FACS identificē unikālu kokaīna izraisītu gēnu regulāciju selektīvi aktivētos pieaugušo striatālo neironos (2011) - mazs striatālo neironu%

J Neurosci. Autora manuskripts; pieejams PMC 16. gada 2011. septembrī.
Publicēts galīgajā rediģētā formā kā:
PMCID: PMC3073079
NIHMSID: NIHMS279955

 

Izdevēja galīgā rediģētā šī raksta versija ir pieejama bez maksas vietnē J Neurosci
Skatiet citus PMC rakstus citāts publicēto rakstu.

Anotācija

Neskaitāmi pētījumi ar neironu aktivitātes marķieri Fos norāda, ka kokaīns aktivizē tikai nelielu daļu no reti sadalītiem striatora neironiem. Līdz šim nebija pieejamas efektīvas metodes, lai novērtētu neiroadaptācijas, kas īpaši izraisītas šajos aktivizētajos neironos. Mēs izmantojām fluorescences aktivizētu šūnu šķirošanu (FACS), lai attīrītu striatūrālos neironus, kas aktivizēti kokaīna izraisītas lokomotivācijas laikā naivos un kokaīna sensibilizētos gadījumos. cfos-lacZ transgēnas žurkas. Aktivizētie neironi tika marķēti ar antivielu pret β-galaktozidāzi, lacZ gēna olbaltumvielu produktu. COkaīns selektīvi inducēja unikālu gēnu ekspresijas profilu nelielā skaitā aktivizēto neironu, kas netika novērots neaktivizētajā neironu vairākumā. Šajos gēnos bija mainīti tūlītējo agrīno gēnu līmeņi loka, fosB, un nr4a3, kā arī gēni, kas iesaistīti p38 MAPK signalizācijā un šūnu tipa specifikā. Mēs ierosinām, ka šo FACS metodi var izmantot, lai izpētītu molekulāros neiroadaptējumus īpašos neironos, kas kodē ļaunprātīgi lietoto narkotiku uzvedības ietekmi un citu iemācīto uzvedību.

atslēgvārdi: kokaīna sensibilizācija, kodola uzkrāšanās, neironu ansambļi, fluorescences aktivizēta šūnu šķirošana

IEVADS

Pašreizējo neirobioloģisko pētījumu par kokaīna atkarību galvenā hipotēze ir tāda, ka hroniska kokaīna iedarbība izraisa ilgstošu neiroadaptāciju striatumā un citos mezolimbiskā dopamīna atlīdzības ķēdes komponentos, izraisot kompulsīvu narkotiku lietošanu un ilgstošu recidīvu neaizsargātību (Nestler, 2001; Shaham un Hope, 2005; Kalivas, 2009; Bowers et al., 2010; Vilks un Ferrario, 2010). Tomēr šī hipotēze ir balstīta uz daudziem pētījumiem, kas aprobežojas ar neiroadaptāciju mērīšanu smadzeņu reģionu homogenātos vai neironos, kas izvēlēti neatkarīgi no to aktivizācijas stāvokļa izturēšanās laikā.

Ir svarīgi atšķirt neiroadaptācijas aktivizētos pret neaktivētajiem neironiem, jo ​​tiem var būt atšķirīga loma kokaīna fizioloģiskajā, uzvedības un psiholoģiskajā efektā. Neskaitāmi pētījumi ar neironu aktivitātes marķieri Fos norāda, ka kokaīns striatumā aktivizē tikai nelielu daļu no reti sadalītiem neironiem. Pēc konteksta specifiskas lokomotorās sensibilizācijas mēs esam parādījuši, ka Fos tiek ierosināts tikai tad, ja žurkas injicēja narkotiku pārī esošā vidē, nevis vidē, kas nav savienota pāra vidē (Mattson et al., 2008; Koya et al., 2009). Vissvarīgākais ir tas, ka mēs esam parādījuši, ka šiem selektīvi aktivizētajiem neironiem ir cēloņsakarība iemācītajā saistībā starp kokaīnu un narkotiku pārī savienoto vidi, kas meditē konteksta specifisku sensibilizāciju (Koya et al., 2009). Tādējādi neiroadaptācijām selektīvi aktivizētos striatora neironos var būt unikāla un svarīga loma mācībās konteksta specifiskas sensibilizācijas un citas narkotiku izraisītas uzvedības laikā.

Līdz šim tehniskie ierobežojumi ir apgrūtinājuši molekulāro izmaiņu novērtēšanu nelielā skaitā reti sadalītu neironu, kas selektīvi aktivizēti uzvedības laikā. Tādas metodes kā mikrouzņēmuma sadalīšana ar lāzeru (Kvons un Hūpts, 2010. gads) un divkāršās etiķetes imūnhistoķīmija (Berretta et al., 1992; Gerfen et al., 1995; Peters et al., 1996) spēj selektīvi noteikt molekulārās izmaiņas aktivizētajos neironos, taču šīm metodēm ir ļoti zema caurlaides spēja vai tās nav kvantitatīvas. Fluorescences aktivizēta šūnu šķirošana (FACS) var būt efektīvs līdzeklis pieaugušo neironu populāciju attīrīšanai molekulārajai analīzei (Liberles un Buks, 2006. gads; Lobo et al., 2006). Tomēr FACS nav izmantots neironu attīrīšanai, pamatojoties uz to aktivizācijas stāvokli. Pašreizējā pētījumā mēs izmantojām FACS, lai attīrītu starp kokaīnu aktivizētos striatālās neironus no transgēniem cfos-lacZ žurkas un salīdzināja viņu unikālos gēnu ekspresijas modeļus ar neaktivizētajā vairākumā neironu.

METODES

Dzīvnieki

Sieviete cfos-lacZ transgēnas žurkas (Kasof et al., 1995. gads; Koya et al., 2009) un sieviešu dzimuma Sprague-Dawley žurkas (Čārlsa upe, Raleigh, NC, ASV) tika izmitinātas individuāli standarta plastmasas būros telpā ar temperatūru un mitrumu. Tos uzturēja 12:12 h gaismā: tumšā ciklā (apgaismojums ieslēdzas plkst. 20.00) un ļāva brīvi piekļūt pārtikai un ūdenim. Viņi vismaz piecas dienas pirms zāļu ārstēšanas tika aklimatizēti pie šiem turēšanas apstākļiem. Eksperimentālās procedūras apstiprināja NIDA Dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja.

Narkotiku ārstēšana

Akūtos kokaīna eksperimentos žurkām injicēja kokaīnu (30 mg / kg, ip; n = 8) vai fizioloģisko šķīdumu (1 ml / kg; n = 6) un ievietoja apaļā plexiglass kamerā (diametrs 38 cm). Žurkas tika nokautas 90 minūtes pēc injekcijām, lai iegūtu smadzeņu audus. Šo apstrādi atkārtoja trīs reizes atsevišķās dienās, lai iegūtu trīs bioloģiskos atkārtojumus mikro masīva analīzei. Turklāt kvantitatīvajai PCR (qPCR) līdzīgi tika izgatavoti trīs neatkarīgi bioloģiski atkārtojumi. QPCR analīzēm loka, pdyn, adora2a, tika izmantoti tikai šie trīs neatkarīgi bioloģiskie atkārtojumi. QPCR analīzēm fosB, nr4a3, kcnc1 un map2k6, mēs arī izmantojām atlikušo RNS no katra mikromatricas parauga.

