Anotācija
Psihostimulantu izraisītas dendritisko muguriņu izmaiņas dopaminoceptīvajos neironos kodolkrāsās (NAcc) ir hipotēzes kā adaptīva neironu reakcija, kas ir saistīta ar ilgstošu atkarību izraisošu uzvedību. NAcc lielā mērā sastāv no divām atšķirīgām vidēja lieluma smadzeņu nervu apakšpopulācijām, kas izpaužas kā dopamīna D1 vai D2 receptoru augsts līmenis. Šajā pētījumā mēs analizējām dendritisko mugurkaula blīvumu pēc hroniskas kokaīna terapijas atsevišķos D1 vai D2 receptoru saturošos vidēja lieluma smadzeņu nervos NAcc. Šajos pētījumos tika izmantotas transgēnas peles, kas ekspresēja EGFP D1 vai D2 receptoru promotora (Drd1-EGFP vai Drd2-EGFP) kontrolē. Pēc kokaīna terapijas 28 dienām un 2 lietošanas pārtraukšanas dienām mugurkaula blīvums palielinājās gan Drd1-EGFP-, gan Drd2-EGFP pozitīvajos neironos. Tomēr mugurkaula blīvuma pieaugums saglabājās tikai Drd1-EGFP pozitīvajos neironos 30 dienas pēc zāļu lietošanas pārtraukšanas. Jāatzīmē, ka palielināta ΔFosB ekspresija tika novērota arī Drd1-EGFP- un Drd2-EGFP-pozitīvajos neironos pēc zāļu izņemšanas no 2 dienas, bet tikai Drd1-EGFP pozitīvajos neironos pēc 30 dienu zāļu lietošanas pārtraukšanas. Šie rezultāti liecina, ka palielinātais mugurkaula blīvums, kas novērots pēc hroniskas kokaīna terapijas, ir stabils tikai D1 receptoru saturošiem neironiem un ka ΔFosB ekspresija ir saistīta ar dendritisko muguriņu veidošanos un / vai uzturēšanu D1, kā arī D2 receptoru saturošiem neironiem NAcc.
Mesolimbiskais dopamīnerģiskais ceļš sastāv no neironiem ventrālā tegmentālā apgabalā, kas iedzen kodolus (NAcc), ožas tuberkulu, prefrontālo garozu un amygdalu (1), savukārt nigrostriatāla dopamīnerģiskie neironi, kas ir materiāla nigrā (pars compacta), nodrošina augošu projekciju uz muguras striatumu (2). Psihostimulanti paaugstina dopamīna sinaptisko koncentrāciju NAcc: kokaīnu, bloķējot dopamīna uzņemšanu no sinaptiskā plaisa un amfetamīnu, veicinot dopamīna izdalīšanos no nervu galiem (3-5). Psihostimulantu atkārtota, periodiska ievadīšana palielina uzvedības reakcijas (sensibilizācija) pret šo zāļu akūtu stimulējošo iedarbību (6-8). Lielākā daļa pierādījumu līniju liecina, ka adaptīvās izmaiņas vēdera tegmentālās zonas - NAcc dopamīnerģiskajā sistēmā ir būtiskas, lai mainītu pieredzi, kas ir atkarīga no plastiskuma, kas ir pamatā narkotiku izraisītajai uzvedībai.
Līdztekus dopamīnam, lai reaģētu uz psihostimulantiem, ir nepieciešama glutamāts, lai attīstītu uzvedību (9, 10). Vidēja izmēra smadzeņu neironi (MSN) ventrālajā striatumā saņem eksitējošus glutamatergiskus projekcijas no prefrontālās garozas, kas sinapses uz dendritisko muguriņu galvām. MSN ir arī galvenais mērķis dopamīnerģiskajiem aksoniem, kas sinapses uz mugurkaula kakliem (1, 11, 12). Tāpēc dendritiskie muguriņas MSNs ir šūnu nodalījums, kurā sākotnēji ir integrēta dopamīnerģiskā un glutamaterģiskā transmisija.
