PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Anotācija
Kokaīna izraisītas gēnu ekspresijas izmaiņas izraisa neironu morfoloģijas un uzvedības izmaiņas, kas var būt atkarīgas no kokaīna atkarības. Mēs noteicām histona 3 lizīna 9 (H3K9) dimetilēšanas un lizīna dimetiltransferāzes G9a būtisko lomu kokaīna izraisītā strukturālā un uzvedības plastitātē. Atkārtota kokaīna lietošana samazināja H3K9 dimetilācijas globālo līmeni kodolkrāsās. Tviņa histona metilēšanas samazināšanos izraisīja G9a apspiešana šajā smadzeņu reģionā, ko regulēja kokaīna izraisītais transkripcijas faktors ΔFosB. Izmantojot nosacītu mutagēzi un vīrusu mediētu gēnu pārnesei, mēs noskaidrojām, ka G9a pazemināta dendrīta mugurkaula plastiskums kodolkrūšu neironiem un labāka kokaīna izvēle, tādējādi radot izšķirošu lomu histona metilēšanai ilgtermiņa kokaīna iedarbībā.
Ievads
Atkārtotu kokaīna iedarbību raksturo pastāvīgas gēnu ekspresijas izmaiņas un mainīta neironu morfoloģija kodola accumbens (NAc) ietvaros, kas ir galvenais smadzeņu atalgojuma shēmas komponents (1-2). Hromatīna remodelācija ir svarīga, lai izmainītu izmaiņas šajā smadzeņu reģionā, kas var būt atkarīgs no kokaīna atkarības aspektiem. (3-9). Kokaīna regulēšana hromatīna struktūrā NAc daļēji izriet no tiešas kokaīna izraisītas hromatīna fermentu modifikācijas, kas izraisa izmaiņas histona acetilācijā un fosforilācijā (4, 7-9); tomēr fermentu, kas kontrolē histonu metilēšanu, lomas vēl nav pētītas.
Nesenā genoma mēroga promotora analīzē, izmantojot hromatīna imunoprecipitāciju, kas savienota ar mikroarķieriem (ChIP-Chip), tika konstatēta repressīvā histona H3 lizīna 9 (H3K9) un 27 (H3K27) metilēšanas modifikācija specifiskos gēnu promotoros NAc pēc atkārtotas kokaīna terapijas (6). Tāpēc mēs profilējām daudzus lizīna metiltransferāzes (KMT) un demetilāzes (KDM), kas ir zināmi, ka kontrolē H3K9 vai H3K27 metilēšanu (1A). Tikai divi fermenti - G9a un GLP - parādīja pastāvīgu transkripcijas regulējumu 24 stundas pēc atkārtotas kokaīna lietošanas, kad abu gēnu ekspresija tika ievērojami samazināta.. Tā kā G9a un GLP īpaši katalizē H3K9 (H3K9me2) dimetilēšanu, to samazinājums ar kokaīnu atbilst šajā brīdī novērotajiem globālajiem Euchromatic H3K9me2 līmeņiem (1B). Turpretī heterokromatiskā H3K27 metilēšanas globālais līmenis nemainījās ar atkārtotu kokaīna iedarbību (Att. S1 tiešsaistes materiāla atbalstam). Sakarā ar augsto katalītiskās aktivitātes līmeni in vitro un in vivo (10), mēs turpinājām izpētīt G9a represiju funkcionālo nozīmi pēc atkārtotas kokaīna iedarbības NAc. G9a proteīna līmenis, tāpat kā tā mRNS līmenis, pēc atkārtotas kokaīna lietošanas ievērojami samazināja 24 stundas (S2). Kaut arī G9a mRNS ekspresija NAc samazinājās par 35%, imūnhistoķīmiskā analīze atklāja G15a proteīnu līmeņa mazāku samazinājumu 9% līmenī, kas atbilst H21K3me9 2% samazinājumam pēc atkārtotas kokaīna lietošanas (1B). G9a mRNS ekspresija šajā smadzeņu reģionā tika samazināta arī par 20% pēc atkārtotas kokaīna lietošanas.S3).
Lai noteiktu, vai izmaiņas euchromatic H3K9me2 korelē ar genoma mēroga izmaiņām gēnu ekspresijā NAc, mēs izmantojām microarray analīzes, lai pārbaudītu gēnu ekspresijas profilus, ko inducē ar kokaīna iedarbības devu dzīvniekiem ar iepriekšēju kokaīna iedarbību anamnēzē vai bez tā. gēnu saraksti Tabulas S1 – S3). Dzīvniekiem, kuri bija saņēmuši atkārtotu kokaīnu, radās dramatisks gēnu ekspresijas pieaugums 1 stundā pēc kokaīna lietošanas, salīdzinot ar akūti ārstētiem dzīvniekiem (1C). Šis palielinātais gēnu ekspresija joprojām radās, reaģējot uz kokaīna izaicinājumu, kas tika lietots pēc 1 nedēļas pārtraukšanas no atkārtota kokaīna. Saskaņā ar iepriekšējiem ziņojumiem neliels procents gēnu (~ 10%) parādīja desensibilizētas transkripcijas atbildes pēc atkārtotas kokaīna lietošanas (1C; redzēt Tabula S1) (5). Lai tieši izpētītu G9a pazemināšanās lomu pastiprinātajā gēnu ekspresijā, kas novērota pēc atkārtota kokaīna, pelēm tika ievadītas iekšējās NAc injekcijas Herpes simplex vīrusa (HSV) vektoriem, kas ekspresē GFP vai G9a, un tika ārstēti ar sāls šķīdumu vai atkārtotu kokaīnu, lai noteiktu, vai G9a pārmērīga ekspresija bija pietiekams, lai bloķētu atkārtotu kokaīna izraisīto gēnu ekspresijas pastiprināšanos. No 12 nejauši izvēlētu gēnu kopas, kas parādīja paaugstinātu izteiksmes līmeni pēc atkārtota kokaīna, mēs novērojām, ka G9a ievērojami samazināja šo gēnu 50% pastiprināto ekspresiju (Tabula S4).
