Psichiatrija. 2018; 9: 81.
Paskelbta internete 2018 Mar 12. doi: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 „Soo-Hyun Paik“,5 Yae Eun parkas,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* ir Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Abstraktus
fonas
Priklausomybę naudojant internetą ir internetinius žaidimus yra potencialus psichikos sutrikimas, vadinamas interneto žaidimų sutrikimu (IGD). Apie kai kuriuos psichikos sutrikimus sergančių pacientų kraujo ir smegenų audiniuose pranešta apie pakeistus mikroRNR (miRNR) ekspresijos profilius ir siūlomi kaip biomarkeriai. Tačiau nėra pranešimų apie kraujo miRNR profilius IGD.
Metodai
Norėdami atrasti su IGD susijusius miRNR, mes analizavome 51 mėginių miRNA ekspresijos profilius (25 IGD ir 26 kontrolė), naudojant TaqMan mažo tankio miRNR struktūrą. Patvirtinimui atlikome kiekybinę atvirkštinės transkripcijos PCR su 36 nepriklausomais mėginiais (20 IGD ir 16 valdikliai).
rezultatai
Atradus ir nepriklausomai patvirtinus, mes nustatėme tris miRNR (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p), kurios buvo žymiai sumažintos IGD grupėje. Asmenims, turintiems visus tris miRNR pokyčius, buvo daug didesnė IGD rizika nei tų, kuriems nebuvo pakitusi [šansų santykis (OR) 22, 95% CI 2.29 – 211.11], o atokiausi regionai padidino dozę priklausomai nuo pakeistų miRNR skaičiaus. Prognozuojami trijų miRNR tiksliniai genai buvo susieti su neuroniniais keliais. Mes ištyrėme trijų pasroviui taikomų tikslinių genų baltymų ekspresiją Western blot ir patvirtinome, kad GABRB2 ir DPYSL2 ekspresija buvo žymiai didesnė IGD grupėje.
Išvada
Mes pastebėjome, kad IGD pacientams buvo sumažintos hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p ir hsa-miR-652-3p ekspresijos. Mūsų rezultatai padės suprasti IGD patofiziologiją.
Įvadas
Priklausomybę sukeliantis interneto ir internetinių žaidimų naudojimas yra ne tik socialinis reiškinys šalyse, kuriose yra didelė interneto prieigos infrastruktūra, bet ir galimas psichikos sutrikimas, vadinamas interneto žaidimų sutrikimu (IGD).1-3). Remiantis epidemiologinėmis ataskaitomis, IGD paplitimas tarp paauglių įvairiose šalyse skiriasi nuo 0.8 iki 26.7% (4). Ypač tyrimai rodo, kad daugelyje Azijos šalių, tokių kaip Pietų Korėja, Kinija, Taivanas, Honkongas ir Singapūras, paplitimo rodikliai viršija 10%.4). IGD siejamas su pažinimo, psichosocialinių santykių ir kasdienio gyvenimo sutrikimu; pavyzdžiui, mažėjant akademiniam ar profesiniam darbui (4-7). IGD dabar įtraukta į penktąjį Diagnostikos ir statistikos vadovo psichikos sutrikimų (DSM-V) peržiūrą III skyriuje (Tolesnės studijos sąlygos).8). Tačiau, nepaisant jo klinikinės ir socialinės svarbos, mažai žinoma apie IGD molekulinį genetinį mechanizmą.
Naujausi didelio masto dvigubi tyrimai parodė, kad IGD yra genetinis pagrindas (9, 10). Vink et al. išnagrinėjo individualius kompulsinio interneto naudojimo su 5,247 monozigotiniais ir dizigotiniais paaugliais dvynius skirtumus Nyderlandų Twin Register ir pranešė, kad 48% skirtumų paaiškinta genetiniais veiksniais (9). Li et al. pastebėjo 825 porų Kinijos paauglių dvynių ir pranešė, kad genetiniai veiksniai paaiškina 58 – 66% skirtumų (10). Atitinkamai, genų, dalyvaujančių neurotransmisijoje, pažinimo ir dėmesio, pvz., Dopamino receptoriaus D2 geno, polimorfizmai (DRD2), katecholamino-O-metiltransferazės genas (COMT), serotonino transporterio genas (5HTTLPR) ir cholinerginio receptoriaus nikotino alfa 4 geno (CHRNA4), buvo pranešta, kad jie labai susiję su interneto priklausomybe (11-13). Neseniai Kim et al. ištirti daugiau nei 100 kandidatų genų variantai, susiję su neurotransmiterių gamyba, veikimu ir metabolizmu, atliekant naujos kartos sekos analizę ir pranešus, kad rs2229910 of NTRK3 genas yra susijęs su IGD (14).
