PSMC5, 19S proteasomu ATPāze, regulē kokainu darbību kodolkrustā (2015)

PLoS Viens. 2015 May 1110 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Anotācija

ΔFosB ir stabils transkripcijas faktors, kas uzkrājas accumbens kodolā (NAc), kas ir galvenā smadzeņu atalgojuma shēmas sastāvdaļa, reaģējot uz hronisku kokaīna vai citu ļaunprātīgu narkotiku iedarbību. Kaut arī ir zināms, ka ΔFosB heterodimerizējas ar Juna ģimenes locekli, veidojot aktīvu transkripcijas faktoru kompleksu, līdz šim nav atklāti pētīti citi iespējamie ΔFosB saistošie partneri smadzenēs. Šeit, izmantojot rauga divu hibrīdu testus, mēs identificējam PSMC5, kas pazīstams arī kā SUG1, ATPāzi saturoša 19S proteasomu kompleksa apakšvienība, kā jaunu proteīnu, kas mijiedarbojas ar ΔFosB. Mēs pārbaudām šādu mijiedarbību starp endogēno ΔFosB un PSMC5 NAc un parādām, ka abi proteīni veido arī kompleksus ar citiem hromatīna regulējošiem proteīniem, kas saistīti ar gēnu aktivāciju. Mēs turpinām pierādīt, ka hronisks kokaīns palielina kodolenerģijas, bet ne citoplazmas līmeni, PSMC5 līmeni NAc un ka PSMC5 pārmērīga ekspresija šajā smadzeņu reģionā veicina kustību reakcijas uz kokaīnu. Kopā šie atklājumi apraksta jaunu mehānismu, kas veicina ΔFosB darbību un pirmo reizi iekļauj PSMC5 kokaīna izraisītajā molekulārajā un uzvedības plastikā.

citāts: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, 19S proteasomu ATPase, regulē Kokainu darbību Nucleus Accumbens. PLOS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Akadēmiskais redaktors: James Edgar McCutcheon, Lesteras Universitāte, APVIENOTĀ KARALISTE

Saņemts: 10 decembris, 2014; Pieņemts: Aprīlis 7, 2015; Publicēts: 11. gada 2015. maijs

Autortiesības: © 2015 Ohnishi et al. Šis ir atvērta piekļuves raksts, kas tiek izplatīts saskaņā ar. \ T Creative Commons piešķiršanas licence, kas pieļauj neierobežotu izmantošanu, izplatīšanu un reproducēšanu jebkurā vidē, ja tiek ieskaitīts oriģinālais autors un avots

Datu pieejamība: Visi attiecīgie dati atrodas dokumentā.

Finansējums: Šo darbu atbalstīja Valsts Veselības institūtu, Nacionālā narkomānijas institūta un Ishibashi fonda un Japānas Zinātnes veicināšanas sabiedrības (KAKENHI numuri: 24591735, 26290064, 25116010) dotācijas. Finansētājiem nebija nekādas nozīmes pētījuma izstrādē, datu vākšanā un analīzē, lēmumu publicēt vai sagatavot manuskriptu.

Konkurējošas intereses: Autori ir paziņojuši, ka nav konkurējošu interešu.

Ievads

ΔFosB, nojaukts produkts FosB gēns, pieder pie transkripcijas faktoru Fos ģimenes, kas ietver arī c-Fos, pilna garuma FosB, Fra-1 un Fra-2. ΔFosB, tāpat kā citas Fos olbaltumvielas, heterodimerizējas ar Jun ģimenes proteīnu - c-Jun, JunB vai JunD -, lai izveidotu aktīvu AP-1 (aktivatora proteīna-1) transkripcijas faktora kompleksu, kas inducē vai apspiež konkrētu mērķa gēnu ekspresiju. [1,2].

Ir pierādīts, ka ΔFosB spēlē galveno lomu narkomānijā [2]. Unikāli starp Fos ģimenes olbaltumvielām tas uzkrājas kodolkrāsās (NAc) un citos ar atalgojumu saistītos smadzeņu reģionos pēc atkārtotas zāļu ievadīšanas augstā stabilitātes līmeņa dēļ [3,4], ko veicina C-terminālo degronu domēnu trūkums un vairāku proteīnu kināžu fosforilēšana [5-7]. Šāda ΔFosB indukcija NAc mediē pastiprinātu uzvedības reakciju pret ļaunprātīgu narkotiku lietošanu. Līdz ar to FosB pārmērīga ekspresija šajā pieaugušo dzīvnieku smadzeņu reģionā, izmantojot vīrusu vektorus vai inducējamas bitransgēnās peles, palielina dzīvnieka jutību pret kokaīna un opiātu lokomotīvi aktivizējošo un atalgojošo iedarbību, kā arī dzīvnieka motivāciju pašregulēt kokaīns [7-11]. Un otrādi, ΔFosB dominējošo negatīvo antagonistu pārprodukcija izraisa pretējos uzvedības fenotipus [10-12].

