Proc Natl Acad Sci US A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460.
Publicēts tiešsaistē aprīlī 15, 2014. doi: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neirozinātnes
Teruko Danjo,a Kenji Jošimi,b Kazuo Funabiki,a Satoshi Yawata,a un Šigetada Nakanishia,1
Šis raksts ir bijis citēts citiem PMC izstrādājumiem.
Nozīme
Dopamīna (DA) neironi ventrālajā fundamentālajā zonā (VTA) reaģē uz aversīviem stimuliem lielākoties ar īslaicīgu klusēšanu. Joprojām nav skaidrs, vai šī reakcija tieši izraisa aversīvas reakcijas, rīkojoties pelēm. Mēs izskatījām šo jautājumu, optogenētiski kontrolējot DA neironus VTA, un konstatējām, ka DA neironu inaktivācija izraisīja nenovēršamu reakciju un mācīšanos. Tika uzskatīts, ka par šo reakciju ir atbildīgi VTA DA neironu galvenie izejas kodoli (NAc), tāpēc, izmantojot D1 vai D2 receptoru nojaukšanu, mēs pārbaudījām, kurš no NAc pamatvirzieniem ir kritisks šai uzvedībai, un konstatēja, ka D2 receptoru specifiskais ceļš bija izšķirošs šādai uzvedībai.
Anotācija
Dopamīna (DA) pārnešana no ventrālās pamata zonas (VTA) ir kritiska, lai kontrolētu gan atalgojošu, gan nelabvēlīgu izturēšanos. DA neironu pārejoša klusēšana ir viena no atbildēm uz atbaidošiem stimuliem, bet tās sekas un neironu mehānismi attiecībā uz atbaidošām reakcijām un mācībām lielā mērā paliek nenotverami. Šeit, mēs ziņojam, ka VTA DA neironu optogenētiskā inaktivācija nekavējoties samazina regulētos DA līmeņus un izraisīja neirālās aktivitātes augšupejošu regulējumu kodolkrāsās (NAc), ko novērtē pēc Fosa izteiksmes. Tviņa optogēnā DA neironu šaušanas apspiešana nekavējoties izraisīja aversīvas reakcijas uz iepriekš izvēlēto tumšo telpu un izraisīja atbaidošu mācīšanos pret optogēniski kondicionētu vietu. Svarīgi ir tas, ka šo vietu atturība tika atcelta, pārtraucot dopamīna D2 receptorus, bet ne ar D1 receptoriem NAc.. Līdz ar to DA neironu klusēšana VTA bija nepieciešama, lai izraisītu aversīvas reakcijas un mācītos caur dopamīna D2 receptoriem NAc.
Mesolimbiskā dopamīnerģiskā sistēma ne tikai spēlē galveno lomu plašā motivācijas un mācīšanās spektrā (1-3), bet tās disfunkcija ir saistīta arī ar smagiem neiropsihiskiem traucējumiem, piemēram, Parkinsona slimība, šizofrēnija un narkomānija. Dopamīna (DA) neironi ventrālajā pamata daļā (VTA) reaģē uz atalgojuma stimuliem ar fāzes apdedzināšanu, un šīs apdedzināšanas galvenā funkcija ir teorētiska, lai kodētu “atlīdzības prognozēšanas kļūdu”, atšķirību vērtībā starp prognozēto atlīdzību un faktiskā atlīdzība (4). Atšķirībā no atbildes uz atalgojuma stimuliem, viņu reakcija uz aversīvajiem stimuliem nav tālu no homologiem; ti, daži DA neironi tiek aktivizēti, reaģējot uz aversīviem stimuliem, turpretim lielākā daļa citu reaģē, īslaicīgi nomācot savu šaušanu. (5-9). Faktiski nesenie pētījumi ir atklājuši, ka GABAergo neironu optogēnā aktivizācija un rezultātā radušās DA neironu inaktivācija nomāc atalgojuma patēriņu un izraisa nenovēršamu reakciju (10, 11). Tomēr lielākoties nav izlemts, kuri neironu ķēžu mehānismi ir nepieciešami, lai iegūtu aversīvas mācības pēc DA neironu inaktivācijas VTA un kā uzvedības reakcijas tiek kontrolētas, lai nomāktu atalgojuma patēriņu un izraisītu nelabvēlīgu izturēšanos.
