(HUMAN) Uzvedības un strukturālā reakcija uz hronisku kokainu Nepieciešama Feedforward cilpa, kas ietver AFosB un kalcija / kalmodulīna atkarīgo olbaltumvielu kināzi II Nucleus Accumbens apvalkā (2013)

Transkripcijas faktors ΔFosB un ar smadzenēm bagātināts kalcija / kalmodulīna atkarīgais proteīnkināze II (CaMKIIα) tiek ierosināts kodolkrāsās (NAc), lietojot hronisku kokaīna vai citu psihostimulantu narkotiku lietošanu, kurās abi proteīni mediē sensibilizētas zāļu atbildes . Lai gan ΔFosB un CaMKIIα regulē AMPA glutamāta receptoru ekspresiju un funkciju NAc, dendrīta mugurkaula veidošanos NAc vidē smailiem neironiem (MSN) un lokomotorisko sensibilizāciju pret kokaīnu, līdz šim nav pētīta tieša saikne starp šīm molekulām. Šeit mēs parādām, ka ΔFosB fosforilējas ar CaMKIIα pie proteīna stabilizējošā Ser27 un ka CaMKII ir nepieciešama kokaīna uzkrāšanās ar AFosB žurku NAc.

Savukārt, mēs parādām, ka ΔFosB ir nepieciešams un pietiekams CaMKIIα gēna ekspresijas in vivo ierosināšanai, kas ir selektīva ietekme uz D₁- tipa MSN NAc apvalka apakšreģionā.

Turklāt dendritisko muguriņu indukcija uz NAc MSN un paaugstināta uzvedības reakcija pret kokaīnu pēc ΔFosB pārmērīgas ekspresijas ir CaMKII atkarīga.

Svarīgi ir tas, ka mēs pirmo reizi demonstrējam ΔFosB un CaMKII indukciju cilvēku kokaīna atkarīgie, ierosinot iespējamos terapeitiskās iejaukšanās mērķus. Šie dati pierāda, ka ΔFosB un CaMKII iesaistās šūnu tipa un smadzeņu reģiona specifiskā pozitīvā plūsmā kā galvenais mehānisms smadzeņu atlīdzības shēmu regulēšanai, reaģējot uz hronisku kokaīnu.

Ievads

Aizvien vairāk pierādījumu atbalsta viedokli, ka gēnu ekspresijas izmaiņas veicina narkomānijas mehānismus (Robison un Nestler, 2011). Viens no svarīgākajiem šo pārmaiņu starpniekiem ir FosB, Fos ģimenes transkripcijas faktors (Nestler, 2008). Hroniska gandrīz jebkuras ļaunprātīgas lietošanas zāļu lietošana izraisa ilgstošu ΔFosB uzkrāšanos kodolkrāsās (NAc), kas ir limbisks reģions, kas ir būtisks atalgojuma uzvedībai. Such indukcija šķiet specifiska NAc vidēja smadzeņu neirona (MSN) klasei, kas ekspresē D1 dopamīna receptorus. Indukējama ΔFosB pārmērīga ekspresija šajos D1 tipa NAc MSN palielina lokomotorisko un atalgojošo reakciju uz kokaīnu un morfīnu (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), ieskaitot paaugstinātu kokaīna pašpārvaldi (\ tColby et al., 2003). Turklāt ΔFosB transkripcijas aktivitātes ģenētiskā vai vīrusu bloķēšana samazina šo zāļu atalgojošo iedarbību (Zachariou et al., 2006), kas norāda, ka šī ilgstoša ΔFosB indukcija ir būtisks starpnieks ilgstošām izmaiņām, ko izraisa hroniska narkotiku lietošana..

FosB neparasta stabilitāte (salīdzinot ar visām citām Fos ģimenes olbaltumvielām) ir gan molekulas būtiska īpašība, jo pilnā garumā FosB esošie degronu domēni tiek saīsināti (Carle et al., 2007) un regulētu procesu. ΔFosB ir fosforilēts in vitro un in vivo Ser27, un šī reakcija stabilizē ΔFosB, ~ 10 reizes, šūnu kultūrā un NAc \ t in vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Lai gan ir pierādīts, ka Ser27-ΔFosB ir substrāts kazeīna kināzei-2 in vitro (Ulery et al., 2006), tā mehānisms in vivo fosforilācija joprojām nav zināma.

Kalcija / kalmodulīna atkarīgais proteīnkināzes II (CaMKII) ir izteikti ekspresēts serīna / treonīna kināze, kuras α un β izoformas veido dodekameru homo- un heteroholoenzīmus. in vivoun ir būtiskas daudzu neiroplastiskuma formām (Lisman et al., 2002; Colbran un Brown, 2004). CaMKIIα inducē selektīvi NAc apvalkā ar hronisku amfetamīnu (Loweth et al., 2010), un CaMKII aktivitātes farmakoloģiskā bloķēšana NAc apvalkā samazina uzvedības sensibilizāciju pret amfetamīnu (\ tLoweth et al., 2008) un kokaīnu (Pierce et al., 1998), bet CaMKIIα vīrusu pārmērīga ekspresija šajā NAc apakšreģionā uzlabo lokomotorisko sensibilizāciju amfetamīnu un pašregulāciju (Loweth et al., 2010). CaMKIIα var ietekmēt atalgojuma uzvedību, modulējot AMPA glutamāta receptoru apakšvienības (Pierce et al., 1998), jo CaMKIIα aktivitāte jau sen ir saistīta ar AMPA receptoru funkcijām un sinaptisko mērķēšanu vairākos neiroplastiskuma veidos (Malinow un Malenka, 2002).

Šī literatūra demonstrē vairākas paralēles starp ΔFosB un CaMKII: abas ir nepieciešamas un pietiekamas, lai novērstu vairāku ļaunprātīgas lietošanas narkotiku iedarbību. in vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010), un abas uzvedības sekas ir vismaz dažas no AMPA receptoru modulācijas (\ tKelz et al., 1999; Malinow un Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Neskatoties uz šīm paralēlām, nav zināms funkcionāls saikne starp ΔFosB un CaMKII. Šeit mēs izveidojam savstarpēju regulēšanu starp ΔFosB un CaMKII, un parādām, ka abi proteīni veido D1 tipa MSN specifisku feed-loop cilpu NAc apvalkā, ko izraisa kokaīns, un regulē virkni kokaīna reakciju in vivo.

Iet uz:

Materiāli un metodes

Eksperiments 1: iTRAQ NAc Shell un Core proteīnu analīze pēc kokaīna terapijas (1A)

Pieaugušo (8 nedēļu) žurku tēviņi tika ievadīti 20 mg / kg kokaīna vai sāls šķīdinātāja IP vienu reizi dienā septiņas dienas. Pēc pēdējās injekcijas 24 hr NAc apvalks un serde tika mikrodizaina (1A) un zibspuldzi iesaldē. iTRAQ analīzes tika veiktas, kā aprakstīts iepriekš (Ross et al., 2004; Davalos et al., 2010).

Skaitlis 1

Kokaīna specifiskā CaMKII indukcija NAc

2 eksperiments: proteīnu izmaiņu kvantitatīva noteikšana žurka NAc Core un Shell pēc kokaīna terapijas (1B – D attēls)

Pieaugušo (8 nedēļu) žurku tēviņi tika ievadīti 10 mg / kg kokaīna vai sāls šķīdinātāja IP vienu reizi dienā septiņas dienas lokomotīvju reģistrācijas kamerās. Lokomotoriskās atbildes reakcija uz vienu kokaīna injekciju (5 mg / kg IP) tika reģistrētas dzīvniekiem, kuri iepriekš ārstēti ar kokaīnu (ko sauc par "hronisku"), un daļa no tiem, kuri tika ārstēti ar sāls šķīdumu (saukts par "akūtu"), un lokomotorisko reakciju uz sāls šķīdumu atlikušajos hroniskos sāls šķīdumos ārstētos dzīvniekus (ko sauc par „sāls šķīdumu”). Lokomotīvās aktivitātes testi tika veikti, kā aprakstīts (Hiroi et al., 1997). Īsumā, pieaugušie vīriešu kārtas žurkas tika ievietotas 18 "× 24" PAS atklātā lauka ierakstīšanas kastēs (San Diego Instruments) 30 min, lai pieradinātu, tika ievadīta viena sāls šķīduma IP injekcija un tika kontrolēta papildu 30 min. 5 mg / kg kokaīna vienreizēja IP injekcija un 30 min.

24 h pēc šīs pēdējās injekcijas žurkas tika atdalītas bez anestēzijas, lai izvairītos no anestēzijas līdzekļu iedarbības uz neironu proteīnu līmeni un fosfora stāvokļiem. Smadzenes sērijveidā sagrieztas 1.2 mm matricā (Braintree Scientific), un mērķa audi tika noņemti fosfātu buferētajā sāls šķīdumā, kas satur proteāzes (Roche) un fosfatāzes (Sigma Aldrich) inhibitorus, izmantojot 14 gabarīta perforatoru NAc kodolam un 12 gabarīta atlikumu no atlikušajiem audu NAc apvalkā (skat 1A) un nekavējoties sasaldē sausā ledā. Paraugus homogenizēja ar ultraskaņu, izmantojot modificētu RIPA buferšķīdumu: 10 mM Tris bāze, 150 mM nātrija hlorīds, 1 mM EDTA, 0.1% nātrija dodecilsulfāts, 1% Triton X-100, 1% nātrija deoksikolāts, pH 7.4, proteāzes un fosfatāzes inhibitori. kā iepriekš. Pēc Laemmli bufera pievienošanas olbaltumvielas tika atdalītas ar 4-15% poliakrilamīda gradientgēliem (kritēriju sistēma, BioRad), un Western blotting tika veikta, izmantojot Odyssey sistēmu (Li-Cor) saskaņā ar ražotāja protokoliem.

Eksperiments 3: proteīnu izmaiņu kvantitatīva noteikšana žurka NAc Core un Shell pēc Kokaīna izņemšanas (1E)

Pieaugušo (8 nedēļu) žurku tēviņi tika ievadīti 10 mg / kg kokaīna vai sāls šķīdinātāja IP vienu reizi dienā septiņas dienas. 14 dienas pēc pēdējās injekcijas dzīvniekiem, kas ārstēti ar fizioloģisko šķīdumu, tika ievadīta cita sāls šķīduma injekcija (saukta par „fizioloģisko šķīdumu”), un ar kokaīnu ārstētiem dzīvniekiem tika ievadīta cita sāls šķīduma injekcija (saukta par 14 dienas pārtraukšanu vai „14d WD”) vai vienreizēja kokaīna injekcija. sauc par “14d WD Chal”, lai izaicinātu). Vienu stundu pēc pēdējās injekcijas dzīvniekus dekapitēja un Western blotēšanu veica kā eksperiments 2.