Dopamīns iedarbojas uz diviem galvenajiem receptoru apakšgrupām, D1 apakšgrupu (D1 un D5 apakštipiem) un D2 apakšgrupu (D2, D3 un D4 apakštipi) (13). Dorsālā striatumā anatomiskie pētījumi ir parādījuši, ka striatonigrālie MSN satur D1 receptorus (kopā ar vielu P un dinamorfīnu), bet striatopallīdie MSN pārsvarā ekspresē D2 receptorus (kopā ar enkefalīnu) (14-17). NAcc projekcijas ir sarežģītākas nekā muguras striatumā, ar NAcc čaumalu un galvenajām daļām, kas projicē uz atsevišķiem ventrālā palliduma apakšreģioniem un ventrālo tegmentālo zonu un materia nigra (18). Tā kā D2 receptoriem un enkefalīnam ir izteikti izteiktas ventrālās palliduma projekcijas, D1 receptoriem un vielai P tiek konstatēts vienāds sadalījums projekcijās pret ventrālo palidumu un ventrālo tegmentālo zonu (19). Pētījumi par D1 vai D2 receptoriem selektīviem agonistiem un antagonistiem parādīja, ka gan D1, gan D2 receptoriem ir nepieciešamas psihostimulantu atkarīgas uzvedības izmaiņas (20-25). Tomēr šo receptoru lomas ir atšķirīgas. Piemēram, D1 receptoru stimulēšana vājina kokaīna meklēšanu, ko izraisa kokaīna iesmidzināšanas injekcijas un ar kokaīnu saistītie vides rādītāji, bet D2 receptoru stimulēšana veicina kokaīna izraisītu atjaunošanu (26-28).
Uzvedības novirzes, kas saistītas ar psihostimulantu atkarību, ir ļoti ilgstošas. Tāpēc ir bijusi liela interese identificēt ilgstošas narkotiku izraisītās izmaiņas molekulārajā un strukturālajā līmenī neironu ķēdēs, ko regulē dopamīns un glutamāts (29-32). Konstatēts, ka ir konstatēts, ka ilgstoša kokaīna vai amfetamīna iedarbība palielina MSNs dendritisko zaru punktu un muguriņu skaitu NAcc (33-35). Ir pierādīts, ka šīs strukturālās izmaiņas saglabājas līdz pat N1 – 3.5 mēnešiem pēc pēdējās zāļu iedarbības (30, 35) un ir ierosināts pamatot ilgstošas sinapsiskās plastitātes izmaiņas, kas saistītas ar psihostimulantu iedarbību.
Šā pētījuma mērķis bija pārbaudīt kokaīna izraisītās strukturālās izmaiņas dendritisko muguriņu veidošanā apakškopu MSN, kas ekspresē vai nu D1, vai D2 receptorus. Šajos pētījumos mēs izmantojām baktēriju mākslīgās hromosomas (BAC) transgēnās peles, kas ekspresē EGFP vai nu D1 (Drd1-EGFP), vai D2 (Drd2-EGFP) dopamīna receptoru promotora kontrolē (36). Rezultāti rāda, ka, lai gan mugurkaula blīvuma palielināšanās sākotnēji rodas D1 receptoru saturošos MSN un D2 receptoru saturošos MSN, mainītais mugurkaula blīvums ir stabils tikai D1 receptoru saturošos neironos. Turklāt mēs atrodam līdzīgas izmaiņas transkripcijas faktora ΔFosB ekspresijā, kas liecina, ka ΔFosB var būt iesaistīts Dendritic muguriņu veidošanā un / vai uzturēšanā D1, kā arī D2 receptoru saturošiem neironiem NAcc.
rezultāti
MSN analīze Drd1-EGFP un Drd2-EGFP BAC transgēnās pelēs.
MSNs projekcijas modelis no dorsāla un ventrālā striatuma Drd1-EGFP vai Drd2-EGFP BAC transgēnās pelēs ir raksturots, analizējot GFP ekspresiju (36). GFP diferencētā ekspresija dorsālā striatuma MSNs kopumā atbilst attiecīgi endogēnajiem D1 vai D2 receptoriem.36). Turpmāk analizējām diferenciālo GFP ekspresiju NAcc Drd1-EGFP vai Drd2-EGFP pelēm (Fig. 1a un b). Lai gan c58% neironiem NAcc izteica GFP Drd1-EGFP pelēm (Fig. 1a), C48% NAcc neironiem izteica GFP Drd-2-EGFP pelēm (Fig. 1b). MSN ir 90 – 95% no visiem NAcc neironiem (12, 37). D1 receptorus izsaka tikai MSN, un D2 receptorus izsaka MSNs un holīnerģiskos interneuronos, kas pārstāv 1 – 3% no striatāla neironiem (37). Ņemot vērā šos faktorus, rezultāti liecina, ka minimāli c10 – 15% MSNs NAcc varētu izpausties gan D1, gan D2 receptoriem.