Lai identificētu augšupejošus transkripcijas notikumus, kas veicina atkārtotu kokaīna izraisīto G9a ekspresijas apspiešanu, mēs pētījām iespējamo ΔFosB lomu, kas ir ļoti stabila tūlītēja agrīna gēna savienojuma produkts. fosB. ΔFosB uzkrājas NAc pēc atkārtotas kokaīna iedarbības, ja tas ir saistīts ar paaugstinātu kokaīna atalgojumu (11). ΔFosB var darboties kā transkripcijas aktivators vai repressors atkarībā no iesaistītā mērķa gēna (3, 5, 6, 12). Bitransgēnu NSE-tTA × tetOP-ΔFosB pelēm, kur ΔFosB ekspresiju var inducēt selektīvi pieaugušo dzīvnieku NAc un dorsālajā striatumā (13), mēs izpētījām ΔFosB izpausmes ietekmi uz kokaīna regulēšanu H3K9me2 un KMTs NAc. ΔFosB pārmērīga ekspresija bija pietiekama, lai samazinātu gan H3K9me2 (1D) un G9a izteiksme (1E), tādējādi atdarinot atkārtota kokaīna ietekmi. Turpretī ΔFosB nesamazināja GLP ekspresiju šajā smadzeņu reģionā, un tam nebija ietekmes uz SUV39H1 un EZH2, kas ir galvenie trimetilēšanas enzīmi H3K9 un H3K27,S4). Lai apstiprinātu šos datus, izmantojot neatkarīgu osFosB pārmērīgas ekspresijas sistēmu, savvaļas tipa pieaugušās peles saņēma divpusējas intra-NAc injekcijas ar Adeno saistītu vīrusu (AAV) vektoriem, kas ekspresē GFP vai ΔFosB. OsFosB pārmērīga ekspresija ar vīrusu pārmērīgi samazināja G9a ekspresijas līmeni šajā smadzeņu reģionā (1E).
Šāds izteikts un specifisks G9a regulējums lika mums izpētīt, vai G9a ekspresijas maiņa tieši NAc neironos regulē uzvedību uz kokaīnu. Savvaļas tipa peles saņēma intra-NAc injekcijas HSV vektoriem, kas ekspresē GFP vai G9a, un pēc tam tika analizēti, izmantojot objektīvu kokaīna nosacītas vietas preferenču paradigmu, kas nodrošina netiešo zāļu atlīdzības mērījumu. Pēc uzvedības testēšanas tika apstiprināta G9a vīrusu pārmērīga ekspresija NAc neironos.2A). G9a pārmērīga ekspresija ievērojami samazināja kokaīna izvēli salīdzinājumā ar dzīvniekiem, kas pārspēja GFP (2B) un palielināja H3K9me2 līmeņus NAc (2C). G9a (G9aH1093K) katalītiski mirušā mutanta pārmērīga ekspresija (14) neietekmēja kokaīna izvēli (2B) un neietekmēja H3K9me2 līmeni šajā smadzeņu reģionā (2C).
Turpināt pētīt G9a lomu kokaīna uzvedības iedarbībā un konkrētāk, lai imitētu atkārtotu kokaīna izraisīto G9a ekspresiju represiju NAc, pieaugušajiem G9afl / fl pelēm (14) saņēma AAV vektoru iekšējās injekcijas, kas ekspresē Cre rekombināzi vai GFP kā kontroli. G9a AAV-Cre knockdown NAc, kas tika apstiprināts imūnhistoķīmiski (S5), ievērojami palielināja kokaīna ietekmi uz kondicionēšanas eksperimentiem un samazināja H3K9me2 līmeni NAc (2D, E). G9a un GLP komerciāli pieejams farmakoloģiskais inhibitors, BIX01294 (15-16), tika izmantots, lai pārliecinātos, vai enzīma inhibīcija līdzīgi ietekmē izturēšanos pret kokaīnu. Patiešām, G9a un GLP farmakoloģiskā inhibīcija ievērojami palielināja kokaīna izvēli un samazināja H3K9me2 NAc (2F, G).
Atkārtota kokaīna lietošana palielina dendritisko muguriņu blīvumu uz NAc vidēja smailes neironiem (17), process, kas saistīts ar funkcionālajām izmaiņām eksitējošās glutamatergiskās sinapsēs uz šiem neironiem (18-19) un sensibilizētas reakcijas uz narkotikām (17, 20). Tādējādi mēs pieņēmām, ka G9a aktivitātes pazemināšanās NAc ar atkārtotu kokaīnu var izraisīt kokaīna spēju regulēt NAc neironu dendrīta mugurkaula blīvumu. Izmantojot hromatīna imunoprecipitāciju (ChIP) ar anti-G9a antivielu, NAc tika identificēti vairāki iespējamie G9a gēnu mērķi, no kuriem katrs ir bijis iesaistīts kokaīna izraisītā dendritiskā plastitātē (3A) (20-26). Mēs atklājām, ka atkārtota kokaīna lietošana ievērojami samazināja G9a saistīšanos, kā arī H3K9me2 līmeni šajos gēnu promotoros (3B). Turpretī akūta kokaīna lietošana dažos no šiem pašiem gēnu promotoriem ātri piesaistīja G9a, kas atbilst paaugstinātai G9a ekspresijai, kas novērota NAc 1 stundā pēc akūtas kokaīna devas (S6). Lai gan G9a saistīšanās ar specifiskiem gēnu promotoriem sakrīt ar izmaiņām tās ekspresijā, joprojām nav skaidrs, vai šādus notikumus mediē G9a globālie līmeņi NAc un / vai atšķirības G9a darbā pēc akūta vs atkārtota kokaīna lietošana.