Be genetinių veiksnių, taip pat gerai žinoma, kad neurotransplantacijos fenotipai yra epigenetiškai kontroliuojami nekoduojančiais RNR, įskaitant mikroRNR (miRNA) (15, 16). miRNR yra mažos nekoduojančios vienos grandinės RNR molekulės (maždaug 20 – 23 nukleotidai), kurios neigiamai reguliuoja baltymų koduojančių genų ekspresiją skaidant mRNR ir atlieka svarbų vaidmenį patofiziologiniame įvairių ligų procese (17). Įrodyta, kad miRNA yra gausu žmogaus centrinėje nervų sistemoje (CNS) ir veikia tikslinių genų ekspresijos lygių, kurie yra susiję su CNS sistemos kūrimu ir brandinimu, tikslumu.15). Iš tiesų, naujausi tyrimai parodė, kad psichikos sutrikimų turinčių pacientų smegenų audinyje miRNR ekspresijos profiliai pasikeitė, o tai rodo, kad jų ekspresijos profiliai gali būti psichikos sutrikimų biomarkeriai (15, 16, 18). Pavyzdžiui, atlikus postortorteminę analizę, Lopez ir kt. pranešė, kad miR-1202 ekspresija, reguliuojanti metabotropinio glutamato receptoriaus-4 geno ekspresiją ir prognozuoja atsaką į antidepresantą, buvo sumažinta pirminių depresijos sutrikimų pacientų prefrontaliniuose žievės audiniuose (19). Kalbant apie biomarkerio tikrinimą, šis metodas turi aiškų apribojimą, nes CNS audinio biopsijos tyrimas yra neįmanomas. Kadangi miRNR gali būti aptinkami kraujyje (plazmoje arba serume), cirkuliuojančios miRNR turi aiškų pranašumą kaip neinvaziniai biomarkeriai neuropsichiatriniuose sutrikimuose. Tačiau iki šiol nebuvo atlikta tyrimų apie miRNR profilių cirkuliavimą IGD. Geresnis cirkuliuojančių miRNR ekspresijos profilių supratimas galėtų padėti išsiaiškinti IGD vystymosi mechanizmą ir palengvinti klinikinį vertimą.
Šiame tyrime siekėme identifikuoti su IGD susijusius miRNR žymenis stebėdami skirtingai ekspresuotą plazmos miRNR tarp IGD ir kontrolinių grupių ir ištirti jų biologinius padarinius.
Medžiagos ir metodai
Studijų dalykai
Apklausėme 3,166 paauglius (12 – 18 metų), naudodami DSM-V IGD balus. Tarp jų 251 (168 patinai ir 83 patelės) buvo diagnozuota kaip IGD pagal DSM-V kriterijus (8). Iš viso 91 asmenys (49 IGD ir 42 kontrolė) suteikė šiam tyrimui pagrįstą sutikimą. Tarp jų buvo pašalinti keturi asmenys pagal atmetimo kriterijus. Galiausiai į šį tyrimą buvo įtraukti 87 asmenys (45 IGD ir 42 sveiki kontroliniai asmenys). Tarp jų 51 dalyviai (25 IGD pacientai ir 26 kontrolė) buvo įdarbinti kaip 2014 ir 2016 atradimai. Kiti 36 dalyviai (20 IGD pacientai ir 16 kontrolė) buvo įdarbinti kaip nepriklausomas patvirtinimo rinkinys iš 2016. Visi dalyviai buvo korėjiečiai, dalyvavo Seulo Šv. Marijos ligoninėje (Seulas, Pietų Korėja) ir Seulo nacionaliniame universiteto Boramae ligoninėje (Seulas, Pietų Korėja). Visi dalyviai surengė struktūrizuotą interviu psichiatrui, remdamiesi Korėjos Kiddie planu dėl afektinių sutrikimų ir šizofrenijos (K-SADS-PL) (20). Visi dalyviai baigė Korėjos ir Vechlerio žvalgybos skalės vaikų, 4th leidimo (K-WISC-IV) blokų projektavimo ir žodyno subtestus.21). Impulsyvumas buvo vertinamas pagal Barratt impulsyvumo skalę (BIS).22). Asmenybės dimensijai įvertinti buvo išmatuoti elgesio slopinimo sistemos (BInS) ir elgesio aktyvinimo sistemos (BAS) skalės (23). Išskirtinumo kriterijai buvo praeities ar dabartiniai svarbiausi medicininiai sutrikimai (pvz., Cukrinis diabetas), neurologiniai sutrikimai (pvz., Traukulių sutrikimai, galvos sužalojimas), psichikos sutrikimai (pvz., Depresijos sutrikimai, nerimo sutrikimai), protinis atsilikimas arba bet koks piktnaudžiavimas medžiagomis (pvz. tabako, kanapių, alkoholio). Bendrosios studijų dalykų charakteristikos apibendrintos 1 lentelėje Table1.1. Šį tyrimą patvirtino Korėjos katalikų universiteto medicinos koledžo (MC16SISI0120) institucinė peržiūros taryba. Visi dalyviai ir jų tėvai davė raštišką sutikimą.
