Mesolimbiskās dopamīna neirona stimulācijas pietiekamība progresēšanai līdz atkarībai (2015)

Ievads

Atkarība ir slimība, kas attīstās vairākos posmos (Everitt et al., 2008, George et al., 2014). Diagnoze tiek noteikta tad, kad rekreācijas lietošana kļūst piespiedu kārtā, saglabājoties neskatoties uz negatīvām sekām. Lai gan vadošā atkarības hipotēze izvirza apgalvojumu, ka ļaunprātīgas narkotikas izraisa slimību, jo tās pārmērīgi palielina dopamīna (DA) koncentrāciju smadzenēs, nav skaidrs, vai šīs sistēmas iedarbināšana ir pietiekama, lai virzītu pāreju no atpūtas lietošanas uz atkarību (Di Chiara un Bassareo, 2007, Volkova un Moralesa, 2015). DA hipotēzes par narkotiku pastiprināšanu pamatojošie pierādījumi ir uzkrājušies vairāku gadu desmitu laikā un balstās uz zāļu sākotnējo iedarbību. Piemēram, atkarību izraisoši medikamenti samazina vidējās priekšpuses smadzeņu saišķa - šķiedru trakta - intrakraniālās pašstimulācijas (ICSS) slieksni, kas cita starpā satur DA augšupejošu projekciju no vidus smadzenēm (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky et al., 1979). Farmakoloģijas un bojājumu pētījumos pēc tam tika identificēta mezokortikolimbiskā DA sistēma kā šīs ķēdes izcelsme (Wise un Bozarth, 1982). Astoņdesmito gadu beigās tiešs ekstracelulārās DA koncentrācijas mērījums ar mikrodialīzi apstiprināja, ka atkarību izraisošajām zālēm ir kopīga īpašība izraisīt DA strauju pieaugumu NAc (Di Chiara un Imperato, 1980). Tas izraisīja priekšlikumu par atkarību izraisošu narkotiku mehānisku klasifikāciju (Lüscher and Ungless, 1988).

Daudz mazāk ir zināms, kā šīs narkotiku lietošanas sākotnējās sekas veicina pāreju uz atkarību. Ir apsvērti no DA neatkarīgi mehānismi, jo atkarību izraisošām zālēm ir citi farmakoloģiski mērķi. Piemēram, kokaīns papildus DA transportera (DAT) inhibēšanai saistās arī ar SERT (serotonīna pārvadātājs) un NET (norepinefrīna pārvadātājs), lai attiecīgi samazinātu serotonīna un norepinefrīna atpakaļsaistību, tādējādi palielinot visu galveno monoamīnu (Han un Gu, 2006, Tassin, 2008). Līdzīgas bažas var attiekties arī uz citiem psihostimulatoriem. Turklāt pastāv apgalvojums, ka opiāti vismaz sākotnējā posmā ir DA neatkarīgi (Badiani et al., 2011, Ting-A-Kee un van der Kooy, 2012). DA hipotēze tika apstrīdēta arī, pamatojoties uz ģenētiskajiem peles modeļiem, kur pēc iejaukšanās DA sistēmā joprojām bija acīmredzamas dažas narkotiku adaptīvās uzvedības formas. Piemēram, DAT nokautās peles pašas lieto kokaīnu (Rocha et al., 1998) un DA sintēzes atcelšana vai nu farmakoloģiski (Pettit et al., 1984), vai ģenētiski (Hnasko et al., 2007) neizdevās novērst narkotiku pašpārvaldi. vai nosacītas vietas izvēle. Lai gan šo transgēno peļu labāka raksturošana un dubulto monoamīna pārvadātāju paaudzes nokaušana ir atrisinājusi dažus no šiem jautājumiem (Rocha, 2003, Thomsen et al., 2009), DA pietiekamība, lai izraisītu kardinālās atkarības pazīmes, nav zināma. Lai apietu nespecifiskuma jautājumus, mēs esam nolēmuši atļaut pelēm pašstimulēt VTA DA neironus, izmantojot optoģenētisku pieeju.