Pamatojoties uz G9a daudzu ar plastiku saistītu gēnu regulēšanu NAc, mēs tieši pārbaudījām, vai G9a ekspresijas saglabāšana šajā smadzeņu reģionā pēc atkārtotas kokaīna terapijas bija pietiekama, lai bloķētu kokaīna izraisītu dendritisko mugurkaula veidošanos. Izmantojot iepriekš pierādītu kokaīna ārstēšanas protokolu, kas veicina dendrīta mugurkaula indukciju NAc (20), mēs pārbaudījām mugurkaula blīvumu dzīvniekiem, kas injicēti ar HSV-GFP vai HSV-G9a. Vienojoties ar iepriekšējiem konstatējumiem, novēroja ievērojamu dendrīta mugurkaula blīvuma palielināšanos NAc pēc kokaīna terapijas, kas tika pilnībā bloķēts ar G9a pārmērīgu ekspresiju (3C). G9a pārmērīga ekspresija vien nebija pietiekama, lai samazinātu NAc dendritisko mugurkaula blīvumu, ja nav kokaīna. Lai papildinātu šos datus, G9afl / fl pelēm saņēma intra-NAc injekcijas HSV-Cre un mugurkaula blīvums tika kvantificēts un salīdzināts ar dzīvniekiem, kas saņēma HSV-GFP bez kokaīna. G9a ekspresijas pazušana ievērojami palielināja mugurkaula blīvumu NAc vidējā smailes neironiem (3C).
Ņemot vērā pierādījumus, ka G9a pazemināšanās NAc pēc atkārtota kokaīna mediācijas ir ΔFosB, mēs pēc tam pārbaudījām, vai šis transkripcijas faktors ir arī iesaistīts NAc dendritisko muguriņu regulēšanā.. Lai gan ΔFosB iepriekš nav bijis cēloņsakarībā saistīts ar šādu dendritisko plastiskumu, vairāki tā mērķi, tostarp Cdk5 un NFκB apakšvienības, ir tik saistīti ar (20-23), un ΔFosB noturīgā ekspresija NAc neironos korelē ar paaugstinātu dendritisko mugurkaula blīvumu pēc atkārtotas kokaīna terapijas (27). Pirmkārt, mēs atklājām, ka ΔFosB indukcija bitransgēnās pelēs bez kokaīna, kas pazemināja G9a un H3K9me2 izteiksmi (1D, E), samazinājās G9a saistīšanās ar daudziem ar plastitāti saistītiem gēniem, no kuriem daudzi arī ir pierādījuši sevi kā tiešus ΔFosB mērķus (3D) (3, 6). Pēc tam mēs parādījām, ka ΔFosB pārmērīga vīrusa ekspresija NAc būtiski palielināja dendrīta mugurkaula blīvumu pamata apstākļos, līdzīga tai, kas novērota pēc atkārtotas kokaīna lietošanas (\ t3E). Savukārt, ΔJunD, dominējošā negatīvā proteīna, kas antagonizē ΔFosB transkripcijas aktivitāti, pārmērīga izpausme NAc, bloķēja atkārtota kokaīna spēju palielināt dendritisko mugurkaula veidošanos NAc. (3C).
Mūsu novērojums, ka ΔFosB regulē G9a ekspresiju NAc un ka ΔFosB un G9a regulē dažus no tiem pašiem mērķa gēniem, lika mums izpētīt citas mijiedarbības starp ΔFosB un G9a. Pēc akūta kokaīna, kad G9a līmenis tika palielināts, G9a saistīšanās ar fosB gēns tika palielināts, bet pēc atkārtota kokaīna, kad G9a ekspresija tika nomākta, G9a \ t fosB samazināts gēns (3A). Šāda samazināta G9a saistīšanās pēc atkārtota kokaīna lietošanas netika novērota c-fos, kur G9a saistīšanās palielinās ar atkārtotu kokaīnu (S7). Tas saskan ar to, ka atšķirībā no fosB, c-fos hroniska psihostimulanta iedarbība tiek apspiesta, nevis izraisīta.5). ΔFosB pārmērīga ekspresija bitransgēnās pelēs bija pietiekama, lai ievērojami samazinātu G9a \ t fosb gēns (3D). Turklāt G9a pārmērīga ekspresija bija pietiekama, lai samazinātu ΔFosB ekspresiju pēc atkārtotas kokaīna lietošanas (Tabula S4). Šie dati liecina par autoregulācijas cilpu, kurā G9a sākotnēji ierobežo ΔFosB indukciju ar akūtu kokaīna lietošanu. Tomēr, tā kā ΔFosB uzkrājas ar atkārtotu zāļu iedarbību, tas apspiež G9a un tādējādi stiprina savu turpmāko indukciju.
Visbeidzot, mēs esam pierādījuši, ka histona lizīna metilēšana NAc ir būtiski iesaistīta neironu gēnu ekspresijas regulēšanā, reaģējot uz kokaīnu. G9a un H3K9me2 represija pēc atkārtotas kokaīna ievadīšanas veicina kokaīna izvēli, daļēji, pateicoties daudzu gēnu transkripcijas aktivācijai, kas, kā zināms, regulē dendrīta plastiskuma novirzes formas. Labāka izpratne par gēniem, ko regulē šādi mehānismi, uzlabos mūsu zināšanas par narkotiku atkarības sarežģīto bioloģisko bāzi un var palīdzēt attīstīt efektīvāku atkarību izraisošo traucējumu ārstēšanu.
Materiāli un metodes
Dzīvnieki un ārstēšana
Ja vien nav norādīts citādi, pelēm tika novietotas četras līdz piecas būris kolonijā ar 12 stundu gaismas / tumšo ciklu (iedegās no 7: 00 AM uz 7: 00 PM) pie nemainīgas temperatūras (23 ° C) ar ad libitum piekļuve ūdenim un pārtikai. Visus dzīvnieku protokolus apstiprināja IACUC gan UT Dienvidrietumu medicīnas centrā, gan Sinaja kalna medicīnas skolā.