Lentelė 1
Bendrosios studijų dalykų charakteristikos.
| Atradimas | Patvirtinimas | Kombinuotas | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Kontrolė | IGD | Preikšmė | Kontrolė | IGD | Preikšmė | Kontrolė | IGD | Preikšmė | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Amžius (metai) | |||||||||
| Vidutinė (min. Maks.) | 13 (12 - 17) | 13 (12 - 15) | 0.759 | 15 (13 - 18) | 14.5 (12 - 18) | 0.628 | 14 (12 - 18) | 14 (12 - 18) | 0.509 |
| Savaitės interneto žaidimų valandos (h) | |||||||||
| Vidutinė (min. Maks.) | 5.25 (2 - 17) | 18 (6 - 46) | 1.27E-6a | 5.5 (2 - 23) | 8 (1 - 112) | 0.374 | 5.5 (2 - 23) | 14 (1 - 112) | 1.63E-5a |
| Mėnesinės namų ūkio pajamos (mln. KRW) | |||||||||
| Vidutinė (min. Maks.) | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.588 | 4 (4 - 4) | 2 (2 - 2) | 1.000 | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.460 |
| Švietimas (metai) | |||||||||
| Vidutinė (min. Maks.) | 8 (7 - 9) | 8 (7 - 9) | 0.584 | 12 (12 - 12) | 6 (6 - 13) | 0.305 | 8 (7 - 12) | 8 (6 - 13) | 0.269 |
| K-WISC: blokų dizainas | |||||||||
| Vidutinė (min. Maks.) | 10.5 (4 - 17) | 10 (4 - 16) | 0.544 | 10 (3 - 16) | 12.5 (4 - 15) | 0.125 | 10 (3 - 17) | 11 (4 - 16) | 0.598 |
| K-WISC: žodynas | |||||||||
| Vidutinė (min. Maks.) | 9 (5 - 17) | 7 (5 - 13) | 0.174 | 9.5 (8 - 15) | 11.5 (5 - 15) | 0.595 | 9 (5 - 17) | 9 (5 - 15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Vidutinė (min. Maks.) | 24 (17 - 36) | 37 (22 - 51) | 3.81E-6a | 29 (17 - 34) | 59 (22 - 108) | 1.2E-5a | 25 (17 - 36) | 40 (22 - 108) | 2.05E-10a |
| TAB | |||||||||
| Vidutinė (min. Maks.) | 63 (35 - 75) | 67.5 (45 - 81) | 0.080 | 61 (45 - 79) | 63 (32 - 82) | 0.835 | 62 (35 - 79) | 65 (32 - 82) | 0.240 |
| VAS | |||||||||
| Vidutinė (min. Maks.) | 31 (15 - 40) | 31 (13 - 51) | 0.558 | 36.5 (22 - 48) | 34 (27 - 52) | 1.000 | 32 (15 - 48) | 34 (13 - 52) | 0.637 |
| BInS | |||||||||
| Vidutinė (min. Maks.) | 18 (10 - 26) | 17.5 (13 - 27) | 0.642 | 18.5 (12 - 25) | 20 (13 - 21) | 0.138 | 18 (10 - 26) | 19 (13 - 27) | 0.302 |
IGD, interneto žaidimų sutrikimų pacientai; KS, Korėjos interneto priklausomybės Proneness Scale; BIS, Barratt impulsyvumo skalė; BAS, elgesio aktyvinimo sistema; BInS, elgesio slopinimo sistema; KRW, korėjietiško laimėjo.
aP <0.05 (Manno – Whitney – Wilcoxono testas).
TaqMan mažo tankio miRNR masyvo (TLDA) eksperimentai
Iš kiekvieno dalyvio surinktas periferinis kraujas ir 4 h perkelta į laboratoriją, kad būtų sumažinta kraujo ląstelių lizė. Mėginys buvo centrifuguojamas 3,000 rpm 10 min. Kambario temperatūroje. Tada supernatantas (plazmos sluoksnis) buvo surinktas be užteršimo kraujo ląstelėmis. Cirkuliuojančios miRNR buvo išgautos TaqMan miRNA ABC valymo rinkiniu (Human Panel A, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV) pagal gamintojo nurodymus. Trumpai tariant, 50 µL plazmos mėginio ir 100 µL ABC buferio buvo sumaišyti. Po hibridizacijos su tiksliniais specifiniais anti-miRNA magnetiniais karoliukais, ribotos cirkuliuojančios miRNR buvo išplautos iš karoliukų su 100 µL eliuavimo buferiu. Atradimo fazėje 381 miRNAs buvo ištirti iš 51 plazmos mėginių (25 IGDs ir 26 kontrolė), naudojant gamintojo nurodymus TaqMan miRNA ABC valymo rinkinį (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). Megaplex atvirkštinės transkripcijos ir prieš amplifikacijos reakcijos buvo atliktos siekiant padidinti cDNR kiekį miRNR ekspresijos analizei naudojant MegaplexPreAmp pradmenų žmogaus baseiną A ir TaqManPreAmp pagrindinį mišinį (Thermo Fisher Scientific). TLDA skydelis „v2.0“ („Thermo Fisher Scientific“) buvo atliktas naudojant „ViiA7“ realaus laiko PCR sistemą („Thermo Fisher Scientific“), kad būtų galima įvertinti miRNR ekspresiją. Neapdoroti duomenys buvo apdorojami naudojant „ExpressionSuite Software v1.0.4“ („Thermo Fisher Scientific“), kad būtų galima nustatyti kiekvienos miRNR Ct reikšmes.