Dendritisko muguriņu analīze Drd1-EGFP un Drd2-EGFP pelēm.
GFP ekspresija Drd1-EGFP un Drd2-EGFP pelēm bija noderīga neironu šūnu struktūru traipiem. Tomēr GFP signāls dendritos un dendrītiskajos muguros bija pārāk vājš, lai varētu veikt analīzi pēc imunoloģiskās krāsošanas ar anti-GFP antivielām. Fluorescējošo krāsu daļiņu mediētā piegāde nesen tika izmantota, lai ātri un efektīvi iezīmētu neironu populācijas (38). Visu neironu var marķēt, izmantojot šo metodi, un metode, šķiet, ir salīdzināma ar Golgi-Cox krāsošanu. Lai analizētu neironu dendrītisko morfoloģiju NAcc, fiksētas akumbālās šķēles tika marķētas ar lipofīlo fluorescences krāsu 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbocianīna perhlorātu (DiI), izmantojot gēnu ieroci. Ir parādīts DiI krāsotas MSN piemērs Fig. 1c. Izmantojamos apstākļos mēs parasti novērojām marķētus neironus bez dendritu pārklāšanās no citiem marķētiem neironiem. Pie augstāka palielinājuma varēja novērot detalizētu dendrīta morfoloģiju, ieskaitot dendritiskos muguriņus (Fig. 1d).
Tad mēs izmantojām DiI marķējuma un imūnhistoķīmijas kombināciju GFP vai nu Drd1-EGFP, vai Drd2-EGFP transgēnās pelēs, kas bija iespējams, izmantojot nelielu mazgāšanas līdzekļa koncentrāciju audu caurlaidībai (skat. Metodes). Rūpīgi salīdzinot DiI traipu un GFP ekspresiju MSN šūnu struktūrās, mēs varētu identificēt DiI- un GFP-pozitīvos vai DiI-pozitīvos un GFP-negatīvos neironus Drd1-EGFP (Fig. 2a) vai Drd2-EGFP (Fig. 2b) pelēm. Turpmākajos pētījumos mēs analizējām dendrītisko morfoloģiju tikai DiI un GFP pozitīvos neironos no Drd1-EGFP vai Drd2-EGFP pelēm.
Hroniskas kokainas ārstēšanas rezultāti paaugstinātā mugurkaula blīvumā, izmantojot MSC, kas izteikts kā Drd1-EGFP vai Drd2-EGFP.
Drd1-EGFP vai Drd2-EGFP peles atkārtoti ievadīja ar kokaīnu (30 mg / kg) vai sāls šķīdumu četras nedēļas pēc kārtas (skatīt \ t Metodes). Divas dienas (2WD) vai 30 dienas (30WD) pēc pēdējās ārstēšanas, smadzenes tika apstrādātas DiI marķēšanai un imūnhistoķīmijai, kā aprakstīts iepriekš. Iepriekšējā pētījumā tika ziņots, ka hroniska ārstēšana ar amfetamīnu palielināja mugurkaula blīvumu MSN dinālā, bet ne tuvākajā dendritā NAcc (35). Tāpēc mēs ierobežojām savu analīzi tikai uz distāliem dendritiem (ti, tiem, kam ir otrās vai trešās kārtas filiāles), ieskaitot gala reģionus. Analizējot 2WD, tika konstatēts, ka mugurkaula blīvums palielinās Drd1-EGFP pozitīvajos MSN (128% sāls grupas grupā).Fig. 3a un c) un mazākā mērā - Drd2-EGFP pozitīvajos neironos (115% sāls grupas grupā).Fig. 3 b un d). Pēc 30WD palielinājās mugurkaula blīvums Drd1-EGFP pozitīvajos neironos (118% sāls šķīduma kontrolē).Fig. 3 a un c), bet ne Drd2-EGFP pozitīvajos neironos (Fig. 3 b un d).