Uzkrātie pierādījumi ir atklājuši, ka motivācijas un kognitīvās mācības, reaģējot uz pozitīviem un negatīviem stimuliem, lielā mērā regulē neirālās ķēdes, ieskaitot bazālo gangliju (12), kas saņem lielu daudzumu dopamīnerģisko projekciju no vidus smadzenēm. Striatumā divas būtiskas neironu ķēdes sastāv no noteikta vidēja izmēra smadzeņu neironiem (MSNs), katrs no tiem izpaužot atšķirīgu DA receptoru tipu (13).
- Viena ķēde ir tiešs ceļš, kas sastāv no MSN, kas tieši projicējas uz bazālo gangliju izvades kodoliem ,rodia nigra pars reticulata (SNr) un pārsvarā izsaka dopamīna D1 receptorus (D1R)..
- Otrs ir netiešais ceļš, kas sastāv no MSN, kas netieši caur globus pallidus virzās uz SNr, un galvenokārt izpauž dopamīna D2 receptorus (D2R).
DA signāli no vidus smadzenēm dinamiski modulē šos divus paralēlos ceļus pretējā veidā, izmantojot D1R un D2R, un šai modulācijai ir jāveicina motivācijas mācīšanās (3, 14).
- Attiecībā uz atalgojošajiem stimuliem tiek uzskatīts, ka augsti regulēti DA līmeņi, ko izraisa apbalvojošie signāli, aktivizē D1R un tādējādi galvenokārt veicina tiešo ceļu kodolkrāsās (NAc)..
- No otras puses, DA neironu šaušanas apspiešana, reaģējot uz aversīvajiem stimuliem, samazina DA līmeni NAc; un šai reakcijai ir paredzēts īpaši veicināt signāla pārraidi netiešā ceļā caur aktivizētiem D2R.
Lai gan pētījumi, izmantojot farmakoloģiskās stratēģijas un atgriezeniskas neirotransmisijas bloķēšanas (RNB) metodi, ir apstiprinājuši šo regulēšanas mehānismu NAc (15, 16), joprojām nav zināms, vai DA neironu dedzināšanas nomākums ir pietiekams, lai veicinātu netiešā ceļa aktivitāti un pēc tam izraisītu izvairīšanās no uzvedības. Šajā pētījumā mēs šo jautājumu risinājām, selektīvi inaktivējot DA neironus VTA, izmantojot optogēniski manipulējot ar membrānas hiperpolarizējošo Arch proteīnu (17) un skaidri parādīja, ka DA neironu nomākums VTA vēlāk pazemināja DA līmeni NAc un izraisīja aversīvu reakciju un mācīšanos. Turklāt mēs izpētījām šīs reakcijas regulēšanas mehānismus un atklājām, ka šo nepatīkamo reakciju īpaši kontrolē NAc D2Rs.
rezultāti
DA neironu optogenētiskā inaktivācija bloķē tumšās telpas izvēli.
Lai selektīvi inaktivētu DA neironu aizdedzināšanu, mēs ievadījām ar Cre inducējamu ar adeno saistītu vīrusu konstrukciju, kas kodē Arch-eGFP [AAV-divkāršās plūsmas apgrieztā atvērtā lasīšanas rāmja (DIO) -Arch] (17) vienpusēji pieaugušo tirozīna hidroksilāzes (TH) -Cre peles VTA \ t18) un savvaļas tipa (WT) pakaiši un novieto optisko šķiedru virs VTA (S1 A un C). Divas nedēļas pēc operācijas Arch-eGFP tika ierobežoti atklāts VTA (S1B). Mēs pārbaudījām Arch proteīna hiperpolarizējošo efektu ar elektrofizioloģisko reģistrēšanu un izmērījām ar AAV-DIO-Arch injicēto TH-Cre peles VTA optiskās stimulācijas ietekmi. In vivo elektrofizioloģiskie ieraksti no anestēzēto TH-Cre peles VTA atklāja, ka iespējamo DA neironu optiskā stimulācija kavēja to degšanu (S2), norādot, ka optiskā stimulācija pietiekami hiperpolarizēja Arku ekspresējošo DA šūnu membrānas potenciālu un tādējādi kavēja to spontānu dedzināšanu.