Jaunākie pētījumi ir parādījuši, ka DA neironu aktivācija vidus smadzenēs var izraisīt priekšroku vietai (Tsai et al., 2009) vai pastiprināt instrumentālo uzvedību (Adamantidis et al., 2011, Witten et al., 2011, Kim et al., 2012, Rossi et al., 2013, McDevitt et al., 2014, Ilango et al., 2014). Lai gan šī DA ceļu selektīva aktivizēšana apstiprina intrakraniālās pašstimulācijas (ICSS) pētījumus, kas veikti vairāk nekā pirms 30 gadiem, nosakot atlīdzības sistēmu (Fouriezos et al., 1978), tie neatbilst, parādot vēlīnās adaptīvās uzvedības indukciju, kas definē atkarību, kā arī neidentificēja pamatā esošos neironu pielāgojumus. Šeit mēs izmantojām optoģenētiskās manipulācijas ne tikai, lai ļautu tieši pārbaudīt DA pakāpeniskās signalizācijas pietiekamības kritēriju, uzsākot pastiprinājumu, bet arī pārbaudīt pāreju uz atkarību.

Pārsteidzošs slimības vēlāko posmu novērojums ir tāds, ka pat ar visvairāk atkarību izraisošām zālēm tikai daļa lietotāju kļūst atkarīgi (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997). Cilvēku atkarīgie turpinās narkotiku lietošanu, neskatoties uz negatīvām sekām (skat. Amerikas Atkarības medicīnas biedrības “Atkarības definīcija”, DSM5, Amerikas Psihiatru asociācija, 2013), kas parasti ir saistīta ar sociālām un psiholoģiskām sakāvēm, kuras bieži kavējas laikā. Līdzīgi grauzējiem aptuveni viens no pieciem dzīvniekiem, kuri iegūst kokaīna pašpārvaldi, galu galā tiek klasificēti kā atkarīgi (Deroche-Gamonet et al., 2004, Kasanetz et al., 2010; bet sk. George et al., 2014). Neskatoties uz negatīvām sekām, zāļu uzņemšanas noturību var arī modelēt grauzējiem, ieviešot vienkāršu aversīvu stimulu patēriņa grafikā. Kaut arī cilvēka slimība ir sarežģītāka, soda saistīšana ar patēriņu ir vienkāršs atkarības pamatkomponenta modelis.

Šeit mēs izmantojām vieglu kāju triecienu, lai novērtētu tā sekas kokaīna, saharozes pašievadīšanai un optoģenētiskai sevis stimulēšanai. Mēs turpinām izpētīt, vai DA neironu pašstimulācija var izraisīt divus ar atkarību saistītus uzvedības veidus, piemēram, ar naudas meklēšanu saistītu atalgojuma meklēšanu un ar patēriņu saistītu kompulsivitāti, neskatoties uz negatīvajām sekām, un raksturo nervu plastiku, kas saistīta ar šo izturēšanos.

rezultāti

Lai kontrolētu DA neironu aktivitāti, mēs ievadījām Cre izraisītu adeno-asociēto vīrusu (AAV) ar divkārši apgrieztu atvērtu lasīšanas rāmi (DIO), kas satur ChR2 sapludināts ar pastiprinātu dzelteno fluorescējošu olbaltumvielu (eYFP) (Atasoy et al., 2008, Brown et al., 2010) DAT-Cre peles VTA. Turklāt, lai mērķētu uz VTA, tika ievietota optiskā šķiedra (ChR2Skatīt Eksperimentālās procedūras). Programmas specifika ChR2 ekspresiju apstiprināja eYFP lokalizācija ar tirozīna hidroksilāzi (TH) - enzīmu, kas nepieciešams DA sintēzei (1. attēlsA). 