Mēs un citi esam iepriekš apstiprinājuši, izmantojot gēla maiņas testus, ka JunD un, iespējams, citi jūnija ģimenes proteīni ir galvenie ΔFosB saistošie partneri smadzenēs in vivo [13-15]. Tomēr līdz šim nav bijis atvērts, objektīvs ΔFosB saistošo partneru novērtējums smadzenēs. Šeit mēs centāmies identificēt jaunus ΔFosB saistošos partnerus, izmantojot rauga divu hibrīdu testu [16,17]. Mūsu dati atklāja, ka PSMC5, kas pazīstams arī kā SUG1, ir spēcīgs AFosB partneris gan in vitro, gan NAc in vivo, kur tas pievienojas ΔFosB kā kokaīna izraisīta transkripcijas aktivācijas kompleksa daļa, kas satur arī CBP (CREB saistošs proteīns ) un p300 - abi histona acetiltransferāzes (HAT) - ir arī BRG1 (hromatīna remodelēšanas proteīns). Mēs turpinām pierādīt, ka hroniska kokaīna iedarbība maina PSNC5, kas satur 19S proteasomu kompleksa ATPāzes saturošo apakšvienību, kodolu līmeni NAc un ka PSMC5 savukārt kontrolē uzvedību pret kokaīnu.

Materiāls un metodes

Rauga divu hibrīdu skrīnings

MaV203 rauga šūnas (Invitrogen Life Technologies) tika pārfiksētas ar pDBLeu, kas noved pie dažādiem AFosB proteīna fragmentiem, un peles smadzeņu bibliotēka tika subklonēta pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Transformētās šūnas tika audzētas uz SC-barotnes, kurā nav leucīna, triptofāna un histidīna un kas satur 10 mM 3-aminotriazolu. Saistība starp FosB fragmentiem un kandidāta partneri izraisa trīs reportiera gēnus (His3, Ura3, un LacZ), un indukcijas rezultātā transformanti var izdzīvot izmantotajos kultivētajos apstākļos. Pozitīvie kloni tika atkārtoti pārbaudīti ar svaigiem pDBLeu-AFosB fragmentiem ar retransformācijas testiem MaV203 šūnās.

Šūnu līnijas

Peles Neuro 2A neiroblastomas šūnas (ATCC) tika uzturētas Ērgļa minimālajā būtiskajā barotnē (EMEM) (ATCC), kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu (FBS) 37 ° C un 5% CO2. Žurkas 1A šūnas bija dāvana no Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japāna) [18] un uzturētas Dulbecco MEM (DMEM) (Life Technologies), papildināts ar 10% FBS pie 37 ° C un 5% CO2. Šūnu transfekcija ar plazmidu DNS tika veikta, izmantojot Effectene (Qiagen) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

PSMC5 un ΔFosB konstrukcijas

Vairāku PSMC5 mutantu formu, katrs no FLAG marķētiem N-galā, tika radīti izmantošanai imunoprecipitācijas vai vīrusu mediētu gēnu pārneses eksperimentos. Tie ietvēra: PSMC5-K196M, PSMC5-Δcoiled-coil domēnu (PSMC5-ΔCC, bez aminoskābēm 27-68), PSMC5-NT (sastāv no proteīna N-gala fragmenta, aminoskābēm 1-151) un PSMC5 -CT (kas sastāv no proteīna C-gala fragmenta, 172 aminoskābēm) (sk. \ T Fig 1). Mēs izmantojām arī N-terminālās ΔFosB, kā arī ΔFosB formas ar mutāciju leucīna-rāvējslēdzēja domēnā (aminoskābju 182 mutācija 205, kas pazīstams kā heterodimerizācija ar Jun ģimenes olbaltumvielām [6].

sīktēls
1. ΔFosB saistās ar PSMC5 in vitro.

 

A. FosB, ΔFosB-LZM shēma, kurā leucīna rāvējslēdzēja domēns ir mutēts, lai iznīcinātu ΔFosB heterodimerizāciju ar Jun proteīniem, un Δ2AFosB, kam trūkst pirmās 78 aminoskābes ΔFosB N-galā. B. PSMC5, PSMC5-NT shēma, kurā ietilpst pirmās PSMC151, PSMC5-CT 5 aminoskābes, kurām trūkst pirmās PSMC235 aminoskābes 5, un PSMC5-ACC, kam trūkst spoles spoles domēna (aminoskābes 28 – 68) . AAA domēns atbilst motīvam, ATPāzes, kas saistītas ar dažādām šūnu aktivitātēm, kas atrodas daudzās ATPāzes. C. 2.4 μg pcDNA3.1-ΔFosB (joslas 1 – 4) vai ΔFosB-LZM (josla 5) tika pārfiksēta ar 2.4 μg FLAG iezīmētu PSMC5 vai dažādiem dzēšanas mutantiem Neuro2a šūnās. Divas dienas pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un pakļautas imunoprecipitācijai ar anti-FLAG antivielu un pēc tam Western blotēja ar anti-AFosB vai anti-FLAG antivielu. Ņemiet vērā, ka ΔFosB, bet ne ΔFosB-LZM, stingri saistās ar PSMC5 vai PSMC5-NT, bet ne PSMC5-CT vai PSMC5-ACC. Attēlā parādītie dati tika atkārtoti trīs eksemplāros katrā no trim atsevišķiem eksperimentiem.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Dzīvnieki

Visiem eksperimentiem tika izmantotas deviņas līdz 11 nedēļas vecas C57BL / 6J vīriešu peles (The Jackson Laboratory). Dzīvnieki tika izmitināti uz 12-h gaiša-tumša cikla ar piekļuvi pārtikai un ūdenim ad libitum un tika pieradināti 1 nedēļā pirms eksperimentiem. Tika izmantoti divi kokaīna lietošanas režīmi. Lai pētītu kokaīna bioķīmisko iedarbību, dzīvniekiem tika dotas 7 dienas devas kokaīna (20 mg / kg) vai sāls šķīduma, un nogalināja ar 24 h un pēc pēdējās injekcijas. Tas ir standarta protokols, kas ir pierādījis, ka rada daudzas molekulāras un šūnu reakcijas uz narkotiku [7]. Lai pētītu PSMC5 ietekmi uz kodolskābes uzvedību uz kokaīna uzvedības reakcijām, mēs izmantojām šīs zāles apakš sliekšņa devu (7.5 mg / kg; skatīt lokomotorās sensibilizāciju zemāk), pamatojoties uz hipotēzi, ka PSMC5, tāpat kā ΔFosB, palielinās dzīvnieka jutību pret kokaīns [8]. Visi izmēģinājumi ar dzīvniekiem tika apstiprināti institucionālajā dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejā Sinajas kalnā.