Izmantojot šīs peles, mēs nākamreiz pārbaudījām, vai DA neironu optiskā inaktivācija VTA varētu kalpot par nelabvēlīgu signālu uzvedības mācībai. Pelēm piemīt iedzimta tendence izvēlēties tumšu vidi (19). Mēs izstrādājām uzvedības aparatūru, kurā peles varēja brīvi izpētīt tumšo telpu un atvērtu spilgtu telpu (Fig. 1A). Pēc pieradināšanas WT peles uzturējās tumšā telpā ar optisko stimulāciju vai bez tās tumšajā telpā (S1D), nodrošinot, ka pati optiskā stimulācija neietekmēja viņu tumšās telpas izvēli. Mēs plānojām dzīvnieku uzvedības eksperimentu, lai pārbaudītu DA neironu optiskās inaktivācijas ietekmi uz viņu uzvedību (S1E). Pēc pieradināšanas un iepriekšējas pārbaudes pelēm kondicionēja, optiski stimulējot DA neironus VTA, kad viņi uzturējās tumšajā telpā. Pat pirmās 5 kondicionēšanas minūtes laikā TH-Cre peles palika ārpus iepriekš izvēlētās tumšās istabas un secīgi izvairījās no tumšās telpas visā kondicionēšanas laikā (Fig. 1B). TH-Cre pelēm netika novērsta izvairīšanās no tumšās telpas, kaut arī pēctesta laikā tās nebija saņēmušas optisko stimulāciju (Fig. 1C). Šie dati norāda, ka DA neironu hiperpolarizācija ne tikai izraisīja pārejošu aversīvu uzvedību, bet arī kalpoja par signālu aversīvai mācībai pret tumšo telpu, kā arī parādīja, ka DA neironu inaktivācijai bija cēloņsakarība gan īslaicīgā aversīvā uzvedībā, gan ilgstošā aversīvā mācībā.
DA līmeņu optogenētiskais regulējums NAc.
Tālāk mēs pētījām, vai DA neironu inaktivācija VTA faktiski mainīja DA koncentrāciju galvenajā mērķa reģionā - NAc. Mēs mērījām DA līmeņus NAc ar ātrās skenēšanas ciklisko voltammetriju (FSCV) anestēzētajās TH-Cre pelēm, kas tika injicētas ar AAV-DIO-Arch to VTA. DA līmeņi NAc tika ātri paaugstināti ar VTA elektrisko stimulāciju, un izraisītā DA izdalīšanās tika ievērojami samazināta, vienlaicīgi veicot VTA optisko stimulāciju.S3). Pēc tam mēs pārbaudījām, vai VTA optiskā stimulācija varētu samazināt tonizējošo DA līmeni NAc. Tajos pašos eksperimentālajos iestatījumos mēs novērojām, ka DA līmenis NAc tika īslaicīgi samazināts ar VTA optiskās stimulācijas 20 s (Fig. 2), kas atbilst ziņotajai FSCV reakcijai pret aversīvajiem stimuliem (20). Šie dati parāda, ka VTA optiskā stimulācija bija pietiekami efektīva, lai inaktivētu VTA DA neironus un samazinātu DA līmeni NAc uzvedības eksperimenta laikā.
Fos gēna ekspresijas uzlabošana ar DA neironu optisko inaktivāciju VTA.