Kokaīna eksperimentos [imūnhistoķīmija, rietumu blotēšana, kvantitatīvais PCR (qPCR), mikroarray analīze un hromatīna imunoprecipitācija (ChIP)] tika izmantotas 8-10 nedēļas vecās peles C57BL / 6J. Dzīvnieki saņēma ikdienas injekcijas sāls šķīdumā (7 terapija sāls, ip), „akūta” kokaīna (6 terapija sāls + viena 20 mg / kg kokaīna-HCl, ip) vai „atkārtota” kokaīna (7 ārstēšana 20 mg / kg). kokaīna HCl, ip). Peles nogalināja 1 stundā vai 24 stundās pēc galīgās apstrādes. Attiecībā uz mikroarray pētījumiem dzīvniekus katru dienu ārstēja ar "sāls šķīdumu" (15 ārstēšana sāls, ip), "akūtu" kokaīnu (14 ārstēšana sāls + 1 ārstēšana 20 mg / kg kokaīna HCl, ip), "atkārtots + akūts" kokaīns ( 7 terapija sāls šķīdums + 8 ārstēšana 20 mg / kg kokaīna-HCl, ip) vai “atkārtota atcelšana + akūta” kokaīna (7 terapija 20 mg / kg kokaīna-HCl + 7 ārstēšana sāls + 1 iedarbība 20 mg / kg kokaīna-HCl, ip) un tika nogalināti 1 stundu pēc galīgās apstrādes. Uzvedības eksperimentos peles tika novietotas pēc operācijas un tika ārstētas ar 10 mg / kg kokaīna HCl, ip, kā aprakstīts turpmāk. Dendrīta mugurkaula analīzei un mikroarray validācijai pēc HSV-GFP un HSV-G9a-GFP infekcijas pelēm tika ārstēti sāls šķīdumi (5 terapija sāls, ip) vai „atkārtots kokaīns” (5 ārstēšana 20 mg / kg kokaīna HCl, ip ) 3 dienu laikā, jo iepriekš tika pierādīts, ka šis injekcijas protokols palielina mugurkaula blīvumu uz kodoliem (NAc) neironiem Herpes simplex vīrusa (HSV) transgēna ekspresijas laikā (Papildu ref S1). Peles, kas tika izmantotas dendrīta mugurkaula analīzei, tika nogalinātas 4 stundas pēc pēdējās ārstēšanas.
Lai izraisītu lokālu G9a transkripta dzēšanu, kas ierobežota ar NAc neironiem, mēs izmantojām mutantās peles, kas homozigotas attiecībā uz fleksētu G9a alēli, kas ir sīki aprakstītas citur (S2). Cre-inducēta rekombinācija rada 22 eksoniju 25 ārpus rāmja savienojumiem, kas noved pie neskaidras maldinātās mutācijas mazināšanās. Mēs izmantojām G9a peldošas peles, kas tika pilnībā pārceltas uz C57BL / 6J pelēm. Pelēm sterilitāti injicēja NAc ar Adeno saistītu vīrusu (AAV) vektoriem (2 serotipu), kas ekspresēja GFP vai Cre-GFP starp 7 un 10 nedēļas vecumu. Lai pārbaudītu Cre-mediētās rekombinācijas efektivitāti, tika izmantota imūnhistoķīmiskā analīze (sk. \ T Papildus attēls S5). Mēs izmantojām AAV injicētus dzīvniekus 21 dienas pēc operācijas, jo rekombinācija G9a peldošajās pelēs bija stabila un maksimāla šajā laika posmā, kas atbilst publicētajiem ziņojumiem (S3-S4). G9a un AJunD pārmērīgas ekspresijas eksperimentus līdzīgi veica, izmantojot HSV vīrusu vektorus, kas ekspresē GFP, savvaļas tipa G9a-GFP, katalītiski nobeigušos G9aH1093K-GFP vai ΔJunD-GFP (skatīt S2 sīkāku informāciju par G9a konstrukciju izstrādi). HSV pārmērīgas ekspresijas pelēm tika izmantotas 3 dienas pēc operācijas, jo pārmērīga ekspresija šajā laika posmā bija maksimāla, kā to novēroja imūnhistoķīmijā. Sakarā ar HSV ekspresijas pārejošo raksturu un ievērojami stabilāku AAV ekspresijas raksturu eksperimentos, kuros bija nepieciešama ātra, īstermiņa transgēna ekspresija, tika izmantoti HSV vektori, bet eksperimentos, kuros bija vajadzīgi ilgstoši transgēnu ekspresijas periodi, tika izmantoti AAV vektori. Gan iepriekšējos pētījumos ir pierādīts, ka abi vektori inficē tikai neironu šūnu ķermeņus injicētā smadzeņu zonā bez jebkādiem afferentiem vai efferentiem neironiem.
Uzvedības eksperimentiem, izmantojot farmakoloģisko G9a / GLP inhibitoru, BIX01294 (25 ng / μl), peles sterilizēja ar divām zemādas sūknēm, kā arī divpusēju vadlīniju kanāliem. Mini-sūkņi tika aktivizēti 12 stundas pirms implantācijas, uzsākot nepārtrauktu ievadīšanu (0.25 μl / stundā) vai nu transportlīdzekli (5 hidroksipropil β-ciklodekstrīnu), vai narkotiku 14 dienām, kuru laikā tika veikti uzvedības novērtējumi.