Imunoprecipitācija un Western blotting

Neuro 2A šūnas tika transficētas ar PSMC5 savvaļas vai mutantu formām. Divas dienas pēc transfekcijas šūnas tika nomazgātas PBS, lizētas RIPA buferšķīdumā (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% nātrija deoksikolāts, 10 mM nātrija butirāts, proteāzes inhibitora kokteilis) . Lizāti tika sadalīti un inkubēti ar neimūnu IgG (Sigma) vai anti-FLAG antivielām (Sigma) 3 hr. 4 ° C temperatūrā. Imunoprecipitācija tika veikta ar proteīna G lodēm (Invitrogen), kā aprakstīts [19]. Īsumā, imunoprecipitētie proteīni tika pakļauti SDS-PAGE un analizēti ar Western blotēšanu, izmantojot anti-FosB / ΔFosB antivielu (šūnu signalizācijas tehnoloģiju), pamatojoties uz publicētiem protokoliem [7]. In vivo olbaltumvielu saistīšanās testos mēs izmantojām attīrītas kodolfrakcijas no peles punch-dissected NAc pēc hroniskas kokaīna terapijas (20 mg / kg IP dienā 7 dienām, ar pelēm lietojot 24 hr pēc pēdējās injekcijas). Koimunoprecipitācija no kodolfrakcijām tika veikta, izmantojot Nuclear Complex Co-IP komplektu (Active Motif), ievērojot ražotāja norādījumus. Tika izmantotas šādas antivielas: MYC vai ß-aktīns, šūnu signalizācijas tehnoloģija (Danvers, MA), PSMC5 un histons H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 un BRG1, Santa Cruz biotehnoloģija (Santa Cruz, CA) un FLAG M2, Sigma.

Imūnhistoķīmija

Imūnhistoķīmija tika veikta saskaņā ar publicētajām procedūrām [20]. Pelēm tika anestezēts un perfuzēts intrakardiāli ar 4% paraformaldehīdu PBS. Smadzenes tika aizsargātas ar 30% saharozi, pēc tam sasaldētas un uzglabātas -80 ° C temperatūrā līdz lietošanai. Koronālās sekcijas (40 μm) tika sagrieztas uz kriostāta un apstrādātas imūnhistoķīmijai. Brīvi peldošas sekcijas iepriekš tika inkubētas bloķējošā buferšķīdumā, kas satur 0.3% Triton un 3% normālu ēzeļu serumu. ΔFosB tika konstatēts, izmantojot kazu poliklonālo antivielu, kas tika iegūta pret proteīna N-gala daļu (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 tika konstatēts, izmantojot trušu poliklonālo antivielu (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Attēli tika uzņemti ar konfokālo mikroskopu (60x palielinājums; Zeiss).

Lokomotīvju sensibilizācija

Visas peles saņēma ikdienas IP šķīdumu sāls šķīdumam 3 dienām, lai tās pieradinātu pie injekciju stresa. Nākamajā dienā pelēm tika ievadīts IP ar sāls šķīdumu vai kokaīna apakšsliekšņa devu (7.5 mg / kg; skatīt zemāk Dzīvnieki iepriekš) un nekavējoties ievietots jaunās lokomotīves kastēs. Pelēm lokomotoriskā aktivitāte tika reģistrēta, izmantojot fotosignālu sistēmu, jo ambulatorā staru kūļa pārrāvumi 30 min. Šīs procedūras tika atkārtotas katru dienu 3 dienās.

Vīrusu mediēts gēnu pārnese

Mēs izmantojām plaši publicētas metodes vīrusu mediētā gēna pārnesei [7,8,11,19]. Īsi sakot, ekspresijas plazmīdas PSMC5 vai vairākiem tās mutantiem (skat. Iepriekšminētos PSMC5 un ΔFosB konstruktus) tika subklonēti bicistroniskā p1005 (+) HSV plazmīdā, kas ekspresē GFP CMV promotora kontrolē, un PSMC5 vai tā mutanti, kas pieder pie IE4 / 5 veicinātājs. Ketamīna (100 mg / kg) / ksilazīna (10 mg / kg) anestēzijā peles tika novietotas mazā dzīvnieka stereotaksiskajā instrumentā, un galvaskausa virsma tika pakļauta. Trīsdesmit trīs šļirču adatas tika izmantotas, lai divpusēji ievadītu 0.5 μl HSV vektoru NAc ar 10 ° leņķi (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) ar ātrumu 0.1 μl / min. Dzīvniekiem, kas saņēma HSV injekcijas, pēc eksperimentiem tika atļauts atjaunoties 2 dienas pēc operācijas.