Pirmkārt, lai izveidotu lāzera stimulācijas protokolu, peles ievietoja operanta kastē, kur tās varēja nospiest aktīvo sviru, kas katru reizi izraisīja virkni lāzera stimulāciju (1, 2, 8, 32, 60 vai 120 pārrāvumi). divas sesijas. Lai atdarinātu fāzes šaušanas modeli (Hyland et al., 2002, Mameli-Engvall et al., 2006, Zhang et al., 2009), ko parasti izraisa dabiska atlīdzība (Schultz, 1998), mēs izmantojām eksplozijas stimulāciju. Viena sērija sastāvēja no pieciem 4 ms lāzera impulsiem ar 20 Hz frekvenci, un to atkārtoja divas reizes sekundē. Mēs noskaidrojām, ka peles pielāgoja sviras nospiešanas uzvedību kā lāzera stimulācijas pārrāvumu funkciju, tādējādi kontrolējot kopējo saņemto pārrāvumu skaitu (1. attēlsB). Šī uzvedība atgādināja atkarību izraisošu zāļu pašpārvaldīšanu, kad deva uz infūziju bija atšķirīga (Piazza et al., 2000). Turpmākajiem eksperimentiem mēs izvēlējāmies ievadīt 30 sērijas vienā sviras nospiešanā, iegūstot pusi no maksimālā sēriju skaita (1. attēlsB). Lai atdarinātu DA pieauguma aizkavēšanos, kas parasti novērojama, ievadot zāles intravenozi (Aragona et al., 2008), mēs par 5 s aizkavējām lāzera stimulāciju un 10 s pievienojām mirgojošu signālu gaismu (1. attēlsC).

12 dienu laikā pēc kārtas pelēm tika atļauts pašstimulēties maksimāli 80 reizes 2 stundu laikā. Peles ātri palielināja lāzera stimulācijas ātrumu, sasniedzot 80 lāzera stimulācijas (LS) pirms pirmās sesijas stundas beigām (Skaitļi 1D un 1E). Strauji tika iegūta atšķirība starp aktīvo un neaktīvo sviru, un attiecīgi palielinājās aktīvo sviru spiedienu skaits, palielinot fiksēto attiecību (FR1, 2, 3) grafikus (Skaitļi 1F un 1G). Kontroles eksperimentos, izmantojot DAT-Cre-peles vai peles, kas ekspresēja ChR2 γ-aminosviestskābes (GABA) neironos (GAD-Cre + pelēm, lai mērķētu uz VTA inhibējošajiem neironiem), pašstimulācijas ātrumi bija zemi un nepārtraukti samazinājās sesijas. Tas attiecās arī uz diviem Cre + dzīvniekiem, kur post hoc validācija parādīja, ka VTA nav inficēts ar ChR2-eYFP (nav parādīts). Turklāt netika atklāta diskriminācija starp aktīvo un neaktīvo sviru (S1A un S1B).

Mēs novērojām, ka DAT-Cre + peles biežāk piespieda aktīvo sviru, nekā nepieciešams lāzera stimulēšanai. Faktiski šādas “veltīgas” aktīvās sviras preses veidoja vairāk nekā 30% no visiem aktīvajiem sviru presēm (S2 attēlsA) un notika - sesijām progresējot - galvenokārt starp bižele un lāzera stimulācijas sākumu (S2B un S2C). Šī savdabīgā izturēšanās attīstījās iegūšanas laikā un var atspoguļot impulsīvas reakcijas.

Kopumā eksplozijas aktivitāte VTA DA neironos spēcīgi pastiprina sviras reakciju.

Kokaīna VTA DA neirona pašstimulācijas oklūzija

Lai pārbaudītu, vai VTA DA neironu pašstimulācija ir atkarīga no tām pašām smadzeņu ķēdēm, kuras ir atkarīgas no narkotikām, lai pastiprinātu uzvedību, mēs tieši pirms pašstimulācijas sesijām injicējām kokaīnu intraperitoneāli (ip) (brīva piekļuve lāzeram 45 minūtes, 2. attēlsA). Sākumā labi apmācīti dzīvnieki spieda apmēram 400 reizes, lai saskaņā ar FR85 grafiku 45 minūtēs iegūtu 3 LS. Pēc kokaīna injekcijas veiktspēja ievērojami samazinājās no devas līdz aptuveni 30 LS 100 sviras presēm ar vislielāko devu (2. attēlsB). Šī oklūzija bija visizteiktākā sesijas pirmajās 30 minūtēs, atspoguļojot zāļu farmakokinētiku (2. attēlsC). Šis eksperiments norāda, ka pastiprināšana ar optoģenētisku pašstimulāciju un pastiprināšana ar kokaīna palīdzību ir pamatā neironu ķēdēm.