ΔFosB pārmērīgas ekspresijas eksperimentiem [western blotting, qPCR un ChIP], vīriešu bitransgēnās NSE-tTA × tetOP-ΔFosB tika izmantotas peles (10 nedēļas vecums), kad tetraciklīna atvasinājuma doksiciklīna (8 nedēļu laikā pēc doksiciklīna) trūkuma, dzīvniekiem bija spēcīga striatāla ierobežota ΔFosB izpausme (S5). OsFosB pārmērīga ekspresija šajās pelēs tika apstiprināta ar qPCR palīdzību. Lai apstiprinātu secinājumus, izmantojot NSE-tTA × tetOP-ΔFosB pelēm, savvaļas tipa 8 nedēļas vecās C57BL / 6J vīriešu peles sterotaksiski injicēja iekšējo NAc ar AAV vektoriem, kas ekspresēja GFP vai ΔFosB-GFP. Šajā gadījumā tika izmantoti AAV vektori, lai nodrošinātu maksimālu ΔFosB ekspresiju 8 nedēļu laikā pēc operācijas, ļaujot tieši salīdzināt vīrusu inficētas un bitransgēnu ΔFosB pārmērīgas ekspresijas peles. Vīrusu pārmērīga ekspresija tika apstiprināta, izmantojot qPCR pēc 8 nedēļas pēc operācijas (15 gauge NAc perforatori tika atdalīti injekcijas vietā). AAV-GFP un AAV-ΔFosB-GFP pārmērīgas ekspresijas peles, kas netika izmantotas qPCR, tika ārstētas ar sāls šķīdumu (14 ārstēšana sāls, ip) vai atkārtotu kokaīnu (14 ārstēšana 30 mg / kg kokaīna-HCl, ip), sākot ar 6 nedēļām pēc operācija. 4 dienas pēc pēdējās apstrādes, smadzenes tika fiksētas ar 4% paraformaldehīdu, sadalītas vibrātos un tika izmantotas dendrīta mugurkaula analīzei.
Western blot analīze
14 gauge NAc perforatori tika paņemti no 1 mm koronālajām sekcijām, kas iegūtas, izmantojot nerūsējošā tērauda peles smadzeņu matricu un tika apstrādātas ar 1 M HEPES līzes buferi (1% SDS), kas satur proteāzes un fosfatāzes inhibitorus. 10-30 μg kopējā proteīna paraugi tika elektroforēze uz 18% SDS gēliem. Olbaltumvielas tika pārnestas uz PVDF membrānām un inkubētas ar anti-H3K9me2 (peles monoklonālo, 1: 500), anti-β-tubulīnu (peles monoklonālo, 1: 60,000), anti-total histonu H3 (trušu poliklonāls, 1: 5,000), anti-GFP (ko izmanto, lai pārbaudītu vienādu vīrusa ekspresiju perforētajos audos) (trušu poliklonāls, 1: 1000), anti-H3K27me3 (trušu poliklonāls, 1: 500) vai anti-aktīna antivielas (peles monoklonālais, 1: 60,000) 4 ° C (visas membrānas tika bloķētas 5% pienā vai 5% liellopu seruma albumīnā). Pēc tam membrānas inkubēja ar peroksidāzes iezīmētajām sekundārajām antivielām (1: 15,000-1: 60,000 atkarībā no izmantotās primārās antivielas) un joslas tika vizualizētas, izmantojot SuperSignal West Dura substrātu. Joslas tika kvantitatīvas ar NIH Image J programmatūru, un H3K9me2 joslas tika normalizētas vai nu ar aktīnu vai β-tubulīnu, bet arī kopējo histonu H3, lai kontrolētu vienādu slodzi. Atkārtots kokaīns neietekmēja aktīna līmeni (\ tS8) vai kopējais histons 3 (S1) NAc. Turklāt HSV-G9a-GFP un HSV-G9aH1093K-GFP infekcija neietekmēja kopējo β-tubulīna līmeni NAc (S8).
Imūnhistoķīmija
Pirms analīzes ar vienu vai divām imūnhistoķīmijām, kā aprakstīts iepriekš, pelēm tika nomierināta hlora hidrāta letāla deva un perfūzija ar 4% paraformaldehīdu.S6). Īsi sakot, pēc fiksētās smadzenes inkubēja istabas temperatūrā nakti 30% saharozes, pirms tās tika sadalītas pie 35 μm (dendrīta mugurkaula analīzei izmantotās smadzenes tika sadalītas vibrātos 100 μm sekcijās bez 30% saharozes). Brīvi peldošas NAc sekcijas tika nomazgātas ar 1X PBS, bloķētas (3% normāls ēzeļu serums, 0.1% tritonX, 1X PBS) un vēlāk inkubētas ar anti-GFP (vistas poliklonālo, 1: 8000) un / vai anti-G9a , 1: 500) antivielas bloķējošā šķīdumā. Dendritisko muguriņu analīzes tika inkubētas ar trušu poliklonālu anti-GFP antivielu 1: 200. Pēc inkubācijas pa nakti NAC sekcijas 3 minūtes tika izskalotas 10X PBS, kam sekoja inkubācija ar Cy1 un / vai Cy2 fluorescējošām sekundārajām antivielām 3X PBS bloķēšanas šķīdumā 1 stundām. Morfoloģijas pētījumos izmantotās sekcijas sekundāro antivielu veidā inkubēja istabas temperatūrā. Kodolkrāsošana tika panākta, inkubējot sekcijas 2X PBS, kas satur DAPI (1: 1) 50,000 minūtes. Sekcijas atkal nomazgāja, kam sekoja etanola dehidratācija un montāža ar DPX. Visas sekcijas tika attēlotas, izmantojot konfokālo mikroskopu.
RNS izolācija un qPCR
Divpusējie 14 gabarītu NAc perforatori tika homogenizēti Trizol un apstrādāti saskaņā ar ražotāja norādījumiem. RNS tika attīrīta ar RNAesy Micro kolonnām un spektroskopija apstiprināja, ka RNS 260/280 un 260/230 devas bija> 1.8. Pēc tam RNS tika transkribēta, izmantojot Bio-Rad iScript Kit. cDNS kvantitatīvi noteica ar qPCR, izmantojot SYBR Green. Katru reakciju veica divos vai trijos eksemplāros un analizēja, izmantojot iepriekš aprakstīto ΔΔCt metodi, kā normalizācijas kontroli izmantojot gliceraldehīda-3-fosfāta dehidrogenāzi (GAPDH) (S7). Skatīt papildu tabula S5 mRNS primer sekvencēm.