Eksperiments 4: proteīnu izmaiņu kvantitatīva noteikšana žurka NAc Core un Shell pēc Kokaīna pašpārvaldes (2A – C attēls)

Žurkas tika apmācītas pašam ievadīt 0.5 mg / kg / kokaīna infūziju vienas stundas laikā ar fiksētu attiecību 1 deviņu dienu laikā. Pēc deviņām sākotnējām sesijām pēdējās divās sesijās žurkas tika sadalītas divās grupās, ko līdzsvaroja kokaīna uzņemšana. Vienai žurku grupai tika atļauts pašam ievadīt kokaīnu (0.5 mg / kg / infūzija) vienas stundas laikā (īslaicīga piekļuve, ShA), bet otra žurku grupa pašam ievadīja kokaīnu sešu stundu laikā (ilga piekļuve, LgA ) desmit dienas (eskalācijas sesijas).

Smadzeņu sekcijas tika apstrādātas imūnhistoķīmijai, kā aprakstīts (Perrotti et al., 2004). Smadzenes tika perfuzētas 18 – 24 hr pēc pēdējās iedarbības uz narkotikām, kā rezultātā jebkura atlikušā pilna garuma FosB proteīna degradācija bija tāda, ka visa atlikušā imunoreaktivitāte atspoguļo ΔFosB. Šo noārdīšanos apstiprināja ar Western blotēšanu, kas neliecināja par būtisku krāsošanu ar antivielu, kas vērsta pret pilna garuma FosB C galu, kas neatpazīst ΔFosB (dati nav parādīti). Pēc šķēlēšanas 35 µm sekcijās ΔFosB imūnsistēmas šūnu skaits tika noteikts kvantitatīvā novērotāja veidā divās daļās caur katras žurkas NAc, un vidējās vērtības katram dzīvniekam 40 × laukā tika aprēķinātas. Katrs dzīvnieks tika uzskatīts par individuālu novērojumu statistiskai analīzei. Interesanti reģioni tika identificēti, izmantojot Paxinos un Watson (Paxinos un Watson, 2007).

CaMKIIα imunoreaktivitātes kvantitatīvo noteikšanu veica, izmantojot licencēšanas sistēmu, kā aprakstīts (Covington et al., 2009). Ar Odyssey programmatūru tika noteikta integrēta CaMKII un GAPDH intensitāte. Rezultāti tiek parādīti kā integrētās intensitātes vērtības uz mm² un tiek uzrādīti kā vidēji ± sem (n = 4 – 10 grupā). GAPDH vērtības tika izmantotas kā atsauce, lai normalizētu CaMKII intensitāti šķēles biezumam un apstākļiem.

Skaitlis 2

CaMKII indukcija patstāvīgi ievadāmām žurkām un narkomāniem, kas lieto NAc

Eksperiments 5: proteīnu līmeņa noteikšana ar kokainu atkarīgiem cilvēkiem (2D)

Procedūra

Pēcdzemdību cilvēka smadzeņu audi tika iegūti no Quebec Suicide Brain Bank (Douglas Garīgās veselības universitātes institūts, Monreāla, Kvebeka, Kanāda). Audu saglabāšana būtībā turpinājās, kā aprakstīts (Quirion et al., 1987). Īsumā, kad to iegūst, smadzenes tiek ievietotas mitrā ledus styrofoam kastē un steidzās uz Quebec Suicide Brain Bank. Puslodes nekavējoties atdala ar sagitālu griezumu smadzeņu, smadzeņu stumbra un smadzeņu vidū. Asinsvadus, pinea dziedzerus, koroidu pusi, pusi smadzeņu un pusi smadzeņu stumbra parasti sasmalcina no kreisās puslodes, kas pēc tam pirms sasaldēšanas sagriež koronāli 1 cm biezās šķēlītēs. Pēdējā puse smadzenēs tiek sagriezta sagitāli 1cm biezās šķēlītēs pirms sasaldēšanas. Audi tiek iesaldēti 2-metilbutānā pie -40 ° C ~ 60 sek. Visi saldēti audi tiek turēti atsevišķi plastmasas maisiņos pie -80 ° C ilgstošai uzglabāšanai. Konkrēti smadzeņu reģioni tiek atdalīti no sasaldētiem koronētiem šķēlītēm uz nerūsējošā tērauda plāksnes ar sausu ledu, lai kontrolētu vides temperatūru. Western blotēšana tika veikta, kā aprakstīts eksperiments 2.

Kohortas

Kohortā bija sievietes 37 un 3 sievietes vecumā starp 15 – 66 gadiem. Visi subjekti pēkšņi nomira bez ilgstošas ​​agona stāvokļa vai ilgstošas ​​slimības. Katrā gadījumā nāves cēloni noskaidroja Kvebekas Coroner birojs, un ar audu paraugiem tika veikts toksikoloģiskais ekrāns, lai iegūtu informāciju par medikamentiem un nelegālu vielu lietošanu nāves brīdī. Priekšmeta grupa sastāvēja no 20 indivīdiem, kuri atbilst SCID-I kritērijiem par kokaīna atkarību. Kontroles grupa sastāvēja no 20 subjektiem, kuriem anamnēzē nav bijusi kokaīna atkarība un nav nozīmīgu psihiatrisku diagnozi. Visi subjekti pēkšņi nomira no cēloņiem, kuriem nebija tiešas ietekmes uz smadzeņu audiem. Grupas tika saskaņotas ar vidējo subjekta vecumu, dzesēšanas kavēšanos un pH. Visiem subjektiem psiholoģiskās autopsijas tika veiktas, kā aprakstīts iepriekš (Dumais et al., 2005), kas ļauj mums piekļūt detalizētai gadījumu informācijai par psihiatrisko un medicīnisko vēsturi, kā arī citiem atbilstošiem klīniskiem un sociodemogrāfiskiem datiem. Īsi sakot, apmācīts intervētājs veica Strukturēta klīniskā intervija DSM-IV Psihiskie traucējumi (SCID-I) ar vienu vai vairākiem mirušā informatoriem. Klīnisko speciālistu grupa izskatīja SCID-I novērtējumus, gadījumu ziņojumus, koronera piezīmes un medicīniskos ierakstus, lai iegūtu vienprātīgas psihiatriskās diagnozes.

Eksperiments 6: hromatīna imunoprecipitācija žurka NAc (3A – C attēls)

Pieaugušo (8 nedēļu) žurku tēviņi tika ievadīti 10 mg / kg kokaīna vai sāls šķīdinātāja IP vienu reizi dienā septiņas dienas. Pēc pēdējās injekcijas 24 hr NAc apvalks un serde tika mikrodizaina. Hromatīna imunoprecipitācija (ChIP) tika veikta, apvienojot divpusējus čaumalu vai serdeņu NAc perforatorus no septiņām žurkām grupā 14 kopējās grupās (kopā 98 dzīvnieki, 7 kokainu baseini, 7 sāls baseini). Audi tika savstarpēji saistīti, mazgāti un uzglabāti –80 ° C temperatūrā, līdz hromatīns nobīdās ar ultraskaņu. Sheared chromatin inkubēja nakti ar antivielām, kas iepriekš bija saistītas ar magnētiskām pērlēm (Dynabeads M-280, Invitrogen). Nekontrolēta IgG tika izmantota kā kontrole. Pēc atgriezeniskās sašūšanas un DNS attīrīšanas tika izmantots QPCR, lai noteiktu CaMKIIα promotora DNS līmeni. Primeri tika izstrādāti, lai pastiprinātu reģionu, kas satur AP-1 konsensa secību, kas atrodas ~ 450 bp pirms transkripcijas sākuma vietas (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverss: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Skaitlis 3

CaMKIIα šūnu tipa un reģionam raksturīgā ΔFosB indukcija in vivo

Eksperiments 7: CaMKII transkripta un proteīna ekspresijas mērīšana ar šūnu tipa specifisko ΔFosB pārprodukciju (3D)

No NSE-tTA (A līnija) × TetOp-ΔfosB (līnija 11) un NSE-tTA (B līnija) × TetOp-FLAG-ΔfosB (11 līnija) pelēm (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) tika izstrādāti un audzēti, lietojot 100 µg / ml doksiciklīnu, lai atturētu ΔFosB ekspresiju attīstības laikā. Littermates tika sadalīti pēc atšķiršanas: puse palika uz doksiciklīna un puse tika pārslēgta uz ūdeni, un dzīvnieki tika izmantoti 8 uz 11 nedēļas vēlāk, kad ΔFosB transkripcijas efekti ir maksimāli (Kelz et al., 1999; McClung un Nestler, 2003). Transkripcijas analīzēm peles tika ātri atdalītas, un smadzenes tika noņemtas un novietotas uz ledus. NAc fragmenti tika paņemti ar 14 mērierīces adatu un ātri sasaldēti sausā ledā, līdz tika izdalīta RNS. RNS izolācija, qPCR un datu analīze tika veikta, kā aprakstīts iepriekš (LaPlants et al., 2009). Īsumā, RNS tika izolēta ar TriZol reaģentu (Invitrogen), tālāk attīra ar Qiagen RNAeasy mikro komplektu un pārbaudīja kvalitāti ar Agilent Bioanalyzer. Reversā transkripcija tika veikta, izmantojot iScript (BioRad). qPCR tika veikta ar Applied Biosystems 7900HT RT PCR sistēmu ar šādiem cikla parametriem: 10 min 95 ° C; 40 ° C 95 cikli 1 min, 60 ° C 30 sek., 72 ° C 30 sek .; karsējot uz 95 ° C, lai izveidotu disociācijas līknes, lai apstiprinātu atsevišķus PCR produktus. AFosB un CaMKIIα proteīna ekspresijas imūnhistoķīmiskās analīzes tika veiktas, kā aprakstīts eksperiments 4.