Atkārtotos kokaīna eksperimentos žurku mātītes tika sensibilizētas ar četrām kokaīna injekcijām (15 mg / kg ip) vienu reizi otrajā dienā. Injekcijas dienās katru žurku ievietoja 43 × 43 cm kvadrātveida Plexiglas lokomotīves aktivitātes kamerā (Med Associates, St Albans, VT, ASV), lai 30 minūtes pierastu. Žurkām tika injicēts kokaīns, un tika reģistrēta lokomotoro aktivitāte, kā nobrauktais attālums 60 minūtes. Pēc ceturtās atkārtotās kokaīna injekcijas žurkas palika mājas būrī 7–8 dienas. Pārbaudes dienā žurkas 30 minūtes pieradināja kustību aktivitātes kamerās un pēc tam injicēja ar kokaīnu (30 mg / kg ip) vai fizioloģisko šķīdumu. Žurkas tika dekapitētas, un smadzenes tika ekstrahētas deviņdesmit minūtes pēc injekcijām. Visu sensibilizācijas ārstēšanu atkārtoja trīs reizes atsevišķās nedēļās, lai iegūtu trīs katras grupas bioloģiskos atkārtojumus qPCR analīzei.

Šūnu disociācija

Strāvas audi tika disociēti, lai iegūtu vienas šūnas suspensiju. Žurkas tika dekapitētas, un to strijas tika izvilktas divu minūšu laikā. Katru striatumu sasmalcināja ar skuvekļa lāpstiņām uz ledusaukstas stikla plāksnes un ievietoja 1 ml Hibernate A (Cat # HALF; Brain Bits, Springfield, IL). Striatas fermentatīvi tika sagremotas 1 ml Accutase per striatum (Cat # SCR005; Chemicon, Billerica, MA), sajaucot galu galā ar galu 30 minūtes 4 ° C temperatūrā. Audu divas minūtes centrifugēja ar ātrumu 425 x g un atkārtoti suspendēja 300 μl ledusaukstā hibernāta A. Visas nākamās centrifugēšanas darbības tika veiktas 4 ° C temperatūrā.

Sagremotie striatālie audi tika mehāniski atdalīti ar triturāciju. Četras striatas tika apvienotas vienā Eppendorfa mēģenē un desmit reizes izskalotas ar liela diametra Pasteur pipeti (~ 1.3 mm). Caurulītes īsi novietoja uz ledus, lai lieli audu gabali nogultu; 600 μl duļķainas suspensijas, kas satur disociētas šūnas, pārnesa uz 15 ml Falcon mēģeni uz ledus. Sākotnējā Eppendorfa mēģenē tika pievienoti 600 μL svaiga hibernāta A, un tad triturēšanas soļus atkārtoja, kā minēts iepriekš, ar vidēja un maza diametra caurulēm (~ 0.8 mm un ~ 0.4 mm). Katra duļķainā suspensija, kas satur disociētās šūnas, tika apvienota ar iepriekšējo suspensiju.

Atlikušās šūnu kopas apvienotajā šūnu suspensijā tika noņemtas, filtrējot caur iepriekš samitrinātiem 100 μm un 40 μm šūnu sietiņiem (Falcon zīmols, BD Biosciences, Sanhosē, CA). Nelielus šūnu atlikumus suspensijā samazināja, centrifugējot filtrātu 3 minūtes ar ātrumu 430 x g caur trīspakāpju blīvuma gradientu Percoll (Cat # P1644; Sigma, St. Louis, MO). Mākoņainais augšējais slānis (apmēram 2 ml), kas satur gružus, tika izmests. Atlikušo slāņu šūnas tika atkārtoti suspendētas atlikušajā Percoll šķīdumā un centrifugētas piecas minūtes pie 550xg. Granulas tika atkārtoti suspendētas 1 ml hibernāta A.

Imūno marķēšana un FACS

Izdalītās šūnas tika fiksētas un permeabilizētas, pievienojot vienādu tilpumu etanola galīgajai koncentrācijai 50% etanola, un 15 minūtes turot uz ledus, ik pa laikam sajaucot. Šūnas divas minūtes centrifugēja ar ātrumu 425xg un atkārtoti suspendēja ar RNāzi nesaturošā fosfātu buferšķīdumā (PBS). Šūnas tika inkubētas ar biotinilētu primāro antivielu pret NeuN (1: 1000 atšķaidījums, Cat # MAB377B, Chemicon) un primāro antivielu pret β-galaktozidāzi ((β-gal; 1: 10000 atšķaidīšana, Cat # 4600-1409, Biogenesis, Poole) , Apvienotā Karaliste) .Šūnas 30 minūtes rotēja primārajā antivielā 4 ° C temperatūrā un trīs minūtes centrifugēja ar ātrumu 425xg. Šūnas tika mazgātas ar 800 μl PBS un atkārtoti suspendētas 700 μl PBS. Šūnas tika inkubētas ar fluorescējoši iezīmētu streptavidīnu (streptavidīna-fikoeritrīns, 1: 1000 atšķaidīšana, Cat # SA1004-1, Invitrogen, Carlsbad, CA) un sekundārajām antivielām (Alexa Fluor 488 marķētais anti-kazu IgG, 1: 1000 atšķaidījums, Cat # A-) 11055, Invitrogen) un 15 minūtes pagriezta ar galu, šūnas tika mazgātas ar 800 μl PBS, trīs minūtes centrifugētas ar ātrumu 425 x g un atkārtoti suspendētas 1 ml PBS.

Imūniezīmētās šūnas tika skenētas un sakārtotas Johns Hopkins Bayview Campus plūsmas citometrijas kodoliekārtā. Šūnu šķirošanai tika izmantota FACS Aria (BD, Franklin Lakes, NJ). Vispirms tika analizēti kontrolparaugi, lai noteiktu optimālos kritērijus testa paraugu šķirošanai. Gaismas izkliedes vārtu iestatīšanai tika izmantotas fiksētas šūnas bez antivielu apstrādes. Fiksētās šūnas, kas apstrādātas ar fluorescējošu sekundāru antivielu, bet bez primārām antivielām, pēc tam tika izmantotas, lai iestatītu sliekšņus endogēno audu fluorescencei un nespecifiskai saistībai ar streptavidīnu vai sekundāro antivielu. Pēc tam, lai kompensētu blakus esošo kanālu fluorescējošo pārklāšanos, tika izmantoti kontroles paraugi, kas atsevišķi marķēti ar primāro un sekundāro antivielu katram proteīnam (NeuN vai β-gal). Visbeidzot tika analizēti un sašķiroti testa paraugi, kas marķēti ar abiem fluorescējošajiem marķieriem. Šķirotās šūnas tika savāktas vāji saistošās mēģenēs (kat. Nr. 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) ar 100 μl PBS katrā mēģenē.