Uzvedības izmaiņas, ko izraisīja nosacīta DA neironu inaktivācija VTA, liecināja, ka optiskā stimulācija tieši mainīja neironu aktivitāti un izraisīja uzvedības maiņu. Tātad mēs nākamreiz izpētījām reģionus, kuros neironu aktivitāti palielināja nosacīta DA neironu inaktivācija, pārbaudot tūlītēja agrīnā gēna Fos ekspresiju. Drīz pēc tam, kad kondicionēšana tika veikta tumšās telpas testā, peles ātri apstrādāja, lai noteiktu Fos ekspresijas daudzumu kvantitatīvā in situ hibridizācijas analīzē (Fig. 3 un S4). NAc, reģions, kas no VTA saņem lielu daudzumu dopamīnerģisko projekciju, uzrādīja ievērojami palielinātu Fos ekspresijas daudzumu TH-Cre pelēm (Fig. 3). Šis regulējums tika konstatēts arī optiskā stimulācijas kontralaterālajā pusē, ko it kā izraisīja neliels vīrusu infekcijas daudzums šajā pusē. Tomēr augšupregulācija bija daudz augstāka ipsilaterālā pusē nekā optiskās stimulācijas kontralaterālajā pusē, kas liek domāt, ka DA neironu optiskā inaktivācija tieši regulēja NAc neironu aktivitāti. Palielināto Fos ekspresiju novēroja arī citos smadzeņu reģionos, tostarp starpsienu, striatuma periventrikulārajos reģionos, bazolaterālā amigdalā (BLA) un sānu hipotalāmā, bet ne sānu habenulā vai mediālajā prefrontālā garozā (mPFC; S4). Šie rezultāti norāda, ka reģioni, kas aktivizēti ar DA neironu optisko inaktivāciju, nebija ierobežoti ar VTA DA neironu tiešajiem mērķa reģioniem, bet drīzāk ietvēra reģionus, kurus varēja netieši aktivizēt no neironu ķēdes atkarīgā veidā. Šis novērojums liek domāt, ka DA neironu optiskā inaktivācija modificēja visā ķēdē esošo neironu aktivitāti un varētu ne tikai izraisīt pretēju reakciju, bet arī izraisīt vairākas citas smadzeņu funkcijas, piemēram, trauksmi, bailes un stresa reakcijas (21).
DA signāls, izmantojot D2R, ir kritiski svarīgs optoģenētiski izraisītai kondicionētai vietai.
Lielākā daļa dopamīnerģisko signālu no VTA tiek pārraidīti uz MSN NAc caur DA receptoriem, D1R un D2R. D1R ir gandrīz ekskluzīvi izteikts vielā P (ko kodē Tac1 gēns), kas ekspresē MSN, un D2R pārsvarā ekspresē enkefalīnā (ko kodē Penk gēns) ekspresē MSN; katrs MSN veids veido attiecīgi tiešos un netiešos ceļus NAc (3). Tā kā afinitāte pret DA ir daudz lielāka D2R (nM secībā) nekā D1R (µM secībā) (22, 23), domājams, ka DA līmeņu samazinājums izraisa G inaktivācijuisavienots D2R, bet tam nav būtiskas ietekmes uz D1R (3, 24), tādējādi regulējot nervu darbību tieši netiešā ceļā. Turklāt Fos aktivācija bija redzamāka piecās vai Drd2 (D2R) ekspresējošās šūnās nekā Tac1 vai Drd1a (D1R) ekspresējošās šūnās (S5). Balstoties uz šiem novērojumiem, mēs izvirzījām hipotēzi, ka DA signalizācijai caur D2R varētu būt liela loma novērotajā aversīvajā kondicionēšanā.
Lai pārbaudītu šo hipotēzi, mēs veicām trīs kameru kondicionētās vietas novēršanas (CPA) testu (S6). Mēs sagatavojām uzvedības aparātu, kurā bija divas kameras ar praktiski identiskiem apstākļiem un viens mazs koridors. Šis objektīvais vides stāvoklis CPA testā ļāva mums papildus izpētīt, vai VTA DA neironu inaktivācija papildus tumsas telpas izvēles bloķēšanai var izraisīt arī aversīvu reakciju un mācīšanos. Ja dzīvniekiem tika atļauts brīvi pārvietoties pa visu aparātu, lielākā daļa no tiem palika divās kamerās bez tipiskas uzvedības atšķirības pretestā. Pēc tam optiskā kondicionēšana tika veikta, savienojot optisko stimulāciju ar vienu fiksētu kameru. Pat ja kondicionēšanai tika izmantota kāda no kamerām, TH-Cre peles neatlaidīgi un ievērojami izvairījās no uzturēšanās optiski kondicionētā kamerā kondicionēšanas laikā un pēc pārbaudēm (S6 B-E). Statistiskā analīze apstiprināja būtisku TH-Cre peļu uzturēšanās laika samazinājumu optiski kondicionētajā kamerā pēckontrolē, salīdzinot ar WT peļu uzturēšanās laiku (S6F).