Lai vēl vairāk salīdzinātu optoģenētisko pašstimulāciju ar atkarību izraisošām zālēm, mēs pēc tam vaicājām, vai pēc vairāku nedēļu pārtraukšanas pelēm atkārtosies VTA DA neironu pašstimulācija. Tā kā ar narkotiku meklēšanu saistītā narkotiku meklēšana ir izveidojies recidīva modelis (Epstein et al., 2006, Soria et al., 2008, Bossert et al., 2013), mēs ievietojām peles operantu kamerā 30 dienas pēc pēdējās pašnovērtēšanas. stimulācijas sesija, kur aktīvā sviras nospiešana tagad izraisīja signāla gaismu bez lāzera stimulācija (3. attēlsA). Izturīga ar nūju saistīta uzvedība, ko demonstrē augsts aktīvo sviru nospiešanas ātrums, bija redzama tikai pelēm ar eYFP-ChR2 VTA DA neironos (DAT-Cre +, bet ne DAT-Cre-peles, 3. attēlsB).

Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši cēloņsakarību starp ar norādi saistītu recidīvu un kokaīna izraisīto sinaptisko plastiskumu NA D neironu apakštipā, kas ekspresē DA D1R, izraisīja kokaīns (Pascoli, Terrier et al., 2014). Tāpēc, lai novērtētu šo sinaptisko plastiskumu, mēs izveidojām DAT-Cre peles, ar kurām sakrustotas Drd1a-tdTomato peles, lai identificētu vidēja izmēra spin neironu (MSN) apakštipu NAc. Meklēšanas testa vietā tika sagatavotas NAc šķēles, kurās D1R-MSN bija sarkanā krāsā, kontrastējot ar zaļajām šķiedrām no VTA DA neironiem, kas inficēti ar flox-ChR2-eYFP (3. attēlsC). Visu šūnu plākstera skavas ex vivo ieraksti parādīja izlīdzinošās strāvas sprieguma attiecības AMPAR izraisītajām postsinaptiskajām strāvām (AMPAR-EPSC) un paaugstinātu AMPAR / NMDAR attiecību (Skaitļi 3D3R-MSN, bet ne D1R-MSN. Tika parādīts, ka līdzīgi atklājumi, kas iepriekš iegūti pēc atteikšanās no kokaīna pašpārvaldes, norāda uz kombinētu GluA2 trūkuma un GluA2 saturošu AMPAR ievietošanu atsevišķās ieejās D2R-MSN (Pascoli, Terrier et al., 1).

Sevis stimulēšana, neskatoties uz sodu

Neskatoties uz negatīvajām sekām, vielu lietošana ir anoher izšķiroša atkarības iezīme (sk. DSM5 definīciju, American Psychiatric Association, 2013). Ir izveidoti žurku modeļi (Deroche-Gamonet et al., 2004, Pelloux et al., 2007, Pelloux et al., 2015, Chen et al., 2013), kur kokaīna pašpārvaldes grafikā ieviestais elektrošoks nomāc kokaīnu patēriņš dažiem dzīvniekiem. Pēc 12 dienu ilgas sākotnējās iedarbības (iegūšanas) pelēm tika atļauts veikt trīs papildu sesijas ar FR3, taču ar samazinātu sesijas pārtraukumu (maksimums 60 minūtes vai 40 atlīdzības). Šīs trīs sesijas kalpoja par pamatu nākamajām četrām sesijām, kur katra trešā lāzera stimulācija tika savienota ar pēdas šoku (500 ms; 0.2 mA), ko paredzēja jauns signāls (4. attēlsA). Pēdas trieciena intensitāte un ilgums tika pielāgoti, lai pilnībā nomāktu sviras nospiešanu, lai iegūtu saharozi (skatīt arī datus zemāk). Soda grafiks izraisīja divas pretējas izturēšanās reakcijas (4. attēlsB). Dažas peles ātri pārstāja reaģēt, kad tika ieviests sods (sauktas par “jūtīgām”), savukārt citas turpināja reaģēt, lai iegūtu maksimālu lāzera stimulāciju skaitu, un tās var uzskatīt par “izturīgām” pret sodu. Divas dzīvnieku kopas pilnībā parādījās četru soda sesiju beigās (4. attēlsC). “Resistentās peles” uzturēja lāzera stimulāciju skaitu (mazāk nekā 20% samazinājums), savukārt “jutīgās peles” samazināja pašstimulāciju par vairāk nekā 80%. Izmantojot šos kritērijus, nevarēja piešķirt tikai vienu dzīvnieku (pelēkus punktus). Šis novērojums parāda, ka piespiedu eksplozijas aktivitāte, ko izraisa VTA DA neironu pašstimulācija, ir pietiekama, lai izraisītu neatlaidīgu patēriņu, neskatoties uz negatīvajām sekām daļai peļu. Kā kontrole neatkarīgā peļu grupā, kurai bija noteikta izturība vai jutība pret sodu, kas saistīta ar sevis stimulēšanu, nocicepcija tika novērtēta, izmantojot astes švīkas testu. Netika konstatētas atšķirības jutīgā un izturīgā starp karstā ūdenī iegremdētās astes aizkavēšanas latentuma (S3 attēls).