RNS ekstrakcija

Pēc šķirošanas paraugus, kas satur vai nu βgal pozitīvas, vai βgal negatīvas šūnas no žurkām, kuras ievadīja kokaīnu, vai visas NeuN pozitīvās šūnas no fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām, 8 minūtes centrifugēja ar ātrumu 2650 × g 18 ° C temperatūrā. No fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām NeuN negatīvās šūnas centrifugēja 8 minūtes ar ātrumu 6000xg pie 18 ° C. Mikrorajonu eksperimentiem RNS tika ekstrahēts ar Trizol reaģentu (kat. Nr. 15596-026, Invitrogen) saskaņā ar ražotāja instrukcijām. RNS kvalitāte un kvantitāte tika novērtēta, izmantojot Bioanalyzer Picochip (Cat # 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). QPCR eksperimentiem RNS tika ekstrahēts ar RNEasy Micro komplektu (Cat # 74004; Qiagen, Valencia, CA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem, apstrādājot ar DNase. RNS daudzumu un tīrību novērtēja, izmantojot Nanodrop spektrofotometru (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Mikrogrāfijas eksperimenti

Mikrouzņēmumus izmantoja, lai analizētu RNS no NeuN pozitīvām un NeuN negatīvām šūnām no fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām, kā arī βgal pozitīvos un βgal negatīvos neironus no žurkām ar kokaīnu. Kā aprakstīts iepriekš narkotiku ārstēšanas sadaļā, mikroarhonos bija trīs bioloģiski atkārtojumi katram no četriem paraugu veidiem. Pieci μl kopējās RNS no katra parauga tika marķēti, izmantojot Illumina TotalPrep RNS pastiprināšanas komplektu (Cat # IL1791; Ambion, Austin, TX) divpakāpju cDNS sintēzes procesā, kam sekoja in vitro RNS transkripcija ar biotin-16-UTP. 0.75 μg ar biotīnu marķētās cRNS 16 stundas tika hibridizēti ar Illumina Sentrix Rat Ref12_v1 BeadChips (Cat # BD-27-303; Illumina, San Diego, CA). Ar mikroshēmu hibridizētā biotinilētā cRNS tika noteikta ar Cy3 iezīmētu streptavidīnu un kvantificēta, izmantojot Illumina BeadStation 500GX ģenētiskās analīzes sistēmu skeneri. Visa marķēšana un analīze tika veikta Johns Hopkins Bayview Medical Campus Lowe Family Genomics Core.

Reālā laika kvantitatīvā PCR

FACS un mikro masīva rezultātu validēšanai tika izmantota reālā laika kvantitatīvā PCR. RNS tika reversi transkribēta cDNS, izmantojot RETROscript komplektu (Cat # AM1710, Ambion) ar oligo (dT) grunti. Katrā 25 μl PCR reakcijā tika iekļauti 12.5 μl Taqman Gene Expression Master Mix (Cat # 4369514; Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.1 μl katrs pa 20 μM uz priekšu un atpakaļgaitas praimeri, 0.25 μl ar 100 μM FAM marķētu zondi, 5 μl ūdens un 5 μl 1 ng / μl cDNS. Grunts un zondes kombinācijas [Tabula 1] tika izstrādāti, izmantojot Roche Universālās zondes bibliotēkas Testa dizaina centru, lai tie būtu intronējoši. PCR reakcijas tika novērotas, izmantojot Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD). Programma sākās ar 20 šķīvju nolasījumiem 50 ° C temperatūrā fotobalināšanai, pēc tam 5 minūtes 95 ° C temperatūrā un pēc tam 40 20 sekunžu ciklus 94 ° C temperatūrā, 1 min 60 ° C temperatūrā un plāksnes nolasīšanu.

Tabula 1 

Grunti un zondes, ko izmanto qPCR

Lai noteiktu amplifikācijas efektivitāti, katram gēnam vispirms tika veiktas standarta līknes reakcijas.Tabula 1]. Katra pastiprinātā gēna ekspresijas līmeņi tika aprēķināti, izmantojot efektivitāti ^ ΔCq kur ΔCq = Cq(eksperimentālais gēns) - Cq(atsauces gēns) katram bioloģiskajam replikātam. Gorasp2 tika izvēlēts kā atsauces gēns, jo tas nekonstatēja atšķirību starp neironiem un glia mikrorajonu analīzēs. Pēc tam, kad tika ielādēts vienāds šablona daudzums, tas tika apstiprināts kā atsauces gēns, pateicoties visiem paraugiem vienādai qPCR amplifikācijai. Tehniskā testa trīs eksemplāriq vērtībām tika aprēķināta vidējā vērtība pirms ΔC aprēķināšanasq katram gēnam paraugā. Katrai mRNS, kas izmērīta qPCR, gēnu ekspresijas vērtībām tika aprēķinātas vidējās vērtības bioloģiskajos atkārtojumos. Pēc tam, lai atspoguļotu izmaiņas maiņas vērtībā, mēs šo vidējo vērtību dalījām ar vidējām gēnu ekspresijas vērtībām, kas iegūtas no fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām NeuN-pozitīvajās šūnās. Šīs vērtības diagrammās un tabulās ir norādītas kā vidējās un standarta kļūdas.

Imūnhistoķīmija

Smadzeņu audi tika iegūti no savvaļas tipa sieviešu dzimuma Spraque-Dawley žurkām pēc tām pašām akūtām un atkārtotām kokaīna procedūrām, kas aprakstītas iepriekš mikrouzņēmuma un qPCR eksperimentos. Tomēr 90 minūtes pēc testa dienas injekcijām žurkas tika dziļi anestēzētas ar izoflurānu un iepludinātas ar 100 ml PBS, kam seko 400 ml 4% paraformaldehīda (PFA). Smadzenes 2 stundas pēc tam fiksēja PFA un pārnesa uz 30% saharozes šķīdumu 4 ° C temperatūrā 2–3 dienas. Smadzenes tika sasaldētas uz sausa pulvera pulvera un līdz sadalīšanai tika turētas –80 ° C. Koronālie griezumi tika sagriezti 40 μm biezumā starp Bregma 2.5 un –0.5 (Paxinos un Watson, 1998).

Sekcijām tika imūniezīme Fos un Arc. Īsumā sekcijas trīs reizes mazgāja ar Tris buferšķīdumu (TBS) un 30 minūtes permeabilizēja TBS ar 0.2% Triton X-100. Sekcijas atkal mazgāja TBS un inkubēja primārajās antivielās, kas atšķaidītas PBS ar 0.3% Triton X-100, 24 stundas kratītājā 4 ° C temperatūrā. Mēs izmantojām trušu poliklonālu pret c-Fos antivielu (1: 500 atšķaidīšana, Cat # sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) un peles monoklonālo Arc antivielu (1: 100 atšķaidīšana, Cat # sc-17839, Santa Krusa biotehnoloģija). Sekcijas trīs reizes mazgā TBS un inkubē sekundārajās antivielās, kas atšķaidītas PBS 1.5 stundas kratītājā istabas temperatūrā. Mēs izmantojām Alexa Fluor 488 marķēto ēzeļa anti-trušu antivielu (1: 200 atšķaidījums, Cat # A21206, Invitrogen) un ar Alexa Fluor 568 marķēto kazu antivielu pret antivielām (1: 200 atšķaidījums, Cat # A11004, Invitrogēns). Sekcijas tika mazgātas TBS, piestiprinātas uz hroma-alumīnija pārklājuma priekšmetstikliņiem un pārklātas ar VectaShield grūti iestatāmu montāžas līdzekli.

Fosfotografējoši Fos un Arc imūnreaktivitātes attēli caudate-putamen un NAc (apmēram 2.0 mm pirms Bregma) tika uzņemti, izmantojot CCD kameru (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ), kas piestiprināta pie Zeiss Axioskop 2 mikroskopa. Attēli marķēto šūnu skaitīšanai tika veikti ar 200x palielinājumu; attēli Fosa un loka loka noteikšanai tika veikti ar 400x palielinājumu. Marķētās šūnas no četrām puslodēm uz vienu žurku tika automātiski saskaitītas, izmantojot Macintosh programmatūru IPLab, versija 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Vidējiem rādītājiem no visām četrām puslodēm tika iegūta viena vērtība katrai žurkai.