DNS mikroarray analīze
Microarray pētījumā tika izmantotas četras grupas (neatkarīgas bioloģiskās replikācijas 3 grupā), kas kopā veidoja 12 microarrays. 1 stunda pēc pēdējās kokaīna injekcijas, dzīvnieki tika ātri atdalīti un smadzenes tika noņemtas un novietotas uz ledus. NAc fragmenti tika ņemti, izmantojot 15 gabarīta adatas perforatoru un ātri sasaldēja sausā ledā, līdz tika izdalīta RNS. Divpusēji perforatori tika apvienoti no četriem dzīvniekiem uz vienu replikātu, kopā 12 pelēm katrā grupā. RNS izolācija, mikroarray apstrāde un datu analīze tika veikta, kā aprakstīts iepriekš (S8). Īsi sakot, RNS tika izolēts un attīrīts, kā aprakstīts iepriekš, un to pārbaudīja, izmantojot Agilent's Bioanalyzer. Reversā transkripcija, amplifikācija, marķēšana un hibridizācija ar Illumina MouseWG-6 v2.0 masīviem tika veikta, izmantojot standarta procedūras, izmantojot UT Southwestern mikroelementu kodolu. Neapstrādāti dati tika atņemti no fona un normalizēti kvantiļi, izmantojot Beadstudio programmatūru. Normalizētie dati tika analizēti, izmantojot GeneSpring programmatūru, un genelisti tika ģenerēti, izmantojot nozīmīguma kritērijus 1.3 reizes lielām izmaiņām, apvienojot ar nepastāvīgu p vērtības samazinājumu p <0.05.
Mēs saglabājam augstu ticamību šiem datiem vairāku iemeslu dēļ. Pirmkārt, visi dzīvnieki vienlaicīgi tika apstrādāti, apstrādāti un nogalināti ar tādiem pašiem nosacījumiem. Vienlaikus tika veikta arī visa RNS un masīvu apstrāde. Otrkārt, mēs veicām trīs reizes kopumus un apkopojām vairākus dzīvniekus uz vienu masas paraugu, tādējādi samazinot atšķirības, kas radušās individuālās mainības un pieaugošās statistiskās jaudas dēļ (S9). Treškārt, mūsu pētījumā izmantotos datu analīzes kritērijus iesaka MicroArray Kvalitātes kontroles projekts, jo šie kritēriji ir apstiprināti, lai nodrošinātu augstu atkārtojamības pakāpi un starp- un intraplatformu reproducējamību (S10-S11).
Vīrusu vektoru būvniecība
Vīrusu vektora ievietošanas lieluma ierobežojumu dēļ kodējošās G9a (G9a) vai katalītiski nobeigušās G9a (G9aH1093K) sekvences tika klonētas bistristroniskā p1005 + HSV plazmīdā, kas ekspresē GFP cilvēka tiešā agrīna citomegalovīrusa promotora (CMV) kontrolē. ievietošanas izmērs bija ~ 9 kb, kas pārsniedz maksimālo AAV-3.96 vektoru ievietošanas lielumu). IE2 / 4 promotors vada G5a izteiksmi. Fragmenti tika subklonēti bicistroniskā p9 + HSV plazmīdā, izmantojot netīrus gala ligējumus ar Klenow apstrādāto PmeI un EcoRI šķelto G1005a (no pcDNA9) un CIP apstrādātu p3.1 + pēc EcoRI šķelšanas. HSV-VJunD-GFP ražošanai AJunD kodējošā secība, kas pārklāta ar EcoRI restrikcijas vietām, tika radīta, izmantojot PCR, izmantojot primer oligonukleotīdus, kas satur EcoRI vietu. Pēc tam PCR produkts tika ligēts p1005 + vektora EcoRI vietā. Cre rekombināzes lokālā ekspresija NAc neironos tika panākta ar vīrusa starpniecību, izmantojot gēnu ievadīšanu, izmantojot AAV vektoru, kā aprakstīts (S12). GFP vai GFP N-terminālais savienojums ar Cre tika subklonēts rekombinantā AAV-2 vektorā, kas satur CMV promotoru ar splice donora akceptora secību un poliadenilācijas signālu. Visas vektoru ievietošanas metodes tika apstiprinātas ar dideoksidēšanu. Vīrusu vektori tika iegūti, izmantojot tripla transfekciju, bez palīglīdzekļu metodi, kā aprakstīts iepriekš (S13). Attīrīts vīruss tika uzglabāts –80 ° C. Vīrusu kvalitāte tika novērtēta ar inficējošu titru, kas novērtēts HEK293 šūnās. Līdzīgi tika sagatavoti AAV-ΔFosB-GFP vīrusi. HSV-Cre gadījumā Cre ekspresiju vadīja IRES promotors, pretēji IE4 / 5 promotoram, lai samazinātu Cre izpausmi un novērstu neironu toksicitāti (skat. S14 vīrusu būvniecībai). Visos gadījumos vīrusu pārprodukcija tika apstiprināta in vitro un in vivo izmantojot qPCR, un vīrusi tika apstiprināti imunohistochemiski, lai parādītu NAc ierobežotu ekspresiju pēc operācijas.
Stereotaksiskā ķirurģija
Ketamīna (100 mg / kg) / ksilazīna (10 mg / kg) anestēzijā peles tika novietotas mazā dzīvnieka stereotaksiskajā instrumentā, un galvaskausa virsma tika pakļauta. Trīsdesmit trīs šļirču adatas tika izmantotas, lai divpusēji ievadītu 0.5 μl vīrusa NAc ar 10 ° leņķi (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) ar ātrumu 0.1 μl / min. Dzīvniekiem, kas saņēma HSV injekcijas, tika atļauts atgūt 2 dienas pēc operācijas, bet pelēm, kas tika izmantotas uzvedības testēšanai, saņemot AAV vektorus, tika atļauts atgūt 20 dienas pirms to pakļaušanas novietošanai. Šie laiki atbilst maksimālajiem vīrusu mediēto transgēnu ekspresijas periodiem abiem vektoriem. BIX01294 infūzijām katrs no diviem mini sūkņiem tika novietots zem ādas uz muguras. Kaņepju izvietojums tika panākts, urbjot divus mazus galvaskausus caur NAc, un kanulu no bregmas (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Pēc operācijas 4 tika atļauta peles atveseļošanās līdz 5 dienām, pirms tika uzsākta kokainas kondicionēšanas procedūra, kā aprakstīts turpmāk.