Pēc tam mēs mēģinājām noteikt DA receptoru apakštipus, kas iesaistīti šajā aversīvajā uzvedībā, konkrēti apspiežot katru DA receptoru (Fig. 4 un S7). Mēs izstrādājām un apstiprinājām lentivīrusu vektorus, kas satur īsu matadata RNS (shRNS), kas ir specifiski katram DA receptoram, ar konstruktīvu mCherry ekspresiju. Trīs nedēļas pēc lentivīrusa ievadīšanas NAc, spēcīga mCherry ekspresija tika lokalizēta NAc (Fig. 4B). Katra receptora mRNS ekspresijas efektīvā izbeigšana tika apstiprināta ar kvantitatīvu reālā laika PCR analīzi (S7. Att.A). Izmērot olbaltumvielu līmeni, izmantojot Rietumu blotēšanu, atklājās arī tas, ka katra lentivīrusa injekcija selektīvi samazināja mērķa olbaltumvielu produktu, neietekmējot DA apakšgrupas DA receptora ekspresiju (Fig. 4C un S7 B-G). ShD1R un shD2R ekspresējošie lentivīrusi samazināja mērķa proteīna līmeni līdz 46.2 ± 1.1% un 38.4 ± 4.9%, salīdzinot ar kontroles vīrusa līmeni (Fig. 4C). Šie rezultāti pārliecināja, ka lentivīrusu vektori, kas selektīvi izsaka D1R un D2R specifiskas shRNS un pietiekami nomāc mērķa RNS un pazemina attiecīgo olbaltumvielu produktu daudzumu. Mēs arī apstiprinājām, ka VCA netika atklāta mCherry vīrusa izraisīta ekspresija, izslēdzot iespēju, ka lentivīrusu starpināta shRNS tieši ietekmēja VTA.
Izmantojot šos lentivīrusus, kas satur shRNS, mēs pārbaudījām, kurš DA receptoru tips ir atbildīgs par aversīvo uzvedību, ko izraisa DA neironu optoģenētiskā inaktivācija. Mēs injicējām shRNA saturošu lentivīrusu vai kontroles lentivīrusu divpusējā NAc kopā ar AAV-DIO-Arch TH-Cre peļu kreisajā VTA. Virs VTA tika ievietota arī optiskā šķiedra (Fig. 4A). Kad trīs kameru CPA tests tika veikts trīs nedēļas pēc operācijas, TH-Cre pelēm, kas injicētas ar lenti: shD1R-mCherry, joprojām bija izteikta CPA pret optisko stimulācijas pārī esošo kameru, kas ir salīdzināma ar TH-Cre pelēm, kas injicētas ar kontrolēt lentivirus (lenti: mCherry). Turpretī TH-Cre pelēm, kas injicētas ar lenti: shD2R-mCherry, neizrādījās acīmredzama CPA kondicionēšanas laikā (Fig. 4D). Ar lenti ievadīto TH-Cre peļu ekskluzīvais mācību deficīts: shD2R-mCherry tika vēl vairāk pamatots ar aversīvas mācīšanās analīzi pēcpārbaudes laikā (Fig. 4E). Šie rezultāti pierāda, ka nelabvēlīgā izturēšanās pret DA neirona inaktivācijas noteikto vietu NAc tika īpaši izsaukta caur D2R, nevis caur D1R.
diskusija
Striatumā pētījumi atklāja, ka Gssavienots D1R atvieglo tā izšaušanu, turpretim G aktivizēšanaisavienots D2R rezultāts ir aizdedzes efektivitātes samazināšana (25). Acsaskaņā ar DA receptoru ekspresijas specifiku DA neironu fāziskie šaušana galvenokārt aktivizē tiešo ceļu caur D1R, turpretim pārejošs DA neironu šaušanas samazinājums pārsvarā veicina netiešās kompetences spēju caur D2R. (3, 26). Balstoties uz šo regulēšanas mehānismu, ir ierosināts, ka DA neironu apklusināšana, reaģējot uz aversīviem stimuliem, galvenokārt tiek apstrādāta pa netiešu ceļu un rada nepatīkamu uzvedību (3). Nesenie pētījumi ir parādījuši, ka netiešā ceļa sinaptiskās pārraides bloķēšana kavē elektriskās strāvas izraisītas aversīvas uzvedības iegūšanu (15) un ka šos traucējumus izraisa D2R starpniecības signāla pārraides kavēšana (16). ITurklāt papildus D2R ekspresējošo MSN regulēšana netiešā ceļā izraisa uzvedības novēršanu (27). Tomēr, tā kā DA neironiem piemīt gan pastiprināti, gan nomākti ugunsgrēki, reaģējot uz aversīvajiem stimuliem, un tāpēc, ka smadzenēs vienlaicīgi tiek apstrādāta cita ar šoku saistīta sensora informācija, vēl ir jāprecizē, vai DA neironu klusēšana var tieši izraisīt pretrunīgu reakciju un mācīšanos, un vai šo reakciju netiešā ceļā regulē ar D2R ekspresējošiem MSN.