Datu analīze

Locomotorās sensibilizācijas dati tika analizēti, izmantojot vienvirziena ANOVA ar atkārtotiem mērījumiem laika galvenajam efektam 4 injekcijas dienu laikā. Statistiskā nozīmība tika noteikta p <0.05. Mikrouzņēmumu dati tika analizēti, izmantojot DIANE 6.0, uz izklājlapām balstītu mikroelementu analīzes programmu, kuras pamatā ir SAS JMP 7.0, kā aprakstīts iepriekš (Gargs un citi, 2009. gads). Mikrouzņēmumu fluorescences intensitātes dati tika filtrēti, izmantojot noteikšanu p-vērtības un Z normalizēšana. Paraugu kvalitāte tika analizēta, izmantojot izkliedes diagrammas, galveno komponentu analīzi un gēnu paraugu Z- uz rezultātiem balstīta hierarhiska kopu veidošana, lai izslēgtu iespējamos izņēmumus. Pēc tam ANOVA testi tika izmantoti, lai izslēgtu gēnus ar lielākām dispersijām katrā salīdzināšanas grupā. Gēni tika identificēti kā atšķirīgi izteikti, ja p <0.01, absolūti Z- koeficients ≥ 1.5 un viltus atklāšanas koeficients (fdr) <0.07. QPCR datiem, lai salīdzinātu katra gēna datus, tika izmantota vienvirziena ANOVA. Statistiskā nozīmība tika noteikta p <0.05. Fos un Arc imūnhistoķīmijai statistiskās nozīmības aprēķināšanai tika izmantots t-tests, pieņemot nevienādu dispersiju, kas iestatīta uz p <0.05.

REZULTĀTI

cfos-lacZ transgēnas žurkas

Jūsu darbs IR Klientu apkalpošana cfos-lacZ transgēnu šīm žurkām regulē a c-fos veicinātājs, kas līdzīgs endogēnā c-fos gēns, un tādējādi līdzīgi tiek aktivizēts neironos ar paaugstinātu ierosinošās sinaptiskās ievades līmeni (Shin et al., 1990; Labiner et al., 1993. gads; Sgambato et al., 1997. gads). Olbaltumvielu produkts cfos-lacZ transgēns, β-galaktozidāze (βgal), izteikti aktivizētos neironos tiek ekspresēts ar c-Fos (Koya et al., 2009) un izmanto, lai marķētu aktivizētos striatora neironus šādā FACS attīrīšanas procedūrā.

FACS aktivizētu striatūra neironu attīrīšana pēc vienreizējām akūtām kokaīna injekcijām

Veseli striati tika iegūti no cfos-lacZ žurkas 90 minūtes pēc akūtas 30 mg / kg kokaīna vai fizioloģiskā šķīduma injekcijas ārpus mājas būra. Izdalītās striatālās šūnas no līdzīgi apstrādātām žurkām pirms FACS attīrīšanas tika apvienotas katram no bioloģiskajiem atkārtojumiem turpmākajos mikroarmasu un kvantitatīvās PCR (qPCR) analīzēs. Sākumā tika analizētas disociētās striatālās šūnas pēc to priekšējās un sānu gaismas izkliedes īpašībām [1a attēls]. Lielākā daļa ar NeuN marķēto neironu tika atrasti notikumu joslā gar diagrammas apakšējo daļu. Tādējādi visas turpmākās analīzes tika veiktas, lai iekļautu tikai notikumus, kas atrasti šajā joslā.

Skaitlis 1 

Ar βgal iezīmētu neironu ar fluorescenci aktivizēta šūnu šķirošana no žurkām, kas apstrādātas ar vienu kokaīna injekciju

Šūnas šajos vārtos tika atdalītas pēc to imūno marķēšanas pakāpes ar neironu marķieri NeuN un neironu aktivizācijas marķieri βgal. Audu audos, kas iegūti no žurkām ar kokaīnu, aptuveni 15% ar NeuN marķētiem neironiem bija augsts βgal līmenis [Attēls 1b], kas atbilda aptuveni 100,000 30 βgal iezīmētu neironu uz vienu žurku. Visas βgal iezīmētās šūnas līdzekspressēja NeuN, norādot, ka βgal ekspresēja tikai neironi. Turpretī ļoti nedaudzi NeuN marķētie neironi, kas iegūti no fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām, izteica aktivizācijas marķierus βgal vai Fos, kas atbalsta βgal un Fos imūnreaktivitāti kā neironu aktivizēšanas marķierus žurkām ar kokaīnu. Mazais βgal ekspresējošo neironu skaits no fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām nenodrošināja pietiekami daudz šūnu turpmākajām molekulārajām analīzēm. Tādējādi visos turpmākajos eksperimentos ar striatālajiem audiem, kas iegūti no fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām, mēs izmantojām tikai NeuN marķējumu, lai atdalītu neironu un neneironu šūnas. Kopumā aptuveni 600,000% no visiem striatālās šūnas bija NeuN-pozitīvi, kas atbilda aptuveni XNUMX XNUMX striatāla neironu uz vienu žurku. Kad FACS attīrītās šūnas tika pārbaudītas ar fluorescences mikroskopiju, visas šūnas bija apaļas un tām nebija procesu [Skaitlis 2]. Mikroskopiskais novērojums apstiprināja, ka FACS šķirotās šūnas tika atbilstoši marķētas NeuN- un βgal-imūnreaktivitātei. Tika konstatēts, ka FACS attīrīto šūnu paraugi ir> 90% tīri, novērtējot ar plūsmas citometrijas otro kārtu (dati nav parādīti).

Skaitlis 2 

FACS attīrīto šūnu un gružu mikroskopa fotoattēli

Mēs noteicām mūsu FACS attīrīšanas procedūras selektivitāti ar mikrorajonu, lai analizētu FACS attīrīto šūnu gēnu ekspresijas modeļus. Mēs salīdzinājām gēnu ekspresiju βgal-pozitīvos un βgal-negatīvos neironos no žurkām, kuras ievadīja kokaīnu, kā arī NeuN-pozitīvās un NeuN-negatīvās šūnās no fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām. Galveno komponentu un klasteru analīze parādīja, ka primārais diferencēšanas faktors bija tas, vai šūnas bija neironi vai glia [3a attēls]. Otrs diferencējošais faktors bija βgal ekspresija, ko izmantoja, lai atdalītu aktivētos no neaktivētajiem neironiem. Gēni tika identificēti kā atšķirīgi izteikti, ja p <0.01, absolūti Z- koeficients ≥ 1.5 un viltus atklāšanas koeficients (fdr) <0.07. Mēs noskaidrojām, ka βgal pozitīvajos neironos palielinājās 125 gēni un samazinājās 467 gēni salīdzinājumā ar βgal negatīvajiem neironiem, kas iegūti no tiem pašiem kokaīna injicēto žurku audu audiem [Attēls 3b]. Kad tos pašus βgal pozitīvos neironus no kokaīna injicētām žurkām salīdzināja ar visu NeuN iezīmēto neironu kontroles paraugiem no sāls injekcijām žurkām, βgal pozitīvajos neironos palielinājās 133 gēni un samazinājās 890 gēnu. Īpaši divas kontroles grupas - βgal-negatīvie neironi no kokaīna injicētām žurkām un visi NeuN marķētie neironi no fizioloģiskā šķīduma injicētām žurkām radīja ļoti līdzīgus gēnu ekspresijas modeļus; gēnu ekspresija šajās kontroles grupās būtiski neatšķīrās [Attēls 3b].