Dendritisko muguriņu morfoloģija ir mainīga atkarībā no garuma un mugurkaula galvas platuma. Tāpēc mēs klasificējām dendritiskos izvirzījumus četrās mugurkaula klasēs (stubby, sēņos, plānās un filopodijās) no kokaīna 2WD (dati nav parādīti). Sēņu veida blīvums (119.7 ± 4.0%, P <0.01) un plāniem muguriņiem (120.0 ± 3.4%, P <0.01) palielinājās, ārstējot kokaīnu ar Drd1-EGFP pozitīviem MSN, turpretī muļķības blīvums (182.4 ± 21.6%, P <0.05) un sēņu muguriņas (122.5 ± 5.0%, P <0.01) palielinājās Drd2-EGFP pozitīvos MSN. Drd1-EGFP pozitīvos neironos nav novērots būtisks mugurkaula mugurkaula pieaugums vai Drd2-EGFP pozitīvu neironu plāno mugurkaulu pieaugums.
Hronisks kokains izraisa ΔFosB ekspresiju Drd1-EGFP- vai Drd2-EGFP-pozitīvās MSNs NAcc.
ΔFosB ir transkripcijas faktoru Fos ģimenes loceklis. Kaut arī akūta kokaīna lietošana izraisa ātru un pārejošu vairāku Fos izoformu indukciju NAcc, atkārtota kokaīna iedarbība palielina ΔFosB līmeni. Turklāt ΔFosB ekspresijas pieaugums saglabājas NAcc nedēļās vai mēnešos pēc zāļu iedarbības pārtraukšanas, un ir ierosināts, ka tas ir iesaistīts ilgstošā gēnu ekspresijas regulēšanā pat pēc zāļu lietošanas pārtraukšanas (29, 39, 40).
Lai pārbaudītu ΔFosB indukciju NAcc no Drd1-EGFP vai Drd2-EGFP pelēm pēc kokaīna terapijas, mēs analizējām FosB un GFP izteiksmi ar dubultu marķēšanu (Fig. 4 un Tabula 1) Anti-FosB antiviela atpazīst visas FosB formas, bet mēs pieņemam, ka palielinātais imūnsensents ir ΔFosB (skat. Metodes turpmākai diskusijai). Sāls šķīdumā ārstētām pelēm XDUMN%% Drd16-EGFP-pozitīvo neironu un 1% Drd15-EGFP pozitīvo neironu izteica FosB imunoreaktivitāti ar relatīvi vāju intensitāti (Fig. 4 a un b un Tabula 1). Atkārtota kokaīna terapija, kam sekoja 2WD, nozīmīgi palielināja Drd1-EGFP pozitīvo neironu skaitu, kas ekspresēja ΔFosB (55% no GFP pozitīviem neironiem).Fig. 4c un Tabula 1). Drd2-EGFP pozitīvos neironos (GFP-pozitīvo neironu 25%) konstatēja mazāku, bet vēl joprojām ievērojamu ΔFosB ekspresijas pieaugumu (Fig. 4d un Tabula 1). Tāpat kā mugurkaula blīvuma izmaiņām, palielinājās AFosB ekspresija Drd1-EGFP pozitīvajos neironos (46% GFP-pozitīvo neironu), bet ne Drd2-EGFP pozitīvajos neironos (15% GFP pozitīvo neironu) pēc 30WD (Fig. 4 e un f un Tabula 1). Ņemiet vērā, ka palielinājās ΔFosB izteiksme, kas novērota Fig. 4f ir Drd2-EGFP negatīvos neironus.
diskusija
Tiek uzskatīts, ka ilgstošas adaptācijas dopamīnerģiskajā neirotransmisijā pamato atkarību izraisošo uzvedību, kas saistīta ar psihostimulējošām zālēm. Konkrēti, hipotēzi, ka psihostimulantu izraisītais MSN dendrīta mugurkaula blīvuma pieaugums NAcc ir saistīts ar sinaptiskā savienojuma reorganizāciju (30). NAcc lielā mērā sastāv no divām atšķirīgām MSN apakšpopulācijām, kas ekspresē D1 vai D2 dopamīna receptoru augstu līmeni. Šajā pētījumā pēc hroniskas kokaīna terapijas esam analizējuši mugurkaula blīvumu atšķirīgos D1 vai D2 receptoru saturošos MSN ar NAcc. Iegūtie rezultāti rāda, ka, lai gan palielinātais mugurkaula blīvums sākotnēji rodas D1 receptoru saturošos MSN un D2 receptoru saturošos MSN, mainītais mugurkaula blīvums ir stabils tikai D1 receptoru saturošos neironos. Bez tam, mēs atrodam līdzīgu izmaiņu modeli transkripcijas faktora ΔFosB izteiksmē D1 un D2 receptoru saturošos MSN.
