DeltaFosB stabilitātes regulēšana ar fosforilēšanu (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.

avots

Psihiatrijas katedra, Neiroloģijas pamatnozares centrs, Teksasas Universitātes Dienvidrietumu medicīnas centrs, Dalasa, Teksasa 75390-9070, ASV.

Anotācija

Transkripcijas faktors DeltaFosB (saukts arī par FosB2 vai FosB [īsu formu]) ir svarīgs ilgstošas ​​plastiskuma starpnieks, ko izraisa smadzeņu hroniska iedarbība uz dažāda veida psihoaktīviem stimuliem, tostarp narkotikām, kas saistītas ar ļaunprātīgu izmantošanu, stresu un elektrokonvulsīvām lēkmēm . DeltaFosB atšķirīga iezīme ir tāda, ka pēc tam, kad tas tiek ierosināts, tas turpinās smadzenēs salīdzinoši ilgu laiku bez papildu stimulācijas. Mehānismi, kas pamato šo šķietamo stabilitāti, tomēr ir palikuši zināmi. Šeit mēs parādām, ka DeltaFosB ir relatīvi stabils transkripcijas faktors, kura pusperiods šūnu kultūrā ir aptuveni 10 h. Turklāt mēs parādām, ka DeltaFosB ir fosfoproteīns smadzenēs un ka ļoti konservēta serīna atlikuma (Ser27) fosforilēšana DeltaFosB aizsargā to no proteasomālās degradācijas. Mēs piedāvājam vairākus pierādījumus, kas liecina, ka šo fosforilāciju ietekmē kazeīna kināze 2. Šie konstatējumi ir pirmais pierādījums tam, ka DeltaFosB ir fosforilēts un pierāda, ka fosforilācija veicina tās stabilitāti, kas ir tās spējas starpniecību ilgstošu adaptāciju smadzenēs.

Ievads

Transkripcijas faktors ΔFosB, arī apzīmēts ar FosB2 vai FosB [īsu formu], ir tiešā agrīna gēna C gala saīsināts splice variants. fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu un Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Tāpat kā pilna garuma FosB, ΔFosB ir DNS saistošs bāzes domēns un leucīna rāvējslēdzējs, caur kuru tas dimerizējas ar jūnija proteīniem, veidojot aktivatora proteīna-1 (AP-1) transkripcijas faktoru kompleksus, kas regulē daudzu gēnu ekspresiju (Morgan un Curran, 1995; Rylski un Kaczmarek, 2004). Neskatoties uz to, ka FosB C terminālī nav atrodama daļa transaktivācijas domēna, ΔFosB darbojas kā spēcīgs transkripcijas aktivators un repressors kultivētās šūnās un smadzenēs (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu un Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung un Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).

ΔFosB smadzenēs pēc hroniskas, bet ne akūtas iedarbības uz dažādiem psihoaktīviem stimuliem, tostarp stresu, dažiem bojājumiem, antipsihotiskiem un antidepresantiem, ļaunprātīgas lietošanas narkotikām un dabiskām atlīdzībām, izraisa augstus līmeņus reģionam raksturīgā veidā smadzenēs. (Hope et al., 1994b; Hiroi un Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). ΔFosB indukcija ir tieši saistīta ar vairāku šo stimulu funkcionālo ietekmi uz smadzenēm. ΔFosB noturība pat bez papildu stimulācijas atšķir to no visiem pārējiem Fos ģimenes transkripcijas faktoriem, kas tiek ātri ierosināti, reaģējot uz akūtajiem stimuliem, atslāboties līdz bazālajam līmenim dažu stundu laikā, un parasti pēc hroniskas stimulācijas parasti izraisa desensibilizāciju (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi un Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Tas padara ΔFosB par pievilcīgu kandidātu, lai starpniekotu dažas ilgstošas ​​izmaiņas gēnu ekspresijā, kas ir pamatā stabilām neironu adaptācijām, ko izraisa daži hroniski stimuli.

Tā kā ilgstoša ΔFosB klātbūtne notiek, ja nav mRNS turpmākās indukcijas (Chen et al., 1995), mēs spekulējām, ka atšķirībā no pilna garuma FosB un visiem pārējiem Fos ģimenes proteīniem, kas ir raksturīgi nestabili, ΔFosB var būt neparasti stabils transkripcijas faktors (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Turklāt akūtās un hroniskās stimulētās smadzeņu audu imunoblotēšanas analīze liecināja, ka ΔFosB pārmaiņas ir redzamas Mr (molekulmasa) no ∼33 kDa akūtā stāvoklī līdz ∼35 – 37 kDa hroniskas ārstēšanas laikā (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Tā kā nav pierādījumu par to, ka pastāv papildu mRNS, kas varētu šifrēt šīs dažādās izoformas, mēs arī spekulējām, ka ΔFosB ir pēctranslacionāli modificēts un ka varbūt tas veicina tās neparasto stabilitāti. Tomēr līdz šim nav ziņots par ΔFosB apgrozījuma vai pēctranslācijas modifikāciju bioķīmiskām analīzēm. Šā pētījuma mērķis bija noteikt, vai ΔFosB ir fosfoproteīns un vai fosforilācija ir svarīga tās stabilitātei.

Iepriekšējā sadaļaNākamā sadaļa

Materiāli un metodes

Zīdītāju šūnu līnijas un DNS konstrukcijas.

PC12 šūnas (Clontech, Mountainview, CA) tika kultivētas augstas glikozes DMEM, kas satur l-glutamīnu (L-Gln) un papildinātas ar 5% liellopu govju serumu (FBS), zirgu serumu 10% (abi iegūti no Invitrogen, Carlsbad, CA) 100 U / ml penicilīna un 100 μg / ml streptomicīna (abi no Sigma-Aldrich, St Louis, MO). HeLa šūnas (American Type Culture Collection, Manassas, VA) tika kultivētas augstas glikozes DMEM, kas satur L-Gln un papildinātas ar 10% FBS, penicilīnu un streptomicīnu. Abas šūnu līnijas tika uzturētas 37 ° C mitrā 5% CO2 atmosfērā.

Par pārejošām transfekcijām ar DNS, PC12 vai HeLa šūnas tika iesētas sešām iedobēm (PC12 šūnām pārklātas ar kolagēnu I), lai nākamajā dienā sasniegtu 90 – 100% saplūšanu, un pēc tam tās tika transfekcijas, izmantojot Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Dažos eksperimentos (skat Att. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB tika īslaicīgi izteikts PC12 šūnās, inficējot ar rekombinanto herpes simplex vīrusu (HSV).

ΔFosB un FosB cDNS ieguva no mūsu pašu pTetop konstrukcijām (Chen et al., 1997) un subklonē pcDNA3.1 vektorā (Invitrogen). Šīs pcDNA3.1-AFosB / FosB konstrukcijas tika izmantotas ekspresijai zīdītāju šūnās un kā paraugs uz vietas vērstai mutagenesei. Rekombinantā HSV-ΔFosB tika sagatavots, kā aprakstīts iepriekš (Neve et al., 1997), un preparāta titrs bija N1 × 108 pfu / ml.

Pulse-chase eksperimenti.

Aptuveni 24 h pēc infekcijas / transfekcijas sešās iedobēs esošās šūnas (PC12 vai HeLa) sešas reizes trīs reizes mazgāja ar 2 ml PBS un inkubēja ar 37 ° C ∼1 h 2 ml Cys / Met-bez DMEM (Invitrogen), kas papildināts ar 5% dializētu FBS (Hyclone, Logan, UT), lai noārdītu Met un Cys intracelulāros baseinus. Šī „bada” perioda beigās tika pievienotas zāles (ja šūnas tika ārstētas) un šūnas tika marķētas (pulss) ar 12 – 25 μCi no 35S proteīnu marķēšanas maisījums (Врска до робе: значење, Wellesley, MA) ∼1 h pie 37 ° C, lai marķētu visas jaunās sintezētās olbaltumvielas. Pēc tam radioaktīvo marķējumu noņēma, mazgājot šūnas divas līdz trīs reizes ar 2 ml PBS un 35Sekoja S-iezīmētas olbaltumvielas (pakaļdzīšanās), aizstājot barotni ar „aukstu” (neradioaktīvu) barotni, kas papildināta ar 5% FBS, un iegūstot šūnas dažādos laika punktos. Šūnu apstrāde tika saglabāta visā vajāšanas laikā. Visi šo eksperimentu skaitļi parāda līdzīgus sākotnējo daudzumu dažādiem proteīniem, lai optimizētu to apgrozījuma rādītāju salīdzinājumus.

Dzīvnieki un hroniska elektrokonvulsīvā lēkmju ārstēšana.

Pieaugušo Sprague Dawley žurku tēviņi (200 – 300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) tika ārstēti vienu reizi dienā, lietojot 7 – 9 d. ECS tika veikta, kā aprakstīts iepriekš (Hope et al., 1994a), izmantojot Ugo Basile (Comerio VA, Itālija) ECS ierīce ar šādiem iestatījumiem: frekvence, 100 impulsi / s; pulss ar, 0.5 ms; trieciena ilgums, 1.0 s; un strāva, 75 mA. Parazītiski kontrolētie dzīvnieki tika ārstēti paralēli, uzliekot austiņu elektrodus bez elektriskās strāvas.

32 P metaboliskā marķēšana.

Smadzeņu šķēlēs marķēšanai žurkām tika dekapitēts, smadzenes ātri sadalītas, un 300 μm frontālās garozas šķēlītes tika sagatavotas ar DSK mikrosliceri (Ted Pella, Redding, CA). Šķēles tika inkubētas plastmasas caurulēs 2 ml fosfāta deficīta mākslīgā CSF (ACSF) un uzturēja 30 ° C temperatūrā, pastāvīgi maigi burbuļojot ar O2/ CO2 maisījums (Hemmings et al., 1989). Šķēles (divas šķēlītes katrā mēģenē) tika marķētas ar 1.3 mCi 8 – 10 h, ja ir okadaīnskābe (100 ng / ml). Šīs inkubācijas beigās šķēles tika izskalotas vismaz trīs reizes ar aukstu ACSF un pēc tam homogenizētas ar ultraskaņu, izmantojot 250 μl auksta radioimunoprecipitācijas testa (RIPA) bufera [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v ) Igepal, 0.5% (w / v) nātrija deoksikolāts, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA], kas pirms lietošanas papildināts ar SDS līdz 0.6%, proteāzes inhibitoru kokteilis zīdītāju šūnām (lietots 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), fosfatāzes inhibitoru kokteiļi I un II (lietoti 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF un 2% glicerīns. Pēc tam homogenāti tika vārīti 15 min un iztīrīti centrifugējot pie 15,000 × g 15 min. Olbaltumvielu koncentrācija iegūtajos supernatantos tika novērtēta, izmantojot BCA proteīna analīzi (Pierce, Holmdel, NJ).

Priekš 32Kultivētu šūnu P marķēšana, ∼24 h pēc infekcijas / transfekcijas, šūnas tika mazgātas divas līdz trīs reizes ar fosfātu nesaturošu barotni un inkubētas šajā vidē ∼1 h. Pēc šī bada perioda, 0.2 – 0.3 mCi no 32PH3PO4 (Врска до робе: значење) tika pievienotas katrai iedobei, un šūnas tika marķētas 4 – 12 h atkarībā no eksperimenta veida (skatīt specifikācijas 1 – 7.). Pēc tam šūnas trīs reizes nomazgāja ar PBS un lizēja uz ledus 15 min ar 50 μl papildinātā RIPA bufera. Lizāti tika savākti, skrāpējot, un 10 laiki tika novadīti 25 laikā, šķēres DNS, vārīti 10 min, un centrifugēti 15,000 rpm 15 – 30 min. 4 ° C. Notīrītie lizāti (supernatanti) tika pārnesti uz jaunu cauruli un tika veikta BCA proteīna analīze (Pierce). Visi šo eksperimentu rādītāji uzrāda līdzīgus kopējās savvaļas tipa (WT) un S27A ΔFosB proteīnu daudzumus, lai optimizētu to relatīvo fosforilācijas līmeni.

Ķīmisko vielu un šūnu kultūras apstrāde.