Skaitlis 3 

Pēc vienreizējas kokaīna vai fizioloģiskā šķīduma injekcijas no mikroorganismu analīzes šūnām, kas sašķirotas no žurku striatām,

Specifiski gēni, kas atrodami dažādās paraugu grupās, apstiprināja aktivēto no neaktivizētajiem neironiem, kā arī neironu un neneironu šūnu atdalīšanu, izmantojot FACS [Tabula 2]. βgal-pozitīvie neironi no žurkām, kuras injicēja ar kokaīnu, izteica augstāku daudzu neironu aktivizācijas marķieru gēnu līmeni salīdzinājumā ar βgal-negatīviem neironiem no tām pašām kokaīna injicētajām žurkām vai visiem ar NeuN marķētajiem neironiem no fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām [Attēls 3c]. Šie aktivitātes marķieru gēni iekļauti c-fos, junB, loks, EGR ģimene (1, 2, 4) un nr4a3 (Guzovskis et al., 2005). Interesanti, ka šie βgal-pozitīvie neironi arī izteica ievērojami augstāku D1 dopamīna receptoru šūnas tipa specifiskā marķiera prodinamorfīna gēna līmeni un ievērojami zemāku D2 dopamīna receptoru gēna līmeni.

Tabula 2 

Akūta kokaīna eksperimenta mikrorajona un qPCR datu kopsavilkums.

Mikroarray gēnu ekspresijas dati tika validēti, izmantojot qPCR. Aktivitātes marķieru gēni fosB, loks, un nr4a3 tika izteikti augstākā līmenī βgal-pozitīvos neironos no kokaīna ievadītām žurkām, salīdzinot gan ar βgal-negatīvajiem neironiem no tām pašām kokaīna injicētajām žurkām, gan visiem neironiem no fizioloģiskā šķīduma ievadītajām žurkām [4a attēls; dati un statistiskā informācija Tabula 2]. βgal-pozitīvie neironi arī izteica augstāku prodynorphin gēna līmeni [Attēls 4b]. Kamēr βgal-pozitīvajiem neironiem bija acīmredzami zemāks ekspresijas līmenis vairākiem gēniem, ieskaitot A2A adenozīna receptoru, Kv3.1 kālija kanālu un map2k6 / MEKK6 gēnus, tikai Kv3.1 un map2k6 / MEKK6 ekspresijas līmeņi statistiski atšķīrās, izmantojot qPCR [Attēls 4c]. Kopumā gēnu ekspresijas izmaiņas, kas novērtētas ar qPCR, bija gandrīz identiskas gēnu ekspresijas izmaiņām, kuras novērtēja ar mikrorajona eksperimentiem.

Skaitlis 4 

Kvantitatīvā PCR parāda atšķirīgu gēnu ekspresijas profilu βgal-pozitīviem neironiem pēc akūtām kokaīna injekcijām, salīdzinot ar βgal-negatīviem neironiem no tām pašām žurkām vai visiem neironiem no fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām

Lai noteiktu, vai mRNS izmaiņas aktivētajos neironos ir atspoguļotas olbaltumvielu līmenī, mēs izmantojām imūnsistoķīmisko analīzi korona smadzeņu sekcijām no kokaīna un fizioloģiskā šķīduma ievadītām savvaļas tipa sieviešu žurkām [Skaitlis 5]. Šajās sadaļās netika veikta disociācija vai FACS, un tāpēc FACS procedūrā konstatētā šūnu disociācija neietekmēja imunohistoķīmisko analīzi. Žurku ventrālajā striatumā no kokaīna ievadītām žurkām [5a attēls], neironu aktivitātes marķieri Fos un Arc tika ekspresēti vienās un tajās pašās šūnās: 85 ± 4% no visām Fos pozitīvajām šūnām bija Arc pozitīvas, savukārt 82 ± 3% no visām Arc pozitīvajām šūnām bija Fos pozitīvas. Kokaīna injekcijas izraisīja Fos marķēto neironu palielināšanos 2.7 reizes un Arka marķēto neironu palielināšanos 2.7 reizes. Žurku muguras smadzenēs no kokaīna ievadītām žurkām [Attēls 5b], 80 ± 2% no visām Fos-pozitīvajām šūnām bija Arc-pozitīvas, savukārt 86 ± 3% no visām Arc-pozitīvajām šūnām bija Fos-pozitīvas. Kokaīna injekcijas izraisīja Fos marķēto neironu palielināšanos 4.4 reizes un Arka marķēto neironu palielināšanos 3.8 reizes.

Skaitlis 5 

Fos un Arc tiek izteikti (a) ventrālajā striatum un (b) dorsal striatum pēc vienas kokaīna injekcijas

FACS no kokaīna sensibilizētām žurkām aktivizētu striatūra neironu attīrīšana

Otrajā FACS eksperimentā visas žurkas tika sensibilizētas ar atkārtotām kokaīna injekcijām. Atkārtota kokaīna ievadīšana lokomotīvju kārbā pastiprināja kokaīna izraisītu pārvietošanos: lokalizācija 7. dienā bija 180 ± 18% no pirmās dienas pārvietošanās (galvenā laika ietekme uz 1 atkārtotām injekcijām, F3, 363 = 24.9, p <0.001), kas liecināja par ievērojamu psihomotoru sensibilizāciju. Septiņas dienas vēlāk testa dienā žurkām tajā pašā kustību kastē ievadīja kokaīnu vai fizioloģisko šķīdumu. Deviņdesmit minūtes vēlāk tika izdalīti striatāla audi, ieskaitot NAc, un šūnas tika attīrītas FACS, izmantojot iepriekš aprakstīto procedūru.

Šūnas tajā pašā gaismas izkliedētajā notikumu joslā kā iepriekšējā eksperimentā tika atdalītas pēc to imūnās iezīmēšanas pakāpes ar neironu marķieri NeuN un neironu aktivizācijas marķieri βgal. Audu audos, kas iegūti no žurkām ar kokaīnu, aptuveni 10% ar NeuN marķētiem neironiem bija augsts βgal līmenis [Skaitlis 6], kas atbilda aptuveni 60,000 30 βgal iezīmētu neironu uz vienu žurku. Visas βgal iezīmētās šūnas līdzekspressēja NeuN, norādot, ka βgal ekspresēja tikai neironi. Atkal audi, kas iegūti no žurkām, kurām testa dienā ievadīja fizioloģisko šķīdumu, ražoja ļoti maz βgal vai Fos ekspresējošus neironus un tādējādi nebija pietiekami daudz šūnu turpmākajām molekulārajām analīzēm. Tādēļ mēs izmantojām tikai NeuN marķējumu, lai atdalītu neironu un neneironu šūnas, kas iegūtas no fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām. Aptuveni 400,000% no visiem fizioloģiskā šķīduma ievadītajām žurkām šūnu ķermenī bija NeuN pozitīvs, kas šajā eksperimentā atbilda aptuveni XNUMX XNUMX striatūriem neironiem uz vienu žurku.