Šajos pētījumos tika izmantotas BAC transgēnās peles, kas ekspresē GFP specifiskās MSN apakšpopulācijās vai nu D1 vai D2 receptoru promotora kontrolē. Turklāt mēs izstrādājām divkāršās marķēšanas metodi, kas apvienoja imūnhistoķīmiju GFP ar neironu ballistisko marķēšanu, izmantojot DiI. Iepriekšējie pētījumi izmantoja Golgi – Cox metodi, lai analizētu psihostimulantu ietekmi uz mugurkaula blīvumu (34), un šeit izmantotā DiI metode sniedza kvantitatīvi salīdzināmus rezultātus. Mēs izstrādājām dubultās marķēšanas metodi, jo Golgi krāsošana nav saderīga ar imūnhistoķīmiju. Imunizēšana parasti prasa audu caurlaidību ar mazgāšanas līdzekļiem, kas parasti noved pie lipofīlo krāsu izšķīdināšanas no membrānas (38). Tomēr mūsu pašreizējos pētījumos GFP imūnfiltrācijai nebija nepieciešama augsta koncentrācijas koncentrācija audu permeabilizācijai, un tādēļ to var izmantot kopā ar lipofilām krāsvielām. Mūsu divkāršās marķēšanas metodei vajadzētu būt vispārēji noderīgai, lai pētītu strukturālas izmaiņas dendrītu mugurās, piemēram, ja tās izmanto, lai analizētu BAC transgēnās peles līnijas, kurās GFP ir izteikta specifiskās neironu populācijās garozā (36).
Lai gan joprojām ir nedaudz pretrunīgi, tiek uzskatīts, ka D1 un D2 receptoriem lielā mērā ir anatomiski atdalīti tiešie (striatonigrālie) un netiešie (striatopalīdie) striatāla projekcijas neironi (17, 41). Sākotnējais GFP lokalizācijas raksturojums Drd1-EGFP un Drd2-EGFP pelēm atbilst šim secinājumam (36). Turklāt mūsu analīze par GFP pozitīvo neironu skaitu NAcc no Drd1-EGFP un Drd2-EGFP pelēm atbilst secinājumam, ka ≈50% MSNs izsaka tikai D1 receptorus, ka N35 – 40% izsaka tikai D2 receptorus, un ka N10 – 15% ekspresē gan D1, gan D2 receptorus. Šī koekspresijas vērtība ir līdzīga tai, ko nosaka pētījumi par muguras striatumu, kas apvienoja atsevišķu striatālu neironu patch-clamp analīzi ar RT-PCR metodēm, lai izolētu un pastiprinātu mRNS (k17% enkefalīna un vielas P ekspresija)42). Jāatzīmē, ka mūsu pašreizējie pētījumi neattiecas uz D3, D4 un D5 receptoru izpausmes jautājumu, kā arī neatrisina jautājumu par zemiem D1 receptoru ekspresijas līmeņiem MSN, kas izsaka augstu D2 receptoru līmeni, vai otrādi.
Vairākos iepriekšējos pētījumos tika pētīta psihostimulanta izraisītās Fos ekspresijas neironu lokalizācija un D1 un D2 receptoru loma.43-45). Šie pētījumi apstiprināja secinājumu, ka Fos un ΔFosB indukciju veicina D1 receptoru aktivizācija. Tomēr Fos izteiksmes šūnu lokalizāciju ietekmē vides konteksts, kurā tiek ievadītas psihostimulējošās zāles (46, 47). Piemēram, amfetamīns vai kokaīns, kas ievadīts mājas būrī, izraisa tūlītējus agrīnos gēnus (ieskaitot Fos), galvenokārt P-pozitīvās šūnās, kas ekspresē D1 receptorus. Turpretī šīs zāles var izraisīt Fos ekspresiju gan D1, gan D2 receptoru saturošos MSN, ja tos lieto jaunā vidē. Mūsu pašreizējos pētījumos izmantotais protokols neietvēra zāļu injicēšanu pārī ar jaunu vidi. Tomēr mēs nevaram izslēgt no konteksta atkarīgu stresu, kas ir atbildīgs par ΔFosB ekspresiju D2 receptoru saturošos MSN.