Statistika

Tika izmantoti ANOVA un studentu t-testi, kas koriģēti, lai veiktu vairākus salīdzinājumus, ar nozīmīgumu, kas noteikts p <0.05.

rezultāti

PSMC5: jauns ΔFosB saistošais partneris

Mēs veicām iepriekšējus eksperimentus, lai identificētu piemērotu ΔFosB fragmentu, kas kalpoja kā ēsma rauga divhibrīda testā, automātiski neaktivējot sistēmu. Holo-ΔFosB inducēja reportergēnu aktivitāti atsevišķi, kā arī proteīna N-terminālais 1 – 78 aminoskābju fragments. Tomēr N-terminālis saīsināts ΔFosB (1A), ko sauc par Δ2AFosB, kam trūkst proteīna pirmās 78 aminoskābes, nebija šādas ietekmes. Tāpēc mēs izmantojām Δ2ΔFosB kā ēsmu proteīnu.

Lai skatītu potenciālos saistošos partnerus, mēs izmantojām peles smadzeņu bibliotēku, kas tika subklonēta pPC86. Mēs noteicām 11 kandidātus saistošiem partneriem. Lai gan šie proteīni iekļāva ΔFosB zināmos heterodimerizācijas partnerus, c-Jun un JunD (Tabula 1), visizplatītākais kandidāts bija PSMC5. Kaut arī tas bija pārsteidzoši, tas bija interesants secinājums, jo PSMC5 tika parādīts pirms viena gada ziņojuma, lai piesaistītu c-Fos in vitro [21]. Tomēr nav bijuši ziņojumi par PSMC5 iesaistīšanos kokaīna darbībā. Tomēr, pateicoties PSMC5 signāla stiprumam rauga divu hibrīdu testā, mēs nolēmām turpināt pētīt mijiedarbības ar ΔFosB-PSMC5.

sīktēls
1 tabula. Rauga divu hibrīdu skrīninga rezultāti ar Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Pirmkārt, lai apstiprinātu fizisko mijiedarbību starp ΔFosB un PSMC5, mēs veicām in vitro koimunoprecipitācijas eksperimentus. Mēs atklājām, ka FLAG-tagged PSMC5 (1B), kas transficēts Neuro 2A šūnās, efektīvi izvilka ΔFosB (1C). Otrkārt, lai identificētu PSMC5 reģionu, kas ir atbildīgs par tās saistīšanu ar ΔFosB, mēs izveidojām vairākus FLAG marķētus PSMC5 mutantus (1B) un atkārtoja koimunoprecipitācijas eksperimentu. ΔFosB tika efektīvi izvilkts ar PSMC151 (PSMC5-NT) N-terminālajām 5 aminoskābēm, bet ne ar proteīna CN-gala 172 aminoskābju fragmentu (PSMC5-CT) (1C). PSMC5, kam trūkst spoles spoles domēna (PSMC5-ΔCC), bija neefektīva arī ΔFosB izgulsnēšanai. Šie atklājumi liecina, ka PSMC5 saistās ar ΔFosB, izmantojot tā spirāles spoles domēnu (aminoskābes 27 – 68). Turklāt FLAG marķēts PSMC5 nesavāca mutantu formu ΔFosB ar mutētu leucīna rāvējslēdzēja domēnu (ΔFosB-LZM) (1C), norādot, ka ΔFosB vai nu piesaista PSMC5 caur šo domēnu, vai, visticamāk, ka PSFCNNXX saistīšanai nepieciešama ΔFosB heterodimerizācija.

PSMC5-ΔFosB saistās NAc pēc hroniskas kokaīna lietošanas

Pamatojoties uz šiem rezultātiem in vitro, mēs pētījām, vai PSMC5 līmenis NAc ir mainīts, reaģējot uz hronisku kokaīna lietošanu. Pēc subcellulārās frakcionēšanas un Western blotting konstatējām, ka hronisks kokaīns palielina PSMC5 kodolenerģijas līmeni šajā smadzeņu reģionā, nemainot citoplazmas līmeni (2A). Šī ietekme netika novērota pēc vienreizējas kokaīna devas lietošanas (dati nav parādīti). Pēc tam mēs pārbaudījām PSMC5 un ΔFosB lokalizāciju NAc ar konfokālo imunofluorescences mikroskopu. Mēs analizējām peles 24 h pēc pēdējās atkārtotās kokaīna devas - laika, kad ΔFosB ir vienīgais nosakāms FosB gēnu produktu (skatīt Nestler 2008). Mēs konstatējām spēcīgu PSMC5 imūnreaktivitāti NAc, ieskaitot spēcīgu kodolenerģijas signālu. ~ 85% ΔFosB + kodolu PSMC5 līdzkrāsojumam (2B). Bez tam, mēs veicām koimunoprecipitācijas eksperimentus ar NAc ekstraktiem un konstatējām, ka pēc hroniskas kokaīna apstrādes ΔFosB efektīvi izvilka anti-PSMC5 antiviela (2C). Pretstatā tam, narkotiku neārstētas NAc analīzes (pēc atkārtotas sāls injekcijas) atklāja, ka nav konstatējama ΔFosB nolaišanās (dati nav parādīti). Šie dati atbilst mūsu konstatējumiem šūnu kultūrā un apstiprina, ka ΔFosB un PSMC5 mijiedarbojas NAc in vivo.

sīktēls
2. PSMC5 regulēšana peles NAc.