Pēc tam mēs post hoc jautājām, vai kāda īpaša iezīme pašstimulācijas iegūšanas posmā varēja paredzēt pretestību sodīšanai. Jutīgas un izturīgas peles sākotnējā sesijas laikā veica identisku aktīvo un neaktīvo sviru spiedienu, un visas peles sasniedza 80 LS maksimumu (S4A un S4B) līdzīgā laika posmā (S4A un S4C). Kaut arī veltīgo aktīvo sviru presēšanas daļa atkal neatšķīrās divās apakšgrupās (Skaitļi 4D un S4D), veltīgo sviru nospiešanu skaits pirms lāzera stimulācijas sākšanās rezistentajām pelēm kļuva ievērojami lielāks līdz ieguves sesiju beigām (Skaitļi 4E un S4E). Tā kā šī uzvedība attīstījās iegūšanas laikā, tā kopā ar iedzimtu impulsivitāti (Economidou et al., 2009, Broos et al., 2012, Jentsch et al., 2014) var veicināt izturību pret sodu. Turklāt 11. dienā tika veikts progresīvās attiecības pētījums, lai kvantitatīvi noteiktu optoģenētiskās stimulācijas motivāciju (Richardson and Roberts, 1996). Rezistentām pelēm novēroja lūzuma punktu, kas statistiski neatšķiras no jutīgām pelēm (S4 attēlsF).

Izturība pret sodīšanu par kokaīnu, bet ne par saharozi

Lai pārbaudītu, vai patēriņa paradigma, neraugoties uz kaitīgajām sekām, un impulsa sviras nospiešana varētu arī paredzēt atkarību izraisošu narkotiku piespiedu uzņemšanu, jaunai peles kohortai 12 dienas tika pašpārvaldīta kokaīna lietošana. Kokaīna pašapkalpošanās eksperimentālie parametri tika noteikti līdz 80 kokaīna infūzijām 4 stundu laikā iegūšanas laikā un līdz 40 infūzijām 2 stundu laikā trīs bāzes sesijās pirms četrām soda sesijām (Skaitļi 5A un S5A). Atkal izveidojās divas grupas pēc tam, kad kokaīns tika savienots pārī ar elektrošoku. Patiešām, 5 no 22 pelēm tika klasificētas kā izturīgas (mazāk nekā 20% samazinājums salīdzinājumā ar sākotnējo līmeni), savukārt 17 kvalificēja kā jutīgu (vairāk nekā 80% samazinājums) un viens dzīvnieks iekrita starp tiem (13 uzlējumi dienā 19) (5. attēlsB). Pēc tam mēs meklējām izturēšanās prognozētājus pretošanās sodiem. Starp abām grupām infūziju skaits, infūzijas ātrums un aktīvo vai neaktīvo sviru spiedienu skaits neatšķīrās (S5B – S5D), un lūzuma punkti bija līdzīgi (S5 attēlsE). Atšķirīgs bija bezjēdzīgo aktīvās sviras spiedienu sadalījuma evolūcija laikā. Pirmajās četrās sesijās veltīgo sviru spiedieni taimauta periodos regulāri samazinājās gan izturīgām, gan jutīgām pelēm, savukārt iegādes beigās tikai jutīgas peles saglabāja šo uzvedību (Skaitļi 5C un 5D un S5F). Turpretim izturīgām pelēm bija tendence palielināt kopējo veltīgo sviru spiedienu skaitu (Skaitļi 5C un S5D), it īpaši noilguma perioda pēdējā ceturksnī (5. attēlsD). Kaut arī kvalitatīvi līdzīgs novērojumam, kas iepriekš tika veikts ar DA neironu optoģenētisko stimulāciju (skat. Iepriekš), veltīgo spiedoņu klasterizācija agrīnajā taimauta periodā kokaīnā netika novērota, visticamāk, lēnākās kinētikas dēļ, ar kādu šī narkotika paaugstināts DA līmenis. Neskatoties uz to, līdzīgus secinājumus varētu izdarīt, pamatojoties uz šo veltīgās sviras preses izplatības vienreizējo attīstību īsā laika posmā pirms “DA pārsprieguma iekšējas noteikšanas”. Tādējādi mūsu novērojumi liek domāt, ka veltīgu aktīvo sviru spiedienu izplatīšana paredz narkotiku lietošanu neskatoties uz negatīvajām sekām.