Skaitlis 6 

Ar sensibilizētām žurkām βgal iezīmētu neironu fluorescences aktivizēta šūnu šķirošana 7 dienas pēc atkārtotas ārstniecības ar kokaīnu

Mēs izmantojām qPCR, lai salīdzinātu gēnu ekspresiju βgal-pozitīvos un βgal-negatīvos neironos no kokaīna injicētām žurkām, kā arī visos NeuN-pozitīvajos neironos no sāls šķīduma injicētām žurkām pēc kokaīna sensibilizācijas. βgal pozitīvi neironi no kokaīna injicētām žurkām izteica augstāku trīs nervu aktivitātes marķiera gēnu līmeni - fosB, loks, un nr4a3–Attiecas uz βgal-negatīvajiem neironiem no tām pašām kokaīna injicētajām žurkām un visiem neironiem no žurkām, kuras injicē ar fizioloģisko šķīdumu [7a attēls; dati un statistiskā informācija Tabula 3]. βgal-pozitīvie neironi arī izteica augstāku prodynorphin gēna līmeni, līdzīgi kā tas bija atsevišķā kokaīna injekcijas eksperimentā [Attēls 7b]. Turpretī βgal-pozitīvajiem neironiem bija zemāks ekspresijas līmenis vairākiem gēniem [Attēls 7c], ieskaitot Drd2 - kodē D2 dopamīna receptoru un Karte2k6 kodē kināzi, kas aktivizē p38 MAPK, līdzīgi kā vienreizējs akūtas kokaīna injekcijas eksperiments. Visbeidzot, βgal-pozitīvajos neironos bija palielināta dusp1, kas pazīstams arī kā mkp1 [Attēls 7c], kas kodē fosfatāzi, kas inaktivē p38 MAPK (Sgambato et al., 1998. gads).

Skaitlis 7 

Kvantitatīvā PCR parāda atšķirīgu gēnu ekspresijas profilu βgal-pozitīvajos neironos no sensibilizētām kokaīna žurkām, salīdzinot ar βgal-negatīviem neironiem no tām pašām žurkām vai visiem neironiem no sāls šķīduma iedarbībai pakļautajām žurkām
Tabula 3 

QPCR datu kopsavilkums no atkārtota kokaīna eksperimenta.

Lai noteiktu, vai mRNS izmaiņas aktivizētajos neironos atspoguļojas olbaltumvielu līmenī, mēs izmantojām savvaļas tipa kokaīna sensibilizētu žurku mātīšu korona smadzeņu sekciju imūnhistoķīmisko analīzi pēc kokaīna vai fizioloģiskā šķīduma injekcijām testa dienā. Žurku ventrālajā striatumā no kokaīna ievadītām neironu aktivitātes marķieriem Fos un Arc tika izteikti vienās un tajās pašās šūnās: 90 ± 2% no visām Fos pozitīvajām šūnām bija arkā pozitīvas, bet 83 ± 2% no visām arka pozitīvām šūnas bija Fos-pozitīvas. Kokaīna testa injekcijas izraisīja 2.3 reizes lielāku Fos marķēto neironu un 2.2 reizes vairāk ar Arka marķēto neironu. Žurku muguras striatumā no kokaīna injicētām 93 ± 2% no visām Fos pozitīvajām šūnām bija loka pozitīvi, un 90 ± 3% no visām Arc pozitīvajām šūnām bija Fos pozitīvas. Kokaīna testa injekcijas izraisīja Fos marķēto neironu palielināšanos 4.4 reizes un Arka marķēto neironu palielināšanos 4.5 reizes. Tādējādi ļoti maz šūnu, kas nav marķētas ar Fos, ekspresēja loka, un ļoti maz šūnu, kas nav marķētas ar šūnu, ekspresēja Fos, kas atbalsta mūsu secinājumus no sakārtotajām šūnām.

DISKUSIJA

Mēs izstrādājām procedūru molekulu izmaiņu attīrīšanai un novērtēšanai neironos, ko nosaka tikai ar to iepriekšējo aktivācijas stāvokli kokaīna izraisītas lokomotorās aktivitātes laikā. Mikrobloka, qPCR un imūnhistoķīmisko eksperimentu dati neatkarīgi apstiprināja, ka mūsu FACS procedūra identificēja unikālas molekulu izmaiņas aktivētos neironos, kā noteikts c-fos βgal ekspresijas induktoru indukcija. Galvenais bioloģiskais atradums, izmantojot šo procedūru, bija tāds, ka tūlītējus agrīnos gēnus (IEG) inducē tikai aktivizētos neironos, turpretim IEG ekspresija nemainās vai pat ir samazinājusies neaktivizētajā neironu vairākumā. Tā kā daudzi no šiem IEG neirālās aktivitātes marķieriem ir arī transkripcijas faktori, iespējams, ka šajos aktivizētajos neironos pēc tam tiek inducēti ļoti atšķirīgi gēnu ekspresijas modeļi, kas var veicināt kokaīna fizioloģisko un uzvedības iedarbību (piemēram, skatīt (Korāns un Franza, 1988. gads; Nestler et al., 1993; McClung et al., 2004; Loebičs un Nedivi, 2009. gads).

IEG diferenciālā indukcija starp aktivizētiem un neaktivizētiem neironiem atbalsta hipotēzi, ka tikai neliela daļa neironu ir spēcīgi aktivizēti kokaīna izraisītas lokomotīcijas laikā, savukārt lielākā daļa neironu tiek aktivizēti daudz mazākā mērā vai vispār netiek aktivizēti. Elektrofizioloģiskie eksperimenti ar savvaļas tipa žurkām liecina, ka Fos olbaltumvielu ekspresija korelē ar augstu ierosinošās sinaptiskās ievades līmeni (Shin et al., 1990; Labiner et al., 1993. gads; Sgambato et al., 1997. gads). Mēs zinām, ka Fosa un βgal ekspresija ir līdzīgi regulēta tajos pašos neironos cfos-lacZ žurkām (Koya et al., 2009). Tādējādi mēs secinām, ka palielināta βgal un IEG ekspresija tikai nelielā skaitā striatālo neironu norāda, ka tikai mazākā daļa striatālo neironu saņem lielu ierosmes sinaptisko ieguldījumu, reaģējot uz kokaīna ievadīšanu.

Striota neironu diskrēta aktivizēšana saskan ar augšstāvokļa un lejupslīdes hipotēzi, kas apraksta dopamīna pretējo iedarbību uz striatora neironu darbību. Tiek uzskatīts, ka kokaīna izraisīts dopamīns palielina atšķirības starp augstas aktivitātes un zemas aktivitātes neironiem, pastiprinot neironu, kas jau ir augstas aktivitātes stāvoklī, notiekošo elektrofizioloģisko aktivitāti, vienlaikus mazinot vairākuma neironu ar zemāku aktivitāti (Vilsons un Kavaguči, 1996. gads; Ernandess-Lopess un citi, 1997; Nicola et al., 2000; O'Donnell, 2003; Nicola et al., 2004). Iegūtais signāla un trokšņa attiecības pieaugums ne tikai palielina selektivitāti akūtas signālu laikā, bet, kā ieteikts mūsu pētījumā, arī var veicināt unikālu molekulāro neiroadaptāciju indukciju tikai augstas aktivitātes neironos. Tikmēr gēna ekspresija βgal-negatīvos neironos, kas veido lielāko daļu striatālās neironu no kokaīna ievadītām žurkām, šķita, ka neatšķiras no gēnu ekspresijas striatora neironos no fizioloģiskā šķīduma ievadītām žurkām; tas apstiprina hipotēzi, ka lielākā daļa striatālo neironu kokaīna iedarbības laikā paliek zemākā stāvoklī.