 

A. Peļu NAc kodola un citosola frakciju rietumu analīze, katru dienu 20 dienas ārstējot ar fizioloģisko šķīdumu vai kokaīnu (7 mg / kg), dzīvniekiem analizējot 24 stundas pēc pēdējās injekcijas. Kokaīns palielina PSMC5 kodola līmeni, bet ne citosola līmeni. Kā slodzes kontroli izmantoja histonu H3 un ß-aktīnu, kurus kokaīns neietekmēja. Dati ir vidējie ± SEM (n = 8–10 / grupa, * p <0.05). B. Endogēno PSMC5 (zaļā) un ΔFosB (zilā) līdz lokalizācija pelēm, kas hroniski ārstētas ar kokaīnu, tāpat kā AC Peles NAc kodolizātos pēc hroniskas kokaīna ārstēšanas tika veikta imunosadzināšana ar anti-PSMC5 antivielu vai peles IgG kā kontroli un pēc tam Western blotē ar anti-FosB / ΔFosB antivielām. Attēlā parādīta PSMC5-ΔFosB mijiedarbība NAc in vivo. B un C dati tika atkārtoti trijos eksemplāros katrā no trim atsevišķiem eksperimentiem.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 uzlabo ΔFosB ekspresiju in vitro

Tā kā PSMC5 ir zināms proteasomu kompleksa dalībnieks, mēs pārbaudījām, vai tas regulē AFosB līmeņus, izmantojot Rat 1A šūnas. PSMC5 pārmērīga ekspresija neietekmēja ΔFosB bazālo līmeni, bet izraisīja nelielu, bet nozīmīgu ΔFosB indukcijas uzlabošanos pēc šūnu stimulācijas serumā (3A). Līdzīga tendence bija vērojama pilna garuma FosB, bet efekts nebija statistiski nozīmīgs. Un otrādi, endogēnās PSMC5 ekspresijas nomākšana žurkām 1A šūnās, kas panākta, izmantojot siRNS, kas mērķa PSMC5, neietekmēja bazālo ΔFosB līmeni, bet spēcīgi inhibēja ΔFosB indukciju ar seruma stimulāciju (3B). Līdzīgi efekti tika novēroti pilna garuma FosB. Šie dati liecina, ka PSMC5 neveicina FosB proteasomālo degradāciju, kā to varētu sagaidīt kā proteasomas galveno apakšvienību, bet tas ir nepieciešams, lai maksimāli uzkrātu FosB gēnu produkti in vitro, iespējams, stabilizējot proteīnus.

sīktēls
3. FosB / ΔFosB ekspresijas PSMC5 regulēšana žurkām 1A šūnās.

 

A. Žurkas 1A šūnas tika transfekētas ar 4 μg PSMC5 vai kontroles DNS. PSMC5 pārmērīgai ekspresijai nebija nekādas ietekmes uz FosB vai ΔFosB olbaltumvielu bāzes ekspresijas līmeni, kā noteikts ar Western blotēšanu, bet tas izraisīja nelielu, bet ievērojamu ΔFosB indukcijas pieaugumu ar seruma stimulāciju (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Žurkas 1A šūnas tika transfektētas ar 5 pmol vai nu no divām siRNS, vai ar kodētu RNS (kontrole). Abas siRNS efektīvi samazināja PSMC5 olbaltumvielu līmeni salīdzinājumā ar kontroles apstākļiem (siRNS # 1, 23 ± 5% no kontroles; siRNS # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). PSMC5 knockdown neietekmēja FosB vai ΔFosB pamata līmeni, bet ar seruma stimulāciju attenēja gan FosB, gan ΔFosB indukciju (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 (p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB un PSMC5 veido kompleksus ar CBP, p300 un BRG1 NAc

Lai labāk izprastu transkripcijas mehānismus, ar kuriem PSMC5 var ietekmēt ΔFosB funkciju, mēs pētījām iespējamos papildu saistošos partnerus abiem proteīniem NAc ar hronisku kokaīna ārstēšanu. Ir viens ziņojums, ka PSMC5 saistās ar CBP - HAT - un palielina histona H3 acetilāciju MHC-II proksimālajā promotorā HeLa šūnās [22]. Turklāt pelēm, kurām trūkst CBP, parādās uzvedības jutīgums pret kokaīnu, kā arī samazināta histona acetilēšana. FosB veicinātājs [23]. Tādējādi mēs pārbaudījām, vai PSMC5 var saistīties ar AFosB kā daļu no kompleksiem, kas satur arī CBP un ​​varbūt citus transkripcijas aktivatorus.

Vispirms mēs parādījām, ka ΔFosB efektīvi izvilka gan CBP, gan p300, saistīto HAT, Neuro2A šūnās (4A). Pretstatā tam, αFosB leucīna rāvējslēdzēja mutanta forma, kā paredzēts, neparādīja šo aktivitāti. Tāpat PSMC5 efektīvi izvilka CBP un ​​p300 (4B). Interesanti, ka šis efekts bija redzams arī PSMC5-ΔCC, kas neizvelk ΔFosB, norādot, ka PSMC5 mijiedarbojas ar CBP un ​​p300 ar citiem proteīna domēniem un neatkarīgi no tā saistīšanās ar ΔFosB.

sīktēls
4. ΔFosB un PSMC5 mijiedarbojas ar CBP, p300 un BRG1 in vitro un in vivo.