TLDA duomenų analizė
Pirmiausia mes išmatavome kiekvienos miRNR slenksčio ciklus (Ct reikšmę). miRNR, kurių Ct vertė> 35, buvo laikomos neaptinkamomis ir pašalintos iš vėlesnės analizės. Visos Ct vertės buvo normalizuotos pagal miR-374b (ΔCt reikšmę), vienos iš stabiliausiai ekspresuotų miRNR, cirkuliuojančių žmogaus plazmoje, Ct vertę (24). Ekspresijos log2 kartų keitimo santykis (ΔΔCt vertė) apskaičiuotas naudojant kontrolinių mėginių vidurkius kaip kalibratorių HTqPCR pakete Bioconductor (25). Santykinis kiekvieno miRNR kiekio nustatymas (RQ) buvo apibrėžtas kaip 2−ΔΔCt. Dėl hipotetinio dviejų grupių ekspresijos skirtumo analizės taikėme pakaitinių kintamųjų analizę (SVA), kad gautume heterogeniškumą, pvz. sva paketas Bioconductor (26). miRNR su a P-vertė <0.05 buvo laikoma reikšmingai skirtinga tarp dviejų grupių.
Genų rinkinio sodrinimo analizė
Genų rinkinio sodrinimo analizei naudojome ToppFun ToppGene Suite (27) daryti išvadą apie žymiai praturtintą genų ontologiją (GO) (28) terminai, kelias ir ligos terminai. Kaip šio metodo įvestį, mes naudojome 1,230 prognozuojamus tikslinių genų kandidatų miRNR. Naudojant KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP ir ToppGene kelius, buvo panaudota kelio analizė siekiant nustatyti reikšmingus numatomų tikslinių genų kelius. Funkcinių praturtinimo terminų reikšmė buvo nustatyta pagal Bonferroni pakoreguotą Preikšmė.
Kiekybinis atvirkštinės transkripcijos PCR (qRT-PCR) patvirtinimas ir replikacija
Norėdami patvirtinti 10 miRNR, kurie buvo skirtingai išreikšti atradimo etape, qRT-PCR buvo atliktas naudojant TaqMan MicroRNA tyrimą (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p, # 000413; miR-125-5p, #000449; -200p, #3 ir miR-002300-337p, #5) ir „ViiA002156“ sistema („Life Technologies“) pagal gamintojo protokolą. Dešimt nanogramų bendros RNR buvo konvertuojamos į pirmojo krypties cDNR su specifiniais praeiviais miRNA naudojant TaqMan MicroRNA atvirkštinės transkripcijos rinkinį (#411, Life Technologies), po to realaus laiko PCR su TaqMan zondais. Kiekvieno miRNR RQ buvo apibrėžta kaip 5−ΔCt, kur ΔCt yra atitinkamo mėginio ribinių ciklų skirtumas, normalizuotas prieš endogeninį miRNR (miR-374b-5p, #001319). Visos PCR reakcijos buvo atliekamos trimis egzemplioriais, o jų Ct vertės buvo vidutinės. Kiekvieno miRNR skaičiuojame log2 kartų keitimo santykį (ΔΔCt) tokiu pat būdu, kaip ir matricos analizėje. Atliktas neparametrinis Mann – Whitney – Wilcoxon testas, siekiant ištirti miRNR ekspresijos lygių skirtumus dviejose grupėse, turinčiose ribą P0.05 reikšmė.