Ievērojama šo rezultātu iezīme bija palielināto mugurkaula blīvuma un ΔFosB ekspresijas paralēlais modelis. Palielināts mugurkaula blīvums un ΔFosB ekspresija sākotnēji notika MSN, kas ekspresēja Drd1-EGFP un Drd2-EGFP. Tomēr šīs izmaiņas bija stabilas tikai D1 receptoru saturošos neironos. Viens no iespējamiem skaidrojumiem novērojumam, ka palielināta mugurkaula blīvums un ΔFosB ekspresija tika konstatēta īslaicīgi D2 receptoru saturošos neironos, ir tā, ka tas notika nelielā MSN frakcijā, kas ekspresē gan D1, gan D2 dopamīna receptorus. Tādējādi šo palielinājumu pārejošais raksturs var būt saistīts ar D2 receptoru aktivācijas antagonistisko iedarbību uz D1 atkarīgiem signalizācijas ceļiem (48). Interesanti, ka mugurkaula blīvuma un ΔFosB ekspresijas izmaiņas ir atgriezeniskas, kas var atspoguļot D2 receptoru atkarīgo signālu ceļu spēju ietekmēt ΔFosB stabilitāti.
Novērojums, ka ΔFosB un mugurkaula blīvuma ekspresijā notiek paralēlas izmaiņas, saskan ar domu, ka ΔFosB ir iesaistīts dendritisko muguriņu sākotnējā veidošanā un turpmākajā uzturēšanā D1 receptoru saturošos neironos NAcc. ΔFosB ekspresiju kontrolē no D1 / DARPP-32 / PP1 atkarīgs signālu ceļš MSNs (49). Vairāki pētījumi ir parādījuši, ka ΔFosB ir svarīga loma psihostimulantu atalgojošās un kustības aktivizējošās darbībās (39), iespējams, ietekmējot vairāku gēnu ekspresiju, kas ietver neirotransmiteru receptorus, signālu proteīnus un proteīnus, kas iesaistīti neironu morfoloģijas regulēšanā (50). Tomēr šobrīd nav zināmi specifiski molekulārie mehānismi, kas saistīti ar hronisku kokaīna izraisītu mugurkaula veidošanos. Mūsu iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka Cdk5 inhibitora roskovitīna intrakumbālā infūzija mazināja kokaīna izraisīto mugurkaula blīvuma palielināšanos (51). Turklāt Cdk5 ir ΔFosB mērķa gēns, un tas ir saistīts ar kompensējošām adaptīvām izmaiņām, kas saistītas ar hronisku kokaīna terapiju (52). Tādēļ Cdk5 atkarīgas fosforilācijas izmaiņas ir ticams mehānisms, kas pamato kokaīna izraisītu mugurkaula veidošanos un / vai mugurkaula stabilitāti. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55) un spinofilīnu (56) ir Cdk5 substrāti un visi ir iesaistīti mugurkaula morfogenēzes regulēšanā (\ t57-60). Turpmāk šo un citu Cdk5 substrātu raksturojums mugurkaulos, cerams, iedegs mehānismus, kas saistīti ar psihostimulantu mugurkaula veidošanās regulēšanu.
Metodes
Dzīvnieki.
Pelēm, kurām ir EGFP transgēns vai nu D1 vai D2 dopamīna receptoru kontrolē, tika izveidots Gensat BAC transgēnu projekts (36). Šajā pētījumā izmantotās transgēnās peles bija 4 – 5 nedēļas vecas un bija Šveices – Webstera fonā. Pelēm tika saglabāts 12: 12-h gaišs / tumšs cikls un izmitināts 2 – 5 grupās kopā ar pārtiku un ūdeni, kas pieejams ad libitum. Visi dzīvnieku protokoli bija saskaņā ar Valsts Veselības rokasgrāmatu laboratorijas dzīvnieku kopšanai un lietošanai, un tos apstiprināja Rockefeller University Institucionālo dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja.
Narkotiku ārstēšana.