Okadaīnskābe (OA; Sigma-Aldrich) tika izšķīdināta etanolā un izmantota ar galīgo 100 ng / ml koncentrāciju. 5,6-Dichlor-1-β-d-ribofuranozil-benzimidazols (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) tika izšķīdināts dimetilsulfoksīdā (DMSO; Sigma-Aldrich) un izmantots šūnu kultūrā ar galīgo 50 μm koncentrāciju. Spermīns (Sigma-Aldrich) tika izšķīdināts ūdenī un izmantots ar galīgo 200 μm koncentrāciju. Calphostin-C (Biomol) tika izšķīdināts DMSO un izmantots 0.2 μm, savukārt phorbol 12-miristāts 13-acetāts (PMA; Promega, Madison, WI) tika izšķīdināts DMSO un izmantots 0.1 μm. ar miristoilētu-autokamīda-2 saistīto inhibējošo peptīdu (m-AIP; Biomol) izšķīdina ūdenī un izmantoja galīgo 1 un 10 μm koncentrāciju. Plaša spektra proteīnkināzes inhibitori H-7 un H-8 (Biomol) tika izšķīdināti ūdenī un tika izmantoti 150 un 200 μm galīgajā koncentrācijā. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) un epoksomicīns (Peptides International, Louisville, KY) tika izšķīdināti DMSO un tika izmantoti 12.5 un 7.5 μm galīgajā koncentrācijā. Visos eksperimentos šūnām tika pievienots DMSO (nesējs), kā nepieciešams, lai saglabātu nemainīgu DMSO daudzumu ārstēšanas laikā. Par 32P marķēšanas eksperimenti, zāles tika pievienotas tieši pirms etiķetes un glabātas atlikušajā etiķetes periodā. Eksperimentiem ar pulsāciju, Cys / Met “bada laikā” tika pievienotas zāles, kuras tika uzglabātas marķēšanas periodā, un pēc tam tika pievienotas atpakaļ barošanas vidē. Proteasomu inhibitori tika ievadīti katru 3 – 4 h visā chase, lai kompensētu šo peptīdu ātru apgrozījumu.

ΔFosB imunoprecipitācija, imunoblotēšana un autoradiogrāfija.

Imunoprecipitācijām lizāti tika atšķaidīti 1: 5 ar vienkāršu RIPA, lai panāktu SDS koncentrāciju līdz 0.1%, pirms turpinājās imunoprecipitācija (IP). Lai ierobežotu nespecifisku saistīšanos, lizāti vispirms tika izvadīti ar imunoprecipitāciju ar neimūnu IgG un proteīna G-Sepharose (Sigma-Aldrich) vismaz 4 h. Pēc tam FosB tika imunizēta no iztīrītajiem lizātiem, izmantojot kazu poliklonālo antivielu, kas atpazīst iekšējo epitopu, kas atrodas gan FosB, gan ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 0.5-1 μg IgG uz 10 μg lizāta proteīna (50 – 300 μg kopējā proteīna) kopējā 0.5 ml tilpumā. IP tika viegli sajaukti pie 4 ° C uz rotora vismaz 8 h, un pēc tam pievienoja 15 μl G-Sepharose proteīna un IP sajauca vismaz vēl vienu 4 h. IP tika granulēti ar vērpšanu pie 3000 × g 3 – 5 min 4 ° C, trīs reizes nomazgājiet ar 0.5 ml auksto plaisu RIPA un divas reizes ar aukstu PBS, kas satur 0.1% Tween 20. Pēc tam IP tika atkārtoti suspendēti 0.5 ml aukstā PBS, pārvietoti, granulēti jaunā mēģenē, un pēc tam imunoprecipitētie proteīni tika eluēti, pievienojot 15-25 μl 2 × samazinot Laemmli proteīna parauga buferi. Šis IP protokols izraisīja praktiski visu AFosB izdalīšanos lizātā. Imunoprecipitētie proteīni tika pakļauti SDS-PAGE, ielādējot visu IP uz 12.5% Tris-HCl kritērija gēla (Bio-Rad, Hercules, CA), un pēc tam pārvietoja uz PVDF vai nitrocelulozi. Pēc pārneses membrāna tika žāvēta gaisā un 32P- un 35S-radioaktīvi iezīmētas proteīnu joslas tika novērotas autoradiogrāfijā, izmantojot Kodak (Rochester, NY) autoradiogrāfisko filmu, kā arī fosforizējot, izmantojot Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Kopējais (nefosforilētais un fosforilētais) ΔFosB šūnu lizātos vai smadzeņu homogenātos tika konstatēts, imunoblotējot vai nu ar imunoprecipitētu proteīnu (izmantojot to pašu membrānu, ko izmantoja, lai noteiktu \ t 32P-marķēts proteīns) vai vienādiem daudzumiem lizāta / homogenāta proteīna, kas pakļauts SDS-PAGE un pārnes uz PVDF vai nitrocelulozi. Pirmo reizi membrāna tika bloķēta, inkubējot to ar 1% (w / v) beztauku sauso pienu (Bio-Rad) PBS, kas papildināts ar 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) 1 h temperatūrā 25 ° C. Pēc tam membrānu imunoblotēja naktī pie 4 ° C ar mūsu pašu trušu anti-FosB poliklonālo antivielu, kas veidota pret FosB / ΔFosB aminoskābēm 1-16 (lieto 1: 10,000). Pēc primārās inkubācijas membrānas četras reizes nomazgāja 5 min ar bloķējošu buferšķīdumu, un pēc tam inkubēja 25 ° C temperatūrā UM1 h ar kazu anti-trušu IgG, kas bija konjugēts ar mārrutku peroksidāzi (izmantots 1: 5000 bloķējošā buferšķīdumā, no vektora Laboratories, Burlingame, CA). Pēc tam membrānas trīs reizes nomazgāja 10 min ar bloķējošu buferšķīdumu un vienu reizi 5 min ar PBS. Kopējās ΔFosB proteīnu joslas tika vizualizētas Kodak MR plēvē, izmantojot pastiprinātu ķīmijuminescenci (Pierce) un / vai fluorescences noteikšanu, izmantojot ECL-Plus reaģentus (Amersham Biosciences) un Storm PhosphorImager.

Rekombinantā ΔFosB pārprodukcija un attīrīšana no kukaiņu šūnām.

ΔFosB tika pārmērīgi izteikta Sf9 kukaiņu šūnās kā N-gala heksa-His-iezīmēta proteīna (N-His (6) ΔFosB), izmantojot Bac-to-Bac baculovīrusa ekspresijas sistēmu (Invitrogen) un ievērojot ražotāja norādījumus. Īsumā, ΔFosB cDNS (atlikumi 2 – 237), kam seko afinitātes N-termināla atzīme MGHHHHHHAG, tika subklonēti pFASTBacTM1 vektorā, kas tika izmantots rekombinantā bakulovira ģenerēšanai. Sf9 šūnas tika inficētas ar rekombinanto vīrusu, un N-His (6) ΔFosB tika attīrīts no šūnu lizātiem ar vairākiem hromatogrāfiskiem soļiem, ieskaitot afinitātes hromatogrāfiju, izmantojot niķeļa kolonnu (Qiagen, Valencia, CA), anjonu apmaiņu, izmantojot mono-Q kolonnu (Amersham Biosciences) un izmēru izslēgšana, izmantojot gēla filtrēšanas kolonnu (Amersham Biosciences).

In vitro fosforilācijas pētījumi.

In vitro fosforilācijas reakcijas laika gaitā un stehiometrijas analīzei tika veiktas 30 μl tilpumā, kas satur 10 μm substrātu (N-His (6) ΔFosB vai pozitīvu kontroles substrātu), 250 μm ATP un 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, kināzes ražotāja piegādātais buferis, un viens no šādiem kināzes: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) vai p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Laika gaitas reakcijas tika veiktas, atdalot 5 μl alikvotas no reakcijas šķīduma norādītajos laika punktos un pievienojot vienādu tilpumu 4 × samazinot Laemmli proteīna parauga buferi. Michaelis-Menten kinetiskie parametri CK2 reakcijai tika noteikti empīriski noteiktajos lineārās līdzsvara apstākļos. Šīs reakcijas tika veiktas 15 min 10 μl tilpumā, kas satur 2 ng / μl fermentu, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP un N-His (6) ΔFosB koncentrācijas, sākot no 2.5 – 30 μm. Visas reakcijas tika veiktas 30 ° C ūdens vannā. Pēc SDS-PAGE un gēla krāsošanas ar Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) želeju žāvēja, un 32P-fosfātu iekļaušana tika novērtēta, izmantojot fosforizēšanas analīzi (skatīt zemāk, Datu kvantifikācija, aprēķini un statistika).

Divdimensiju fosfopeptīdu karte un fosfonamīnskābes analīze.

Abas šīs analīzes tika veiktas, kā aprakstīts Ploegh un Dunn (2000). Īsumā, sausie gēla fragmenti, kas satur 32P-marķēts ΔFosB (vai nu no in vitro reakcijas vai metaboliski iezīmētu šūnu imunosadimenti), tika izņemti, rehidratēti, mazgāti un pakļauti triptiskajai gremošanai. Supernatants, kas satur triptiskās fermentācijas produktus, tika liofilizēts un liofilizāts vairākas reizes nomazgāts un atkārtoti suspendēts 10 μl elektroforēzes buferī, pH 1.9. Paraugs (3 μl) tika konstatēts uz celulozes plānslāņa hromatogrāfijas (TLC) plāksnes (Analtech, Newark, DE) un vienā dimensijā atdalīts ar elektroforēzi un otru dimensiju, augot TLC. Iegūtās fosfopeptīdu kartes tika vizualizētas ar autoradiogrāfiju un fosforizāciju. Fosfoamīnskābes analīzei 2 μl triptisko digestu, kas tika atkārtoti suspendēts elektroforēzes buferšķīdumā, tālāk tika atdalīts ar HCl hidrolīzi 105 ° C temperatūrā 25 min.2 atmosfērā. Reakcija tika pārtraukta ar seškārtīgu atšķaidīšanu ūdenī, un maisījums tika liofilizēts. Liofilātu atkārtoti suspendēja 5 μl elektroforēzes buferšķīdumā, pH 1.9, un plankumainu uz celulozes TLC plāksnes kopā ar fosfo-Ser, -Thr un -Tyr standartiem. Elektroforēze tika veikta vairāk nekā pusi no TLC plāksnes garuma, izmantojot elektroforēzes buferi, pH 1.9, un pēc tam plate tika pārnesta uz pH 3.5 buferi, un tika pabeigta elektroforēze. Fosfoamīnskābes standarti tika vizualizēti, izsmidzinot TLC plati ar 1% (v / v) ninhidrīna šķīdumu acetonā un 32P-marķēti aminoskābju paraugi tika vizualizēti gan autoradiogrāfijā, gan fosforizējot.

siRNS izraisītais CK2α knock-down.

Mēs izmantojām RNS traucējumu metodi, lai selektīvi samazinātu CK2 līmeņus (Di Maira et al., 2005). PC12 šūnas tika iesūktas uz kolagēna I pārklātajām sešstūrajām plāksnēm, lai nākamajā dienā sasniegtu N70 – 80% saplūšanu, kad tās īslaicīgi tika transfekcijas ar 20 nm (galīgā koncentrācija) vai nu necenorientētā siRNS vai siRNS, kas vērsta pret katalītiskā MRNS. α žurka CK2 apakšvienība, izmantojot 5 μl transfekcijas līdzekļa SilentFectin (Bio-Rad) un ievērojot ražotāja norādījumus. Aptuveni 24 h vēlāk šūnas īslaicīgi tika transficētas ar ΔFosB plazmīdu, kā minēts iepriekš. Aptuveni 24 h vēlāk (N48 h pēc siRNS transfekcijas), šūnas tika pakļautas vai nu 32P vielmaiņas marķējums vai pulsa-chase analīze, kā aprakstīts iepriekš. Šādi četri CK2α siRNSs tika izmantoti ar līdzīgus rezultātus: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3 "(Dharmacon, Lafayette, CO). Kā negatīvu kontroli mēs izmantojām Silencer negatīva kontrole #3 siRNA no Ambion (Austin, TX). CK2 knock-down apjomu novēroja, izmantojot imunoblotēšanu, izmantojot anti-CK2 poliklonālo antivielu (katalogs # 06-873 no Upstate) nakti 1: 1000 atšķaidījumā. β-Tubulīnu izmantoja kā iekraušanas kontroli un konstatēja ar monoklonālu antivielu (katalogs # 05-661 no Upstate) nakti 1: 20,000 atšķaidījumā.