Šajā pētījumā mēs izmantojām DA neironu izšaušanas optoģenētisko kontroli divos uzvedības testos: tumšās telpas izvēles testā un trīs kameru CPA testā. Mūsu optogēnā manipulācija parādīja DA neironu šaušanas efektīvu nomākšanu VTA un DA līmeņu regulēšanu NAc.. Mūsu precīza DA neironu šaušanas optogenētiskā inaktivācija tikai tajā laikā, kad dzīvnieki uzturējās kondicionētajā kamerā, skaidri izraisīja atbaidošu reakciju un mācīšanos, parādot, ka pārejoša DA trokšņa slāpēšana tieši izraisīja pasīvo izvairīšanos. Turklāt šī izmeklēšana ir izskaidrojusi, ka D2R mediētā signāla apstrāde ir galvenais noteicošais faktors šīs atbaidošās reakcijas un mācīšanās ierosināšanai.
Lai gan mūsu dati parādīja, ka D1R nebija ietekmes uz uzvedības eksperimentiem, lai izsauktu CPA, vairākos pētījumos ir dokumentēts, ka DA neironu pakāpeniska dedzināšana ir nepieciešama, lai reaģētu uz bailēm un aversīvu mācīšanos (28, 29). Šī atšķirība ir saistīta ar eksperimentālo iestatījumu; ti, mūsu optogēnā pieeja izslēdza iespēju, ka signalizācija caur aktivētiem DA neironiem izraisa aversīvu uzvedību, norādot, ka DA neironu inaktivēšana bija pietiekama, lai izraisītu elpojošu uzvedību un mācīšanos. Aktīvās DA ierosināšanas funkcijas un signālu apstrāde, ko izraisa atbaidošie stimuli, varētu atšķirīgi ietekmēt uzvedību, kas tiek novērota no šeit pētītajiem, un tie ir jāprecizē nākotnē.
DA neironi arī projektē dažādus citus reģionus, tostarp mPFC, amygdala un hipokampus. Nesenā pētījumā norādīts, ka sānu habenula neironu, kas projicē uz DA neironiem, optogenētiskā aktivizācija VTA spēj izraisīt aversīvu uzvedību, un šie DA neironi galvenokārt un specifiski ir vērsti uz mPFC (30), lai gan to optogenētiskā kondicionēšana atšķiras no mūsu pašreizējā pētījuma, jo to optogenētiskais stimulējums tika pagarināts visai kondicionēšanas sesijai. Tā kā ir ziņots, ka dopamīnerģiskā ieeja mPFC ir aktivizēta ne tikai ar elpojošiem stimuliem, bet arī ar hronisku stresu (31, 32) ir iespējams, ka to nepārtraukta mPFC projektējošo DA neironu aktivizēšana tiktu uztverta kā signāls no ļoti saspringtas vides; un, saspringtas kondicionēšanas uzkrāšanās rezultātā, dzīvnieki uzrādīja kondicionējošu kameru uzbudinošu uzvedību. Turpretī mēs tikai inhibējām DA neironu šaušanu tikai tad, kad dzīvnieki atradās kondicionētajā kamerā. Mūsu uzvedības eksperimentu rezultāti, kas izmantoti ar laiku saskaņotai kondicionēšanai, liecināja, ka pēkšņa DA signāla apspiešana tiktu uztverta kā pēkšņa aversīva ievade, kā rezultātā tika panākta ātra atbildes reakcija.