 

A. Neuro2A šūnas tika transficētas ar 2.4 μg MYC-tagged AFosB vai MYC-tagged AFosB-LZM. Šūnu ekstrakti tika imunizēti ar anti-CBP vai anti-p300 antivielām, un nogulsnes tika Western blotētas ar to pašu antivielu vai anti-MYC antivielu. Gan CBP, gan p300 mijiedarbojas ar ΔFosB, un šādai mijiedarbībai ir nepieciešams neskarts leucīna rāvējslēdzējs. B. Neuro2A šūnas tika transficētas ar 2.4 μg FLAG iezīmētu PSMC5 vai FLAG marķētu PSMC5-ACC. Šūnu ekstrakti tika imunizēti ar anti-CBP vai anti-p300 antivielām, un nogulsnes tika Western blotētas ar to pašu antivielu vai anti-FLAG antivielu. Gan CBP, gan p300 mijiedarbojas ar PSMC5, un šādai mijiedarbībai nav nepieciešams CC domēns. C. Peles NAc kodol lizāti pēc hroniskas kokaīna terapijas tika pakļauti imunoprecipitācijai ar anti-CBP vai anti-p300 antivielām. Pēc tam iegūto nogulšņu Western blotēšana ar anti-FosB / ΔFosB antivielām parādīja endogēnas mijiedarbības starp ΔFosB un CBP / p300. D. Šo pašu lizātu alikvotu daļas tika imunizētas ar anti-BRG1 vai anti-PSMC5 antivielām, kam sekoja nogulšņu Western blotēšana ar anti-FosB / AFosB vai anti-BRG1 antivielu. Rezultāti liecina par endogēno mijiedarbību starp ΔFosB un BRG1, un BRG1 un PSMC5. E. Transkripcijas aktivācijas kompleksa, kas sastāv no ΔFosB, shematisks attēls: JunD heterodimēri, kas mijiedarbojas ar CBP / p300, BRG1 un PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Lai apstiprinātu, ka šīs mijiedarbības notiek arī in vivo, mēs ieviesām kokaīnu hroniski, lai izraisītu AFosB un kodolmateriālu PSMC5 līmeņus, pēc tam imunoprecipitated NAc ekstrakti ar anti-CBP vai anti-p300 antivielām. Saskaņā ar mūsu šūnu kultūras datiem, CBP vai p300 imunoprecipitācija efektīvi samazināja ΔFosB (4C). Mēs pārbaudījām, vai BRG1, SWI-SNF hromatīna remodelēšanas kompleksa galvenā apakšvienība, var arī saistīties ar ΔFosB un PSMC5, pamatojoties uz mūsu agrāko konstatējumu, ka BRG1 tiek pieņemts darbā noteiktiem ΔFosB mērķa gēniem vienlaicīgi ar to aktivizēšanu NAc pēc hroniska kokaīna [24]. Mēs noskaidrojām, ka BRG1 imunoprecipitācija nojauca ΔFosB NAc ekstraktos un ka PSMC5 imunoprecipitācija tāpat sajauc endogēnu BRG1 (4D). Kopumā šie rezultāti liecina, ka ΔFosB-PSMC5 veido kompleksus NAc, kas ietver arī CBP / p300 un BRG1 (4E).

PSMC5 pārmērīga ekspresija palielina lokomotorisko reakciju uz kokaīnu

Spilgta PSMC5 saistība ar ΔFosB NAc lika mums izpētīt, vai PSMC5 līmeņa paaugstināšana šajā smadzeņu reģionā regulē uzvedību uz kokaīnu. Mēs izveidojām Herpes Simplex vīrusa (HSV) vektoru, kas pārmērīgi ekspresē vai nu savvaļas PSMC5 vai kādu tā mutantu, bet arī apstiprināja vektorus NAc in vivo (5A). Šūnu kodolā dominē PSMC5 vīrusu mediētā ekspresija (5B). Pelēm, kas pārmērīgi ekspresēja savvaļas tipa PSMC5, netika novērotas pārmaiņas pret kokaīna sākotnējām devām, bet parādījās pastiprināta lokomotoriskā aktivācija, reaģējot uz atkārtotām kokaīna devām, salīdzinot ar GFP ekspresējošām kontroles pelēm. Turpretī pelēm, kas pārmērīgi izpauž PSMC5 mutantu formu, kurai trūkst spoles spoles domēna (PSMC5-ΔCC), šī ietekme netika konstatēta (5B). Interesanti, ka PSMC5-K196M pārmērīga ekspresija, kurai trūkst savvaļas proteīna ATPāzes aktivitātes, arī pastiprināja kokaīna lokomotoriskās atbildes reakciju.

sīktēls
5. PSMC5 pārmērīga ekspresija NAc palielina lokomotorisko reakciju uz kokaīnu.

 

A. Reprezentatīva HSV mediēta transgēna ekspresija mediālā NAc. AC, priekšējā komisija. Uz attēla ir atzīmēti NAc kodola un apvalka apakšreģioni. B. Reprezentatīvs lielāks PSMC60 imūnhistoķīmiskās krāsošanas palielinājums (5x) NAc neironos pēc HSV-PSMC5 injekcijas, parādot, ka proteīns pārsvarā ir kodols, kā tas ir atzīmēts ar DAPI krāsošanu. C. Peles saņēma divpusējas HSV injekcijas NAc, kam sekoja ikdienas IP injekcijas, kas bija zemākas kokaīna devas (7.5 mg / kg). Locomotorās reakcijas tiek parādītas, reaģējot uz pirmo un pēdējo no 3 dienas zāļu devām. PSMC5 vai PSMC5-K196M pārmērīga ekspresija palielina kustību reakciju uz atkārtotu kokaīnu, efektu, kas nav novērojams, lietojot PSMC5-ΔCC. Transgēniem nebija būtiskas ietekmes uz kustību reakcijām uz sākotnējām kokaīna devām. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05, izmantojot Dannett posthoc testu.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