Vietas virzīta mutagēze.

Ser27 mutācija uz Ala vai Asp tika veikta, izmantojot Quick Change Site-Directed Mutagenesis komplektu (Stratagene, La Jolla, CA) un ievērojot ražotāja norādījumus. Lai ievadītu Ser27 mutācijas peles ΔFosB proteīnā, tika izmantoti šādi mutagēzes primeri. Ser27 uz Ala: (atgriezeniskais primer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 uz Asp (priekšu grunts) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. Mutētās bāzes ir treknrakstā, un Ser27 kodons ir slīprakstīts.

Bioinformātika.

Potenciālās αFosB fosforilācijas vietas un kināzes tika meklētas, iesniedzot peles proteīnu secību specializētām datu bāzēm, ieskaitot ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004) un NetPhosK (Blom et al., 2004).

Datu kvantificēšana, aprēķini un statistika.

PVDF vai nitrocelulozes membrānā esošā proteīna daudzums tika kvantificēts, izmantojot Storm PhosphorImager un pievienoto ImageQuant programmatūru (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). Šūnu kultūrā un smadzeņu šķēlītēs fosforilācijas pētījumos iegūtās vērtības tika iegūtas 32Pēc tam P-iezīmētais proteīns tika sadalīts ar vērtībām, kas iegūtas attiecībā uz kopējo ΔFosB, un izteiktas kā attiecība. Iekš in vitro fosforilācijas pētījumi 32P-iezīmētais ΔFosB uz molu ΔFosB (stehiometrija) tika aprēķināts, kā aprakstīts iepriekš (Sahin et al., 2004). Visi mērījumi tika veikti izmantotā instrumenta linearitātes diapazonā. Kinētiskie parametri tika aprēķināti, izmantojot Michaelis-Menten modeli V = VMax[S] / ([S]+KM) Un VMax = k2[EKopā]. Pusperiods (t1/2) no FosB un FosB tika novērtēti no pulsa-chase parauglaukumiem (izmantojot nelineāro regresiju, kas vislabāk uzstādīja datu punktus) un atbilst laikam, kad atlikušā proteīna daudzums ir 50% no oriģināla. Visos attēlos redzamie rezultāti reprezentē vismaz divus līdz trīs neatkarīgus eksperimentus. Visos grafikos attēlotie dati ir vidēji ± SEM (3 ≤ n ≤16). Atšķirību statistiskā nozīmība tika novērtēta, izmantojot nesadalītu t testu, koriģējot vairākus salīdzinājumus, un zvaigznītes norāda p ≤ 0.05.

Iepriekšējā sadaļaNākamā sadaļa

rezultāti

ΔFosB ir neparasti stabils transkripcijas faktors

Lai gan iepriekš esam spekulējuši, ka ΔFosB ir relatīvi stabils transkripcijas faktors (Nestler et al., 2001), līdz šim nav veikta tieša proteīna apgrozījuma profila analīze. Lai risinātu šo jautājumu, mēs veicām pulsa-chase eksperimentus, izmantojot PC12 šūnas, kas tika plaši izmantotas kā neironu līdzīga šūnu līnija, kurā ΔFosB īslaicīgi izpaužas ar infekciju ar rekombinanto herpes simplex vīrusu (HSV-ΔFosB). Nesen sintezētie proteīni tika metabolizēti ar metabolismu 35S-Met / Cys un degradācijas modelis 35S-marķēts ΔFosB (35S-ΔFosB) tika kontrolēts, imunizucējot to no šūnu lizātiem, kas iegūti dažādos laika punktos pēc radioaktīvi iezīmēto aminoskābju noņemšanas. Imunoprecipitātu analīze ar SDS-PAGE un autoradiogrāfiju atklāja, ka ΔFosB pusperiods PC12 šūnās ir N10 h (Fig. 1). Šie atklājumi liecina, ka ΔFosB eliminācijas pusperiods ir lielāks nekā vairumam inducējamo transkripcijas faktoru (skat. Diskusiju), ieskaitot pilna garuma FosB, kura pusperiods šūnu kultūrā ir ∼90 min.Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Turklāt ir vērts atzīmēt, ka ΔFosB degradācija neietilpst pirmās pakāpes eksponenciālās sabrukšanas līknē, bet drīzāk tā ir divfāziska, sākot ar lēnāku noārdīšanās ātrumu. Tas liecina par vairāk nekā vienu ΔFosB sugu un / vai vairāk nekā vienu noārdīšanās ceļu.

Skaitlis 1.

Skatīt lielāku versiju:

Skaitlis 1.

ΔFosB ir neparasti stabils transkripcijas faktors. ΔFosB pusperiods šūnu kultūrā ir N10 h. AFosB tika izteikts PC12 šūnās, vai nu inficējot ar HSV-AFosB, vai pārejošu transfekciju ar AFosB saturošu plazmīdu, un šūnas tika pakļautas pulsa-chase eksperimentiem, kā aprakstīts Materiāli un metodes. Līdzvērtīgi rezultāti tika iegūti neatkarīgi no metodes, kas izmantota ΔFosB pārmērīgai ekspresijai. Attēlā ir parādīta ΔFosB noārdīšanās laika gaita (un reprezentatīvā autoradiogramma). Uzzīmētie dati ir vismaz 15 atsevišķo datu punktu vidējais ± SEM, kas iegūti no vismaz pieciem neatkarīgiem eksperimentiem. Salīdzinājumam ir norādīts pilnais FosB pussabrukšanas periods.

ΔFosB ir fosfoproteīns smadzenēs

Mēs esam pieņēmuši, ka ΔFosB pēctranslācijas modifikācija var veicināt tā acīmredzamo stabilitāti. Tā kā ir pierādīts, ka fosforilācija daudzējādā ziņā ietekmē transkripcijas faktoru aktivitāti, tostarp to stabilitāti (skat Desterro et al., 2000; Whitmarsh un Davis, 2000), mēs pētījām, vai ΔFosB ir fosfoproteīns. Šajā nolūkā αFosB ekspresija tika ierosināta žurku smadzenēs, lietojot hronisku ECS, kas ir zināms, ka tas izraisa augstu ΔFosB līmeni, jo īpaši frontālā garozā (Hope et al., 1994a). Vienu dienu pēc pēdējās ECS ārstēšanas, kad ΔFosB līmenis saglabājas augsts, tika sagatavotas plānas priekšējās kortikālās šķēlītes un metaboliski marķētas ar 32P-ortofosfāts. Paralēli sagrieztu šķēļu komplektu nenorādīja radioaktīvi, un tos izmantoja, lai noteiktu kopējo AFosB līmeni. Pēc imunoprecipitācijas ar specifisku anti-FosB / ΔFosB antivielu un imunoprecipitēto proteīnu atdalīšanu ar SDS-PAGE, fosforilējot 32P-marķēts ΔFosB tika konstatēts ar autoradiogrāfiju, bet kopējā ΔFosB tika konstatēta ar imunoblotēšanu. Šī analīze parādīja, ka ΔFosB ir fosforilēts smadzenēs, par ko liecina specifisks 32P-iezīmēta ∼35 kDa josla, kas atrodas hroniski apstrādātajos smadzeņu paraugos, bet faktiski nav konstatējama, izmantojot viltus apstrādātās kontroles (Fig. 2A). Tas saskan ar to, ka hroniskas stimulācijas neesamības gadījumā ΔFosB bazālie līmeņi ir ļoti zemi. Imunoprecipitācijas reakcijas specifiku ilustrē signāla trūkums nonimūnās IgG nogulsnēs.

Skaitlis 2.

Skatīt lielāku versiju:

Skaitlis 2.

ΔFosB ir fosfoproteīns smadzenēs. A, ΔFosB ir fosforilēts smadzenēs. Endogēnu ΔFosB inducēja žurku smadzenēs ar hronisku ECS ārstēšanu, kā aprakstīts Materiāli un metodes. Frontālās kortikālās šķēlītes tika metabolizētas ar metabolismu 32PH3PO4 vairākas stundas. Pēc šķēļu homogenizācijas ΔFosB tika imunizēts un fosforilēts ΔFosB (32P-ΔFosB) tika konstatēts autoradiogrāfijā (augšējais panelis). Kopējais ΔFosB netradioaktīvos imunoprecipitātos tika konstatēts ar imunoblotēšanu (apakšējais panelis). Kā negatīvas kontrolparaugas ir parādīta viltus apstrādāta dzīvnieka un neimūnās IgG imunoprecipitāts. B, Bioinformātiskās analīzes rezultātā tika iegūtas kandidātu fosforilācijas vietas un kināzes ar atbilstošiem prognozes rādītājiem peles ΔFosB proteīna secībai. Kandidātu vietnes ar augstākiem prognozēšanas rādītājiem ir iezīmētas proteīnu secībā un uzskaitītas tabulā. DNS saistošs (bāzes) domēns un leucīna rāvējslēdzējs ir baltā secībā treknrakstā. C, DΔFosB fosforilācija palielinās ar Ser / Thr fosfatāzes inhibitoru OA. C, 32P-ΔFosB līmeņi imūndepipitātos no frontālās garozas šķēlītēm, kas marķētas, ja nav (Ctr) vai 100 ng / ml OA (grafiks un augšējais panelis), tika konstatēti ar autoradiogrāfiju. Apakšējā panelī parādīts kopējais ΔFosB, kas konstatēts imunoprecipitātēs no nenoslogotām šķēlītēm ar imunoblotēšanu. DPC12 šūnas tika inficētas ar HSV-ΔFosB vai HSV-LacZ (vektoru) un metaboliski marķētas ar 32PH3PO4 100 ng / ml OA klātbūtnē vai bez klātbūtnes. 32P-ΔFosB līmeņi imūndepipitātos tika konstatēti autoradiogrāfijā (grafiks, augšējais panelis). Apakšējā panelī parādīts kopējais ΔFosB, kas konstatēts šūnu lizātos ar imunoblotēšanu.

Kā pirmais solis, lai noskaidrotu, kura kināze (-as) un vieta (-as) ir iesaistītas ΔFosB fosforilācijā, mēs pakļaujām tās aminoskābju secībai vairākas bioinformātiskas analīzes. Tas atklāja, ka, lai gan ΔFosB nesatur Tyr fosforilācijas kandidātu vietas, tas satur vairākas Ser / Thr kināzes konsensa vietas, ieskaitot trīs CaMKII vietas, trīs CK2 vietas un divas PKC vietas ar ļoti augstu fosforilācijas prognozes punktu skaitu (Fig. 2B). Ja, kā prognozēts, izmantojot bioinformātiku, ΔFosB fosforilējas tikai Ser vai Thr atliekās, tad tā fosforilācija būtiski jāmaina ar Ser / Thr fosfatāžu aktivitāti. Lai pārbaudītu šo hipotēzi, mēs ar etiķešu šķēlītēm iezīmējām 32P-ortofosfāts OA, Ser / Thr proteīna fosfatāzes inhibitora klātbūtnē vai bez tās. Kā parādīts Skaitlis 2C, OA izraisīja lielu (N2.5 reizes) pieaugumu 32P-ΔFosB. Tas arī izraisīja nelielu kopējo ΔFosB līmeņu pieaugumu, kas atbilst iepriekšējiem ziņojumiem, kas sasaista OA kancerogēno iedarbību ar tās spēju izraisīt vairākus tiešus agrīnus gēnus, tostarp Fos proteīnus (Millers et al., 1998; Choe et al., 2004). Neto rezultāts ir ievērojams kopējais pieaugums (N60%) fosforilētos ΔFosB līmeņos.