Eksperiments 8: Intra-NAc D1 un D2 dopamīna receptoru antagonistu ietekme uz kokaīna mediēto proteīnu izmaiņām (3H)

Pieaugušo (8 nedēļu) žurku tēviņi tika ievadīti 10 mg / kg kokaīna vai sāls šķīduma transportlīdzekļa (“transportlīdzekļa” grupa) IP vienu reizi dienā septiņas dienas. 30 min pirms katras kokaīna injekcijas, žurkām tika ievadīts vai nu D1 receptoru antagonists SCH 23390 (0.5 mg / kg, „D1 Ant” grupa), vai D2 receptoru antagonists etikloprīds (0.5 mg / kg, “D2 Ant” grupa) vai sāls šķīduma injekciju (“kokaīna” grupa). 24 h pēc pēdējās injekcijas dzīvniekus dekapitēja un proteīnus kvantitatīvi noteica ar Western blotēšanu eksperiments 2.

Eksperiments 9: AAV-mediētas ΔFosB pārmērīgas ekspresijas ietekme uz proteīnu ekspresiju (4 A – C)

Stereotaxic operācija tika veikta ar pieaugušiem vīriešu kārtas žurkas (8 nedēļas), lai injicētu AAV-GFP (zaļo fluorescējošo proteīnu) vai AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). Visām operācijām tika izmantotas 33 gabarītu adatas (Hamiltona), kuru laikā 0.5 µl attīrīta augstas titra vīrusa 5 min laika periodā tika ievadīta divpusēji, kam sekoja papildu 5 min pēc infūzijas. Visi attālumi tiek mērīti attiecībā pret Bregma: 10 ° leņķis, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 dienas pēc operācijas dzīvniekiem tika veikta vienreizēja 10 mg / kg kokaīna injekcija lokomotīves novērošanas kamerās, lai novērtētu ΔFosB pārmērīgas ekspresijas uzvedības ietekmi. 24 h pēc šīs pēdējās injekcijas žurkām tika dekapitēts atbilstoši eksperiments 2un audu mikrodissekcija tika veikta saskaņā ar fluorescences mikroskopiskiem norādījumiem, lai iegūtu GFP pozitīvu NAc audu. Pēc tam tika veikta Western blotēšana Eksperimentējiet 2.

Skaitlis 4

ΔFosB ir gan nepieciešams, gan pietiekams ar kokaīna starpniecību saistīta D1 receptoru CaMKIIα indukcija NAc apvalkā.

Eksperiments 10: AAV-mediētas ΔJunD pārmērīgas ekspresijas ietekme uz kokaīna atkarīgo proteīnu ekspresiju (4 D – F)

AAV-GFP vai AAV-GFP-ΔJunD stereotaksisko injekciju veica kā vienu Eksperimentējiet 8. 14 dienas pēc operācijas dzīvniekiem tika ievadītas 10 mg / kg kokaīna vai sāls šķīdinātāja IP vienu reizi dienā septiņas dienas lokomotīvju reģistrācijas kamerās. Tika reģistrētas lokomotoriskās atbildes reakcijas uz vienu kokaīna injekciju (5 mg / kg IP) vai sāls šķīdumu. 24 h pēc šīs pēdējās injekcijas žurkām tika dekapitēti, audi ievākti un Western bloti veikti tāpat kā Eksperimentējiet 9.

Eksperiments 11: in vitro Olbaltumvielu kināzes testi (5A – D attēls)

Rekombinantā CaMKIIα un ΔFosB tika attīrīti no kukaiņu šūnām (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007), un tika veikti proteīnu kināzes testi (Colbran, 1993), kā aprakstīts iepriekš. Īsumā, CaMKII tika iepriekš inkubēts uz ledus ar 2.5 µM ​​(vai norādīto koncentrāciju) ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 µM ​​kalmodulīns un 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforilācija tika uzsākta, pievienojot 200 µM ​​ATP ar vai bez [γ-³²P] ATP un ļautu turpināt 10 min istabas temperatūrā (5.A un B. attēls) vai 2 min uz ledus (5.C un D attēls). Produkti tika atrisināti ar Western blotting (5.A un B. attēls) vai autoradiogrammas un scintilācijas skaitīšana (B – D attēls).

Skaitlis 5

ΔFosB ir spēcīgs CaMKIIα substrāts

Eksperiments 12: Ser27 ΔFosB fosforilācijas identifikācija (5E)

In vitro kināzes testus veica kā vienu eksperiments 11olbaltumvielas tika atdalītas ar SDS-PAGE, un joslas, kas atbilst ΔFosB, tika izgrieztas un pakļautas tandēma masas spektrometrijai. Atbilstošo jonu fragmentu m / z piešķiršana visos paneļos ir marķēta uz jonu virsotnēm. Ne visi fragmentu joni ir marķēti telpu ierobežojumu dēļ. Parasti fragmenta jonu etiķetes teksts ir melnā krāsā, izņemot gadījumus, kad tie tieši apstiprina vai pievieno pierādījumus par interesējošām fosforilācijas vietām, un tādā gadījumā tie ir atzīmēti ar sarkanu. Pierādījumi par mugurkaula fragmentācijas produktiem ir parādīti fosfeptīda secības nolasījumā ar konstatēto fosforilācijas atlikuma vietu, kas norādīta sarkanā krāsā ar vienu aminoskābju burtu apzīmējumu. Novēroto fragmentu jonu skaitliskais apraksts ir atzīmēts arī uz peptīdu secības kā b un y joniem. Katra fragmenta masas spektra augšdaļā ir atzīmēti m / z ass posmu palielinājuma koeficienti, lai parādītu zemākas intensitātes fragmentu jonus. H panelī parādītie fragmentu joni apstiprina Ser27 fosforilētā izoforma klātbūtni citu fosforilētu izoformu maisījumā vietās Ser28, Ser31, Ser34 un Thr37. Pa5, pa5-P, pb5 un pb5-P jonu klātbūtne unikāli apstiprina Ser27 atlikuma fosforilāciju.

Eksperiments 13: Ser27 fosforilācijas kvantitatīva noteikšana (5F)

Standarta peptīdi tika izstrādāti, atdarinot Ser27 ΔFosB fosfora un nefosfora formas. Pēc sintēzes un attīrīšanas katrs “smagais” idiotipiskais peptīds tika izšķīdināts 50 / 50 acetonitrila / ūdens buferšķīdumā un nosūtīts aminoskābju analīzei, lai noteiktu absolūto koncentrāciju uz sintētiskā peptīda izejas šķīduma. Pēc tam katrs “smagais” peptīds tika ievadīts tieši 4000 QTRAP masas spektrometrā (MS), lai noteiktu labāko sadursmes enerģiju MS / MS fragmentācijai un divām līdz četrām MRM pārejām. Pēc tam tīrie „smagie” peptīdi tika pakļauti LCMS uz 4000 QTRAP, lai nodrošinātu peptīdu atdalīšanu. Instrumentu darbināja trīskāršā kvadrupola režīmā, Q1 iestatot uz konkrētu prekursora m / z vērtību (Q1 nav skenēšanas), un Q3 iestatīts uz konkrētu m / z vērtību, kas atbilst konkrētam minētā peptīda fragmentam. MRM režīmā secīgi tika mērīta virkne atsevišķu reakciju (prekursoru / fragmentu jonu pārejas, kad sadursmes enerģija ir noregulēta, lai optimizētu interesējošo fragmentu jonu intensitāti), un cikls (parasti 1 – 2 sek.) visu HPLC atdalīšanas laiku. MRM pārejas tika noteiktas no esošo peptīdu MS / MS spektriem. Pēc tam tika izvēlētas divas pārejas uz vienu peptīdu, kas atbilst augstas intensitātes fragmentu joniem, un sadursmes enerģija tika optimizēta, lai maksimāli palielinātu MRM pāreju signāla stiprumu, izmantojot automatizācijas programmatūru. Tad tika salīdzināti virsmas, kas rodas no standarta peptīdiem un ΔFosB paraugiem, kas pakļauti CaMKII vai kontrolei, lai noteiktu katra peptīda formas absolūto pārpilnību reakcijā. Datu analīze par LC-MRM datiem tiek veikta, izmantojot AB Multiquant 1.1 programmatūru.

Eksperiments 14: ΔFosB indukcija CaMKII pārmērīgas ekspresijas pelēm (5G & H attēls)

Transgēnās peles, kas pārmērīgi izpaužas T286D CaMKII (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) un savvaļas tipa pakaišiem, kas nav bijuši doksiciklīni, tika panākta transgēna ekspresija. Pieaugušajām pelēm 20 dienas tika ievadītas 14 mg / kg kokaīna vai sāls šķīduma IP vienu reizi dienā. 24 h pēc pēdējās injekcijas dzīvnieki tika atdalīti un imūnhistoķīmija un ΔFosB ekspresijas kvantitatīvā noteikšana tika veikta, kā eksperiments 4.

Eksperiments 15: HSV-mediētas ΔFosB pārmērīgas ekspresijas un CaMKII inhibīcijas ietekme uz NAc dendritiskajiem muguriņiem (6A – E attēls)

Pieaugušo tēviņu peles (8 nedēļas) stereotaksiski injicēja NAc ar HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I vai HSV-GFPAC3I-ΔFosB. Šajās konstrukcijās AC3I, kas balstās uz peptīdu balstītu CaMKII aktivitātes inhibitoru, ir savienots ar GFP C-galu. GFPAC3I tika klonēts ar PCR, izmantojot pMM400-vektoru, kas satur GFPAC3I kā veidni ar šādiem primeriem: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Iegūtais PCR produkts tika ievietots p1005 + un p1005 + -A FosB vektoros, izmantojot NheI un BspEI vietas. Konstrukcija tika apstiprināta ar sekvencēšanu. Stereotaksiskās koordinātas bija: 10 ° leņķis, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = −4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfūzija un smadzeņu šķelšanās tika veikta kā vienu eksperiments 4.

Muguras analīze tika veikta, kā aprakstīts (Christoffel et al., 2011). Īsumā, dendrītiskie segmenti 50 – 150 µm prom no somas tika nejauši izvēlēti no HSV inficētām šūnām, kas ekspresē GFP. Attēli tika iegūti ar konfokālu LSM 710 (Carl Zeiss) morfoloģiskai analīzei, izmantojot NeuronStudio ar rayburst algoritmu. NeuronStudio klasificē muguriņas kā plānas, sēnes vai spītīgas, pamatojoties uz šādām vērtībām: (1) malu attiecība, (2) galvas un kakla attiecība un (3) galvas diametrs. Spines ar kaklu var klasificēt kā plānas vai sēnes, un tās, kurām nav ievērojama kakla, klasificē kā nelīdzenas. Spoles ar kaklu ir marķētas kā plānas vai sēnes, pamatojoties uz galvas diametru.