Tika ziņots, ka hroniska kokaīna terapija (30 mg / kg dienā) rada spēcīgu MSN mugurkaula blīvuma palielināšanos gan NAcc serumā, gan čaulā, bet mazāka deva (15 mg / kg) palielināja mugurkaula blīvumu tikai apvalks (61). Tāpēc mēs izmantojām lielāko kokaīna devu, lai izraisītu strukturālas izmaiņas abās NAcc daļās. Peles 30 dienas pēc kārtas katru dienu saņēma vienu 5 mg / kg kokaīna-HCl (vai sāls šķīduma) injekciju, kam sekoja dienas bez 2 injekcijas, un šī procedūra tika atkārtota 4 secīgas nedēļas. Injekcijas tika veiktas mājas būrī. 2WD vai 30WD, peles smadzenes tika apstrādātas DiI marķēšanai un / vai imūnhistoķīmijai.
Balistiskā marķēšana ar fluorescējošo krāsu diolu.
Peles tika anestezētas ar 80 mg / kg nātrija pentobarbitālu un transkardiāli perfūzētas ar 5 ml PBS, kam sekoja ātra perfūzija ar 40 ml 4% paraformaldehīda PBS (20 ml / min). Smadzenes tika ātri izņemtas no galvaskausa un pēc tam pievienotas 4% paraformaldehīdam 10 min. Smadzeņu šķēlītes (100 μm) tika marķētas ar fluorizējošās krāsvielas DiI (Molecular Probes) balistisko piegādi, kā aprakstīts ref. 38. Kombinētais DiI marķēšanas un imūnhistoķīmijas metode tika izstrādāta ar nelielu mazgāšanas līdzekļa koncentrāciju. DiI iezīmētas sekcijas tika permeabilizētas ar 0.01% Triton X-100 PBS 15 min, un pēc tam inkubētas 0.01% Triton X-100 un 10% normālā kazu serumā PBS 1 h, lai samazinātu nespecifisko marķēšanu. Pēc tam audu sekcijas inkubēja ar 1% normālu kazu serumu / 0.01% Triton X-100 un anti-GFP antivielu (Abcam, Cambridge, MA) istabas temperatūrā 2 h, mazgāja un inkubēja 1: 1,000 atšķaidījumā FITC- konjugētā sekundārā antiviela (Molecular Probes). Sekcijas tika novietotas uz mikroskopa priekšmetstikliņiem un pārklātas ar montāžas vidi. Balistiskās marķēšanas metode ļāva veikt detalizētu dendritisko mugurkaula struktūru, un iegūtie rezultāti bija kvalitatīvi un kvantitatīvi salīdzināmi ar iepriekšējiem pētījumiem, izmantojot Golgi – Cox impregnēšanas metodi žurku smadzeņu šķēlītēs (34). Tomēr, atšķirībā no iepriekšējiem pētījumiem, DiI krāsotajos neironos mēs reti novērojām divvirzienu muguriņas. Šo atšķirību var izraisīt krāsošanas metožu jutīgums vai peles mainīgums (šis pētījums) pret žurku audiem (34).
Imūnhistoķīmija.