Pēc tam mēs pētījām, vai PC12 šūnās, kas ir vairāk pakļautas eksperimentālai manipulācijai, ΔFosB parādīja fosforilācijas modeli, kas ir līdzīgs tam, kas redzams smadzenēs. Mēs izdalījām ΔFosB PC12 šūnās, inficējot ar HSV-ΔFosB un metaboliski marķējot šūnas ar 32P-ortofosfāts OA klātbūtnē vai bez tās. Par proteīna veiksmīgu ekspresiju un imunoprecipitāciju no HSV-ΔFosB inficētām šūnām liecina gan imunoblota klātbūtne (Fig. 2Dbottom35 kDa joslas apakšējā panelī) un autoradiogrāfijā (augšējā panelī), kas nav vektora inficētajās šūnās. Kā novērots smadzenēs, OA izraisīja nelielu kopējo ΔFosB līmeņu pieaugumu, bet daudz lielāks (aptuveni divreiz) palielinājās. 32P-ΔFosB, radot nozīmīgu (N50%) ΔFosB fosforilācijas neto pieaugumu. Turklāt, saskaņā ar bioinformātiskajām prognozēm, PC12 šūnu ārstēšana ar Tyr fosfatāzes inhibitoru neizraisīja būtiskas izmaiņas. 32P-ΔFosB līmeņi (dati nav parādīti). Kopā šie atklājumi atklāja, ka ΔFosB ir fosforilēts uz Ser un / vai Thr atliekām smadzenēs un PC12 šūnās, un apstiprināja, ka tā ir laba šūnu kultūras sistēma, kurā tālāk izpētīt ΔFosB fosforilācijas un noārdīšanās profilus.

CK2, bet ne PKC vai CaMKII fosforilē ΔFosB in vitro

Kā aprakstīts iepriekš, ΔFosB aminoskābju sekvences analīze atklāja augstas prognozes rādītājus CK2, PKC un CaMKII fosforilācijas vietām. Lai noteiktu, kuras no šīm kināzēm var fosforilēt ΔFosB, mēs veicām virkni in vitro fosforilācijas reakcijas, izmantojot attīrītas kināzes un attīrītu rekombinanto ΔFosB. Kā parādīts Skaitlis 3A, no trim kandidātkināzēm tikai CK2 fosforilēja ΔFosB nozīmīgā veidā. Turklāt tika pārbaudītas vairākas citas kināzes (piemēram, GSK3 un p70S6K), bet neizdevās ievērojami fosforilēt ΔFosB (dati nav parādīti). CK2 reakcijas papildu raksturojums ar laika gaitas analīzi atklāja, ka šī kināze var katalizēt ∼0.5 mol fosfāta molu ΔFosB molam (Fig. 3B). Tas, ka CK2 var fosforilēt ΔFosB in vitro uz ievērojamu stehiometriju (N50%) liecina par fizioloģiski būtisku reakciju. Pēc tam mēs pētījām šīs reakcijas kinētiku, inkubējot CK2 arvien vairāk attīrītu ΔFosB daudzumu, un mēs noteicām, ka CK2 fosforilē ΔFosB ar Vmaks no 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 fermentu, a KM no 18.4 μm, un a kkaķis no 0.2 / s (Fig. 3C). Šo kinetisko parametru vērtības vēl vairāk apstiprina šīs reakcijas fizioloģisko nozīmību. Piemēram, KM CK2 DARPP32, viens no tās pazīstamākajiem substrātiem, ir 3.4 μm, un kkaķis ir ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); KM ATP svārstās no ∼10 – 40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002) un kazeīna diapazons ir no ∼10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Kopā šie dati liecina, ka ΔFosB ir bona fide substrāts CK2 in vitro.

Skaitlis 3.

Skatīt lielāku versiju:

Skaitlis 3.

CK2, bet ne PKC vai CaMKII fosforilē ΔFosB in vitro. Autoradiogrāfs (augšējais panelis) parāda fosforilēto produktu, un Coomassie krāsotais gēls (apakšējais panelis) parāda kopējo reakcijā esošo ΔFosB. ATika veikts attīrīts rekombinants ΔFosB in vitro fosforilēšana ar dažādām kandidātkināzēm (no kurām trīs ir parādītas). B, Laika gaita un stehiometriskās analīzes liecina, ka CK2 var fosforilēt ΔFosB in vitro ar o50% stehiometriju. CCK2 reakcijas kinētiskā analīze atklāja, ka ΔFosB ir bona fide in vitro substrāts. Reakcijas linearizācija ir parādīta divkāršā reciproka diagrammā (apakšā), bet kinētiskie parametri tika iegūti no Michaelis-Menten līknes (augšā).

CK2 modulē ΔFosB fosforilāciju un stabilitāti neskartās šūnās

Lai novērtētu ΔFosB CK2-mediētā fosforilācijas fizioloģisko nozīmi, mēs veicām salīdzinošu fosfopeptīdu kartēšanu, izmantojot in vitro fosforilēts un PC12-šūnu fosforilēts ΔFosB. Pēc SDS-PAGE un gēla eluēšanas 32P-ΔFosB (no in vitro reakcijas vai no imunoprecipitāta 32P-iezīmētās šūnas), olbaltumviela tika sagremota ar triptīnu, un iegūtie fosfeptīdi tika pakļauti divdimensiju atdalīšanai. Šī analīze atklāja, ka galvenais fosfeptīds no CK2 reakcijas pārceļas ar vienu no diviem fosfeptīdiem no FosB, kas fosforilēts PC12 šūnās (Fig. 4A), savukārt fosfopeptīdi, kas radušies PKC vai CaMKII (dati nav parādīti) reakcijā, nebija. Kartē no PC12 šūnām bija otrs ΔFosB fosfopeptīds, bet kāda no kināzēm nespēja pārbaudīt, lai radītu līdzīgu fosfopeptīdu. in vitrošobrīd mēs nezinām, vai šis otrais fosfopeptīds satur fosforilācijas vietu, kas atšķiras no citas fosfopeptīda, vai arī tas ir atšķirīgs triptisks peptīds, kas satur to pašu fosforilācijas vietu.

Skaitlis 4.

Skatīt lielāku versiju:

Skaitlis 4.

CK2 modulē ΔFosB fosforilāciju un stabilitāti neskartās šūnās. A, CK2, bet ne PKC, šķiet, fosforilē ΔFosB šūnās. CK2 vai PKC fosforilētās ΔFosB divdimensiju fosfeptīdu kartes in vitro vai ar neskartām PC12 šūnām. Bultiņas parāda CK2 fosforilētā peptīda, bet ne PKC-fosforilētā savienojuma ar vienu no ΔFosB fosfopeptīdiem, kas iegūti no PC12 šūnām, migrāciju. BΔFosB fosforilācija PC12 šūnās tiek palielināta, ārstējot šūnas ar spēcīgu CK2 aktivatora spermīnu (SP) un samazinot ārstēšanu ar CK2 inhibitoru DRB. Pretstatā tam, AFosB fosforilācija PC12 šūnās neietekmēja ārstēšanu ar PKC aktivatoru (PMA) vai PKC specifisko inhibitoru calphostin-C (Calph). Tiek parādīta reprezentatīva autoradiogramma (augšējais panelis) un imunoblots (apakšējais panelis). C – F, CK2 aktivitātes ietekme uz ΔFosB stabilitāti. Attēlā parādīta laika gaita (un reprezentatīvā autoradiogramma) ΔFosB degradācijai. PC12 šūnas, kas īslaicīgi ekspressē ΔFosB, tika pakļautas pulsa-chase eksperimentiem, kas tika veikti, ja CK2 inhibitora DRB klātbūtne nav klāt.C), CK2 aktivatora spermīns (D) vai plaša spektra kināzes inhibitoru H-8 (E), ko izmantoja, lai kontrolētu DRB nespecifisko ietekmi. F, CK2 katalītiskās apakšvienības nolaišanas ietekme uz ΔFosB stabilitāti. PC12 šūnas tika transfekētas ar necenorientējošu siRNS (Ctr) vai siRNS, kas mērķēja uz žurkām CK2α un 24 h, kas vēlāk tika transficētas ar AFosB plazmīdu. Augšējais panelis attēlo veselu šūnu lizātu imūnoblotus, kas parāda CK2 siRNS ietekmi uz CK2 un ΔFosB proteīna līmeni. Atbilstošais imūnoblots β-tubulīnam ir parādīts kā iekraušanas kontrole.

Lai vēl vairāk risinātu CK2 kā FosB kināzes fizioloģisko nozīmi, mēs apstrādājām AFosB ekspresējošās PC12 šūnas ar divām zālēm, kas modulē CK2 aktivitāti. Kā parādīts Skaitlis 4BΔFosB fosforilācija tika samazināta, apstrādājot PC12 šūnas ar šūnu caurlaidīgu CK2 inhibitoru DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995) un palielināts, ārstējot ar poliaminu spermīnu, kas pazīstams kā spēcīgs CK2 aktivators (Cochet un Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Turpretī PC12 šūnu ārstēšana ar PKC inhibitoru calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) vai PKC aktivatoru PMA (Schmidt un Hecker, 1975; Beh et al., 1989) neizraisīja būtiskas izmaiņas ΔFosB fosforilācijā. PMA gadījumā nelielais (un ne nozīmīgais) pieaugums 2006. \ T 32P-ΔFosB varētu būt saistīts ar šīs zāles izraisīto kopējo ΔFosB līmeņu palielināšanos; patiesībā ir ziņots, ka forbolu esteri izraisa vairāku Fos ģimenes proteīnu, tostarp FosB, ekspresiju (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Turklāt šūnu apstrāde ar specifisku caurlaidīgu CaMKII inhibitoru m-AIP (Ishida un Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) arī neizraisīja samazinātu ΔFosB fosforilāciju (dati nav parādīti). Kopā šie rezultāti atbilst mūsu in vitro konstatē, ka neskartās šūnās ΔFosB, iespējams, fosforilējas ar CK2, bet ne PKC vai CaMKII. Tas, ka CK2 inhibīcija pilnībā neizslēdz FosB fosforilāciju, norāda uz papildu fosforilācijas vietu esamību proteīnā.

Pēc tam mēs pārbaudījām, vai CK2 spēlē lomu ΔFosB apgrozībā un tādējādi arī tās stabilitātē. Lai to panāktu, mēs veicām eksperimentus ar pulsāciju, izmantojot AFosB ekspresējošās PC12 šūnas, kas tika ārstētas ar fosforilācijas pētījumā izmantoto CK2 inhibitoru vai CK2 aktivatoru. Kā parādīts Skaitlis 4Cšūnu ārstēšana ar CK2 inhibitoru DRB būtiski ietekmēja ΔFosB apgrozījuma ātrumu, ko apliecina tās degradācijas līknes formas maiņa no bifāziskās uz līkni, kas ir tuvāka eksponenciālās sabrukšanas līknei. Un otrādi, CK2 aktivatora spermīna klātbūtne izraisīja ievērojamu ΔFosB sadalīšanās ātruma samazināšanos, kas izraisīja proteīna uzkrāšanos pirmās dzemdību stundas laikā.Fig. 4D).

Tāpat kā daudziem kināzes aktivatoriem un inhibitoriem, spermīnam un DRB var būt metaboliska iedarbība ārpus CK2 aktivitātes modulācijas. Faktiski ir pierādīts, ka DRB inhibē transkripcijas faktora IIH (TFIIH) saistīto kināzi (Yankulov et al., 1995), kas izraisa RNS polimerāzes II mediētās transkripcijas inhibīciju. Tā kā šī ietekme varētu ietekmēt ΔFosB stabilitāti, mēs analizējām plaša spektra kināzes inhibitora H-8 (Hidaka un Kobayashi, 1992) par ΔFosB apgrozījumu koncentrācijā (200 μm), kas, kā zināms, inhibē TFIIH saistīto kināzi, bet ne CK2 (Yankulov et al., 1995). Kā parādīts Skaitlis 4Eārstēšana ar H-8 neietekmēja ΔFosB apgrozījuma ātrumu. Līdzīgi rezultāti tika iegūti ar citu plašu spektru kināzes inhibitoru H-7, kuru lietoja koncentrācijā, kas inhibē TFIIH saistīto kināzi, bet ne CK2 (dati nav parādīti). Šie dati vēl vairāk apstiprina interpretāciju, ka DRB izraisītā ΔFosB stabilitātes samazināšanās, visticamāk, ir saistīta ar CK2 inhibīciju.