P38 MAP kināzes signalizācijas ceļa komponenti arī tika atšķirīgi mainīti starp aktivizētajiem un neaktivizētajiem neironiem. Kināzes, kas aktivizē p2, Map6k6 / MEKK38 gēnu ekspresija tika samazināta, bet Mkp1 / Dusp1 - fosfatāzes, kas inaktivē p38 (Sgambato et al., 1998. gads), tika palielināts aktivizētajos neironos, bet neaktivizētajos neironos. Tādējādi kopējai p38 MAPK signalizācijai, kas pierādīta kā loma sinaptiskajā plastikā (Boļšakovs et al., 2000; Izumi et al., 2008. gads), var būt novājināti aktivizētos neironos attiecībā pret neaktivizēto neironu vairākumu.

FACS var arī palīdzēt noteikt neironu tipus, kas tiek aktivizēti pēc akūtas vai atkārtotas kokaīna iedarbības. Mēs atradām augstāku D1 neironu marķieru gēna prodinamfīna ekspresiju aktivizētos neironos un zemāku D2 neironu marķieru gēnu D2 dopamīna receptoru un A2A adenozīna receptoru ekspresiju aktivizētos neironos. Tas liek domāt, ka Fosu galvenokārt izraisīja D1 striatūra neironi. Kaut arī tas piekrīt daudziem imūnhistoķīmiskiem pētījumiem, kas ziņo par Fos indukciju galvenokārt D1 neironos pēc psihostimulantu injekcijām mājas būris (Berretta et al., 1992; Cenci et al., 1992), tas ir pretrunā ar vienādu D1 un D2 neironu aktivizēšanu, kas konstatēti pēc psihostimulantu injekcijām salīdzinoši jauna vide ārpus žurku mājas būra (Jaber et al., 1995; Badiani et al., 1999; Hope et al., 2006).

Tā kā FACS laikā aktivizēto neironu identificēšanai mēs izmantojām to pašu βgal marķieri, ko mēs izmantojām iepriekš aprakstītajai Daun02 inaktivācijas procedūrai (Koya et al., 2009), ir ticams, ka mēs novērojam unikālas molekulāras izmaiņas neironu ansambļos, kas nepieciešami kokaīna izraisītas lokomotīves konteksta specifiskās sensibilizācijas apgūtajam komponentam. Iepriekš mēs atklājām, ka tikai neliela skaita reti izkliedētu neironu inaktivācija domājamā ansamblī ir pietiekama, lai izjauktu kontekstam specifisku kokaīna psihomotorisko sensibilizāciju (Koya et al., 2009). Šis atradums tika atkārtots, izmantojot to pašu mātīti cfos-lacZ žurkas un sensibilizācijas režīms, kas izmantots šajā pētījumā [http://irp.drugabuse.gov]. Šie neironi pēc savas būtības nav jutīgāki pret visiem stimuliem, jo, mainot vidi vai kontekstu, kad narkotika tika ievadīta, pēc kokaīna injekcijām tika aktivizēts atšķirīgs striatūra neironu komplekts (Mattson et al., 2008; Koya et al., 2009). Konkrēta striatūra neironu ansambļa izvēle galvenokārt ir atkarīga no kortikālo un subkortikālo glutamaterģisko afferentu aktivitātes modeļa (Pennartz et al., 1994; O'Donnell, 2003), un šos ievadus paši nosaka īpaši vides un interoceptive stimuli, kas atrodas uzvedības laikā. No šī iepriekšējā darba kopā ar mūsu pašreizējiem datiem mēs esam izvirzījuši hipotēzi, ka atkārtota kokaīna savienošana ar vides stimuliem sensibilizācijas režīma laikā rada unikālas molekulāras izmaiņas atkārtoti aktivizētos neironu ansambļos, kas var veicināt apzinātās asociācijas, kas ir konteksta specifiskas sensibilizācijas pamatā.

Kopumā mēs demonstrējām jaunu FACS pielietojumu pieaugušo neironu izolēšanai, kas selektīvi aktivizēti akūtas kokaīna izraisītas lokomotorās aktivitātes un atkārtotas kokaīna izraisītas lokomotorās sensibilizācijas laikā. Mēs ierosinām, ka šo pieeju varētu izmantot arī, lai identificētu unikālas molekulāras neiroadaptācijas neironu ansambļos, kas kodē ļaunprātīgi lietotu narkotiku uzvedību un citu apgūto uzvedību. Šo unikālo molekulāro neiroadaptāciju cēloņsakarības neironu plastikā un uzvedībā galu galā jāpārbauda, ​​manipulējot ar gēnu ekspresiju tikai aktivizētos neironos; tomēr šī metode vēl nav izstrādāta.

Pateicības

Šo pētījumu atbalstīja Narkotiku ļaunprātīgas izmantošanas nacionālā institūta Intramulāro pētījumu programma. D. Guez-Barber atbalstīja NIH MSTP TG 5T32GM07205, balvas numurs F30DA024931 no Narkotiku ļaunprātīgas izmantošanas Nacionālā institūta un Charles BG Murphy katedras psihiatrijas Jēlas universitātē. Mēs pateicamies Džo Črestam par lielisko tehnisko palīdzību FACS, kā arī Krisam Čadle, Tonijai Vatskinai un Alanam Bergeram par darbu pie mikromašīnām. Mēs pateicamies Yavin Shaham par noderīgajiem komentāriem par manuskriptu.

Zemsvītras piezīmes

 

Nevienam šī manuskripta autoram nav interešu konfliktu.