Skaitlis 6

CaMKII aktivitātes bloķēšana novērš ΔFosB morfoloģisko un uzvedības ietekmi NAc

Eksperiments 16: HSV-mediētas ΔFosB pārmērīgas ekspresijas un CaMKII inhibīcijas ietekme uz kokaīna reakciju (6F)

Pieaugušo tēviņu pelēm tika ievadīti vīrusi, kā noteikts eksperiments 15un lokomotoriskās atbildes reakcijas uz vienu 5 mg / kg kokaīna injekciju tika mērītas kā Eksperimentējiet 9. Locomotoros datus izsaka kā kopējo staru lūzumu pār 30 min pēc kokaīna injekcijas.

Papildus informācija

Dzīvnieku mājokļi

Vīriešiem Sprague Dawley žurkas (250 – 275 g; Charles River Laboratories) tika novietotas pārī. Astoņu nedēļu vecās C57BL / 6J vīriešu peles (Džeksona laboratorija) tika izmitinātas grupā ar ne vairāk kā pieciem dzīvniekiem vienā būrī. Visi dzīvnieki tika pieradināti pie dzīvnieku novietnes ≥1 nedēļu pirms eksperimentālajām manipulācijām un izmitināti klimata kontrolētajās telpās (23 – 25 ° C) uz 12 hroma / tumšā cikla (apgaismojums pie 7: 00 AM) ar piekļuvi pārtikai un ūdeni ad libitum. Eksperimenti tika veikti saskaņā ar Neiroloģijas biedrības un institucionālās dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejas (IACUC) vadlīnijām Sinaja kalnā.

Narkotikas

Narkotikas tika ievadītas IP un izšķīdinātas sterilā fizioloģiskā šķīdumā, ieskaitot kokaīnu (5 – 20 mg / kg 10 µl pelēm, uz 1 ml žurkām, NIDA) un SCH 23390 vai etikloprīda hidrohlorīdu (0.5 mg / kg uz 1 ml, Tocris) . Stereotaksiskai ķirurģijai pelēm tika veikta anestēzija ar ketamīna "kokteili" (100 mg / kg) un ksilazīnu (10 mg / kg) (Henry Schein) sterilā fizioloģiskā šķīdumā.

Antivielas

CaMKIIα (kopā): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII fosfo-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (kopā): šūnu signalizācija 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfo-Ser27: fosfosolācijas, 1: 500

GluA1 (kopā): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statistiskā analīze

Visas statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot Prism 6 programmatūras pakotni (GraphPad). Studentu t-testi tika izmantoti visiem pāru salīdzinājumiem (norādīti rezultātos, kur ir dota t vērtība), un vienvirziena ANOVA tika izmantoti visiem daudzkārtējiem salīdzinājumiem (norādīti rezultātu sadaļā, kur norādīta F vērtība).

Iet uz:

rezultāti

Hronisks kokains izraisa CaMKII NAc Shell

Daudzos pētījumos norādīts, ka MSN korpusā un kodolā ir atšķirīgas bioķīmiskas un fizioloģiskas atbildes uz hronisku iedarbību uz narkotikām (Kourriha un Toms, 2009; Loweth et al., 2010) un ka abi apakšreģioni atšķirīgi regulē narkotiku meklēšanu (Ito et al., 2004). Lai noteiktu kokaīna atšķirīgo ietekmi uz NAc apvalka proteīnu sastāvdaļām vs mēs izmantojām multipleksētu izobarisko marķēšanu (iTRAQ) un tandēma masas spektroskopiju (MS / MS). Pieaugušiem vīriešu kārtas žurkām tika ievadīts IP ar kokaīnu (20 mg / kg) vai sāls šķīdumu katru dienu 7 dienās; Pēc pēdējās injekcijas 24 hr NAc apvalks un serde tika mikrodizaina (1A). Pēc tam šo paraugu olbaltumvielas tika kvantificētas, izmantojot iTRAQ. Visas četras CaMKII izoformas parādīja izteiktu izteiksmes palielināšanos pēc kokaīna terapijas, kas bija specifiskas NAc apvalkam, salīdzinot ar kodolu. Vairākas olbaltumvielu fosfatāzes, tostarp PP1 katalītiskās un regulējošās apakšvienības un PP2A, kas iepriekš bija saistītas ar dažādiem CaMKII substrātiem citās sistēmās (Colbran, 2004), sekoja līdzīgs modelis. Šie atklājumi sniedza jaunus, objektīvus pierādījumus tam, ka CaMKII signalizācijas ceļš ir redzami regulēts ar kokaīnu NAc korpusā.

Lai apstiprinātu šo konstatējumu kvantitatīvāk, mēs apstrādājām iepriekš aprakstītās žurkas ar kokaīnu (ar dažādām devām) vai sāls šķīdumu un mērījām lokomotoriskās atbildes reakciju uz kokaīna (5 mg / kg) vai sāls šķīduma devu. Atkārtota 10 mg / kg kokaīna iedarbība izraisīja tipisku lokomotorisko sensibilizāciju (1B). Turpmākie pētījumi ar šo dozēšanas shēmu atklāja, izmantojot Western blotēšanu, ka atkārtotais kokaīns izraisa CaMKIIα selektīvi NAc apvalkā 24 h pēc pēdējā kokaīna injekcijas (1C un D attēls; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Turklāt AMPA receptoru GluA831 subvienības kanoniskā CaMKII substrāta Ser1 fosforilēšana ievērojami palielinājās NAc apvalkā, nevis kodols (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), bet CaMKIIα Thr286 autofosforilācija bija spēcīga, bet ne nozīmīga tendence tikai indukcijas virzienā (1D). Vairāki citi glutamāta receptori netika ietekmēti. Atšķirībā no šiem CaMKII mērījumiem, tie paši audu paraugi parādīja ΔFosB indukciju abos apvalkos (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) un kodolu (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) (1C un D attēls), kas atbilst iepriekšējiem konstatējumiem (Perrotti et al., 2008).

Tā kā vairāki iepriekšējie pētījumi par AMPA receptoru kokaīna regulēšanu analizēja dzīvniekus pēc ~ 14 dienas pēc izņemšanas no hroniskā kokaīna (skatīt diskusiju), mēs šo bioķīmisko analīzi atkārtojām šajā brīdī. Mēs noskaidrojām, ka 14 dienas pēc kokaīna pēdējās injekcijas ΔFosB saglabājas paaugstināts NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), kamēr ne CaMKII, ne GluA1 Ser831 fosforilācija nemainās (1E). Tomēr 1 hr pēc vienas 10 mg / kg kokaīna iedarbības devas, kopējā CaMKII līmeņa (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) un GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforilācija ir paaugstināta līdz tādam līmenim, kāds ir pēc sākotnējās hroniskās kokaīna iedarbības (\ t1E). Šie dati liecina, ka NAc čaula neironi tiek sagatavoti CaMKII indukcijai ilgstošu abstinences periodu laikā, iespējams, izmantojot CaMKII gēna promotora tiešu primēšanu (skat. Diskusiju). Turklāt fakts, ka ΔFosB indukcija ir noturīgāka par CaMKII indukciju, liecina par papildu mehānismu esamību, neatkarīgi no tā, vai tie ir hromatīnu saturoši vai citādi, kas izraisa „bremzēšanu” uz CaMKII regulējumu, kā minēts diskusijā.

Lai vēl vairāk nostiprinātu šos novērojumus, mēs pētījām kokaīna pašpārvaldes modeļus, kas ietver narkotiku lietošanu. Pieaugušiem vīriešu kārtas žurkām tika nodrošināta īslaicīga vai ilgstoša piekļuve kokaīnam; kā gaidīts (Ahmed un Koob, 1998), tikai ilgi piekļuves nosacījumi izraisīja narkotiku pašpārvaldes palielināšanos (2A). ΔFosB lielā mērā inducēja vs īsa piekļuve kokaīnam gan NAc apvalkā (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) un kodols (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Turpretim CaMKIIα tika izraisīts NAc apvalkā tikai ar ilgu piekļuvi kokaīnam (2B un C attēls; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Ir interesanti salīdzināt vidējo kokaīna dienas devu īstermiņa dzīvniekiem (~ 12 mg / kg IV), dzīvniekiem, kas ilgstoši piekļūst (~ 70 mg / kg IV), un eksperimentu ievadītiem dzīvniekiem (10 mg / kg), un jautājiet, kāpēc tas izraisa spēcīgu ΔFosB un CaMKII indukciju, bet īss piekļuves nav. Šī atšķirība, iespējams, ir saistīta ar kokaīna maksimālā līmeņa atšķirībām (eksperimenta ievadītais kokaīns tiek ievadīts kā vienreizējs bolus IP, savukārt pašapkalpošanās kokaīns tiek piegādāts ar vairākām IV devām) vai zāļu iedarbības ilguma atšķirības (7 dienas eksperimenta devējam). lietošana, 19 dienas pašregulācijai).

Neskatoties uz plašo literatūru par ΔFosB un CaMKII kokaīna iedarbībā, nav pētījumi par šiem proteīniem cilvēku kokaīna lietotājiem. Šeit mēs iepazīstinām ar pirmajiem pierādījumiem, ka abu ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) un CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) līmenis ir atkarīgs no kokaīna atkarīgo cilvēku NAc.2D, Tabula 1). Šie dati liecina, ka mūsu kokaīna ΔFosB un CaMKII indukcijas pārbaude grauzēju NAc ir klīniski nozīmīga atkarībai no cilvēka kokaīna.