Lai vēl vairāk noskaidrotu CK2 lomu ΔFosB apgrozījumā, mēs pētījām CK2 nokļūšanas sekas caur siRNA. Mēs veicām šos eksperimentus, izmantojot PC12 šūnas, kuras vispirms tika transficētas ar kontroles (nontargeting) siRNS vai siRNA, kas mērķē žurkas CK2 (CK2α) katalītiskā subvienības mRNS un vēlāk pārnēsāta ar ΔFosB. Kā parādīts Skaitlis 4F, transfekcija ar CK2α siRNA efektīvi un specifiski iznīcināja CK2α proteīna līmeni, neietekmējot ΔFosB līmeni (augšējais panelis). Pulsa-chase analīze parādīja, ka CK2 nokaušana izraisīja ievērojamu ΔFosB apgrozījuma ātruma pieaugumu, par ko liecina ātrāka proteīna degradācija. Fakts, ka CK2 aktivitātes inhibēšana (vai nu izmantojot DRB vai siRNS) palielina ΔFosB apgrozījumu un izraisa bifāziskās līknes lēnā ātruma komponenta izzušanu, bet CK2 aktivizēšana uzlabo lēnas līknes fāzi, nodrošina spēcīgu atbalstu ideja, ka CK2 spēlē lomu ΔFosB stabilitātes regulēšanā.

CK2 fosforilē ΔFosB uz Ser27

Lai sāktu identificēt vietu (-as) uz ΔFosB, kas fosforilēts ar CK2, mēs veicām fosforilīnskābes analīzi ar rekombinanto ΔFosB, kas fosforilēts ar CK2 in vitro un AFosB, kas fosforilēts PC12 šūnās. Šie eksperimenti atklāja, ka abos gadījumos vienīgā konstatētā fosfo-aminoskābe bija fosfo-Ser (Fig. 5A). Šis konstatējums kopā ar stehiometriju, kas iegūta CK2 in vitro fosforilācijas reakcija (N50%) (Fig. 3B) un tikai viena nozīmīga vieta CK2 fosfopeptīda kartē (Fig. 4A), liecina, ka ΔFosB fosforilēšana CK2, iespējams, ir ierobežota ar vienu serīna atlikumu. Šis secinājums atbilst fosforilācijas konsensa vietas analīzei (Fig. 2B), kas paredzēja tikai vienu kandidātu serīnu, ti, Ser27, CK2. Taksonomiskā analīze atklāja, ka Ser27 ir ļoti saglabājies, attīstoties Fos ģimenes locekļiem (Fig. 5B), kas liecina, ka tai var būt svarīga fizioloģiska funkcija.

Skaitlis 5.

Skatīt lielāku versiju:

Skaitlis 5.

CK2 fosforilāti ΔFosB uz Ser27. A, Fosforilīnskābes analīze fosforilētā CK2 (in vitro) un PC12 šūnu fosforilētā ΔFosB, kas parāda, ka abos gadījumos galvenais atlikums fosforilē ir serīns. BFosB / ΔFosB aminoskābju sekvences krustenisko sugu analīze atklāja Ser27 augstu saglabāšanos starp Fos ģimenes locekļiem no cilvēka līdz zebrafam (tumšs izcēlums). Tomēr skāba atlikums pozīcijā + 3, kas nepieciešams CK2 konsensa vietai, nav saglabāts (gaismas izgaismojums). C, HeLa šūnas īslaicīgi tika transficētas ar savvaļas AFosB (WT) vai ΔFosB, kas satur punktu mutāciju, lai aizstātu Ser27 ar Ala (S27A). Šūnas tika metaboliski marķētas ar 32PH3PO4 un ar spermīnu (SP), lai aktivizētu CK2. Tiek parādīta reprezentatīva autoradiogramma (augšējais panelis) un iegūto ΔFosB imunoprecipitātu imūnoblots (apakšējais panelis). Tiek parādīta izspēlēto šūnu (vektora) imunoprecipitācija.

Lai noskaidrotu, vai Ser27 ir fosforilēts ΔFosB, mēs šo atlikumu pārveidojām Ala, un analizējām sekas uz proteīna fosforilācijas stāvokli. Šim nolūkam mēs izmantojām HeLa šūnas (kuras var transfekēt ar lielāku efektivitāti), lai īslaicīgi izteiktu vai nu WT vai S27A mutantu ΔFosB. Aptuveni 24 h pēc transfekcijas šūnas tika metabolizētas metaboliski 32Tika sagatavoti P-ortofosfāti un veselu šūnu lizāti. Pēc imunoprecipitācijas un SDS-PAGE, 32P-ΔFosB tika konstatēts ar autoradiogrāfiju un kopējo ΔFosB ar imunoblotēšanu. Kā parādīts Skaitlis 5C (Apakšējais panelis), vektora transfekto šūnās ΔFosB netika konstatēts, bet šūnas, kas transfekētas ar WT vai S27A mutantu ΔFosB, veiksmīgi ekspresēja proteīnu. Mēs atklājām, ka S27A mutācija izraisīja ievērojamu (N30%) samazinājumu 32P-ΔFosB līmeņi (Fig. 5C, augšējo paneli un grafiku), norādot, ka dzīvās šūnās ΔFosB ir fosforilēts uz Ser27. Lai noteiktu, vai šūnās Ser27 patiešām fosforilējas CK2, mēs salīdzinājām CK2 aktivatora spermīna spēju modulēt WT un S27A ΔFosB fosforilāciju. Kā mēs iepriekš novērojām PC12 šūnās (Fig. 4B), HeLa šūnu ārstēšana ar spermīnu ievērojami palielināja WT proteīna fosforilāciju. Tas, ka S27A mutācija šo efektu ievērojami samazināja (Fig. 5C) atbalsta interpretāciju, ka Ser27 ΔFosB ir fizioloģisks substrāts CK2.

Ser27 fosforilācija regulē ΔFosB stabilitāti

Pēc tam, kad CK2 tiek inhibēts un uzlabots, kad CK2 ir aktivizēts, konstatējot, ka ΔFosB stabilitāte ir samazinātaFig. 4) un ka CK2 fosforilē ΔFosB uz Ser27 (Fig. 5), mēs paredzējām, ka šīs vietnes fosforilācijas novēršanai vajadzētu destabilizēt proteīnu. Eksperimenti ar pulsa-vajāšanu, kas veikti ar HeLa šūnām, kas īslaicīgi ekspresē vai nu WT vai S27A mutantu ΔFosB, atklāja, ka, kā prognozēts, S27A mutācija izraisīja ΔFosB degradācijas ātruma ievērojamu pieaugumu un vienlaikus samazina proteīna pusperiodu. (Fig. 6A). Pēc tam mēs pētījām, vai šis regulējošais mehānisms notiek arī vairāk neironu līdzīgā PC12 šūnu līnijā. Šie eksperimenti atklāja, ka, kā mēs novērojām HeLa šūnās, S27A punkta mutācija izraisa ΔFosB pusperioda strauju samazināšanos PC12 šūnās (no ∼11 līdz ∼4 h).Fig. 6B). Fakts, ka šī destabilizācija ir līdzīga CK2 kavēšanas vai nojaukšanas izraisītajai \ tFig. 4) sniedz papildu atbalstu idejai, ka Ser2 CK27-mediētā fosforilācija regulē ΔFosB stabilitāti. Papildu pierādījumi par Ser27 fosforilācijas regulējošo lomu ΔFosB proteīna apgrozībā tika iegūti, izmantojot fosfomimetisko Ser27 uz Asp mutāciju (S27D). S27D mutāciju uzskata par fosfomimetiku, jo tā aminoskābē 27 ievieto lielu negatīvi lādētu (karboksil) grupu un tādējādi daļēji atdarina Ser27 fosforilāciju. Kā parādīts Skaitlis 6C, S27D mutācija izraisīja pretēju S27A mutācijas efektu un izraisīja proteīna daudz stabilāku nekā WT proteīns. Līdzīgi kā ietekme, kas iegūta pēc CK2 aktivizēšanas (Fig. 4D), S27D mutācija izraisīja uzkrāšanos un tādējādi palielināja ΔFosB līmeni pirmajās tramdīšanas stundās.

Skaitlis 6.

Skatīt lielāku versiju:

Skaitlis 6.

Ser27 fosforilācija regulē ΔFosB stabilitāti. A, C, Pulse-chase analīze, kas parāda Ser27 fosforilācijas ietekmi uz ΔFosB apgrozījuma ātrumu. Tiek parādīts savvaļas tipa AFosB (WT), Ser27 līdz Ala mutanta (S27A) un fosfomimetisko Ser27 uz Asp mutantu (S27D) sadalīšanās profils un aprēķinātais pusperiods. Tie paši konstatējumi iegūti HeLa šūnās (A) un PC12 šūnas (B, C).

Ser27 fosforilācija stabilizē ΔFosB, novēršot tā proteasomu degradāciju

Lai sāktu izskaidrot mehānismu, ar kuru Ser27 fosforilācija stabilizējas ΔFosB, mēs pārbaudījām proteasomu inhibitoru MG132 spēju (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) un epoksomicīnu (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) modulēt WT un S27A mutanta degradācijas ātrumu ΔFosB. Pulse-chase eksperimenti tika veikti, izmantojot PC12 šūnas, kas inficētas ar rekombinanto HSV, kas ekspresē vai nu WT vai S27A ΔFosB, un apstrādājamas ar DMSO vai vienu no diviem proteasomu inhibitoriem. Šie eksperimenti atklāja, ka, lai gan WT proteīna sadalīšanās ātrums ir relatīvi nejutīgs pret kādu no diviem proteasomu inhibitoriem (Fig. 7A), S27A mutanta jutība pret šīm zālēm (Fig. 7B). Tas norāda, ka atšķirībā no WT proteīna S27A mutants ir proteaomu degradācijas mērķis. Patiešām, šūnu ārstēšana ar MG132 vai epoksomicīnu pilnībā mainīja S27A mutācijas ietekmi uz ΔFosB degradācijas ātrumu, ko apliecina S27A mutanta pusperioda palielināšanās no ∼4 līdz ∼9 h MG132 un ∼ 12 h epoksomicīnam (Fig. 7B). Kopā šie rezultāti liecina, ka ΔFosB fosforilācija uz Ser27 aizsargā proteīnu no proteasomālās degradācijas un tāpēc ir būtiska tās neparastajai stabilitātei.

Skaitlis 7.

Skatīt lielāku versiju:

Skaitlis 7.

Ser27 fosforilācija stabilizē ΔFosB, novēršot tā proteasomu degradāciju. A, B, Pulsa-chase analīze ar HSV inficētām PC12 šūnām, kas parāda savvaļas tipa ΔFosB sadalīšanās profilu un paredzamo pusperiodu (A) vai S27A ΔFosB (B) vai nu kāda no diviem proteasomu inhibitoriem [MG132 un epoksomicīns (Epoxo)]. Ņemiet vērā to, ka nevienam medikamentam nav būtiskas ietekmes uz savvaļas tipa AFosB apgrozījumu, bet šūnu ārstēšana ar abiem proteasomu inhibitoriem izraisīja S27A ΔFosB stabilizāciju. C, Ser27 fosforilācijas lomu ΔFosB spējā mediēt ilgtermiņa smadzeņu plastiskumu. Pēc indukcijas AFosB daļu smadzenēs stabilizē S2 ar CK27 starpniecību. Tas izraisa tā uzkrāšanos, kas savukārt izraisa ilgstošas ​​izmaiņas gēnu ekspresijā. Šīs stabilās gēnu ekspresijas izmaiņas veicina stabilu uzvedību. Turpretī S27 fosforilācija ar fosfatāzes Ser / Thr PP1 un / vai PP2A izraisa proteīna destabilizāciju un tās apstrādi ar proteasomu mašīnu.