Atsauces

  1. Badiani A, Oates MM, diena HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Amfetamīna izraisītas c-fos ekspresijas vides modulācija D1 un D2 striatūra neironos. Behav Brain Res. 1999; 103: 203–209. [PubMed]
  2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM. Dopamīna un glutamāta agonisti stimulē Fosam līdzīga proteīna neironiem raksturīgu izpausmi striatumā. J neirofiziols. 1992; 68: 767–777. [PubMed]
  3. Boļšakova VY, Carboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. Divkāršie MAP kināzes ceļi meditē ilgtermiņa plastiskuma pretstatītās formas CA3-CA1 sinapsēs. Nat Neurosci. 2000; 3: 1107–1112. [PubMed]
  4. Bowers MS, Chen BT, Bonci A. AMPA receptoru sinaptiskā plastika, ko izraisa psihostimulatori: pagātne, tagadne un terapeitiskā nākotne. Neirons. 2010; 67: 11–24. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  5. Cenci MA, Campbell K, Wictorin K, Bjorklund A. Kokaīna vai apomorfīna ierosināšana ar striatal c-fos preferenciāli notiek izejas neironos, kas projicē Substantia Nigra žurkām. Eur J Neurosci. 1992; 4: 376–380. [PubMed]
  6. Curran T, Franza BR., Jr Fos un Jun: AP-1 savienojums. Šūna. 1988; 55: 395–397. [PubMed]
  7. Garg S, Nichols JR, Esen N, Liu S, Phulwani NK, Syed MM, Wood WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. MyD88 ekspresija, ko veic CNS rezidentu šūnas, ir galvenā, lai izraisītu aizsargājošu imunitāti smadzeņu abscesos. ASN Neuro. 2009: 1. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB. D1 un D2 dopamīna receptoru funkcija striatumā: D1 un D2 dopamīna receptoru koaktivācija atsevišķās neironu populācijās rada potenciāli tūlītēju agrīnu gēnu reakciju D1 saturošos neironos. J Neurosci. 1995; 15: 8167–8176. [PubMed]
  9. Guzowski JF, Timlin JA, Roysam B, McNaughton BL, Worley PF, Barnes CA. Uzvedībai atbilstošu neironu ķēžu kartēšana ar tūlītēju un agrīnu gēnu ekspresiju. Curr Opin Neurobiol. 2005; 15: 599–606. [PubMed]
  10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, Surmeier DJ, Reyes A, Galarraga E. D1 receptoru aktivizēšana pastiprina izraisītu izdalīšanos neostriatal vidējos spininga neironos, modulējot L veida Ca2 + vadītspēju. J Neurosci. 1997; 17: 3334–3342. [PubMed]
  11. Cerība B, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. 6 mēnešus pēc atkārtotas kokaīna ievadīšanas ārpus mājas būra kokaīna izraisīta lokomotorā aktivitāte un Fos ekspresija kodolos uzkrājas. Eur J Neurosci. 2006; 24: 867–875. [PubMed]
  12. Izumi Y, Tokuda K, Zorumski CF. Ilgtermiņa potenciācijas nomākums ar zema līmeņa N-metil-D-aspartāta receptoru aktivāciju ietver kalcineurīnu, slāpekļa oksīdu un p38 mitogēna aktivētu proteīna kināzi. Hipokampā. 2008; 18: 258–265. [PubMed]
  13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. Akūta un hroniska amfetamīna terapija atšķirīgi regulē neiropeptīdu kurjeru RNS līmeni un Fos imūnreaktivitāti žurku striatal neironos. NEUROZINĀTĪBA. 1995; 65: 1041–1050. [PubMed]
  14. Kalivas PW. Glutamāta homeostāzes hipotēze par atkarību. Nat Rev Neurosci. 2009: 10: 561 – 572. [PubMed]
  15. Kasofs GM, Mahanty NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI. Spontāna un izsaukta glutamāta signālu pārnešana ietekmē Fos-lacZ ekspresiju un piramīdveida šūnu nāvi hipokampu šķēļu kultūrās no transgēnām žurkām. Smadzenes, Res Mol smadzenes, Res. 1995; 34: 197–208. [PubMed]
  16. Koya E, Golden S, Harvey B, Guez-Barber D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farquhar D, Ghosh S, Mattson B, Hope B. Mērķtiecīgi traucējumi kokaīna aktivēti kodoli akumulē neironus, novērš konteksta specifisku sensibilizāciju. Nat Neurosci. 2009; 12: 1069 – U1152. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  17. Kwon B, Houpta TA. Kombinēta lāzera uztveršanas mikrodissekcijas un X-Gal histoloģijas metode, lai analizētu gēna ekspresiju c-Fos specifiskos neironos. J Neurosci metodes. 2010; 186: 155–164. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  18. Labiner DM, Butler LS, Cao Z, Hosford DA, Shin C, McNamara JO. C-fos mRNS indukcija ar iekurtiem krampjiem: sarežģītas attiecības ar neironu plīsumu. J Neurosci. 1993; 13: 744–751. [PubMed]
  19. Liberles SD, Buck LB. Otrās klases chemosensory receptori ožas epitēlijā. Daba. 2006; 442: 645–650. [PubMed]
  20. Lobo MK, Karsten SL, Grey M, Geschwind DH, Yang XW. FACS masīva profilēšana striatālās projekcijas neironu apakštipos nepilngadīgo un pieaugušo peļu smadzenēs. Nat Neurosci. 2006; 9: 443–452. [PubMed]
  21. Loebrich S, Nedivi E. Aktivitātes regulēto gēnu funkcija nervu sistēmā. Physiol Rev., 2009; 89: 1079–1103. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
  22. Mattsons B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Hope B. Konteksta specifiska kokaīna izraisītas lokomotorās aktivitātes un ar to saistīto neironu ansambļu sensibilizācija žurku kodola uzkrāšanās kodolos. Eur J Neurosci. 2008; 27: 202–212. [PubMed]
  23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekulārs slēdzis ilgstošai adaptācijai smadzenēs. Brain Res Mol Brain Res. 2004: 132: 146 – 154. [PubMed]
  24. Nestler E, Hope B, Widnell K. Atkarība no narkotikām - neironu plastiskuma molekulārā pamata modelis. Neirons. 1993; 11: 995–1006. [PubMed]
  25. Nestler EJ. Atkarībā esošās ilgtermiņa plastiskuma molekulārā bāze. Nat Rev Neurosci. 2001: 2: 119 – 128. [PubMed]
  26. Nicola SM, Surmeier J, Malenka RC. Neironu uzbudināmības dopamīnerģiskā modulācija striatumā un kodolu uzkrāšanās procesos. Annu Rev Neurosci. 2000; 23: 185–215. [PubMed]
  27. Nicola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO. Kontrasta uzlabošana: striatālā dopamīna fizioloģiskā iedarbība? Šūnu audu rez. 2004; 318: 93–106. [PubMed]
  28. O'Donnell P. Priekškaula neironu ansambļu dopamīna vārtu atdalīšana. Eur J Neurosci. 2003; 17: 429–435. [PubMed]
  29. Paxinos G, Watson C. Žurkas smadzenes stereotaksiskās koordinātēs. 4. Sandjego: akadēmiskā prese; 1998. gads.
  30. Pennartz CM, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH. Kodols uzkrājas kā funkcionāli atšķirīgu neironu ansambļu komplekss: uzvedības, elektrofizioloģisko un anatomisko datu integrācija. Prog neurobiols. 1994; 42: 719 – 761. [PubMed]
  31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ. c-Fos ekspresija žurku intergenulātajā bukletā: fotoregulācija, vietējā lokalizācija ar Fos-B un šūnu identificēšana. Brain Res. 1996; 728: 231–241. [PubMed]
  32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM. Smadzeņu garozas elektriskās stimulācijas ietekme uz Fos olbaltumvielu ekspresiju bazālajos ganglijos. Neirosci. 1997; 81: 93–112. [PubMed]
  33. Sgambato V, C lapas, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. Āršūnu signāla regulēta kināze (ERK) kontrolē tūlītēju agrīnu gēna indukciju kortikostriatālās stimulācijas laikā. J Neurosci. 1998; 18: 8814–8825. [PubMed]
  34. Shaham Y, Hope BT. Neiroadaptāciju loma narkotiku meklēšanas recidīvos. Nat Neurosci. 2005; 8: 1437–1439. [PubMed]
  35. Shin C, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Cohen DR. C-fos mRNS ekspresijas indukcija ar nākošo un sadedzināto žurku hipokampā pēc izlādes. J Neurochem. 1990; 55: 1050–1055. [PubMed]
  36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. Neostriatal spinālo neironu divu stāvokļu spontānas membrānas potenciāla svārstību pirmsākumi. J Neurosci. 1996; 16: 2397–2410. [PubMed]
  37. Vilks ME, Ferrario CR. Pēc atkārtotas kokaīna iedarbības AMPA receptoru plastika kodolā uzkrājas. Neurosci Biobehav Rev 2010 [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]