DA neironi arī projektē uz amygdalu, reģionu, kas lielā mērā veicina bailes reakciju. Patiešām, DA signalizācija uz amygdalu ir saistīta ar bailes reakciju un bailes atmiņas iegūšanu (33, 34). Mūsu pētījumā, atzīmējot DA neironus VTA, tika konstatēts DA neironu kopums, kas izvirzās uz BLA, bet šo prognožu apjoms bija daudz mazāks nekā tas, kas tika prognozēts NAC. Lai gan mēs nevarējām izslēgt izsmalcinātu amygdala prognozēto DA signālu ietekmi uz mūsu novēroto aversīvo uzvedību, galvenajai DA neironu optogenētiskās inaktivācijas ietekmei vajadzētu būt NAc, jo mūsu eksperimenti ar specifisku D2R nolaupīšanu NAc ievērojami samazinājās atbaidošs uzvedība. Turpmākie pētījumi, kas vērsti uz mērķa specifisko DA signālu pārraidi, ir nepieciešami, lai noskaidrotu DA neironu ķēdes mēroga modifikācijas ietekmi uz aversīvajiem stimuliem un bailes kondicionēšanu.
Materiāli un metodes
Priekšmeti.
Tirozīna hidroksilāze :: IRES-Cre (TH-Cre) peles (EM: 00254) (18) iegūti no Eiropas peles mutantu arhīva. Visi eksperimentālie dzīvnieki tika pārsūtīti uz C57BL / 6J celmu vairāk nekā 10 paaudzēm. Peles saista ar C57BL / 6J WT pelēm un izmitināja ar standarta 12-h gaismas / 12-h tumšo ciklu un deva ēdienu un ūdeni ad libitum. Cre+ un Cre- eksperimentos tika izmantotas peles no tām pašām ligzdām (3 – 6 mo vecuma). Visi izmēģinājumi ar dzīvniekiem tika apstiprināti Osakas Bioloģijas institūta dzīvnieku komitejā saskaņā ar eksperimentiem ar dzīvniekiem.
Uzvedības testi.
Visu uzvedības testu laikā peles tika savienotas ar optisko šķiedru un ļāva pārvietoties pa visu aparātu. Tika novērota peles kustība, lai tās varētu pārvietoties bez šķēršļiem pat tad, ja tās bija savienotas ar optisko šķiedru uz galvas. Peles stāvoklis tika konstatēts ar videokameru, kas tika apturēta uzvedības aparātā un analizēta pēc pasūtījuma izgatavotas programmas, izmantojot Labview programmatūru.
Tumšās telpas preferenču tests.
Testā izmantoto pēc pasūtījuma izgatavoto uzvedības aparātu veidoja tumša telpa (15 × 9.5 cm) un spilgta atvērta telpa (15 × 11 cm). Tumšajā telpā bija sienas, grīdas un jumts, kas bija krāsains melnā krāsā un kam bija ieeja (4.5 cm garš) līdz atklātai gaišajai telpai. Atvērta spilgta telpa tika veidota kā elipse un tai bija metāla grīdas grīdas un skaidras sienas bez jumta. Pirms testa visas peles ieradās aparātā 10 min. Tests sastāvēja no trim sesijām: 1 dienas sākumā (pretest: 5 min), pelēm tika atļauts izpētīt visu aparātu. No 1 dienas beigām līdz 4 dienai (kopā: 35 min), peles saņēma optisko stimulāciju, kad viņi palika tumšā telpā. 5 dienā tumšās telpas izvēle tika pārbaudīta bez optiskās stimulācijas (posttest: 5 min; S1E).
Trīs kameru CPA tests.
Testā izmantoto trīskameru kondicionēto vietu preferenču / CPA speciāli izgatavoto aparātu veidoja divas kameras (10 × 17 cm) un savienojošais koridors. Tests sastāvēja no trim sesijām. 1 diena (pretest: 15 min): pelēm tika atļauts brīvi izpētīt visu aparātu. No testiem tika izslēgtas peles, kas vienā kamerā palika 1.5 reizes ilgākas nekā citās kamerās. Dienas 2 un 3 (kondicionēšana: 15 min katrs): peles saņēma optisko stimulāciju, kad tās palika gaismas pārī esošajā kamerā. Gaismas pāra kameras izvēle tika līdzsvarota. 4 diena (posttest: 15 min): Tests tika veikts ar tādiem pašiem nosacījumiem kā pretestē (S6A).