Iepriekšējā sadaļaNākamā sadaļa

diskusija

Šajā pētījumā mēs parādām, ka ΔFosB ir N10 h pusperiods šūnu kultūrā, kas padara to stabilu salīdzinājumā ar pilna garuma FosB un vairumu citu inducējamu transkripcijas faktoru, kuru pusperiods šūnu kultūrā var būt tikpat īss dažas minūtes un reti pārsniedz 3 h (Hann un Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts un Whitelaws, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Turklāt mēs atklājam, ka ΔFosB ir fosforilēts smadzenēs un ka tā fosforilācija ir jutīga pret PP1 / PP2A inhibitoru okadaīnskābi. Mūsu šūnu kultūras pētījumi pierāda, ka ΔFosB stabilitāti modulē CK2 ar lielāku CK2 aktivitāti, kas stabilizē proteīnu. Visbeidzot, mūsu rezultāti liecina, ka CK2 fosforilē ΔFosB uz ļoti konservēta N-gala serīna (S27) un pierāda, ka S27 fosforilācija aizsargā ΔFosB no proteasomālās degradācijas. Tādēļ mēs piedāvājam modeli, kurā ΔFosB fosforilēšana uz S27 ar CK2 ir kritisks regulēšanas mehānisms ΔFosB apgrozījumam (Fig. 7C). Šāda FosB fosforilācijas mediētā stabilizācija ir funkcionāli svarīga, jo ir pierādīts, ka palielināts ΔFosB līmenis konkrētos smadzeņu reģionos tieši regulē daudzus neironu gēnus in vivo un iedarbīgi iedarboties uz vairākiem neiropsihiskiem traucējumiem dzīvnieku modeļos (skatīt ievadu).

Lai gan fosforilēšana ir ātrs un atgriezenisks veids, kā regulēt dažu transkripcijas faktoru, piemēram, CREB (cAMP atbildes elementa saistošā proteīna) transkripcijas aktivitāti (Bohmann, 1990), transkripcijas faktoru degradācijas modulēšana nodrošina vēl spēcīgāku (mazāk viegli atgriezenisku) regulējuma formu (Desterro et al., 2000). Transkripcijas faktori, kuru funkcionālā aktivitāte tiek regulēta to sadalīšanās līmenī, ietver NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999) un c-Fos (Ferrara et al., 2003), starp citiem. Daudzos gadījumos fosforilācija ir galvenais transkripcijas faktora stabilitātes regulators, kā tas ir parādīts c-Fos (Okazaki un Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Ar Fos saistīto antigēnu-1 (Fra-1) (Vial un Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000) un p53 (Buschmann et al., 2001). Tādējādi mūsu pētījumi pievieno ΔFosB šim transkripcijas faktoru sarakstam, kura funkcionālā aktivitāte tiek regulēta ar fosforilēto atkarību.

CK2 ir visuresoša un konstitutīvi aktīva Ser / Thr kināze, kurai līdz šim ir identificēti> 300 apgalvotie substrāti un kas ir iesaistīta vairākos bioloģiskos procesos, ieskaitot šūnu nāvi un izdzīvošanu (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), šūnu stresa reakcijas (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003) un DNS remonts un hromatīna pārveidošana (\ tBarz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Vairāk nekā viena trešdaļa no CK2 paredzamajiem substrātiem ir proteīni, kas iesaistīti gēnu ekspresijas regulēšanā.Meggio un Pinna, 2003). Faktiski ir pierādīts, ka CK2 ir ievērojama kodolkināze (Krek et al., 1992) (pārskatīšanai skat Yu et al., 2001) un mijiedarboties ar vairāku transkripcijas faktoru bZIP domēniem (Yamaguchi et al., 1998). Ir pierādīts, ka arī CK2 mediētā fosforilācija modulē daudzu olbaltumvielu, tostarp IkB, degradāciju (to pastiprina vai samazina).Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres un Pulido, 2001), lēcu connexin (Yin et al., 2000), ar hromatīnu saistīts proteīns HMG1 (Wisniewski et al., 1999) un vairāki transkripcijas faktori, piemēram, HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997) un c-Myc (Channavajhala un Seldin, 2002). CK2 ir visbiežāk sastopams smadzenēs (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), un tās darbība ir saistīta ar daudziem smadzeņu darbības aspektiem, ieskaitot neironu izdzīvošanu (\ tBoehning et al., 2003), diferenciācija (Nuthall et al., 2004), jonu kanāla funkcija (Jones un Yakel, 2003; Bildl et al., 2004) un ilgstoša potencēšana un neironu plastiskums (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman un Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).

Neskatoties uz šo pieaugošo pierādījumu par CK2 lomu neironu funkcijas regulēšanā, ir maz zināms par to, kas kontrolē tās darbību. Tiek uzskatīts, ka CK2 ir konstitutīvi aktīvs, regulējot tā spēju fosforilēt specifiskus substrātus, galvenokārt balstoties uz tās intracelulārās lokalizācijas izmaiņām (piemēram, citozols pret kodolu).Ahmed un Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Šī informācija rada svarīgu jautājumu par to, kādi signāli ir nepieciešami, lai izraisītu ΔFosB uzkrāšanos smadzenēs pēc hroniskas stimulācijas (Fig. 7C). Viena prasība ir atkārtota fosB gēnu un ΔFosB mRNS indukciju (Chen et al., 1995). Mūsu dati liecina, ka ΔFosB fosforilācija CK2 ir būtiska tās stabilitātei, kas liecina, ka var būt nepieciešams otrs signāls ΔFosB ilgtermiņa ietekmei uz gēnu ekspresiju, proti, signālu, kas stimulē proteīna fosforilāciju ar CK2. Tas varētu ietvert CK2 aktivizēšanu ar kādu nezināmu mehānismu vai tā pārvietošanu uz kodolu. Alternatīvi AFosB CK2 fosforilēšana var būt konstitutīva, tā kā ΔFosB proteīns tiek pārvērsts atbildes reakcijā uz katru stimulu, daļa no tā kļūst fosforilēta un tādējādi stabilizējas tā, ka ar atkārtotu stimulāciju tā uzkrājas augstos līmeņos skartajos neironos.

Mūsu rezultāti rāda, ka CK2 un S27, iespējams, nav vienīgā kināze un vieta, kas atbild par FosB fosforilāciju, jo ne CK2 ne inhibēšana, ne S27A mutācija nespēja pilnībā novērst FosB fosforilāciju. Tāpat tas, ka S27A mutācija izraisa fosfora-AFosB samazinājumu par 30%, apgalvo, ka S27 ir galvenā proteīna fosforilācijas vieta. Tomēr mēs pētām citas iespējamās kināzes un fosforilācijas vietas ΔFosB. Galu galā būs svarīgi analizēt arī S27 un citu fosforilācijas vietu fosforilāciju ΔFosB smadzenēs. in vivo pēc dažāda veida hroniskas stimulācijas, piemēram, izmantojot masas spektrometriju vai fosfora specifiskas antivielas.

Kā minēts iepriekš, SFNUMX ΔFosB ir ļoti konservēts visā evolūcijas laikā un starp citiem Fos ģimenes proteīniem. Tomēr vienprātības vieta CK27 nav: kā parādīts Skaitlis 5Btikai FosB / ΔFosB (un Zebrafish xenolog), bet ne c-Fos vai Fra-2, ir skābais atlikums pie + 3, kas ir galvenais CK2 fosforilācijas noteicējs (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Tādējādi CK2 fosforilācijas trūkums uz S27 var izskaidrot, kāpēc citi Fos ģimenes proteīni nav tik stabili kā ΔFosB. Tomēr tas nepaskaidro, kāpēc FosB, kam ir tāda pati CK2 konsensa vieta kā ΔFosB, nav līdzīgi stabilizējies. Mēs nezinām, vai CK2 uz šo konservēto atlieku fosforilē pilna garuma FosB. FosB vienīgie ziņojumi (Skinner et al., 1997) un c-Fos (Okazaki un Sagata, 1995; Chen et al., 1996) fosforilācija apraksta šo proteīnu C-terminālajā reģionā esošās vietas, kas nav ΔFosB. Lai CK2 varētu pilnībā fosforilēt FosB un citus Fos ģimenes proteīnus, nepieciešama tieša izmeklēšana. Tomēr, pat ja tie ir fosforilēti, ir zināms, ka citi Fos ģimenes proteīni satur motīvus C galos, kas vērsti uz proteīniem ātrai noārdīšanai (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Piemēram, ir pierādīts, ka ∼21 atlieku posms, kas atrodas visu Fos ģimenes proteīnu C galā, bet nav ΔFosB, darbojas kā c-Fos destabilizējošs domēns (Acquaviva et al., 2001). Mēs atklājām, ka, lai gan šī secība līdzīgi destabilizē pilna garuma FosB (Carle et al., 2004), šī domēna trūkums ΔFosB pilnībā neņem vērā tās stabilizāciju. Drīzāk šīs C gala domēna un Ser27 fosforilācijas trūkuma kombinācija, šķiet, pilnībā veido aptuveni piecas reizes lielākas stabilitātes atšķirības starp ΔFosB un FosB.

Lai gan Fos ģimenes olbaltumvielu noārdīšanās ir sarežģīta un nav pilnībā saprotama, proteasomu degradācija, šķiet, ir galvenais ceļš (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Šeit sniegtie dati, kuros proteasomu inhibitori būtiski nemaina ΔFosB degradācijas ātrumu, apgalvo, ka atšķirībā no citiem Fos ģimenes proteīniem ΔFosB izvairās no 26S proteasomas, un tam ir galvenā loma tās stabilizēšanā. Tādēļ mēs ierosinām shēmu, kurā pastiprināta ΔFosB stabilitāte ir attiecināma uz divu galveno faktoru kombināciju: (1) C-termināla destabilizējošā domēna un (2) S27 fosforilācijas CK2 trūkumu.

Kopumā, šis pētījums sniedz mehānisku ieskatu par to, kāpēc ΔFosB - tiešā agrīna gēna produkts fosB, atšķirībā no visiem pārējiem Fos ģimenes locekļiem, ir salīdzinoši ilgi dzīvojuši proteīni. Lai gan domājams, ka citi Fos ģimenes proteīni veicina ātru, bet pārejošu stimulēšanas-transkripcijas savienojumu (Morgan un Curran, 1995), ΔFosB relatīvā stabilitāte piešķir tai iespēju mediēt ilgstošas ​​transkripcijas izmaiņas, ko izraisa hroniska stimulācija. Tas atbalsta viedokli, ka ΔFosB darbojas kā ilgstošs molekulārs slēdzis smadzenēs, pakāpeniski pārveidojot akūtas reakcijas hroniskām adaptācijām. Ser27 fosforilācijas identificēšana kā ΔFosB stabilitātes galvenais mehānisms atver jaunas iespējas, kā attīstīt līdzekļus, lai regulētu ΔFosB funkciju un tādējādi modulētu tā ilgtermiņa ietekmi uz neirālo un uzvedības plastiskumu.

Iepriekšējā sadaļaNākamā sadaļa

Zemsvītras piezīmes

  • Saņemts novembris 21, 2005.
  • Pārskatīšana saņemta februārī 21, 2006.
  • Pieņemts aprīlis 2, 2006.
  • Šo darbu atbalstīja Nacionālā šizofrēnijas un depresijas pētījuma alianses alianse PGU, Nacionālajam narkomānijas apkarošanas institūta (NIDA) PGU institūtam, kā arī Nacionālā garīgās veselības institūta un NIDA dotācijas EJN Mēs paldies Dr. James Bibb par viņa palīdzību in vitro fosforilācijas testi, Dr. Ming-Hu Han par viņa palīdzību, lai sagatavotu vielmaiņas marķēšanai izmantotās smadzeņu šķēlītes, un Dr Rachael Neve par viņas palīdzību saistībā ar rekombinantā HSV iepakošanu.
  • G. Rudenko pašreizējā adrese: Dzīvības zinātņu institūts un Farmakoloģijas katedra, Mičiganas universitāte, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
  • Korespondence ir adresējama Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. E-pasts: [e-pasts aizsargāts]

Iepriekšējā sadaļa

 

Atsauces

  1. ↵

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) C-terminālā tripeptīda motīva identifikācija, kas iesaistīta c-Fos proto-onkoproteīna ātrās proteasomu degradācijas kontrolē G (0) -S fāzes pārejas laikā. onkogēnā 20:7563–7572.

CrossRefMedline

  1. ↵

Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Vairāki degradācijas ceļi Fos ģimenes proteīniem. Ann NY Acad Sci 973:426–434.

Medline

  1. ↵

Ahmed K, Tawfic S (1994) CK2 proteīnkināzes intracelulārās regulēšanas mehānisms: stimulējošās subnukleārās asociācijas loma. Cell Mol Biol Res 40:539–545.

Medline

  1. ↵

Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Uzlabota attīrīšanas procedūra un kazeīna kināzes II īpašības no smadzenēm. Neurochem Res 13:829–836.