Western Blot analizė
Kiekvienas serumo mėginys pirmą kartą buvo išeikvotas iš 14 didelio gausumo baltymų (albumino, imunoglobulino G, imunoglobulino A, serotransferino, haptoglobino, alfa-1 antitripsino, fibrinogeno, alfa-2 makroglobulino, alfa-1 rūgšties glikoproteino, imunoglobulino M, apolipoproteino AI). , apolipoproteinas A-II, komplementas C3 ir transtiretinas), naudojant MARS-14 kolonėlę (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) prieš Western blot analizę. Nesurišta frakcija, gauta iš MARS-14 kolonėlės, koncentruota naudojant „Amicon Ultracel-3“ išcentrinį filtrą (3 kDa ribą), o tada baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant binokronino rūgšties metodą. Tokie patys kiekiai (nuo 10 iki 30 µg) kontroliniai ir IGD serumo mėginiai buvo atskirti 4-20% Mini-PROTEAN TGX geliu (Bio-Rad, CA, JAV) ir perkelti į polivinilideno difluorido membraną. Po to membrana buvo užblokuota TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 ir 0.05% Tween 20) su 5% riebalų sausu pienu kambario temperatūroje, esant 30 min. Tada membranos buvo inkubuojamos su pirminiais antikūnais prieš DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, JAV) ir CNR1 (1: 100, Santa Cruz biotechnologija , Inc, Santa Cruz, CA, USA), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, JAV) ir PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) TBS-T su 5 % riebalų neturinčio sauso pieno per naktį 4 ° C temperatūroje ir tada su atitinkamais antriniais antikūnais, arba galvijų anti-pele (1: 1,000, Santa Cruz biotechnologija), arba ožkų anti-triušiais (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, JAV ), konjuguotas su krienų peroksidaze kambario temperatūroje 1 h. Signalo aptikimas buvo atliktas naudojant chemiluminescenciją su ECL reagentu (GE sveikatos priežiūra, Piscataway, NJ, JAV). Mes nustatėme Western blot rezultatus, naudojant TotalLab 1D analizės programinę įrangą (Nelinijinė dinamika, Niukaslas prie Taino, JK). Tada densitometrijos santykio vertė buvo apskaičiuota dalinant kiekvieno mėginio densitometrijos vertę, kaip aprašyta kitur (29). Kaip normalizavimo kontrolė, kiekvienam eksperimentui buvo panaudotas 46 IGD ir kontrolinių mėginių kiekis. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas naudojant neparametrinį Mann – Whitney – Wilcoxon testą su ribine verte P0.05 reikšmė.
rezultatai
Studijų dalykų charakteristikos
Demografiniai ir klinikiniai tyrimo dalykų bruožai pateikti 1 lentelėje Table1.1. Palyginus IGD ir kontrolės grupes pagal Korėjos interneto priklausomybės pranašumo skalę (K-Skale), kaip aprašyta kitur (20, 30), IGD grupė parodė žymiai didesnę K-skalės vidutinę vertę nei kontrolinė grupė (37 vs. 24, \ t P = 3.81 × 10-6) (Lentelė. \ T (Table1) .1). Vidutinė savaitės trukmė, skirta internetiniams žaidimams IGD grupėje, buvo žymiai ilgesnė nei kontrolinių grupių (18 vs 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Nors tarp dviejų grupių nebuvo didelio skirtumo tarp amžiaus, namų ūkių mėnesinių pajamų, išsilavinimo trukmės, blokų projektavimo ir „K-WISC“, BIS, BInS ir BAS rezultatų.
Skirtingai išreikšti miRNR tarp IGD ir kontrolės
Norėdami atrasti su IGD susijusius miRNA, mes priėmėme dviejų pakopų (atradimo ir nepriklausomo patvirtinimo) metodą. Studijų planas ir bendra strategija pavaizduoti S1 paveiksle papildomoje medžiagoje. Atradimo etape mes analizavome 51 mėginių miRNA ekspresijos profilius (25 IGDs ir 26 kontrolė), naudojant miRNA matricą, kurioje yra 384 miRNAs. Nustatyta, kad 10 miRNR ekspresijos lygiai žymiai skiriasi tarp IGD ir kontrolinių grupių (lentelė. \ T (Table2) .2). Šių 10 miRNAs santykiniai ekspresijos lygiai pateikti pav Figure1.1. Tarp jų du (hsa-miR-423-5p ir hsa-miR-483-5p) buvo reguliuojami ir aštuoni (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411-5p ir hsa-miR-652-3p) buvo sureguliuoti IGD grupėje.
Lentelė 2
Diferencijuotai išreikšti mikroRNR (miRNR) ir pakitimai.
| miRNR | Atradimas | Patvirtinimas | Kombinuotas | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Preikšmė | Sulenkite pakeitimus | Preikšmė | Sulenkite pakeitimus | Preikšmė | Sulenkite pakeitimus | |
| hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
aMiRNAs nuosekliai žymiai pasikeitė tiek atradimų, tiek patvirtinimo rinkiniuose.
qRT-PCR kandidatų MiRNA patvirtinimas
Norėdami patvirtinti 10 kandidato miRNA, atlikome qRT-PCR su nepriklausomu patvirtinimo rinkiniu (20 IGDs ir 16 valdikliai) (lentelė S1 papildomoje medžiagoje). Trys iš šių miRNR (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p ir hsa-miR-652-3p) reikšmingai sumažėjo patvirtinimo rinkinio IGD grupėje (lentelė (Table2) .2). Trys kiti miRNR (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b ir hsa-miR-423-5p) taip pat buvo sumažinti IGD grupėje, bet ne reikšmingai. Likę keturi miRNR (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p ir hsa-miR-423-5p) buvo patvirtinti priešingai validavimo rinkinyje. Sujungus atradimų ir patvirtinimo rinkinius (iš viso 45 IGD subjektai ir 42 kontrolė), trys patvirtinti miRNA buvo nuosekliai reikšmingi (lentelė (Table2) .2). Išsami informacija, chromosomų vietos, brandžios sekos ir ekspresijos lygiai šių trijų miRNR CNS yra prieinami papildomos medžiagos lentelėje S2.