Kondicionēšanas sesijā optiskā stimulācija tika pārtraukta 30 s, kad peles nepārtraukti palika pāri 30 s tumšajā telpā vai vieglā pārī ar kameru, lai izvairītos no pārkaršanas. Visās uzvedības pārbaudēs lāzera jauda tika kontrolēta kā aptuveni 5 mW pie optiskās šķiedras gala.
Vivo ātrās skenēšanas cikliskā voltammetrija.
FSCV eksperimenti tika veikti, izmantojot iepriekšējos pētījumos aprakstīto metodi (35-37). Peles tika anestēzētas ar ketamīna / ksilazīna maisījumu, kā aprakstīts SI materiāli un metodes un novieto stereotaksiskajā rāmī. Optisko šķiedru, kas tiek izmantota, lai stimulētu ar DA ekspresējošu neironu, atradās tuvu stimulējošajam elektrodam. Tad stimulējošais optrode tika ievietots VTA (no bregmas: priekšējais-aizmugurējais, −3.2 mm; sānu, 0.5 mm un muguras – vēdera, 3.5 mm) un nolaists 0.25 mm intervālos. Oglekļa šķiedras mikroelektrode (300 µm garumā) voltammetriskajai ierakstīšanai tika samazināta NAc (no bregmas: priekšējā - aizmugurējā, 1.0 mm; sānu, 1.0 mm un muguras – vēdera, 3.5 mm). Voltammetriskos mērījumus veica katru 100 ms, izmantojot oglekļa šķiedras mikroelektrodi ar trijstūra viļņu formu (−0.4 V līdz + 1.3 V –0.4 V pret Ag / AgCl, pie 400 V / s). Veidlapu izolācijai un strāvas pastiprināšanai tika izmantots pēc pasūtījuma izgatavots potenciostats. DA izdalīšanos izraisīja DA neironu elektriskā stimulācija, izmantojot 24 impulsu stimulāciju (100 µA, 5 ms ilgums, 30 Hz). DA neironu optiskā stimulācija (532 nm, X5 mW jauda pie šķiedras gala) tika izmantota 10 s, sākot 5 s pirms elektriskās stimulācijas sākuma. Oglekļa šķiedras mikroelektrodi tika kalibrēti šķīdumā ar zināmām DA koncentrācijām (0.2 µM, 0.5 µM un 1.0 µM). Visi voltammetrijas dati tika analizēti pēc pasūtījuma izgatavotām programmām, izmantojot Labview un Matlab programmatūru. DA līmeņu samazināšana ar optisko stimulāciju tika atrisināta ar galveno komponentu analīzi, izmantojot veidnes DA viļņu formas, kas iegūtas no elektriskajiem VTA stimuliem, lai atdalītu dopamīna signālus (35, 36).
Statistiskā analīze.
Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software). Dati tika analizēti ar atkārtotiem ANOVA pasākumiem (Att. 1B, , 4D,4D, un S6 D un E) vai vienvirziena ANOVA (Att. 1C, , 3D,3D, 4 C un E, un Att. S4 K-M, S6F, un S7A), un post hoc analīzes tika veiktas, izmantojot Bonferroni testu. Visas atzīmes / kolonnas un stieņi bija attiecīgi vidējais un ± SEM.
Citas eksperimentālās procedūras, tostarp vīrusu sagatavošana un injekcija, elektrofizioloģiskā reģistrācija un imūnhistoķīmiskā un mRNS analīze ir sīki aprakstītas SI materiāli un metodes.
Pateicības
Mēs pateicamies E. Boyden par Arhitektu, R. Matsui par tehnisko padomu lentivir ražošanā un attīrīšanā, un Y. Hayashi par tehnisko padomu datu analīzes plānošanā. Šo darbu atbalstīja Izglītības, kultūras, sporta, zinātnes un zinātnes ministrijas Pētniecības granti-22220005 (uz SN), 23120011 (uz SY un SN), 24700339 (uz TD) un 25871080 (uz SY). Japānas tehnoloģija un Takeda Science Foundation (SN) dotācija.
Zemsvītras piezīmes
Autori paziņo, ka nav interešu konflikta.
Šajā rakstā ir pieejama papildinformācija tiešsaistē www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Atsauces
;