CrossRefMedline

  1. ↵

Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Striatāla DeltaFosB līdzīga imūnoreaktivitātes un prodynorphin mRNS laika gaita pēc hroniskas dopaminomimetiskās ārstēšanas pārtraukšanas. Eur J Neurosci 17:661–666.

CrossRefMedline

  1. ↵

Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Genoma mēroga ekspresijas ekrāni norāda uz proteīnu kināzes CK2 globālo lomu hromatīna pārveidošanā. J Cell Sci 116:1563–1577.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Divos PKC izozīmos, kas atrodami HL-60 šūnās, ir atšķirība aktivācijā ar forbolesteru TPA. FEBS Lett 249:264–266.

Medline

  1. ↵

Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Olbaltumvielu kināze CK2 tiek apvienota ar nelielu vadītspēju Ca (2 +) - aktivizētajiem K + kanāliem un regulē kanālu vāršanu. Neirons 43:847–858.

CrossRefMedline

  1. ↵

Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Fos saistītā antigēna ilgtermiņa ekspresija un īslaicīga delta FosB izpausme, kas saistīta ar krampjiem hippokampā un striatumā. J Neirochem 68:272–279.

Medline

  1. ↵

Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Preklīniskās glikozilēšanas un proteīnu fosforilācijas prognoze no aminoskābju secības. Proteomika 4:1633–1649.

CrossRefMedline

  1. ↵

Boehning D, Mēness C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Oglekļa monoksīda neirotransmisija, ko aktivizē hemokarbonāzes-2 CK2 fosforilācija. Neirons 40:129–137.

CrossRefMedline

  1. ↵

Bohmann D (1990) Transkripcijas faktora fosforilācija: saikne starp signāla transdukciju un gēnu ekspresijas regulēšanu. Vēža šūnas 2:337–344.

Medline

  1. ↵

Buschmann, T, Potapova, O, bar-Shira, A, Ivanov, VN, Fuchs, SY, Henderson, S, Fried, VA, Minamoto, T, Alarcon-Vargas, D, Pincus, MR, Gaarde, WA, Holbrook, NJ, Shiloh, Y, Ronai, Z (2001) P2 jūnija NH53-termināla kināzes fosforilācija uz Thr-81 ir svarīga p53 stabilizācijai un transkripcijas aktivitātēm, reaģējot uz stresu. Mol Cell Biol 21:2743–2754.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Konservēta Fos ģimenes C-termināla domēna neesamība veicina deltaFosB unikālo stabilitāti. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.

  1. ↵

Channavajhala P, Seldin DC (2002) Funkcionālā mijiedarbība ar proteīnu kināzi CK2 un c-Myc lymphomagenesis. onkogēnā 21:5280–5288.

CrossRefMedline

  1. ↵

Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Delta FosB un FosB līdzīgo proteīnu regulēšana ar elektrokonvulsīvo krampju un kokaīna terapiju. Mol Pharmacol 48:880–889.

Anotācija

  1. ↵

Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Hroniski Fos saistītie antigēni: stabilie ΔFosB varianti, kas inducēti smadzenēs ar hronisku ārstēšanu. J Neurosci 17:4933–4941.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) C-Fos fosforilācija C-galā uzlabo tā transformējošo aktivitāti. onkogēnā 12:1493–1502.

Medline

  1. ↵

Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Proteīna fosfatāzes 1 / 2A inhibitors okadīnskābe palielina CREB un Elk-1 fosforilāciju un c-fos ekspresiju žurku striatumā in vivo. J Neirochem 89:383–390.

CrossRefMedline

  1. ↵

Cochet C, Chambaz EM (1983) Poliamīna mediētie proteīnu fosforilācijas: iespējamais mērķis intracelulārajai poliamīna iedarbībai. Mol Cell Endocrinol 30:247–266.

CrossRefMedline

  1. ↵

Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Ļoti attīrītas G tipa kazeīna kināzes katalītiskās un molekulārās īpašības no liellopu plaušu audiem. Biochim Biophys Acta 743:1–12.

Medline

  1. ↵

Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) DeltaFosB pārmērīga ekspresija uz striatālu šūnu tipa specifiku palielina kokaīna stimulēšanu. J Neurosci 23:2488–2493.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Kokaīna pašregulācija palielina preprodynorphin, bet ne c-fos, mRNS žurku striatumā. NeuroReport 4:543–546.

Medline

  1. ↵

Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Transkripcijas faktoru regulēšana ar proteīnu degradāciju. Cell Mol Life Sci 57:1207–1219.

CrossRefMedline

  1. ↵

Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Pēc DNS sintēzes inhibīcijas NIA-103 neiroblastomas šūnās citoplazmas kazeīna kināzes II tipa aktivitātes palielināšanās ir saistīta ar neitīta izaugšanu. J Neirochem 58:1820–1828.

Medline

  1. ↵

Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Olbaltumvielu kināze CK2 fosforilē un atjauno Akt / PKB. Šūnu nāve atšķiras 12:668–677.

CrossRefMedline

  1. ↵

Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Abi fosB gēna produkti, FosB un tā īsa forma, FosB / SF, ir transkripcijas aktivatori fibroblastos. Mol Cell Biol 11:5470–5478.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Ferrara P, Andermarče E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Strukturālie faktori, kas ir atbildīgi par c-Fos proteīna proteasomu degradāciju, atšķiras atkarībā no izteiksmes nosacījumiem. onkogēnā 22:1461–1474.

CrossRefMedline

  1. ↵

Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) No c-Jun ubikvininācijas atkarīgs no fosforilēšanas atkarīgs no jūnija N-kināzes. onkogēnā 13:1531–1535.

Medline

  1. ↵

Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminālie kināzes nosaka to saistīto transkripcijas faktoru ubikvināciju. J Biol Chem 272:32163–32168.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) ATF2 transkripcijas faktora stabilitāti regulē fosforilācija un defosforilācija. J Biol Chem 275:12560–12564.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) DOPPP-32, dopamīna un cAMP regulēta fosfoproteīna fosforilēšana ar kazeīna kināzi II. J Biol Chem 264:21748–21759.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) DARPP-32 serīna kināzes, kas ir identiska kazeīna kināzei II, raksturojums zīdītāju smadzenēs. J Neirochem 55:1772–1783.

Medline

  1. ↵

Hanada, M, Sugawara, K, Kaneta, K, Toda, S, Nishiyama, Y, Tomita, K, Yamamoto, H, Konishi, M, Oki, T (1992) Epoksomicīns - jauns mikrobu izcelsmes pretvēža līdzeklis. J Antibiot (Tokija) 45:1746–1752.

Medline

  1. ↵

Hann SR, Eisenman RN (1984) Cilvēka c-myc onkogēna kodēti proteīni: diferenciāla ekspresija neoplastiskajās šūnās. Mol Cell Biol 4:2486–2497.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21 - cikliska AMP regulēta fosfoproteīns (Mr = 21,000), kas bagātināts ar dopamīna innervētiem smadzeņu reģioniem. Vietas aminoskābju secība, kas fosforilējas ar ciklisku AMP, neskartās šūnās un kinetiskie pētījumi par tā fosforilāciju in vitro. J Biol Chem 264:7726–7733.

  1. ↵

Hidaka H, ​​Kobayashi R (1992) Proteīna kināzes inhibitoru farmakoloģija. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377–397.

CrossRefMedline

  1. ↵

Hirata, H, Bessho, Y, Kokubu, H, Masamizu, Y, Yamada, S, Lewis, J, Kageyama, R (2004) Hes7 proteīna nestabilitāte ir būtiska somīta segmentācijas pulkstenim. Nat Genet 36:750–754.

CrossRefMedline

  1. ↵

Hiroi N, Graybiel AM (1996) Netipiskas un tipiskas neiroleptiskās terapijas izraisa atšķirīgas transkripcijas faktora ekspresijas programmas striatumā. J Comp Neurol 374:70–83.

CrossRefMedline

  1. ↵

Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Tūlītēja agrīna gēna ekspresijas regulēšana un AP-1 saistīšanās ar žurku kodolu accumbens ar hronisku kokaīnu. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764–5768.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Hroniska elektrokonvulsīvā krampju (ECS) ārstēšana izraisa ilgstošu AP-1 kompleksa ekspresiju smadzenēs ar mainītu sastāvu un īpašībām. J Neurosci 14:4318–4328.

Anotācija

  1. ↵

Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Ilgstoša AP-1 kompleksa, kas sastāv no mainītiem Fos līdzīgiem proteīniem smadzenēs, indukcija ar hronisku kokaīnu un citām hroniskām procedūrām. Neirons 13:1235–1244.

CrossRefMedline

  1. ↵

Ishida A, Fujisawa H (1995) Kalmodulīnam atkarīga proteīnkināzes II stabilizācija caur autoinhibitoru. J Biol Chem 270:2163–2170.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Komplekss mehānisms c-fos un c-jun degradācijai. Mol Biol Rep 24:51–56.

CrossRefMedline

  1. ↵

Jones S, Yakel JL (2003) Kazeīna kināze ii (proteīnkināze ck2) regulē serotonīna 5-ht (3) receptoru funkciju ng108 – 15 šūnās. Neirozinātnes 119:629–634.

CrossRefMedline

  1. ↵

Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 ir C-gala IkappaB kināze, kas atbild par NF-kappaB aktivāciju UV reakcijas laikā. Mol Cell 12:829–839.

CrossRefMedline

  1. ↵

Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Transkripcijas faktora deltaFosB ekspresija smadzenēs kontrolē jutību pret kokaīnu. daba 401:272–276.

CrossRefMedline

  1. ↵

Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Proteasomu inhibīcija, ko veic dabiskie produkti epoksomicīns un dihidroeponemicīns: ieskats specifiskumu un spēju. Bioorg Med Chem Lett 9:3335–3340.

CrossRefMedline

  1. ↵

Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), jauns mikrobu savienojums, ir ļoti spēcīgs un specifisks proteīnkināzes C inhibitors. Biochem Biophys Res Commun 159:548–553.

CrossRefMedline

  1. ↵

Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Kazeīna kināze II ir galvenokārt kodolsintēze. J Cell Biol 116:43–55.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Olbaltumvielu kināze CK2 fosforilē augstas mobilitātes grupas domēna proteīnu SSRP1, izraisot UV bojātas DNS atpazīšanu. J Biol Chem 278:12710–12715.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Chromatin remodeling ir galvenais mehānisms, kas pamato kokaīna izraisīto plastiskumu striatumā. Neirons 48:303–314.

CrossRefMedline

  1. ↵

Lieberman DN, Mody I (1999) Kazeīna kināze-II regulē NMDA kanālu funkciju hipokampu neironos. Nat Neurosci 2:125–132.

CrossRefMedline

  1. ↵

Litchfield DW (2003) Olbaltumvielu kināze CK2: struktūra, regulējums un loma dzīvības un nāves šūnu lēmumos. Biochem J 369:1–15.

CrossRefMedline

  1. ↵

Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) C-Fos proteīna noārdīšanās, ko izsaka ar N-metil-d-aspartīnskābe peles hippocampus kodolfrakcijās. Smadzenes Res 905:34–43.

Medline

  1. ↵

Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Nav pastāvīgi paaugstināta 37 kDa fos-saistītā antigēna un AP-1 līdzīgās DNS saistīšanās aktivitātes cenu skābes apstrādātās fosB null peles smadzenēs. J Neurosci 17:5407–5415.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Kazeīna kināzes-2 (TS) vietas specifika no žurku aknu citozola. Pētījums ar parauga peptīdu substrātiem. Eur J Biochem 160:239–244.

  1. ↵

McClung CA, Nestler EJ (2003) Gēnu ekspresijas un kokaīna atlīdzības regulēšana ar CREB un DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208–1215.

CrossRefMedline

  1. ↵

McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: molekulārs slēdzis ilgstošai adaptācijai smadzenēs. Brain Res Mol Brain Res 132:146–154.

Medline

  1. ↵

Meggio F, Pinna LA (2003) Viens tūkstotis un viens olbaltumvielu kināzes CK2 substrāts? FASEB J 17:349–368.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Kazeīna frakciju fosforilēšana ar žurku aknu fosfotīnkināzi. FEBS Lett 75:192–196.

Medline

  1. ↵

Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) 2 tipa kazeīna kināzes TS autofosforilēšana gan alfa, gan beta apakšvienībās. Dažādu efektoru ietekme. FEBS Lett 160:203–208.