diskusija

Šī pētījuma rezultāti atklāj jaunu mehānismu, ar kuru ΔFosB starpniecību ietekmē tās ietekmi uz smadzenēm un jaunu mehānismu, kas saistīts ar kokaīna iedarbību. Izmantojot objektīvu pieeju, rauga divu hibrīdu testu, mēs identificējām PSMC5 kā jaunu saistošu partneri ΔFosB. Mēs apstiprinājām šo konstatējumu gan kultūrās, gan in vitro un NAc in vivo, demonstrējot spēcīgu PSMC5-ΔFosB saistīšanu. Svarīgi, ka PSMC5 kodolenerģijas līmeni NAc izraisa hroniska kokaīna lietošana. Turklāt mēs parādījām, ka PSMC5-ΔFosB saistīšanās notiek kopā ar vairākiem citiem transkripcijas aktivatora proteīniem, proti, CBP un ​​p300 (diviem HAT) un BRG1 (SWI-SNF hromatīna remodelēšanas kompleksu galvenais komponents). Kopā mūsu secinājumi apstiprina hipotēzi, ka PSMC5 ir daļa no transkripcijas aktivācijas kompleksa, kas tiek pieņemts darbā vismaz noteiktiem ΔFosB inducētiem gēniem hroniskas kokaīna lietošanas laikā (4E). Saskaņā ar šo hipotēzi ir papildu konstatējums, ka PSMC5 pārmērīga ekspresija NAc, tāpat kā pati ΔFosB pārprodukcija, veicina uzvedību uz kokaīnu. Turpmākos pētījumos būtu interesanti sekot šiem in vivo novērojumiem, raksturojot PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 mijiedarbību, izmantojot in vitro reporteru testus.

PSMC5 iesaistīšanās kokaīna lietošanā ir pilnīgi jauna. Sākotnēji identificēts kā lielas ATPāzes ģimenes loceklis, kas ietver proteasomu, gadu gaitā ir pierādīts, ka PSMC5 mijiedarbojas ar vairākiem transkripcijas faktoriem, tostarp c-Fos, p53, kodolhormona receptoriem un bazālās transkripcijas kompleksa sastāvdaļām [25] tomēr gadu gaitā ir veikti daži funkcionālie pētījumi [26]. Tās labākā rīcība ir veicināt MYC transkripcijas faktoru aktivitāti kultivētās šūnās [27]. PSMC5 ietekme uz transkripcijas mehānismiem liecina, ka ubiquitination-proteasomal aktivitāte ir potenciāla loma gēnu transkripcijas regulēšanā, bet PSMC5 iesaistīšana šādā regulējumā līdz šim nav praktiski pārbaudīta [28,29].

Ļoti maz ir zināms par PSMC5 funkciju smadzenēs. Agrāk veikts pētījums parādīja plašu PSMC5 mRNS izpausmi visā smadzenēs [30], bet tās funkcionālā aktivitāte nav pārbaudīta. Mūsu secinājumi tagad veicina šīs interesantas olbaltumvielas turpmāku izpēti, lai labāk izprastu tās lomu gēnu transkripcijas regulēšanā un tās saistību ar ubikvitināciju-proteasomu funkciju smadzenēs. PSMC5 saistīšanos ar ΔFosB mediē PSMC5 spoles spole. Turklāt PSMC5 spēja veicināt lokomotoriskās atbildes reakciju uz kokaīnu, vienlaikus pieprasot spirāles spoles domēnu, neprasa proteīnam raksturīgo ATPāzes aktivitāti. Šie rezultāti palielina iespēju, ka vismaz mūsu sistēmā PSMC5 galvenā aktivitāte varētu būt saistīta ar tās saistīšanos ar AFosB un citiem transkripcijas regulējošajiem proteīniem, nevis ar savu proteasomālo aktivitāti. Jāturpina darbs, lai tieši pārbaudītu šo un alternatīvo iespēju. Hipotēze, ka vīrusu mediēta PSMC5 pārmērīga ekspresija palielināja lokomotorisko reakciju uz kokaīnu, mijiedarbojoties ar ΔFosB, ir ticama, neraugoties uz 3 dienas kokaīna terapijas shēmas lietošanu, jo ir zināms, ka šajā laika posmā smadzenēs ievērojami uzkrājas ΔFosB līmenis [3].

Šie secinājumi vēl vairāk pamato objektīvu, atvērtu eksperimentālu pieeju izmantošanu smadzeņu regulēšanas molekulārā pamata pētīšanā. Mūsu sākotnējā uzmanība PSMC5 balstījās tikai uz tā ievērojamo saistīšanos ar ΔFosB rauga divu hibrīdu testā, tomēr tā šķiet svarīga transkripcijas izmaiņu sastāvdaļa, ko NAc pieņem darbā ar atkārtotu kokaīna lietošanu. Pašreizējo pētījumu uzmanības centrā ir labāka izpratne par sīki izstrādātiem mehānismiem, kas izraisa PSMC5 kodolu līmeni kokainā, un pēc tam PSMC5 veicina kokaīna izraisītos transkripcijas aktivācijas kompleksus. Tajā pašā laikā mūsu rauga divu hibrīdu tests atklāja vairākus papildu iespējamus ΔFosB saistošos partnerus (Tabula 1), kas tagad arī prasa tiešu pārbaudi kokaīna modeļos. Kopā šis darbs veicina izpratni par sarežģītajiem molekulārajiem mehānismiem, ar kuriem kokaīns maina NAc funkciju.

Pateicības

Šo darbu atbalstīja Zāļu ļaunprātīgas izmantošanas valsts institūts un Ishibashi fonds un Japānas Zinātnes veicināšanas biedrība (KAKENHI numuri: 24591735, 26290064, 25116010).

Autora iemaksas

Izstrādāti un izstrādāti eksperimenti: YHO YNO EJN. Veikti eksperimenti: YHO YNO PJK RN. Analizēja datus: YHO YNO EJN. Iegūtie reaģenti / materiāli / analīzes rīki. Rakstīja rakstu: YHO EJN.