Tabula 1

Cilvēku kokaīna atkarīgo un saskaņotās kontroles grupas paraugu raksturojums

ΔFosB regulē CaMKII transkripciju selektīvi NAc Shell D1 tipa MSN

Noskaidrojums, ka gan kokaīns, gan grauzēju NAc, gan CaMKII, gan AFosB regulē, noteica, ka AFosB var regulēt CaMKII gēna transkripciju. Mēs jau iepriekš ziņojām par CaMKIIα kā iespējamu ΔFosB mērķi neobjektīvā NAc mikroarray analīzē (McClung un Nestler, 2003), bet šis pētījums šajā pētījumā netika apstiprināts. Vispirms mēs izmantojām kvantitatīvu ChIP (qChIP-ChIP, kam sekoja kvantitatīvā PCR), lai noteiktu, vai ΔFosB saistās ar CaMKIIα gēna promotoru pieaugušo vīriešu žurku NAc, un konstatēja, ka šī saistība ir ievērojami palielinājusies hroniskā kokaīna ievadīšanā čaulā ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), bet ne apakšgrupu (3A). Lai tālāk saprastu mehānismus, kas saistīti ar šo apakšreģionam raksturīgo atšķirību ΔFosB saistībās ar CaMKIIα promotoru, mēs izmantojām qChIP, lai raksturotu histonu modifikāciju stāvokli šajā genoma reģionā. Iepriekšējie pētījumi parādīja H3 acetilēšanas kokaīna indukciju CaMKIIα promotorā kopā ar peles NAc (Wang et al., 2010). Turpretī konstatējām, ka kokaīns samazina H3 acetilāciju CaMKIIα promoterā selektīvi NAc kodolā (3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), bez izmaiņām, kas redzamas korpusā, atbilst apakšreģionam specifiskām hromatīna izmaiņām ārpus ΔFosB saistībām. qChIP attiecībā uz represīvo zīmi, dimetilētais H3 lizīns 9 (H3K9me2), atklāja tendences gan čaumalas, gan galveno apakšreģionu samazinājumam (3C).

Lai noteiktu, vai ΔFosB regulē CaMKIIα transkripciju in vivo, mēs izmantojām divas bitransgeniskas peles līnijas, kas inducējami pārspēja ΔFosB, īpaši D1 vs D2 tipa MSN tādā veidā, ko kontrolē doksiciklīna lietošana dzeramajā ūdenī (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Pieaugušajām vīriešu pelēm, kas pārmērīgi izpaužas ΔFosB tikai D1 tipa MSN, bija ievērojami palielināts CaMKIIα mRNS līmenis NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), kas nav novērota pelēm, kas pārmērīgi ekspressē ΔFosB galvenokārt D2 tipa MSNs (3D). CaMKIIα mRNS pieaugums, ko inducēja ΔFosB ekspresija D1 tipa MSN, tika papildināts ar vienlaikus palielinātu CaMKIIα proteīnu gan NAc apvalkā (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) un kodols (p = 0.0392; = 2.275; df = 14; 3E un F). Šie dati liecina, ka ΔFosB spēj vadīt CaMKIIα gēna ekspresiju D1 tipa MSN abos apakšreģionos, lai gan Attēls 3B ierosina, ka ar kokaīnu saistītās hromatīna izmaiņas CaMKIIα promoterā (piemēram, samazināta acetilācija) novērš ΔFosB no CaMKII regulēšanas galvenajā apakšreģionā pēc kokaīna.

Tā kā mūsu transgēno peļu dati liecināja, ka CaMKII gēna ekspresijas ΔFosB indukcija ir specifiska D1 tipa MSN NAc, mēs pēc tam centāmies noteikt, vai no kokaīna atkarīga CaMKII regulēšana prasa D1 dopamīna receptora aktivāciju. Pieaugušām žurku tēviņām hronisks kokaīns vai fizioloģiskais šķīdums tika ievadīts tāpat kā iepriekš, bet 30 minūtes pirms katras injekcijas kokaīna grupas žurkām tika ievadīta fizioloģiskā šķīduma IP injekcija, D1 antagonists SCH 23390 (0.5 mg / kg) vai D2 receptoru antagonists etikloprīds. (0.5 mg / kg). Dzīvniekus analizēja 24 stundas pēc pēdējās kokaīna injekcijas. Western blotting atklāja, ka D1, bet ne D2 antagonists pilnībā bloķēja kokaīna izraisīto ΔFosB pieaugumu (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), kā ziņots iepriekš (Nye et al., 1995), kā arī CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; 3G un H attēls). Šie dati apstiprina hipotēzi, ka kokaīns piesaista ΔFosB-mediētu CaMKII gēna ekspresijas pieaugumu tieši NAc apvalka D1 tipa MSN. Nākamajos pētījumos būtu svarīgi tieši demonstrēt kokaīna specifisko specifisko šūnu ietekmi uz CaMKII ekspresiju šajā smadzeņu reģionā.

ΔFosB ir nepieciešams un pietiekams CaMKII Kokaīna indukcijai NAc Shell

Lai papildinātu bitransgēnu peles izmantošanu, mēs tālāk pētījām ΔFosB lomu CaMKIIα kokaīna indukcijas mediācijā, izmantojot vīrusu mediētu gēnu pārnesi žurkām. Pieaugušo vīriešu žurku (kur čaulu var selektīvi mērķēt) NAc apvalkā mēs divpusēji injicējam ar adeno saistītu vīrusu (AAV) daļiņas, lai pārmērīgi izpaustu ΔFosB plus GFP vai GFP. Pēc tam dzīvniekiem tika ievadīta vienreizēja 10 mg / kg kokaīna injekcija. Dzīvniekiem, kas pārmērīgi izpaužas ΔFosB / GFP, novēroja pastiprinātu lokomotorisko atbildes reakciju, salīdzinot ar dzīvniekiem, kas ekspressēja tikai GFP (4A). 24 hr pēc vienreizējas kokaīna injekcijas, GFP pozitīvs NAc audums tika izgriezts no šiem dzīvniekiem, sadalot tos fluorescējošā gaismas avotā. Šā auda Western blotēšana (4B un C attēls) atklāja spēcīgu ΔFosB pārmērīgu ekspresiju, kā arī ievērojamu kopējo CaMKIIα proteīna pieaugumu, salīdzinot ar GFP dzīvniekiem (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), līdzīgi indukcijai, ko novēroja ar hronisku kokaīna lietošanu. Turklāt CaMKIIα autofosforilācija pie Thr286 (norādot uz fermentu aktivāciju) tika palielināta ar ΔFosB pārmērīgu ekspresiju (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), kā arī CaMKII substrāta, GluA831 Ser1 fosforilācija (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), atkal imitējot hroniska kokaīna iedarbību (1C un D attēls). TKopā šie dati sniedz papildu pierādījumus tam, ka ΔFosB ekspresija NAc apvalkā ir pietiekama lokomotoriskai sensibilizācijai pret kokaīnu un CaMKII indukcijai un aktivācijai šajā apakšreģionā.

Mēs izmantojām līdzīgu pieeju, lai noteiktu, vai ΔFosB ir nepieciešama arī kokaīna izraisītā CaMKIIα indukcijai NAc apvalkā. AAV tika izmantots, lai pārspīlētu saīsinātu JunD proteīnu, ko sauc par ΔJunD, kas ir negatīvs ΔFosB transkripcijas aktivācijas regulators (Winstanley et al., 2007), kā arī tikai GFP vai GFP. Divas nedēļas vēlāk, kad transgēna ekspresija ir maksimāla, dzīvniekiem 10 dienas tika dota kokaīna (7 mg / kg) vai sālsūdens sāls, un tika pārbaudīta lokomotoriskā reakcija uz kokaīna iedarbību (5 mg / kg) pēc pēdējās hroniskās injekcijas (4D). ΔJunD pārmērīga ekspresija novērsa lokomotorisko sensibilizāciju pret kokaīnu, kā arī novērsa CaMKIIα indukciju un aktivāciju NAc apvalkā (4E un F; p = 0.0437; F = 2.997; kopā df = 38), norādot, ka αFosB transkripcijas aktivitāte ir nepieciešama kokaīna mediētas CaMKIIα indukcijas šajā apakšreģionā. Interesanti, ka mēs atklājām, ka ΔJunD samazināja AFosB līmeni gan ar sāls, gan ar kokaīnu ārstētiem apstākļiem (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), paaugstinot jauno iespēju, ka ΔFosB ir atkarīgs no AP-1 aktivitātes savām ekspresijas pakāpēm.

CaMKII fosforilāti ΔFosB pie Ser27

Izmantojot in vitro proteīna kināzes analīzes, mēs noteicām, ka attīrītais ΔFosB ir spēcīgs substrāts CaMKIIα. Viņa inkubācija₆-AFosB ar CaMKIIα un ATP izraisīja augšupejošu ΔFosB elektroforētiskās mobilitātes maiņu (5A); vairākas radušās joslas ieteica vairākas fosforilācijas vietas. Līdzīgi in vitro kināzes testi, izmantojot [γ-³²P] ATP parādīja radioaktīvi iezīmēta fosfāta iekļaušanu nobīdītajās ΔFosB joslās (5B), kas parāda proteīna tiešu fosforilāciju. Mēs izveidojām fosfo-specifisku antivielu pret iepriekš aprakstīto ΔFosB Ser27 (Ulery et al., 2006). Lai gan šī antiviela nerada signālu pret smadzeņu ekstraktiem, kas satur Ser27 fosforilētu ΔFosB (dati nav parādīti), mēs varējām noteikt Ser27 fosforilāciju in vitro kināzes tests, izmantojot CaMKII (5B). ΔFosB CaMKII fosforilācijas kinētiskās analīzes liecina, ka tas ir spēcīgs kināzes substrāts (5C), ar redzamu K_M 5.7 ± 2.0µM un K_CAT no 2.3 ± 0.3min^-1. Šie rezultāti ir salīdzināmi ar daudziem labi raksturotiem in vivo CaMKII substrāti (Colbran un Brown, 2004). Turklāt mēs noteicām, ka CaMKII fosforilē ΔFosB ar 2.27 ± 0.07 mol / mol stehiometriju (5D), norādot, ka ir vismaz trīs CaMKII fosforilācijas vietas₆-AFosB proteīns, vienojoties ar 5A.

Lai izpētītu atsevišķas fosforilācijas vietas, mēs izmantojām MS analīzes no mūsu paraugiem in vitro kināzes testi. 5E demonstrē ΔFosB fosforilāciju iepriekš raksturotajā Ser27 un vairākās papildu vietās (dati nav parādīti). Ņemot vērā iepriekšējo Ser27 funkcionālo raksturojumu, mēs koncentrējāmies uz šo vietni, radot marķētus sintētiskus peptīdus, kas atdarina Ser27 fosfo- un nefosfozes stāvokli, pēc tam izmantoja zināmus šo peptīdu daudzumus kā standartus ΔFosB MRM analīzēs pirms un pēc in vitro fosforilēšana ar CaMKII. Turpmākā kvantitācija (5F) apstiprina, ka Ser27 ir spēcīgs CaMKII substrāts. Šie rezultāti liecina, ka starp vairākiem fosforilētiem atlikumiem ΔFosB, Ser27 ir īpaši efektīvs substrāts CaMKII.