Visbeidzot mēs atkārtojām eksperimentu ar pelēm, kuras baroja ar ad libitum un kuras varēja nospiest, lai iegūtu saharozes atlīdzību. Kad sods tika ieviests, visas peles pārstāja patstāvīgi lietot saharozi (5. attēlsE), parādot, ka šis grafiks nomāc nebūtiskas dabiskas atlīdzības uzņemšanu, bet ļāva noteikt atkarību izraisošu zāļu kompulsīvu uzņemšanu vai spēcīgu DA neironu stimulāciju.

Kopumā šie rezultāti parāda, ka VTA DA pašstimulācija ir pietiekama, lai izraisītu kompulsivitāti, par ko liecina pretestība soda izpildīšanai peļu apakškopā (68%). Līdzīgi pēc kokaīna SA dažas peles kļuva izturīgas pret sodīšanu (23%), kā tas nekad nebija pēc saharozes SA (5. attēlsF).

Lai precīzi noteiktu smadzeņu zonu, kas, neskatoties uz negatīvām sekām, var kontrolēt lēmumu pastāvīgi veikt pašpārvaldi, vispirms mēs novērojām vispārējo “neironu aktivitāti”, saskaitot neironu skaitu, kuros soda sesija izraisīja tūlītēja agrīna gēna cFos izpausmi 15 dažādos reģionos. Peles intrakardiāli perfuzēja ar PFA 90 minūtes pēc pēdējās soda sesijas beigām. Kontroles grupas ietvēra naivus dzīvniekus, kā arī peles, kuras ievilināja jutīgām vai izturīgām pelēm, lai kontrolētu saņemto triecienu skaita iespējamo mulsinošo iedarbību.

Lai gan lielākajā daļā izvēlēto reģionu cFos-pozitīvo neironu skaits bija visaugstākais rezistentu peļu šķēlēs, salīdzinot ar naivām peļu šķēlītēm, parādījās divu veidu reakcijas, no kurām, piemēram, ir provbiksiskā garoza (PL) un sānu OFC. PL mēs atradām līdzīgu cFos-pozitīvo šūnu pieaugumu rezistentās pelēs un to jūga kontrolgrupās, savukārt OFC šis pieaugums bija redzams tikai rezistentās, nevis atbilstošajās jūga pelēs (Skaitļi 6A un 6B). Lai kvantitatīvi noteiktu šo atšķirību, visi dati vispirms tika normalizēti līdz ekspresijas līmenim naivos dzīvniekos. Pēc tam tika aprēķināta attiecība starp izturīgo pret jutīgo un dalīta ar joku un izturību pret jūga un jutīga (attiecība_cfos = (R / S) / (YR / YS), 6. attēlsB). Šī procedūra identificēja cingulāro garozu, OFC un VTA kā reģionus, kas tiek aktivizēti rezistentās, bet ne jutīgās pelēs un kur bija maz atšķirību abās jūga kontroles grupās (faktiski līdzīgi zemu cFos-pozitīvi neironi jūgā) . VTA atrašana nav pārsteidzoša, jo tā ir lāzeru stimulētu neironu reģions. Tas atbilst iepriekšējam ziņojumam, kas parāda, ka ChR2 stimulācija izraisa cFos aktivāciju (Lobo et al., 2010, Van den Oever et al., 2013). Zema attiecība_cfos tika atrasts reģionos, kur aktivēšana bija līdzīga jutīgai un izturīgai (piemēram, CeA un PAG). Attiecība_cfos bija arī zems, kad aktivizēšana tika paralēla ar lielu atšķirību jūga vadības ierīcēs (piemēram, PL, 6. attēlsC par apkopoto attiecību_cfos dati). Tādēļ līdzīgu cFos ekspresiju izturīgās un jūga izturīgajās pelēs, visticamāk, izraisīja pēdu triecienu skaits, un tam bija maz sakara ar izturību pret sodu. Kopumā ņemot, augstā attiecība_cfos OFC norāda, ka neironu darbība šajā reģionā ir saistīta ar izturību pret sodu un tādējādi var sekmēt pāreju uz atkarību.