Atsauces

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Tūlītēji agri gēni: pēc desmit gadiem. Tendences Neurosci 18: 66 – 67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Atkarības transkripcijas mehānismi: deltaFosB loma. Philos Trans R Soc Londona B Biol Sci 363: 3245 – 3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. pmid: 18640924
  3. Skatīt pantu
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Skatīt pantu
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Skatīt pantu
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Skatīt pantu
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Skatīt pantu
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Skatīt pantu
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Skatīt pantu
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Skatīt pantu
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Skatīt pantu
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Skatīt pantu
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Skatīt pantu
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Skatīt pantu
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Skatīt pantu
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Skatīt pantu
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Skatīt pantu
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Skatīt pantu
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Skatīt pantu
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Skatīt pantu
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Skatīt pantu
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Skatīt pantu
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Skatīt pantu
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Skatīt pantu
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Skatīt pantu
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Skatīt pantu
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Skatīt pantu
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Skatīt pantu
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Skatīt pantu
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Skatīt pantu
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Skatīt pantu
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Ilgstoša AP-1 kompleksa, kas sastāv no mainītiem Fos līdzīgiem proteīniem smadzenēs, indukcija ar hronisku kokaīnu un citām hroniskām procedūrām. Neurons 13: 1235 – 1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB mutantu peles: Hroniskas kokaīna indukcijas ar Fos saistīto olbaltumvielu zudums un paaugstināta jutība pret kokaīna psihomotoru un atalgojošo iedarbību. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) ΔFosB stabilitātes regulēšana ar fosforilēšanu. J Neurosci 26: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) Konservēta C-termināla degrona domēna neesamība veicina ΔFosB unikālo stabilitāti. Eur J Neurosci 25: 3009 – 3019. pmid: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) Uzvedības un strukturālajai reakcijai pret hronisku kokaīnu ir nepieciešama barības avota līnija, kas ietver ΔFosB un CaMKII kodolskābes korpusā. J Neurosci 33: 4295 – 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. pmid: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) Transkripcijas faktora ΔFosB ekspresija smadzenēs kontrolē jutību pret kokaīnu. Daba 401: 272 – 276. pmid: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB veicina kokaīna stimulēšanu. J Neurosci 23: 2488 – 2493. pmid: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) CREB un DFosB regulē gēnu ekspresiju un kokaīna atlīdzību. Nat Neurosci 11: 1208 – 1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: ΔFosB būtiska loma morfīna darbībā. Daba Neurosci 9: 205 – 211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, et al. (2003) Inducēja, smadzeņu reģiona specifiskā c-Jun dominējošā negatīvā mutanta ekspresija transgēnās pelēs samazina jutību pret kokaīnu. Brain Res 970: 73 – 86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Delta FosB un FosB līdzīgo proteīnu regulēšana ar elektrokonvulsīvo krampju un kokaīna terapiju. Mol Pharmacol 48: 880 – 889. pmid: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) FosB gēna būtiska loma molekulāro, šūnu un uzvedības aktivitātēs, ko izraisa elektrokonvulsīvie krampji. J Neurosci 18: 6952 – 6962. pmid: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonisms ir saistīts ar pastāvīgu D-FosB līdzīga proteīna ekspresiju dopamīnerģiskos ceļos. Mol Brain Res 53: 41 – 52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Eukariotiskā transkripcijas inhibitora konvertēšana par aktivatoru. Šūnas 55: 443 – 446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, lauki S (1991) Divu hibrīdu sistēma: metode, lai identificētu un klonētu gēnus proteīniem, kas mijiedarbojas ar interesējošo proteīnu. Proc Natl Acad Sci ASV 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferatīvā lēnā Rat-1A šūnu aktivācija ar delta FosB. Mol Cell Biol 13: 4157 – 4166. pmid: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Poli (ADP-ribosil) ationa būtiska loma kokaīna iedarbībā. Proc Natl Acad Sci ASV 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. pmid: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) osFosB indukcijas smadzenēs atšķirīgi ļaunprātīgas lietošanas veidi. Synapse 62: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. pmid: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Zīdītāju Sug1 un c-Fos kodolenerģijas 26S proteasomā. Proc Natl Acad Sci ASV 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Acetilēšanas regulēšana galvenajā histokompatibilitātes kompleksa II klases proksimālajā promotorā ar 19S proteasomu ATPase Sug1. Mol Cell Biol 28: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. pmid: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB saistošs proteīns kontrolē atbildes reakciju uz kokaīnu, acetilējot histonus fosB promoterā peles striatumā. Proc Natl Acad Sci ASV 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) Chromatin remodeling ir galvenais mehānisms, kas pamato kokaīna izraisīto plastiskumu striatumā. Neurons 48: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Divkāršās funkcijas transkripcijas regulatoriem: mīts vai realitāte. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) 26S proteasomas regulējošā apakšvienības mijiedarbība, sarežģīta problēma. Tendences Biochem Sci 25: 83 – 88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) ubikvitīna / proteasomas sistēmas ietekme uz manuāli regulētu transkripciju. Šūnu cikls 2 – 5: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin un transkripcijas proteasomi. Annu Rev Biochem 81: 177 – 201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. pmid: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteasoms: noderīgs rīks transkripcijai? Curr Op Genet Dev 16: 197 – 202. pmid: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Filogenētiski konservēta Sug1 CAD ģimenes locekļa identifikācija, kas ir atšķirīgi izteikta peles nervu sistēmā. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5