CaMKII mediē Kokaīnu ΔFosB uzkrāšanos NAc Shell

Tā kā CaMKII var fosforilēt ΔFosB in vitro vietā, kas ievērojami uzlabo tās stabilitāti in vitro un in vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009), mēs noteicām, vai CaMKII aktivitāte kontrolē ΔFosB līmeņus NAc in vivo. Lai risinātu šo jautājumu, mēs vispirms izmantojām peles līniju, kas pārmērīgi izpaužas CaMKIIα (T286D) kalcija neatkarīgu mutantu vairākos smadzeņu reģionos, ieskaitot NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Ar 20 mg / kg kokaīna vai fizioloģiskā šķīduma vienreiz dienā 14 dienām ievadījām vecuma grupām atbilstošus pieaugušos vīriešu mutantu un savvaļas tipa pakaišus, pēc tam vienu dienu pēc pēdējās injekcijas analizēja dzīvniekus. Mēs noskaidrojām, ka ΔFosB bazālie līmeņi tika palielināti mutācijas dzīvniekiem NAc apvalkā (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), bet ne kodols (5G un H attēls). Pārsteidzoši, ka kokaīna atkarīgā ΔFosB indukcija tika bloķēta mutējošos dzīvniekos gan čaulā, gan kodolā, liekot domāt, ka, lai gan CaMKII var tieši regulēt ΔFosB stabilitāti NAc apvalkā, tas var arī atrasties augšdaļā ΔFosB abos NAc apakšreģionos kokaīna aktivētos ceļos. .

CaMKII aktivitāte ir nepieciešama ΔFosB-mediētās strukturālās un uzvedības plastiskuma gadījumā

Dendritisko muguriņu kokaīna indukcija uz NAc MSN ir viens no labākajiem konstatētajiem zāļu izraisītajiem pielāgojumiem šajā smadzeņu reģionā, un šāda mugurkaula indukcija ir korelēta ar sensibilizētām reakcijām uz narkotikām (Robinsons un Kolb, 2004; Russo et al., 2010) un ziņots, ka tie ir selektīvi D1 tipa MSNs (Lee et al., 2006). Nesen mēs pierādījām, ka dendrītu muguriņu kokaīna indukcija NAc ir atkarīga no ΔFosB un tās pakārtotās transkripcijas programmas (Maze et al., 2010). Lai gan ir plaša literatūra par CaMKII iesaistīšanos dendrīta mugurkaula morfoloģijā un indukcijā citos smadzeņu reģionos un eksperimentālajās sistēmās (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), tā loma NAc MSN mugurkaula veidošanā nav pētīta. Tāpēc mēs noteicām, vai CaMKII aktivitāte ir nepieciešama, lai panāktu MSN dendritisko muguriņu AFosB-mediētu indukciju, izmantojot HSV-mediētu CaMKII inhibitora peptīda AC3I pārmērīgu ekspresiju, kas ir kondensēta ar GFP, konstruktu, kas iepriekš pierādīja, ka inhibē CaMKII aktivitāti in vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). ΔFosB vīrusu pārmērīga ekspresija pieaugušo peļu NAc apvalkā izraisīja ievērojamu MSN dendrīta mugurkaula blīvuma palielināšanos (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; 6A un B attēls), kā norādīts iepriekš (Maze et al., 2010), un šo pieaugumu galvenokārt noteica plānas (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) un stubby (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) mugurkaula veidi (abi domājami par nenobriedušiem mugurkauliem).6C – E attēls). Netika novērota ietekme uz nobriedušākiem, sēņu formas mugurkauliem. Tomēr, kad GFP-AC3I tika izpausts kopā, ΔFosB spoļu indukcija tika pilnībā atcelta (6A – E attēls), kas norāda, ka CaMKII aktivitāte nepieciešama dendritisko muguriņu ΔFosB indukcijai NAc apvalkā.

Pēc tam mēs izmantojām vienus un tos pašus vīrusu rīkus, lai noteiktu, vai CaMKII aktivitāte ir nepieciešama ΔFosB ietekmei uz uzvedību attiecībā uz kokaīnu. 72 hr pēc vīrusu injekcijas NAc apvalkā, dzīvniekiem tika ievadīta vienreizēja 5 mg / kg kokaīna injekcija un reģistrēta to lokomotoriskā aktivitāte. Kā parādīts iepriekš, ar plašāku AAV pārmērīgu ΔFosB ekspresiju (4A), HSV-mediētā ΔFosB pārmērīga ekspresija palielināja lokomotorisko jutību pret kokaīnu (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; 6F). Tāpat kā ar dendrītu muguriņu indukciju, CaMKII aktivitātes inhibīcija, ko veicina GFP-AC3I ekspresija, pilnībā bloķēja AFosB-mediēto kokaīna jutības pieaugumu, norādot, ka CaMKII aktivitāte nepieciešama, lai ΔFosB izraisītas izmaiņas kokaīna uzvedības iedarbībā.

Iet uz:

diskusija

Šajā pētījumā ir aprakstīts jauns mehānisms, kurā kokaīns izraisa ΔFosB NAc, kas palielina CaMKIIα gēna transkripciju selektīvi NAc apvalkā. Pēc tam CaMKIIα fosforilē un stabilizē ΔFosB, kas izraisa lielāku ΔFosB uzkrāšanos un turpmāku CaMKIIα indukciju (6G). Pēc tam abu olbaltumvielu līdzsvara palielināšanās hroniskā kokaīna iedarbības laikā būtiski veicina uzvedības reakcijas uz narkotikām. Tā ir īpaši pievilcīga hipotēze, jo gan AFosB, gan CaMKII katrs ir pierādīts, ka tām ir nepieciešama pastiprināta uzvedība pret kokaīnu. (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), un mēs atkārtojam šo konstatējumu attiecībā uz ΔFosB NAc korpusā, īpaši izmantojot vīrusu pieeju (4 un Un66).

Lai gan transgēnā ΔFosB pārmērīga ekspresija D1 tipa MSNs var vadīt CaMKII indukciju gan NAc korpusā, gan kokaīna neārstēto dzīvnieku kodolā, kokaīna kontekstā endogēno AFosB uzkrāšanās, kas notiek abos apakšreģionos, izraisa CaMKII indukciju tieši NAc apvalkā . Šī atšķirība varētu attiekties uz augstākiem AFosB līmeņiem, kas inducēti mūsu bitransgēnajā modelī, tomēr tas varētu arī atspoguļot kokaīna spēju diferencēti mainīt CaMKIIα promotoru čaulā. vs galvenie MSN, lai vai nu veicinātu ΔFosB saistīšanos pirmajā, vai izslēgtu to pēdējā apakšreģionā. Faktiski, mūsu ChIP dati, kas atklāj kokaīna izraisītu dezacetilāciju histoniem CaMKIIα gēna promotorā tikai NAc kodolā, atbalsta iespējamo hromatīna mehānisma iesaistīšanos. Saskaņā ar šo hipotēzi ΔFosB pārmērīga ekspresija D1 tipa MSNs varēja vadīt CaMKIIα indukciju NAc kodolā bez kokaīna (3F), kas liecina, ka pastāv aktīva CaMKIIα promotora modifikācija, kas novērš šo indukciju hroniskas kokaīna iedarbības laikā. Kromatīna ainavas regulēšana CaMKII promotorā var arī izskaidrot, kāpēc CaMKII izraisa ar kokaīnu saistītā deva NAc apvalkā hroniskām kokainu izņemošām žurkām (1E), bet ne no iepriekš neārstētiem \ t1D). Tas varētu nozīmēt ΔFosB epigenetisko „gēnu primēšanas” efektu (Robison un Nestler, 2011), un tādējādi tas varētu būt viens no kokaīna iejaukšanās molekulārajiem mehānismiem (\ tPickens et al., 2011). Tomēr, lai šī hromatīna maiņa būtu cēloniski saistīta ar alkas inkubāciju, tai laika gaitā būtu jāpalielinās. Būs interesanti noteikt, vai tas tā ir, un izpētīt, vai citiem gēniem ir atkarīgs no kokaīna atkarīgs ΔFosB atkarīgs subregiona regulējums. Svarīgi arī atzīmēt, ka mūsu aprakstītā plūsmas kontūra neizraisa bezgalīgu CaMKII vai ΔFosB uzkrāšanos (1E); Atklājot molekulāro “bremzi”, kas ir atbildīgs par to, ir svarīgs turpmāko pētījumu mērķis.

