo įrodyta, kad veiksmai yra tiesioginiai arba netiesioginiai. moduliuojant kitus siųstuvus (Charbogne et al., 2014).

Čia nustatėme, kad gydymas subchroniniu JMV2959 padidino MEAP lygį VTA. MEAP yra išimtinai gaunamas iš proenkefalino ir buvo naudojamas kaip proenkefalino peptidų, daugiausia aktyvuojančių δ-opioidinius receptorius, žymeklis. Mes hipotezuojame, kad padidėjęs endogeninio MEAP lygis VTA po gydymo JMV2959 gali užkirsti kelią morfino gebėjimui sumažinti mezakumbalinių dopamino neuronų (Johnsonas ir šiaurė, 1992) GABA slopinimą, o tai gali prisidėti prie sumažėjusio morfino sukelto poveikio, stebimo po JMV2959. Be to, GHS-R1A yra VAB GABAerginiuose interneuronuose (Abizaid ir kt., 2006). Be to, ankstesni tyrimai parodė, kad JMV2959 infuzija VTA viduje, per nežinomi mechanizmai, susilpnina grelino sukeltą atlygį (Jerlhag ir kt., 2011), taip pat ghrelino sukeltą sacharozės vartojimą graužikams (Skibicka ir kt., 2011), rodo, kad ventrinis tegmentinis GHS-R1A yra svarbus atlygio reguliavimui. Tokį teiginį pagrindžia išvados, rodančios, kad kiti badą reguliuojantys peptidai, tokie kaip galaninas ir oreksinas, tarpininkauja teikiant morfino savybes. per vietiniai mechanizmai VTA viduje (Narita ir kt., 2006, Richardson ir Aston-Jones, 2012).

Stuburyje mes nustatėme, kad subchrominis JMV2959 padidino LeuArg iris lygį, o tai rodo, kad JMV2959 gebėjimas susilpninti morfino sukeltą sąlygotos vietos pasirinkimą, dopamino išsiskyrimą ir lokomotorinę stimuliaciją bent iš dalies priklauso nuo padidėjusio kaupiamojo δ- opioidų receptorių aktyvumas. Padidėjęs LeuArg lygis gali atsirasti dėl padidėjusio fermentinio dinorfinų peptidų pavertimo enkefalinais arba padidėjusio Dyn išsiskyrimo NAc, reaguojant į padidėjusį dopamino kiekį, o paskui skaidymąsi LeuArg. Nors ankstesni tyrimai parodė, kad mezolimbinės dopamino sistemos veikla yra reguliuojama per NA-κ-opioidiniai receptoriai (Spanagel et al., 1992) ir endogeniniai κ-opioidiniai receptoriai suteikia toninį mezoakumbalinio dopamino neurotransmisijos slopinimą ir silpnina kokaino sukeliamą dopamino išsiskyrimą NAc (Chefer et al., 2005). parodyti, kad JMV2959 keičia „DynB“ lygius striatumoje. Todėl norint nustatyti GHS-R1A antagonizmo ir dinorfinų sąveiką, reikia atlikti papildomus tyrimus su prodynorphin peptidais.

Šiame tyrime mes taip pat parodėme, kad gydymas JMV2959 žymiai padidina hipokampinės DynB lygį. Ghrelin padidina atminties konsolidaciją, taip pat dendritinį stuburo formavimąsi, sukuria ilgalaikę potenciaciją ir skatina atmintį per hipokampinis GHS-R1A graužikams (Carlini ir kt., 2010, Diano ir kt., 2006). Be to, „GHS-R1A“ išmuštos pelės turi patobulintą erdvinę atmintį atliekant „Morris“ vandens labirinto testą ir sutrikusią kontekstinę atmintį baimės mažinimo paradigmoje, palyginti su laukinio tipo pelėmis (Albarran-Zeckler et al., 2012). Dynorphin peptidų, įskaitant DynB, gausu hipokampuose ir jie susilpnina ilgalaikį potencijavimą (Chavkin ir kt., 1985, Wagner ir kt., 1993), taip pat pablogina erdvinį mokymąsi žiurkėms (Sandin ir kt., 1998). Todėl manome, kad GHR-R1A antagonistas gali susilpninti atlygio atminimą, slopindamas hipokampo ilgalaikę potenciaciją per aktyvuoti DynB. Visi šie duomenys suteikia naują potencialų mechanizmą, kuriuo JMV2959 per opioidiniai peptidai gali pakeisti sutvirtėjimą. Tačiau opioidiniai receptoriai yra plačiai pasiskirstę smegenyse, todėl galima daryti išvadą, kad GHS-R1A reguliuojamo morfino sukeltas atlygis gali būti įtrauktas į kitas sritis, kurios nėra įtrauktos į šį tyrimą. Pvz., Ghrelino suvartotas maistas ir sacharozės paspaudimas yra sumažinami centriniu ar hipotalaminiu būdu vartojant κ-opioidų receptorių antagonistą (Romero-Pico ir kt., 2013). Tačiau būsimuose tyrimuose reikia išsiaiškinti opioidinių peptidų vaidmenį kitose srityse.