Apstiprinātās vietas izvēle
Vietas kondicionēšanas procedūra tika veikta, kā aprakstīts iepriekš, ar šādām izmaiņām:S7). Īsi sakot, 3 dienas pēc HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP vai HSV-GFP iekšējas NAc infūzijas peles ievietoja kondicionēšanas kamerās, kas sastāv no trim atšķirīgām vidēm. Peles, kurām bija ievērojama priekšroka kādai no abām kondicionēšanas kamerām, tika izslēgtas no pētījuma (<10% no visiem dzīvniekiem). Pēc tam kondicionēšanas grupas tika sabalansētas, lai pielāgotos iespējamai kameras aizspriedumiem, kas joprojām var pastāvēt. Turpmākajās dienās dzīvniekiem injicēja fizioloģisko šķīdumu un pēcpusdienā 30 minūtes tos ievietoja vienā kamerā, pēc tam injicēja kokaīnu (10 mg / kg, ip) un 30 minūtes ieslēdza otrajā kamerā vakarā 2 dienas (divas fizioloģisko šķīdumu un divus kokaīna pārus). Testa dienā peles bez apstrādes 20 minūtes ievietoja atpakaļ aparātā un pārbaudīja, lai novērtētu, kurai pusei viņi dod priekšroku. Lokomotoru reakcijas uz kokaīnu tika novērtētas, pārraujot staru kūku pāra kamerās, lai nodrošinātu narkotiku ārstēšanas efektivitāti. AAV un BIX01294 CPP eksperimentiem tika izmantots nedaudz modificēts protokols. Dzīvniekiem atkal tika injicēts vai nu fizioloģiskais šķīdums, vai kokaīns (10 mg / kg, ip), un tos 30 minūšu laikā ievietoja īpašās kamerās, bet tā vietā tos 4 dienas kondicionēja tikai vienu reizi dienā, pēc tam sekoja tests 5. dienā (dzīvniekus kondicionēja). vakarā un kondicionēšanas procedūras tika mainītas). Visām grupām tika novērtēta sākotnējā kustība, reaģējot uz fizioloģisko šķīdumu, lai pārliecinātos, ka ārstēšana ar vīrusiem vai inhibitoriem neietekmē kustību kustību.
Intravenoza kokaīna pašapkalpošanās
Tika iegūti vīriešu pusaudži Long-Evans žurkas, kas eksperimenta sākumā sver 230 – 250 g. Tās tika novietotas mitruma un temperatūras kontrolētā vidē apgrieztā 12 stundu apgaismojuma / tumšā cikla laikā (apgaismojums izslēgts 9: 00 am) ar ad libitum piekļuvi pārtikai un ūdenim. Žurām tika atļauts aklimatizēties savā jaunajā vidē un katru dienu tika apstrādātas 1 nedēļā pirms eksperimenta sākuma. Visas procedūras tika veiktas saskaņā ar Nacionālā veselības institūta laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmatu, un tās apstiprināja Sinaja kalna dzīvnieku aprūpes un lietošanas komiteja. Pašpārvaldes aprīkojums bija aprīkots ar infrasarkanajiem stariem, lai noteiktu lokomotorisko uzvedību. Pašregulācija tika veikta, kā aprakstīts iepriekš (S15-S16) ar katetriem, kas implantēti labajā kakla vēnā zem izoflurāna (2.4–2.7%) anestēzijas. Katetri tika izskaloti ar 0.1 ml fizioloģiskā šķīduma, kas satur 10 U heparīnu un ampicilīnu (50 mg / kg). Pēc vienas nedēļas atveseļošanās pēc operācijas gaišā / tumšā cikla tumšajā fāzē sākās pašpārvaldes apmācība. Dzīvniekiem 3 stundas dienā tika atļauts piekļūt kokaīnam (0.75 mg / kg / infūzijai) saskaņā ar fiksētu attiecību 1 (FR1) pastiprināšanas shēmu, kur 1 aktīvā sviras nospiešana izraisīja vienu zāļu infūziju. Žurkas pēc 6 dienām stabilizēja kokaīna uzņemšanu (<15% atbildes reakcijas variācija 3 dienas pēc kārtas, vismaz 75% reaģējot uz pastiprinātas sviras). 24 stundas pēc pēdējās sevis ievadīšanas žurkas ātri nogrieza no galvas, smadzenes ātri izņēma un apstrādāja RNS izolēšanai un qPCR.