Zināmās ΔFosB un CaMKII funkcijas vairākās eksperimentālajās sistēmās un smadzeņu reģionos saplūst daudzos līmeņos (6F). Abas molekulas ir cieši saistītas ar dendrīta mugurkaula augšanu: CaMKII mijiedarbojas ar aktīncituletu (Okamoto et al., 2009), regulē mugurkaula galvas izmēru (Matsuzaki et al., 2004), un tas ir gan nepieciešams, gan pietiekams, lai palielinātu filopodiju un sinapses skaita palielināšanos hippokampālā organotipiskajās šķēlītēs.Jourdain et al., 2003), wHile ΔFosB ir gan nepieciešams, gan pietiekams, lai kokaīna izraisītu dendrītu mugurkaula veidošanos NAc MSNs (Maze et al., 2010). Turklāt abas molekulas ir saistītas ar AMPA glutamāta receptoru regulēšanu. CaMKII nereglamentē AMPA receptoru apakšvienību kopējo līmeni, bet AMPA receptoru ievietošanu sinaptos un palielina AMPA kanāla vadītspēju, fosforilējot GluA1 Ser831 hippokampālā piramīdas neironos kultūrā un in vivo (pārskatīts (Malinow un Malenka, 2002; Colbran un Brown, 2004)). Šāda pastiprināta GluA1 tirdzniecība ar sinapsiju ir saistīta arī ar hronisku kokaīna iedarbību (Boudreau un vilks, 2005). Bez tam uzvedības reakcijas uz AMPA receptoru aktivāciju NAc pastiprina CaMKIIα pārmērīga ekspresija D1 dopamīna receptoru atkarīgā veidā (Singer et al., 2010). Ir pierādīts, ka ilgstoša DFNUMX specifiskā ΔFosB pārmērīga ekspresija inducē GluA1 transkripciju NAc (Kelz et al., 1999), kas mazina GPAA1 starpniecību izraisītās AMPA atbildes, kamēr mēs parādām, ka īsāka termiņa ΔFosB pārmērīga ekspresija - kā arī īsāka termiņa kokaīna iedarbība - neietekmē šo apakšvienību (Fig 1). Neskatoties uz to, nesen mēs esam atklājuši, ka īstermiņa ΔFosB pārmērīga ekspresija tomēr samazina AMPA atbildes D1 tipa MSNs NAc (Grueter et al., 2013). Šie dati liek domāt par laiku atšķirīgiem mehānismiem, kas varētu būt laika atkarīgs no kokaīna neuroadaptāciju sērijas, kas ir pamatā dažādiem atkarības progresa aspektiem, kas vēl nav labi saprotami. Uzvedības līmenī gan CaMKII, gan ΔFosB ir nepieciešami lokomotoriskai sensibilizācijai pret kokaīnu (skatīt iepriekš), un abi ir nepieciešami ilgstošai kokaīna lietošanai grauzējiem (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), kas liecina, ka abi proteīni ir svarīgi gan īstermiņa, gan ilgtermiņa uzvedības pielāgošanai narkotiku iedarbībai, kaut arī ar daļēji atšķirīgiem mehānismiem. Iespējams, ΔFosB un CaMKII regulē šādas sarežģītas uzvedības adaptācijas, veicot izmaiņas NAc sinaptiskajā funkcijā, lai gan ir vajadzīgs daudz tālāks darbs, lai tieši sasaistītu sinaptiskās parādības ar uzvedības izmaiņām.

CaMKII holoenzīms vienlaikus mijiedarbojas ar dažādām ar sinapsi saistītām olbaltumvielām (Robison et al., 2005), kas, domājams, regulē tās mērķauditoriju pēc postsinaptiskā blīvuma (PSD), parādība, kas tiek uzskatīta par svarīgu sinaptiskai plastiskumam. Konkrētāk, nesen tika pierādīts, ka CaMKII mijiedarbība ar NMDA tipa glutamāta receptora GluN2B apakšvienību regulē gan sinaptisko plastiskumu, gan mācīšanos (Halt et al., 2012). Kaut arī AC3I peptīds atdarina CaMKII autoinhibitīvo domēnu un tādējādi inhibē enzīmu katalītisko aktivitāti, tas arī bloķē vairākas proteīnu un olbaltumvielu mijiedarbības (Strack et al., 2000; Robison et al., 2005). Tādējādi šeit aprakstītās HSV-GFP-AC3I uzvedības un morfoloģiskās sekas var rasties, samazinot CaMKII mērķa proteīnu fosforilāciju, izmaiņas CaMKII mērķauditorijas atlasē vai CaMKII ierosinātās strukturālās lomas izmaiņas sinapsēs (Lisman et al., 2002).

Ierosinātās ΔFosB-CaMKII cilpas ierobežošana ar NAc apvalku ir īpaši atzīmējama, jo nesenais darbs ir parādījis vairākas fizioloģiskas atšķirības starp NAc apvalku un kodolu, reaģējot uz kokaīna lietošanu, ko apstiprina mūsu objektīvie iTRAQ (tabula S1) dati . MSN, kas atrodas NAc apvalkā, liecina par aizdegšanās spējas samazināšanos pēc hroniskas kokaīna, kas saglabājas nedēļu garumā, savukārt galvenie MSN no tiem pašiem dzīvniekiem uzrāda pārejošu (1 – 3 dienu) palielināšanos šaušanas kapacitātē, kas atgriežas pie pamata līmeņa 2 nedēļās (Kourriha un Toms, 2009). Turklāt daudzas sinaptiskās olbaltumvielas ir atšķirīgi regulētas NAc apvalkā vs dzīvniekiem, kas pakļauti hroniskam kokaīnam, ieskaitot GluA2 (\ tKnackstedt et al., 2010). Tā kā hronisks amfetamīns inducē CaMKIIα īpaši NAc apvalkā (Loweth et al., 2010), nav pārsteidzoši, ka līdzīga ietekme ir ar kokaīnu. Tomēr, tā kā ΔFosB izraisa gan NAc apvalks, gan kodols ar hronisku kokaīnu (Perrotti et al., 2008) un tā kā mēs parādām, ka CaMKIIα indukcija čaulā ir atkarīga no FosB, mūsu rezultāti sniedz jaunus pierādījumus par atšķirīgiem transkripcijas mehānismiem CaMKIIα promotorā starp šiem diviem apakšreģioniem, kas ir atbildīgi par selektīvu CaMKIIα indukciju čaumalā.

Liela daļa neseno darbu ir vērsti uz atšķirībām starp D1 un D2 tipa NAc MSN. Lai gan gan D1, gan D2 receptoriem ir liela nozīme kokaīna ieguvē (Self, 2010), nesenais darbs parāda, ka D1 tipa MSN optogenētiskā aktivizēšana palielina uzvedību uz kokaīnu, bet D2 tipa MSN aktivācijai ir pretējs efekts (Lobo et al., 2010). Atbilstoši šiem konstatējumiem, D1-receptoru knockout pelēm trūkst kokaīna pašpārvaldes (Caine et al., 2007), bet D2 izspiešanas nav (Caine et al., 2002). D1 agonistu ievadīšana tieši NAc izraisa kokaīna meklēšanu uzvedības atjaunošanas paradigmās (Self, 2010). Interesanti, ka šis efekts prasa no D1 receptoriem atkarīgu CaMKII aktivitātes pieaugumu NAc apvalkā, bet ne kodolu (Anderson et al., 2008) rezultāts, kas labi saskan ar šeit piedāvāto D1 un čaulas specifisko ΔFosB-CaMKII cilpu.

Mēs iepriekš ziņojām, ka Ser27 ΔFosB var fosforilēt ar kazeīna kināzi-2 (Ulery et al., 2006Tomēr mēs šeit konstatējam, ka CaMKII fosforilē ΔFosB šajā un citās vietās ar daudz lielāku kinētiku un stehiometriju un var atkārtot augstāko redzamo M_r novērota ΔFosB (5A) ar kokaīna iedarbību in vivo (Nestler, 2008). Mēs jau zinām, ka Ser27 fosforilācija palielina ΔFosB stabilitāti un transkripcijas aktivitāti (Ulery et al., 2006; Ulery un Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). Nākotnes darbs tagad būs vērsts uz jaunu pētāmo AFosB fosforilācijas vietu identificēšanu un funkcionālajām sekām.

Šeit aprakstītā barības avota cilpa sniedz ticamu jaunu mehānismu, ar kura palīdzību atkārtota kokaīna lietošana izraisa progresējošas novirzes NAc. Kā tāds, šis bioķīmiskais ceļš var būt nozīmīgs mērķis turpmākai terapeitiskai iejaukšanai atkarību izraisošos traucējumos. Tā kā CaMKII ir visuresoša un nepieciešama daudzām pamata neironu un uzvedības funkcijām, CaMKII inhibitoru tieša lietošana ir novērsta kā atkarības ārstēšana. Mūsu dati liecina, ka sīkāka CaMKII indukcijas mehānisma mērķēšana, kas ir raksturīga atsevišķam šūnu tipam un smadzeņu atalgojuma shēmas apakšreģionam, varētu nodrošināt terapeitisku mērķi, kas novērstu sistēmiskas CaMKII inhibīcijas komplikācijas.

Iet uz:

Pateicības

Šo darbu atbalstīja Zāļu ļaunprātīgas izmantošanas valsts institūta (EJN), NIDA-Yale Proteomics centra DA018343 (AJR un EJN) un Hartwell Foundation (AJR) dotācijas. Autori vēlas pateikties Gabby Rundenko par dāsnu attīrītas ΔFosB un Roger Colbran dāvanu par attīrītās CaMKIIα dāsno dāvanu.

Iet uz:

Atsauces

1. Ahmed SH, Koob GF. Pāreja no mērenas līdz pārmērīgai narkotiku lietošanai: izmaiņas hedoniskajā punktā. Zinātne. 1998: 282: 298 – 300. [PubMed]
2. Anderson SM, Famous KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: bioķīmisks tilts, kas savieno accumbens dopamīna un glutamāta sistēmas kokaīna meklēšanā. Nat Neurosci. 2008: 11: 344 – 353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Uzvedības jutīgums pret kokaīnu ir saistīts ar paaugstinātu AMPA receptoru virsmas ekspresiju kodolkrāsās. J Neurosci. 2005: 25: 9144 – 9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Ca2 + / kalmodulīna atkarīgā proteīnkināzes II alfa apakšvienības ekspresija un raksturojums, izmantojot bakulovira ekspresijas sistēmu. Biochem Biophys Res Commun. 1990: 173: 578 – 584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Dopamīna D2 līdzīgo receptoru loma kokaīna pašpārvaldē: pētījumi ar D2 receptoru mutantu pelēm un jauniem D2 receptoriem antagonistiem. J Neurosci. 2002: 22: 2977 – 2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Nepietiekama kokaīna lietošana dopamīna D1 receptoru knock-out pelēm. J Neurosci. 2007: 27: 13140 – 13150. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. FosB destabilizācijas proteasomu atkarīgie un neatkarīgie mehānismi: FosB degronu domēnu identifikācija un ietekme uz DeltaFosB stabilitāti. Eur J Neurosci. 2007: 25: 3009 – 3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgeniski dzīvnieki ar inducējamu, mērķtiecīgu gēnu ekspresiju smadzenēs. Mol Pharmacol. 1998: 54: 495 – 503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kināze regulē sociālās sakāves stresa izraisīto sinaptisko un uzvedības plastiskumu. J Neurosci. 2011: 31: 314 – 321. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
10. Colbran RJ. Ca2 + / kalmodulīna atkarīgā proteīnkināzes II inaktivācija ar bazālo autofosforilāciju. J Biol Chem. 1993: 268: 7163 – 7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Proteīna fosfatāzes un kalcija / kalmodulīna atkarīgais proteīnkināzes II atkarīgais sinaptiskais plastiskums. J Neurosci. 2004: 24: 8404 – 8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Kalcija / kalmodulīna atkarīgais proteīnkināzes II un sinaptiskais plastiskums. Curr Opin Neurobiol. 2004: 14: 318 – 327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. DeltaFosB pārmērīga ekspresija uz striatālu šūnu tipa specifiku palielina kokaīna stimulēšanu. J Neurosci. 2003: 23: 2488 – 2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Histonu dezacetilāzes inhibitoru antidepresanti. J Neurosci. 2009: 29: 11451 – 11460. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhans B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Caveolin-1 regulēto proteīnu kvantitatīvā proteomika: polimerāzes i un transkripta atbrīvošanas faktora / CAVIN-1 IN raksturojums endotēlija šūnās. Mol Cell Proteomics. 2010: 9: 2109 – 2124. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Riska faktori pašnāvību pabeigšanai smagās depresijas gadījumā: gadījuma kontroles pētījums par impulsīvu un agresīvu uzvedību vīriešiem. Es esmu psihiatrija. 2005: 162: 2116 – 2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB diferencēti modulē tiešo un netiešo kodola funkciju. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 presē. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. CaMKII saistīšanās ar GluN2B ir būtiska atmiņas konsolidācijas laikā. EMBO J. 2012, 31: 1203 – 1216. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB mutantu peles: ar Fos saistītu olbaltumvielu hroniskas kokaīna indukcijas zudums un paaugstināta jutība pret kokaīna psihomotoru un atalgojošo iedarbību. Proc Natl Acad Sci, US A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Atšķirīga kontrole no kokaīna meklējošās uzvedības kodola un čaumalas. Nat Neurosci. 2004: 7: 389 – 397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerization un DNS saistošas ​​īpašības transkripcijas faktors DeltaFosB. Bioķīmija. 2007: 46: 8360 – 8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalcija / kalmodulīna atkarīgais proteīnkināze II veicina no aktivitātēm atkarīgu filopodiju augšanu un mugurkaula veidošanos. J Neurosci. 2003: 23: 10645 – 10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Transkripcijas faktora deltaFosB ekspresija smadzenēs kontrolē jutību pret kokaīnu. Daba. 1999: 401: 272 – 276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. CaMKII ģenētiskā inhibīcija mugurkaula vidējas smadzeņu neironos Samazina funkcionālās eksitējošās sinapses un uzlabo iekšējo uzbudināmību. PLoS One. 2012: 7: e45323. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Pēc kokaīna pašpārvaldes izzušanas apmācība izraisa glutamatergisko plastiskumu, lai kavētu kokaīna meklēšanu. J Neurosci. 2010: 30: 7984 – 7992. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Līdzīgi neironi, pretēji pielāgojumi: psihostimulanta pieredze atšķiras no degšanas īpašību izmaiņām akumbensu kodolā pret apvalku. J Neurosci. 2009: 29: 12275 – 12283. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-Neatkarīga Striatāla alphaCaMKII ietekme Sekmē kokaīna jutīguma paaugstināšanu. J Neurosci. 2012: 32: 6578 – 6586. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Kodupas faktora kappaB loma olnīcu hormonu izraisītā stresa paaugstināta jutībā sievietēm pelēm. Biol Psihiatrija. 2009: 65: 874 – 880. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmins K, Nairna AC, Greengards P. Kokaīna izraisīta dendrīta mugurkaula veidošanās D1 un D2 dopamīna receptoru saturošos vidējos smadzeņu neironus kodolkrūmos. Proc Natl Acad Sci US A. 2006, 103: 3399 – 3404. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. CaMKII funkcijas molekulārā bāze sinaptiskā un uzvedības atmiņā. Nat Rev Neurosci. 2002: 3: 175 – 190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. BDNF signalizācijas šūnu tipa specifiskais zudums imitē kokaīna atalgojuma optogenētisko kontroli. Zinātne. 2010: 330: 385 – 390. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. CaMKII inhibīcija kodolkrāsas apvalkā samazina pastiprinātu amfetamīna devu jutīgajās žurkās. Neurosci Lett. 2008: 444: 157 – 160. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Aleksandrs JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Pagaidu alfa-Ca2 + / kalmodulīna atkarīgā proteīnkināzes II pārmērīga ekspresija kodolā uzlabo uzvedību, reaģējot uz amfetamīnu. J Neurosci. 2010: 30: 939 – 949. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. AMPA receptoru tirdzniecība un sinaptiskā plastiskums. Annu Rev Neurosci. 2002: 25: 103 – 126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Viena dendritiskā mugurkaula ilgtermiņa potencēšanas strukturālais pamats. Daba. 2004: 429: 761 – 766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Atmiņas veidošanās kontrole, izmantojot regulētu CaMKII transgēna ekspresiju. Zinātne. 1996: 274: 1678 – 1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Histona metiltransferāzes G9a būtiska loma kokaīna izraisītā plastiskumā. Zinātne. 2010: 327: 213 – 216. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Gēnu ekspresijas un kokaīna atlīdzības regulēšana ar CREB un DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003: 6: 1208 – 1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Pārskatīšana. Atkarības transkripcijas mehānismi: DeltaFosB loma. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008: 363: 3245 – 3255. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakoloģiskie pētījumi par hroniska FOS saistītā antigēna indukcijas ar kokainu regulēšanu striatumā un kodolskaldnē. J Pharmacol Exp Ther. 1995: 275: 1671 – 1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. CaMKII un F-aktīna loma dendritisko muguriņu strukturālajā plastiskumā: iespējamā molekulārā identitāte sinaptiskā tagā? Fizioloģija (Bethesda) 2009, 24: 357 – 366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB kodolā accumbens regulē pastiprinātu instrumentālo uzvedību un motivāciju. J Neurosci. 2006: 26: 9196 – 9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Žurku smadzenes stereotaksiskās koordinātās. 6th Edition. Amsterdama; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, krājumi JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducible, smadzeņu specifiskā c-Jun dominējošā negatīvā mutanta ekspresija transgēnās pelēs samazina jutību pret kokaīnu. Brain Res. 2003: 970: 73 – 86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Convergent CaMK un RacGEF signalizē dendrītu struktūru un funkciju. Trends Cell Biol. 2008: 18: 405 – 413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. DeltaFosB indukcija ar smadzenēm saistītajās smadzeņu struktūrās pēc hroniska stresa. J Neurosci. 2004: 24: 10594 – 10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB indukcijas smadzenēs atšķiras no ļaunprātīgas narkotikas. Sinapse. 2008: 62: 358 – 369. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Narkotiku par narkotiku tieksmes inkubāciju. Tendences Neurosci. 2011: 34: 411 – 420. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Kalcija izraisītie otrā kurjeri modulē uzvedību uz kokaīnu. J Pharmacol Exp Ther. 1998: 286: 1171 – 1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Cilvēka smadzeņu receptoru autoradiogrāfija, izmantojot visas puslodes sekcijas: vispārēja metode, kas samazina audu artefaktus. Sinapse. 1987: 1: 446 – 454. [PubMed]
51. Robinsons TE, Kolb B. Strukturālā plastiskums, kas saistīts ar ļaunprātīgas lietošanas narkotikām. Neirofarmakoloģija. 2004; 47 (Suppl 1): 33 – 46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Atkarības transkripcijas un epigenetiskie mehānismi. Nat Rev Neurosci. 2011: 12: 623 – 637. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Kalcija / kalmodulīna atkarīgā proteīnkināzes II daudzvērtīga mijiedarbība ar postsinaptiskā blīvuma proteīniem NR2B, densin-180 un alfa-aktinīn-2. J Biol Chem. 2005: 280: 35329 – 35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Multipleksēta proteīnu kvantitatīva noteikšana Saccharomyces cerevisiae, izmantojot amīnu reaktīvus izobariskos marķēšanas reaģentus. Mol Cell Proteomics. 2004: 3: 1154 – 1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Atkarīgā sinapse: sinaptiskā un strukturālā plastiskuma mehānismi kodolkrāsās. Tendences Neurosci. 2010: 33: 267 – 276. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
56. Self DW. In: Dopamīna receptori. Neve KA, redaktors. Ņujorka: Humana Press; 2010. lpp. 479 – 524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Pagaidu alfa-kalcija / kalmodulīna atkarīgā proteīnkināzes pārmērīga ekspresija ar kodoliem accumbens apvalkā noved pie ilgstošas ​​alfa-amino-3-hidroksil-5 funkcionālās augšupejas -metil-4-izoksazola-propionāta receptori: dopamīna tipa-1 receptoru un proteīna kināzes A atkarība. Eur J Neurosci. 2010: 31: 1243 – 1251. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Kalcija / kalmodulīna atkarīgā proteīnkināzes II mehānisma un regulēšanas mehānisms ar N-metil-D-aspartāta receptoru NR2B apakšvienību. J Biol Chem. 2000: 275: 23798 – 23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. DeltaFosB fosforilācija nodrošina tā stabilitāti in vivo. Neirozinātne. 2009: 158: 369 – 372. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. DeltaFosB transkripcijas aktivitātes regulēšana ar Ser27 fosforilāciju. Eur J Neurosci. 2007: 25: 224 – 230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. DeltaFosB stabilitātes regulēšana ar fosforilēšanu. J Neurosci. 2006: 26: 5131 – 5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB smadzeņu atlīdzības shēmās nodrošina izturību pret stresu un antidepresantu reakcijām. Nat Neurosci. 2010: 13: 745 – 752. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Hroniska kokaīna izraisīta H3 acetilēšana un CaMKIIalpha transkripcijas aktivācija kodolā accumbens ir būtiska, lai stimulētu zāļu pastiprināšanu. Neiropsihofarmakoloģija. 2010: 35: 913 – 928. [PMC bezmaksas raksts] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB regulē riteņu darbību. J Neurosci. 2002: 22: 8133 – 8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB indukcija orbitofrontālajā garozā mediē toleranci pret kokaīna izraisītu kognitīvo disfunkciju. J Neurosci. 2007: 27: 10497 – 10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. DeltaFosB būtiska loma morfīna iedarbības kodolā. Nat Neurosci. 2006: 9: 205 – 211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Price EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Kalmodulīna kināzes II inhibīcija pasargā no sirds slimībām. Nat Med. 2005: 11: 409 – 417. [PubMed]