Lai identificētu paaugstinātas neironu aktivitātes substrātu OFC pelēm, kas izturas pret sodu, mēs sagatavojām PL un L-OFC šķēles 24 stundas pēc pēdējās soda sesijas, lai pārbaudītu iekšējo uzbudināmību. Abi reģioni tika izvēlēti to ļoti atšķirīgā c-Fos ekspresijas modeļa dēļ iepriekšējos eksperimentos. Neironu uzbudināmība tika kvantitatīvi noteikta, skaitot darbības potenciālu (AP) skaitu, ko izraisīja pieaugoša strāvas daudzuma (no 0 līdz 600 pA) ievadīšana visu šūnu ierakstos. Šie ieraksti atklāja noturīgu hipo uzbudināmību rezistentu peles (un to jūga kontroles) PL piramīdveida neironos, salīdzinot ar jutīgām vai naivām pelēm (7. attēlsA). Reģistrēto neironu atpūtas membrānas potenciāls (RMP) neatšķīrās starp eksperimentālajām grupām (7. attēlsB). Šie rezultāti stingri norāda, ka neironu uzbudināmība PL tieši korelē ar saņemto triecienu skaitu un varbūt ne ar lēmumu pretoties sodīšanai. Tas, visticamāk, atspoguļo negatīvās atgriezeniskās saites pielāgošanos, ko izraisa neironu ierosme, ko iepriekšējā dienā izraisīja pēdu satricinājums. Turpretī L-OFC neironi uzbudināmi bija tikai izturīgām pelēm. Peļu neironu uzbudināmība neatšķīrās no naivo peļu neironu uzbudināmības, izslēdzot pašas pēdas satricinājumu (Skaitļi 7C un 7D). Šī OFC neironu paaugstinātā aktivitāte, iespējams, ir cFos ekspresijas pamatā un var izraisīt izturību pret sodīšanu.

Lai pārbaudītu cēloņsakarību starp uzlabotu OFC neironu uzbudināmību un izturību pret sodu, mēs izteicām inhibējošo DREADD (dizaineru receptori, kurus aktivizē tikai dizaina zāles: CamKIIα-hM4D) DAT-Cre + peles OFC piramīdveida neironos (8. attēlsA). Akūtās OFC šķēlītēs CNO (klozapīna-N-oksīda) uzklāšana vannā izraisīja lēnu ārējo strāvu, kuru, visticamāk, veic GIRK kanāli, un kuru apgriezta bārijs (Ba²⁺), nespecifisks kālija kanālu bloķētājs (8. attēlsB). CNO arī novirzīja ievades / izvades līkni pa labi (8. attēlsC). DAT-Cre + peles, kas OFC inficētas ar AAV1 / CamKIIα-hM4D-mCherry (8. attēlsD) iegūta DA neironu pašstimulācijas paradigma, kurai seko divi secīgi bloki ar soda grafiku - pirmais CNO klātbūtnē un otrais bez CNO. Abus blokus pārtrauca 6 dienas bez soda (8. attēlsE). Pirmā soda bloka beigās CNO klātbūtnē tikai 5 peļu 16 bija izturīgi (8. attēlsF, kreisais panelis). Turpretī bez OFC inhibīcijas otrajā soda periodā 14 no 16 tika klasificēti kā “izturīgi” (Skaitļi 8F, labais panelis un 8G). Citiem vārdiem sakot, izturīgu peļu daļa bija ievērojami zemāka CNO klātbūtnē, salīdzinot ar 34 peļu pirmo kohortu, kas iepriekš pārbaudīta tajos pašos apstākļos (starp grupām, 8. attēlsH) un kļuva līdzīgs pirmajai kohortai bez CNO (grupas iekšējais salīdzinājums). Visbeidzot, deviņām pelēm, kuras mainījās no jutīgām pret izturīgām, CNO nemainīja astes uzsitiena latentumu, iegremdējoties karstā ūdenī (8. attēlsI).