Dzīvnieki tika anestēzēti un perfūzēti, kā aprakstīts iepriekš. Smadzenes tika noņemtas un nakti uzglabātas 4% paraformaldehīdā 4 ° C temperatūrā. Smadzenes tika pārnestas uz 30% saharozi PBS šķīdumā krioprotekcijai. Koronālās sekcijas (12 μm) tika sagrieztas sasalšanas mikrotomā (Leica) un pēc tam apstrādātas imūnhistoķīmijai. Pēc tam smadzeņu sekcijas tika permeabilizētas 0.3% Triton X-100 PBS 15 min un divas reizes skalo PBS. Sekcijas tika iepriekš inkubētas 10% normālā kazu serumā PBS 1 h pie 37 ° C, pakļautas primārajām antivielām (atšķaidītas ar 1% normālu kazu serumu PBS) nakti 4 ° C temperatūrā, un pēc tam noskaloja PBS un inkubēja ar sekundāro 1 h antivielas 37 ° C temperatūrā. Tika izmantotas šādas antivielas: trušu anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz biotehnoloģija), peles anti-NeuN (Chemicon), trušu anti-GFP, FITC konjugētais anti-truša IgG un rodamīns konjugēta anti-peles IgG (Molecular Probes). Trīskāršai marķēšanai (ΔFosB, NeuN un GFP) smadzeņu sekcijas vispirms tika imunizētas ar anti-pan FosB antivielām un anti-NeuN antivielām un pēc tam inkubētas ar sekundārajām antivielām (rodamīna konjugētais anti-trušu IgG un ciāna konjugēts anti-peles IgG) ). Dubultkrāsotas smadzeņu sekcijas tika tālāk apstrādātas, lai iegūtu GFP imūnfilmu, izmantojot Zenon marķēšanas tehnoloģiju (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Anti-pan-FosB antiviela tika paaugstināta uz FosB N-galu un atpazīst ΔFosB un pilna garuma FosB (62). Pamatojoties uz iepriekšējiem pētījumiem, kas parādīja, ka pēc hroniskas kokaīna terapijas ΔFosB, bet ne FosB vai citi ar Fos saistītie antigēni ir stabili izteikti, mēs pieņemam, ka ilgstošais imūnoreaktivitātes pieaugums ir stabils AFBB ekspresija. Tomēr imunoreaktīvā FosB signāla identitāte, kas novērota sāls šķīdumā apstrādātās pelēs, nav zināma. Statistiskā analīze. \ T Tabula 1 izmantoja Studentu t pārbaude.
Dendritiskā mugurkaula analīze.
Atsevišķas MSNs tika izvēlētas mugurkaula analīzei, pamatojoties uz vairākiem kritērijiem. (i) Lai nodrošinātu, ka procesi no dažādām šūnām netiktu sajaukti, bija minimāla pārklāšanās ar citām iezīmētām šūnām. (ii) Analīzei izmantojamām šūnām bija jābūt vismaz trīs primāriem dendritiem. (iii) Tika pārbaudīti distālie dendrīti (galīgie dendrīti vai tuvu terminālajam dendritam). Tika analizēti dendrīti no abiem MSN NAcc kodolā un apvalkā. Lai gan mēs novērojām reti sagrieztus MSN (spiny type II), mēs analizējām tikai blīvi sagrieztus MSN (I spiny tipa). Lai aprēķinātu mugurkaula blīvumu, tika izsekots dendrīta garums (> 20 μm garš), izmantojot konfokālo mikroskopu (Zeiss LSM 510) ar eļļas iegremdēšanas lēcu (× 40). Visi dendrītu attēli tika uzņemti dažādos veidos z (0.5 – 1 μm dziļuma intervāli), lai pārbaudītu dendritisko muguriņu morfoloģiju. Visi mērījumi tika veikti ar metamorfa attēla analīzes programmatūru (Universal Imaging, Downingtown, PA). Statistiskā analīze izmantoja Kolmogorova – Smirnova testu.
Dendritu izvirzījumi tika iedalīti četros veidos, pamatojoties uz to garumu, kā aprakstīts ref. 63 un 64. 1. klases izvirzījumi, kurus sauc arī par stulbiem izvirzījumiem, bija garāki par 0.5 μm, tiem nebija lielas mugurkaula galvas, un viņiem, šķiet, nebija kakla; 2. klases jeb sēņu formas muguriņas bija no 0.5 līdz 1.25 μm garas, un tām bija raksturīga īsa kakla un liela mugurkaula galva; 3. klases jeb plānās muguriņas bija robežās no 1.25 līdz 3.0 μm, un tām bija iegarenas mugurkaula kakliņas ar mazām galvām; 4. klase jeb filopodiālie pagarinājumi bija gari pavedienu izvirzījumi, kuriem nebija redzamas mugurkaula galvas.
Pateicības
Šo darbu atbalstīja ASV Sabiedrības veselības dienesta dotācija DA10044 (PG un ACN) un Simons fonds, Peter J. Sharp fonds, Picower fonds un FM Kirby fonds.
Saīsinājumi
- NAcc
- kodols accumbens
- MSN
- vidēja izmēra smadzeņu neirons
- BAC
- baktēriju mākslīgā hromosoma
- Drd1
- dopamīna receptoru D1 promotors
- Drd2
- dopamīna receptoru D2 promotors
- DiI
- 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbocianīna perhlorāts
- 2WD
- 2 dienas pēc pēdējās ārstēšanas
- 30WD
- 30 dienas pēc pēdējās ārstēšanas.
Atsauces
;