Trijų miRNR sinergistinis poveikis IGD rizikai
Siekiant įvertinti bendrą trijų miRNR poveikį, mes stebėjome keturių pogrupių (su 0, 1, 2 arba 3 miRNA pakeitimais) šansų santykius. MiRNA keitimas buvo nustatytas pagal RQ vertę, kaip aprašyta skyriuje „Medžiagos ir metodai. “Kadangi visi trys miRNAs žymenys buvo pakoreguoti IGD grupėje, miRNA, kurios RQ vertė buvo mažesnė už vieną, buvo pakeista. Išsami informacija apie kiekvieno tyrimo dalyko RQ vertę trims miRNAs yra pateikta S3 lentelėje Papildomos medžiagos. Kiekvienam pogrupiui šansai buvo apskaičiuoti kaip kontrolinių skaičiaus ir IGD santykis, tada kiekvienas OR apskaičiuotas kiekvienos pogrupio koeficientus padalijus iš pogrupio koeficientų be jokių MiRNA pakeitimų. Asmenys, turintys tris miRNR pokyčius, parodė, kad 22 kartus didesnė rizika nei nustatyta be MiRNA pakeitimo (ARBA 22, 95% CI 2.29 – 211.11). Atvirieji regionai parodė didėjančią tendenciją, kai iš 0 į 3 buvo pakeistas miRNR (r2 = 0.996) (pav (Pav .22).
Kandidatų MiRNR tikslinių genų GO ir Pathway analizė
Norint įžvelgti trijų miRNR žymenų, žymiai sumažintų IGD grupėje, funkcijas, jų tiksliniai genai buvo prognozuojami naudojant miRWalk 2.0 duomenų bazę (31). Iš viso 1,230 genai buvo nuosekliai numatyti keturiais algoritmais (miRWalk, miRanda, RNA22 ir Targetscan), naudojant miRWalk duomenų bazę (downstream).32-34) (Lentelė S4 papildomoje medžiagoje). Genų rinkinio sodrinimo analizė, naudojant „ToppFun“ ToppGene Suite, parodė, kad šių miRNAs tiksliniai genai buvo reikšmingai susiję su neuronų vystymosi keliais, pvz., „Axon“ gairėmis ir GO terminais, tokiais kaip „neurogenesis“ (lentelė S5 papildomoje medžiagoje).
Prognozuojamų tikslinių genų išraiška
Tarp trijų miRNR žemutinių tikslinių genų 140 buvo prognozuojami vienu metu dviem ar daugiau miRNAs (lentelė S4 papildomoje medžiagoje). Norėdami ištirti, ar jų baltymų ekspresijos lygiai pasroviui taikomuose genuose yra skirtingi tarp IGD ir kontrolinių grupių, mes pasirinkome 2 genus (DUSP4 ir PI15), kurios yra numatytos kaip visų 3 miRNAs ir papildomų 3 genų (\ tGABRB2, DPYSL2ir CNR1) iš numatytų 2 miRNAs ir atlikta vakcinos analizė su plazmos mėginiais iš 28 IGDs ir 28 valdiklių, kurie buvo prieinami eksperimentui. Palyginome penkių tikslų išraiškas tarp IGD ir kontrolinių grupių, matuojant juostos intensyvumą ir plotą, kaip aprašyta kitur (29). Tarp jų - DPYSL2 (28 IGD ir 28 valdikliai) išraiškos lygiai, P = 0.0037) ir GABBR2 (27 IGD ir 28 kontroliniai, P = 0.0052) buvo žymiai didesni IGD grupėje (XNUMX pav (Figure3) .3). Tačiau mes negalėjome stebėti skirtingų CNR1 išraiškų (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) ir PI15 (P = 0.6346).
Diskusija
Pranešta, kad miRNR dalyvauja neuronų vystyme (35, 36), ir diferencinė smegenų miRNR ekspresija stebima psichikos ligomis, tokiomis kaip šizofrenija (\ t37). Todėl tikėtina, kad cirkuliuojančios miRNR profiliai galėtų būti naudingi biomedžiagos žymenys IGD. Cirkuliuojančios miRNR buvo pasiūlytos kaip biomarkeriai įvairiems neuropsichiatriniams sutrikimams (38-40); tačiau molekuliniai IGD vystymosi mechanizmai vis dar nežinomi, nepaisant jo klinikinės ir socialinės svarbos. Konkrečiai, nebuvo atlikta su IGD susijusių miRNR tyrimų. Šio tyrimo tikslas buvo dvejopas. Pirma, bandėme atrasti plazmos miRNR, susijusių su IGD. Antra, įvertinome miRNR kandidatų biologinę įtaką, ištiriant baltymų ekspresiją ir GO pasroviui žemiau esančius tikslinius genus. Atliekant genominį visapusišką miRNR ekspresijos profilių patikrinimą ir kandidatų patvirtinimą, mes nustatėme, kad trijų miRNR (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p ir hsa-miR-652-3p) ekspresija buvo pacientams, kurie yra žymiai mažesni nei kontrolinės grupės. Nors kitų septynių miRNR kandidatų ekspresijos modeliai patvirtinimo metu nebuvo pakartoti, tai gali būti klaidinga neigiama dėl mažo mėginio dydžio šiame tyrime. Mūsų žiniomis, tai yra pirmoji ataskaita apie galimybę, kad kraujo miRNR ekspresijos profiliai gali būti naudingi IGD biomarkeriai. Trijų miRNR žymenų derinys galėtų būti minimaliai invazinis įrankis, skirtas ankstyvam žmonių, kuriems gresia IGD, identifikavimui.