CrossRefMedline

  1. ↵

Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Ribofuranozil-benzimidazola atvasinājumi kā kazeīna kināzes-2 un kazeīna kināzes-1 inhibitori. Eur J Biochem 187:89–94.

Medline

  1. ↵

Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) CK2 proteīnkināzes substrāta specifika. Cell Mol Biol Res 40:401–409.

Medline

  1. ↵

Millers C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Ciklooksigenāzes-2 gēna transkripcijas indukcija ar okadaīnskābes fosfatāzes aktivitātes inhibēšanu cilvēka kondrocītos: AP-1 un CRE kodolieroču proteīnu kop stimulēšana. J Cell Biochem 69:392–413.

CrossRefMedline

  1. ↵

Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Tīkla līmeņa izmaiņas inducējamo Fos-Jun olbaltumvielu izpausmē striatumā hroniskas kokaīna terapijas un izņemšanas laikā. Neirons 17:147–156.

CrossRefMedline

  1. ↵

Morgan JI, Curran T (1995) Tūlītēji agri gēni: desmit gadi. Tendences Neurosci 18:66–67.

CrossRefMedline

  1. ↵

Nakabeppu Y, Nathans D (1991) FosB dabiski sastopama forma, kas inhibē Fos / Jun transkripcijas aktivitāti. Šūna 64:751–759.

CrossRefMedline

  1. ↵

Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: ilgstoša molekulārais slēdzis atkarībai. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042–11046.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Glutamāta receptora apakšvienības 1 ievadīšana motoru neironos in vitro un in vivo, izmantojot rekombinanto herpes simplex vīrusu. Neirozinātnes 79:435–447.

CrossRefMedline

  1. ↵

Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Groucho / TLE239 serīna 1 fosforilēšana ar proteīnkināzi CK2 ir svarīga neironu diferenciācijas inhibēšanai. Mol Cell Biol 24:8395–8407.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Okazaki K, Sagata N (1995) Mos / MAP kināzes ceļš stabilizē c-Fos ar fosforilēšanu un palielina tā transformējošo aktivitāti NIH 3T3 šūnās. EMBO J 14:5048–5059.

Medline

  1. ↵

Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Ubikvitīna-proteasomas ceļš ir nepieciešams NF-kappa B1 prekursoru proteīna apstrādei un NF-kappa B aktivācijai. Šūna 78:773–785.

CrossRefMedline

  1. ↵

Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) C-Fos mērķtiecīga degradācija, bet ne v-Fos, ar fosforilācijas atkarīgu signālu c-Jun. Zinātne 258:1941–1944.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, krājumi JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Inducējama smadzeņu specifiskā c-Jun mutanta ekspresija transgēnās pelēs samazina jutību pret kokaīnu. Smadzenes Res 970:73–86.

CrossRefMedline

  1. ↵

Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) DeltaFosB indukcija ar smadzenēm saistītajās smadzeņu struktūrās pēc hroniska stresa. J Neurosci 24:10594–10602.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Persiko AM, Šindlers CW, O'Hara BF, Brannoks MT, Uhl GR (1993) Smadzeņu transkripcijas faktora ekspresija: akūtas un hroniskas amfetamīna un injekcijas stresa ietekme. Brain Res Mol Brain Res 20:91–100.

Medline

  1. ↵

Ploegh HL, Dunn BM (2000) Posttranslācijas modifikācija: fosforilācija un fosfatāzes. In: Pašreizējie proteīnu zinātnes protokoli (Dunn BM, red.) Lpp. 13.01–13.02. Ņujorka: Wiley un Sons.

  1. ↵

Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Augsti attīrītas fosvitīna / kazeīna kināzes II tipa katalītiskās un molekulārās īpašības no cilvēka epitēlija šūnām kultūrā (HeLa) un saistībā ar ekto proteīnu kināzi. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215–227.

Medline

  1. ↵

Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) “Proteīna kināzes CK2-HMG14” sistēmas stāvoklis ar vecumu saistītā amnēzijā žurkām. Neurosci Behav Physiol 33:799–804.

Medline

  1. ↵

Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Helix-loop-helix / Per-ARNT-Sim homoloģijas domēna dioksīna receptoru noārdīšanās caur ubikvitīna / proteasomas ceļu. J Biol Chem 274:36351–36356.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) PredictProtein serveris. Nucleic Acids Res 32:W321–W326.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 mērķi smadzenēs. Front Biosci 9:8–23.

CrossRefMedline

  1. ↵

Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Rekombinantā peles adenozīna kināzes molekulārā raksturošana un novērtēšana kā proteīna fosforilācijas mērķis. Eur J Biochem 271:3547–3555.

Medline

  1. ↵

Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Vai ir vairāki proteolītiskie ceļi, kas veicina c-Fos, c-Jun un p53 proteīnu degradāciju in vivo? Mol Biol Rep 26:45–51.

CrossRefMedline

  1. ↵

Schmidt R, Hecker E (1975) Forbolu esteru autoksidēšana normālos uzglabāšanas apstākļos. Vēža rez 35:1375–1377.

BEZMAKSAS pilns teksts

  1. ↵

Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) IkappaBalpha konstitutīvā fosforilācija ar kazeīna kināzi II notiek galvenokārt serīna 293 gadījumā: brīvas IkappaBalpha degradācijas prasība. Mol Cell Biol 16:3554–3559.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras uzlabo Myc proteīna stabilitāti. Mol Cell 3:169–179.

CrossRefMedline

  1. ↵

Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Vitamīna cikliskā nukleotīda neatkarīgā fosforilācija ar kazeīna kināzi II, kas attīrīta no Rhodnius prolixus oocītiem. Insektu Biochem Mol Biol 32:847–857.

CrossRefMedline

  1. ↵

Skinner M, Qu S, Moore C, Gudrība R (1997) Transkripcijas aktivācijai un transformācijai ar FosB proteīnu nepieciešama karboksil-gala aktivācijas domēna fosforilācija. Mol Cell Biol 17:2372–2380.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Proteīna kināze CK2 diferencēti fosforilē kukurūzas hromosomu augstas mobilitātes grupas B (HMGB) proteīnus, kas modulē to stabilitāti un DNS mijiedarbību. J Biol Chem 277:1092–1098.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Cik, ciklin B2 kināzes, kā jauna kalcija / kalmodulīna atkarīgā proteīnkināzes II identifikācija un tās nozīme Xenopus laevis oocītu nobriešanas laikā. Exp Cell Res 252:303–318.

CrossRefMedline

  1. ↵

Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) C-fos un c-jun gēnu ekspresijas regulēšana ar lipopolisaharīdu un citokīniem primārajos kultivētajos astrocītos: PKA un PKC ceļu ietekme. Arch Pharm Res 27:396–401.

Medline

  1. ↵

Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Ribosomu skābo olbaltumvielu diferenciālā fosforilācija no rauga šūnām ar divām endogēnām proteīnu kināzēm: kazeīna kināzi-2 un 60S kināzi. Acta Biochim Pol 42:357–362.

Medline

  1. ↵

Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) un calphostin saistītie savienojumi, jauna klase specifiskiem un spēcīgiem proteīnkināzes C inhibitoriem. Adv otrais Messenger Phosphoprotein Res 24:497–501.

Medline

  1. ↵

Torres J, Pulido R (2001) Audzēja supresoru PTEN fosforilē ar proteīnu kināzi CK2 tās C galā. PTEN stabilitātes ietekme uz proteasomu izraisītu degradāciju. J Biol Chem 276:993–998.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Difainoalpalans un proteasomu aktivitātes inhibīcija ar di-leucīna un tri-leucīna peptidilaldehīdiem. J Biochem (Tokija) 119:572–576.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) C-Fos degradāciju ar 26S proteasomu paātrina c-Jun un vairākas proteīnu kināzes. Mol Cell Biol 15:5682–5687.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Olbaltumvielu kināze CK2 kā šūnu izdzīvošanas regulators: ietekme uz vēža terapiju. Curr Cancer Drug Targets 4:77–84.

CrossRefMedline

  1. ↵

Vial E, Marshall CJ (2003) Paaugstināta ERK-MAP kināzes aktivitāte aizsargā FOS ģimenes locekli FRA-1 pret proteasomu degradāciju resnās zarnas karcinomas šūnās. J Cell Sci 116:4957–4963.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB regulē riteņu kustību. J Neurosci 22:8133–8138.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Transkripcijas faktora funkcijas regulēšana ar fosforilēšanu. Cell Mol Life Sci 57:1172–1183.

CrossRefMedline

  1. ↵

Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Divas iespējamās proteīnu kināzes CK2 fosforilācijas vietas ir svarīgas Myf-5 aktivitātei. Biol Chem 378:1445–1456.

Medline

  1. ↵

Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Augsta mobilitātes grupas 1 proteīnu skābās astes konstitutīvā fosforilēšana ar kazeīna kināzi II maina to konformāciju, stabilitāti un DNS saistīšanās specifiku. J Biol Chem 274:20116–20122.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Kazeīna kināze II mijiedarbojas ar vairāku transkripcijas faktoru bZIP domēniem. Nucleic Acids Res 26:3854–3861.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) A170 stresa proteīna fosforilācija ar kazeīna kināzes II līdzīgo aktivitāti makrofāgos. Biochem Biophys Res Commun 241:157–163.

CrossRefMedline

  1. ↵

Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Transkripcijas pagarinājuma inhibitors 5,6-dichlor-1-beta-d-ribofuranozilbenzimidazols inhibē IIH saistīto proteīna kināzi. J Biol Chem 270:23922–23925.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Yen J, Wisdom RM, Tratner I, Verma IM (1991) FosB alternatīva spliced ​​forma ir negatīvs transkripcijas aktivācijas un transformācijas regulators ar Fos proteīniem. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077–5081.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Kazeīna kināze II fosforilē lēcu connexin 45.6 un ir iesaistīta tās degradācijā. J Biol Chem 275:6850–6856.

Kopsavilkums / bezmaksas teksts

  1. ↵

Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) AP-1 transkripcijas faktoru komponentu indukcija T-šūnu aktivācijas laikā ar interleukīna 1 un forbolu esteri. Šūnu augšana atšķiras 3:677–684.

Anotācija

  1. ↵

Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) CK2 signalizācijas sekas kodolmateriāla matricai. Mol Cell Biochem 227:67–71.

CrossRefMedline

  1. ↵

Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Proteīna kināzes CK2 diferenciāla noteikšana kodolmateriāla matricai pēc tās apakšvienību pārejošas pārprodukcijas. J Cell Biochem 74:127–134.

CrossRefMedline

  1. ↵

Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: ΔFosB būtiska loma morfīna iedarbībā. Nat Neurosci 9:205–211.

CrossRefMedline

Raksti, kuros minēts šis pants

  • Uzvedības un strukturālā reakcija uz hronisku kokainu Nepieciešams, lai Nucleus Accumbens Shell ievadītu cilpiņu, kas ietver {Delta} FosB un kalcija / kalmodulīna atkarīgo proteīnu kināzi II Žurnāls neiroloģiju, 6 marts 2013, 33(10):4295-4307
  • {Delta} FosB pārmērīga ekspresija pārmērīgi izpaužas kā hroniska Levodopas izraisīta nevēlama kustība Žurnāls neiroloģiju, 26 maijs 2010, 30(21):7335-7343
  • Anotācija
  • pilna teksta
  • Pilns teksts (PDF)
  • Anotācija
  • pilna teksta
  • Pilns teksts (PDF)
  • Anotācija
  • pilna teksta
  • Pilns teksts (PDF)
  • Anotācija
  • pilna teksta
  • Pilns teksts (PDF)
  • Atkarības transkripcijas mehānismi: {Delta} FosB loma Royal Society B filozofiskie darījumi: bioloģiskās zinātnes, 12 oktobris 2008, 363(1507):3245-3255
  • Ilgstoša neaizsargātība pret metamfetamīnu meklējošas uzvedības atjaunošanu glielu šūnu līnijas radīto neirotrofu faktoru mutantu pelēm FASEB Vēstnesis, 1 jūlijs 2007, 21(9):1994-2004
  • Aktivatora proteīna-1 transkripcijas faktors elpošanas epitēlija karcinogenēzē Molekulāro vēža izpēte, 1 februāris 2007, 5(2):109-120