Hromatīna imunoprecipitācija (ChIP)
Svaigi NAc perforatori bija šķērssaistīti formaldehīdi un sagatavoti ChIP, kā aprakstīts iepriekš (S17-S18) ar nelielām izmaiņām. Īsumā, 4 14 mērierīces NAc perforatori uz vienu dzīvnieku (5 dzīvnieki, kas apvienoti vienā paraugā) tika savākti, šķērssaistīti ar 1% formaldehīdu un tika apturēti ar 2 M glicīnu pirms sasalšanas pie -80 ° C. 1 diena pirms ultraskaņas paraugu ņemšanas, aitas anti-trušu / peles (atkarībā no nogulsnes antivielas) IgG magnētiskās lodītes tika sagatavotas, inkubējot atbilstošas magnētiskās lodītes ar anti-G9a (trušu poliklonālo ChIP pakāpi) vai anti-H3K9me2 (peles monoklonālās ChIP pakāpes) antivielas uz nakti 4 ° C temperatūrā, pastāvīgi rotējot bloka šķīdumā. Audu apstrāde ar ultraskaņu un hromatīna griešana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš (S17). Pēc ultraskaņas apstrādes vienādas hromatīna koncentrācijas tika pārnestas uz jaunām caurulēm un ~ 5% galaproduktu tika saglabāti, lai kalpotu kā “ievades” kontroles. Pēc konjugēto lodīšu / antivielu maisījumu rūpīgas mazgāšanas un atkārtotas suspensijas katram hromatīna paraugam tika pievienoti vienādi tilpuma antivielas / lodītes maisījumi (~ 7.5 μg antivielas / paraugs) un inkubēti 16 stundas pastāvīgā rotācijā pie 4 ° C. Paraugi tika nomazgāti un atgriezti krusteniski saistīti ar 65 ° C nakti pirms DNS attīrīšanas, izmantojot PCR attīrīšanas komplektu. Pēc DNS attīrīšanas paraugi tika pakļauti qPCR un tika normalizēti atbilstoši savām atbilstošajām “ievades” kontrolēm, kā aprakstīts iepriekš (S17). Lai kontrolētu signāla pastiprinājuma atbilstošu bagātināšanos, tika veiktas arī normālas peles IgG imunoprecipitācijas, izmantojot peles poliklonālo anti-IgG antivielu. Adenīna fosforiboziltransferāze (APRT) tika izmantota kā negatīva kokaīna un ΔFosB ekspresijas eksperimentu kontrole. Skatīt Papildu tabula S5 promotora primer sekvencēm.
Dendrīta mugurkaula analīze
Lai izpētītu G9a lomu neironu morfoloģijas regulēšanā in vivo, mēs izmantojām iepriekš aprakstītās metodes ar sekojošām izmaiņām:S1). Trīs dienas pēc HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-AJunD-GFP injekcijas (visi vīrusi tika izmantoti savvaļas C57Bl / 6J pelēm) vai HSV-Cre-GFP (lietoti G9afl / fl pelēm), kad vīrusu ekspresija bija maksimāla, pelēm tika veikta perfūzija, smadzenes tika aizsargātas ar kriozēm un vēlāk sadalītas pie 100 μm uz vibratoma. Pēc tam sekcijas tika imunizētas, izmantojot antivielu pret GFP, kā aprakstīts iepriekš (skatīt Immunohistochemistry). Lai novērtētu G9a pārmērīgas ekspresijas un knockout ietekmi uz mugurkaula numuriem, kā arī ΔJunD pārmērīgas ekspresijas ietekmi, mēs mērījām muguriņu skaitu aptuveni 1 – 2 neitritos uz neironu, kas atbilst vismaz 299 μm sekundāro dendrītu no GFP ekspresējošas NAc vidējas smadzeņu neironi (MSN). Ņemot vērā, ka MSN ir morfoloģiski atšķirīgi no citām NAc neironu populācijām, kā arī iepriekšējiem ziņojumiem, kas norāda, ka HSV galvenokārt inficē DARPP-32 ekspresējošos neironus šajā smadzeņu reģionā (S19), mēs esam pārliecināti, ka MSN tika novērtēti tikai šajos pētījumos. Katram dzīvniekam mēs pārbaudījām ~ 6 – 8 neironus 3 – 4 dzīvniekiem katrā grupā (7 grupas), pēc tam tika iegūta vidējā vērtība katram dzīvniekam statistiskai analīzei. Eksperimenti, kas veikti, lai pārbaudītu ΔFosB pārmērīgas ekspresijas ietekmi uz NAc mugurkaula blīvumu, tika veikti līdzīgi kā aprakstīts iepriekš, izņemot to, ka AAV vektorus izmantoja, lai ilgstoši (8 nedēļas) izteiktu GFP vai ΔFosB-GFP. Visi HSV attēli tika uzņemti, izmantojot konfokālu mikroskopu ar 100X eļļas imersijas mērķi (AAV attēli tika uzņemti ar 63X eļļas imersijas mērķi). Attēli tika iegūti ar 1 patvaļīgā vienībā iestatīto pinhole un 1024 × 1024 rāmja izmēru. Dendritu garumu noteica, izmantojot NIH Image J programmatūru, un mugurkaula numurus primārais eksperimentētājs skaitīja akli, jo slaidi tika kodēti pirms eksperimentālās skenēšanas. Tika aprēķināts vidējais muguriņu skaits uz dendrīta 10 μm.
Statistiskā analīze
Tika veiktas vienvirziena un divvirzienu ANOVA, lai noteiktu nozīmīgumu attiecībā uz kondicionētu vietu preferenci un dendritisko mugurkaula analīzi ar vairāk nekā divām grupām. Studentu t testi tika izmantoti citiem salīdzinājumiem, ieskaitot qPCR, rietumu blotēšanu, dendrītu mugurkaula analīzi, salīdzinot HSV-GFP ar HSV-Cre G9afl / fl pelēm, mikroelementu analīzes (skatīt iepriekš) un hromatīna imūnnogulsnēšanas eksperimenti. Plānotie studenta t-testi tika izmantoti pēc divvirzienu mugurkaula dendrīta blīvuma ANOVA analīzes pēc ΔFosB pārmērīgas ekspresijas, apstiprinot nozīmīgu zāļu un vīrusu ārstēšanas galveno ietekmi. Visas skaitļu leģendās iekļautās vērtības atspoguļo vidējo ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Detalizēta statistiskā analīze Att. 1-3 galvenajā tekstā ir sniegts: Detalizēts attēla leģendas, ieskaitot statistiku.
Zemsvītras piezīmes
Es apliecinu, ka neviens no manuskripta materiāliem neattiecas Histona metiltransferāzes G9a būtiska loma kokaīna izraisītā plastiskumā iepriekš ir publicēti vai tiek izskatīti citur, tostarp internetā.
Visi darbi, kas saistīti ar dzīvnieku izmantošanu, tika veikti saskaņā ar institucionālajām un IACUC vadlīnijām gan Teksasas Universitātes Dienvidrietumu medicīnas centrā, gan Sinaja kalna medicīnas skolā.
Atsauces un piezīmes
;