Nustatyta, kad šiame tyrime nustatyti miRNR dalyvauja įvairiuose neuropsichiatriniuose sutrikimuose. Nustatyta, kad hsa-miR-200c ekspresija kraujyje sumažėjo keliuose psichikos sutrikimuose, tokiuose kaip šizofrenija (41) ir didelių depresijos epizodų (\ t42). Manoma, kad miR-200c yra labiau išreikštas sinaptinėmis frakcijomis nei bendrojo smegenų (43) ir taip pat būti susiję su neuronų ląstelių mirtimi (44). Remiantis šiais ankstesniais pranešimais, miR-200c dalyvauja neurodiagnostikoje ir gali būti siejamas su neuropsichiatriniais sutrikimais, jei jo ekspresija yra sutrikusi. Keletas tyrimų parodė ryšį tarp miR-652 ir neuropsichiatrinių sutrikimų. Panašiai kaip ir mūsų požiūris, nustatyti šizofrenijos kraujo biomarkerius, Lai et al. atlikta TLDA analizė su šizofrenijos ligoniais ir normaliomis kontrolėmis ir nustatyta, kad septyni miRNR, įskaitant hsa-miR-652, buvo skirtingai ekspresuoti šizofrenijos pacientams (45). Vėlesniame tyrime jie sukūrė prognozavimo modelį, naudodamiesi miRNA ekspresijos duomenimis, ir sėkmingai išskyrė šizofreniją nuo normalios kontrolės (46). Taip pat pastebėta hsa-miR-652 pakeista ekspresija alkoholikams (47). Nustatyta, kad Hsa-miR-26b aktyvuojamas neuronų ląstelių diferenciacijos metu (48). Perkins ir kt. pranešė, kad hs-miR-26b buvo sumažintas šizofrenijos pacientų prefrontiniame žieve (49).
Nors nėra tiesioginių įrodymų, patvirtinančių ryšį tarp sutrikusios šių miRNR ekspresijos ir IGD patofiziologijos, galime daryti išvadą, kad šių miRNR disreguliacija gali būti siejama su IGD patofiziologija, remiantis įvairiomis ankstesnėmis ataskaitomis apie prognozuojamus genus. . Kai kurie iš trijų miRNR genų, tokių kaip GABRB2, CNR1, NRXN1ir DPYSL2 pranešama, kad yra susiję su neuropsichiatriniais sutrikimais. Gamma-aminobutirūgštis (GABA) yra pagrindinis neurotransmiterius CNS. GABA receptorių reguliavimas yra susijęs su neuropsichiatriniais sutrikimais, įskaitant priklausomybę, nerimą ir depresiją (50), kurios taip pat yra pagrindinės IGD savybės (\ t8). GABA receptorių genų genetiniai polimorfizmai yra susiję su alkoholio priklausomybe ir šizofrenija (51, 52). Dihidropirimidinazei panašus 2 (DPYSL2) yra kolapsino atsako mediatoriaus baltymų šeimos narys, kuris atlieka svarbų vaidmenį mikrotubulų surinkime, sinaptinėje signalizacijoje ir aksoninio augimo reguliavime. Todėl ši molekulė buvo pasiūlyta kaip psichikos sutrikimų biomarkeris (53, 54). Polimorfizmas DPYSL2 taip pat buvo pranešta, kad jis susijęs su alkoholio vartojimo sutrikimu (55). Ankstesnės ataskaitos ir mūsų duomenys rodo, kad GABRB2 ir DPYSL2, žemiau reguliuojamų miRNAs, poekspresija turi įtakos neuropsichiatrinių sutrikimų, įskaitant IGD, patogenezei. 1 tipo kanabinoidų receptorius (CNR1) yra presinaptinis heteroreceptorius, kuris moduliuoja neurotransmiterio išsiskyrimą ir kanabinoidų signalizacijos sutrikimus sieja su įvairiais neuropsichiatriniais sutrikimais (56). Genetinis polimorfizmas. \ T CNR1 žinoma, kad genas yra priklausomas nuo priklausomybės nuo kaukazo \ t57). Žiurkių modelio ventralinio hipokampo CNR1 aktyvacija sutrikdo normalų socialinį elgesį ir pažinimą (58). Yra žinoma, kad genetinis NRXN šeimos pakeitimas yra susijęs su įvairiais neuropsichiatriniais sutrikimais, įskaitant priklausomybę (59).