Endogeniniai μ-receptorių ligadai, endomorfinai ir beta-endorfinai, čia nebuvo analizuojami, todėl negalime atmesti galimo JMV2959 poveikio šiems peptidams. Iš tiesų, malonios morfino savybės apima μ-opioidinius receptorius VTA, taip pat NAc (Hirose ir kt., 2005, Johnson and North, 1992, Murakawa ir kt., 2004, Yoshida ir kt., 1999). Tačiau μ-receptorių antagonistas nesumažina grelino suvartoto maisto (Naleid ir kt., 2005), nei ghrelino sukeltos lokomotorinės stimuliacijos ir akumuliacinio dopamino išsiskyrimo (Jerlhag ir kt., 2011), suponuodamas, kad GHSR- 1A antagonistas, reguliuojantis armatūrą, neapima μ receptorių. Kita vertus, JMV2959 darė įtaką opioidiniams peptidams, gautiems iš proenkefalino ir prodynorphin, parodydamas, kad jie gali būti susiję su GHSR-1A antagonistų sukeltu poveikiu.

Nors ankstesni tyrimai parodė, kad sisteminis ghrelino vartojimas sukelia atlygį (Jerlhag, 2008), taip pat pagerina priklausomybę sukeliančių vaistų naudingąsias savybes (apžvalgą žr. Engel ir Jerlhag (2014)), mes čia parodėme, kad gydymas subchroniniu ghrelinu nepakito opioidų peptidų lygis audiniuose ir audiniuose bet kurioje iš su tyrimais susijusių sričių. Sisteminis grelino vartojimas suaktyvina c-fos ekspresiją pagumburio, bet ne mezolimbinėse ir hipokampinėse srityse (Pirnik ir kt., 2011), o fluorescenciniu žymėtu grelinu jungiasi tik maistą reguliuojantys pagumburio neuronai (Schaeffer ir kt., 2013). ). Kartu su išvadomis, rodančiomis, kad pagumburio pėdsakų pavidalo ghrelino negalima aptikti gilesniuose smegenų plotuose po periferinio grelino vartojimo (Furness ir kt., 2011, Grouselle ir kt., 2008, Sakata ir kt., 2009) ), kyla galimybė, kad sisteminis grelinas suaktyvina atlygio sistemą per netiesioginiai mechanizmai, nepriklausomi nuo endogeninių opioidų. Be to, ghrelino sukeltas kaupiamasis dopamino išsiskyrimas reikalauja aukščiau esančio oreksigeninio hipotalaminio signalo (Cone et al., 2014), periferinis grelino vartojimas nekeičia pelių alkoholio vartojimo (Lyons et al., 2008), o periferinio grelino neutralizavimas nesumažina alkoholio. - sukeltas atlygis pelėms arba alkoholio vartojimas žiurkėms (Jerlhag ir kt., spaudoje). Reikėtų apsvarstyti galimybę, kad subhroninis ghrelino vartojimas padidina opioidų peptidų kiekį audinių audiniuose, tačiau tai reikia išsamiai ištirti būsimuose tyrimuose.

Priklausomybę sukeliančių vaistų gebėjimas sukelti stimuliaciją, dopamino išsiskyrimą ir sąlygotos vietos pasirinkimą yra glaudžiai susijęs su priklausomybę sukeliančių vaistų stiprinamosiomis savybėmis, ir šie parametrai laikomi priklausomybės proceso dalimi (Wise, 2004). Atsižvelgiant į tai, kad mes nustatėme, kad JMV2959 silpnina šiuos atlygio parametrus pelėms, mes spėjame, kad GHS-R1A gali vaidinti svarbų vaidmenį priklausomybės procesuose ir kad šiuose procesuose dalyvauja endogeniniai opioidai. Visi šie duomenys rodo, kad GHS-R1A antagonistai turėtų būti išaiškinti kaip priklausomybės nuo narkotikų gydymas.

JE ir EJ remiamos Švedijos mokslinių tyrimų tarybos (Švedijos mokslinių tyrimų tarybos, subsidijos Nr. 2011-4646, 2009-2782 ir 2011-4819), Švedijos smegenų fondo, LLA / ALF (stipendijos nr. 148251) iš Sahlgrenska universiteto ligoninės, Alkoholis, subsidijomis. Švedijos alkoholio mažmeninės prekybos monopolio tyrimų taryba ir Adlerbertska, Fredriko ir Ingrid Thuring, Tore Nilsson, Längmanska, Torsten ir Ragnar Söderberg, Wilhelm ir Martina Lundgren, NovoNordisk, Knut ir Alice Wallenberg, Magnus Bergvall, Anérs, Jekesons, fondai. , Švedijos medicinos draugija, Švedijos medicinos tyrimų draugija ir Geteborgo psichiatrijos tyrimų fondas. IN palaikė Švedijos mažmeninės prekybos alkoholiu monopolijos alkoholio tyrimų taryba ir Švedijos tyrimų taryba (K2012-61X-22090-01-3). Finansavimo šaltiniai neturėjo reikšmės tyrimo planui, duomenų rinkimui, analizei ir aiškinimui, ataskaitos rašymui ir sprendimui skelbti duomenis