Norėdami ištirti trijų miRNR kandidatų biologinę įtaką tiesioginiu būdu, ištyrėme jų pasroviui taikomų tikslinių genų baltymų ekspresiją. Dėl riboto plazmos mėginių, 140 bendrų kandidatų (numatytų kaip 2 ar daugiau miRNAs), mes išnagrinėjome 5 taikinius (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 ir PI15) Western blot ir patvirtinome, kad GABRB2 ir DPYSL2 buvo žymiai didesnis IGD grupėje. Ankstesnės ataskaitos ir mūsų duomenys rodo, kad GABRB2 ir DPYSL2, žemiau reguliuojamų miRNAs, poekspresija gali turėti įtakos neuropsichiatrinių sutrikimų, įskaitant IGD, patogenezei. Neurobiologinių miRNR žymenų reikšmės taip pat palaiko neuronų vystymosi takų GO ir kelio analizės rezultatus. Kitas įdomus atradimas buvo sinerginis efektas, kurį tuo pačiu metu pakeitė miRNA. Asmenims, kuriems nustatytas visų 3 miRNR slopinimas, nustatyta, kad 22 kartus didesnė rizika yra didesnė nei tų, kuriems nenustatyta reguliacija, o atokiausi regionai padidėjo priklausomai nuo dozės. Nors šių trijų pakeitimų CI buvo didelis dėl riboto imties dydžio, aiški teigiama koreliacija (r2 = 0.996) palaiko trijų miRNR sinerginį poveikį.
Nors mes nustatėme su IGD susijusius miRNR žymenis ir asmenis, turinčius visus tris miRNR pokyčius, rizika 22 kartus buvo didesnė už tuos, kurie neturėjo jokių miRNR pokyčių, šiame tyrime yra keletas apribojimų. Pirma, mažas mėginio dydis padidino tikimybę, kad trūksta kitų reikšmingų miRNA žymenų. Antra, kadangi mūsų duomenų nepakako, kad išsiaiškintume, ar plazmos miRNR profiliai yra arba priežastiniai, ir negalime patvirtinti šių neinvazinių žymenų biologinių vaidmenų klinikinėje aplinkoje. Tolesnis miRNR profiliavimas ir jų genų analizė, naudojant smegenų audinį iš žmogaus smegenų audinio, gali suteikti daugiau tiesioginio atsakymo. Būtų naudinga ir smegenų audinių analizė su žaidimų sutrikimų gyvūno modeliu. Trečia, dėl riboto plazmos mėginių prieinamumo, ištyrėme tik penkias pasroviui kandidatų molekules. Siekiant geriau suprasti IGD molekulinį mechanizmą, bus naudinga ištirti daugiau pasroviui taikomų tikslų su didesniu pavyzdžių rinkiniu.
Apibendrinant, atlikus miRNR ekspresijos profilių ir nepriklausomo patvirtinimo genomo tyrimą, mes nustatėme tris su IGD susijusias miRNR (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p ir hsa-miR-652-3p). Pranešama, kad daugelis jų žemutinių genų dalyvauja įvairiuose neuropsichiatriniuose sutrikimuose, ir eksperimentinis šių pakitimų genų ekspresijos patvirtinimas palaiko šiame tyrime nustatytų miRNR implikaciją. Mes nustatėme, kad asmenims, kuriems nustatytas visų trijų miRNR sumažėjimas, yra didelė IGD rizika. Kartu su žinomais klinikiniais ar aplinkos rizikos veiksniais ir diagnostiniais kriterijais mūsų išvados gali palengvinti ankstyvą intervenciją, siekiant padėti žmonėms, kuriems yra didesnė IGD rizika.
Etikos ataskaita
Šį tyrimą patvirtino Korėjos katalikų universiteto medicinos koledžo (MC16SISI0120) institucinė peržiūros taryba. Visi dalyviai ir jų tėvai davė raštišką sutikimą.
Autoriaus įnašai
ML ir HC taip pat prisidėjo prie šio dokumento. Tyrimą parengė ML, D-JK ir Y-JC. SJ, S-MC, YP, DC ir JL atliko eksperimentus ir duomenų generavimą. J-WC, S-HP, J-SC ir D-JK surinko kraujo mėginius ir klinikinę informaciją. ML, HC, S-HY ir Y-JC analizavo duomenis. ML, HC, S-HY ir Y-JC aprašė rankraštį. Y-JC prižiūrėjo projektą.
Interesų konflikto pareiškimas
Autoriai teigia, kad tyrimas buvo atliktas nesant jokių komercinių ar finansinių santykių, kurie galėtų būti laikomi galimu interesų konfliktu.
Išnašos
Finansavimas. Šis darbas buvo paremtas „Smegenų tyrimų programos“ parama iš Korėjos nacionalinio mokslinių tyrimų fondo (NRF), kurią finansavo Mokslo ir IRT ministerija ir būsimas planavimas (NRF-2015M3C7A1064778).
Papildoma medžiaga
Šio straipsnio papildomą medžiagą galima rasti internete adresu http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Nuorodos
;