Kopumā šis eksperiments parāda, ka OFC piramīdveida neironu darbība virza lēmumu turpināt pašstimulāciju, neskatoties uz negatīvajām sekām, kas ir galvenā iezīme pārejā uz atkarību grauzējiem.

diskusija 

Nesen ierosinātais atkarības modelis izceļ trīs slimības progresēšanas posmus: sporādiska izklaides narkotiku lietošana, kam seko pastiprināta, ilgstoša, eskalēta narkotiku lietošana un galu galā piespiedu lietošana, kas saistīta ar kontroles zaudēšanu (Piazza and Deroche-Gamonet, 2013; bet sk. Džordžs u.c., 2014). Mūsu pētījums parāda, ka VTA DA neironu stimulēšana ir pietiekama, lai virzītu šo progresu ar samērā ātru laika kursu.

Atdarinot dabiski sastopamu sprādziena modeli, VTA mērķa reģionos, piemēram, NAc, tiek izsaukta efektīva DA izdalīšanās (Bass et al., 2010). Tāpēc DA līmenis NAc, visticamāk, regulē pašstimulāciju, tāpat kā grauzēji paši ievada nākamo kokaīna vai heroīna infūziju, tiklīdz DA koncentrācija nokrītas zem sliekšņa (Wise et al., 1995). To apstiprina arī mūsu novērojums, ka kokaīns, injicēts ip, var aizsprostot pašstimulāciju. Tādējādi DA neironu pašstimulācija ir ļoti līdzīga zāļu pašpārvaldei, kaut arī tā kinētika noteikti ir ātrāka nekā jebkura farmakoloģiska viela, ieskaitot kokaīnu, kā to liecina atšķirīgais reakciju ātrums, kas novērots šajā pētījumā.

Kamēr mēs selektīvi mērķējam uz VTA DA neironiem, to optogenētiskajai pašstimulācijai var būt aktivētas šūnu grupas ar dažādām fizioloģiskām funkcijām. Piemēram, nesen tika ierosināts, ka daži DA neironi kodē aversīvos stimulus (Lammel et al., 2012, Gunaydin et al., 2014). Šīs šūnas izvirzās mPFC, savukārt VTA DA neironi, kas izvirzīti uz sānu NAc apvalku, ir pozitīvas pastiprināšanas starpnieki (Lammel et al., 2012). Būtu interesanti novērtēt pašistimulāciju un progresēšanu ar selektīvu mērķēšanu (Gunaydin et al., 2014). Tā kā mūsu manipulācijas aktivizēja visus VTA DA neironus, tāpat kā kokaīns iedarbojas uz visiem DAT ekspresējošajiem neironiem, ir iedomājams, ka daži DA neironi vadītu pastiprināšanas mācības, savukārt citi DA neironi vadītu nepatiku. Neto efekts joprojām būtu izturēšanās pastiprināšana; tomēr “nepatiku neironi” varētu veicināt pretinieka procesa indukciju (Koob, 2013, Wise and Koob, 2014).

Pēc piespiedu atturēšanās atkārtota ekspozīcija kontekstā izraisīja pašstimulācijas meklēšanu, kas ir izveidojies grauzēju narkotiku recidīva modelis. Jāatzīmē, ka pamatā esošā neironu plastika neatšķiras no tās, kas novērota pēc atteikšanās no kokaīna pašpārvaldes (Pascoli, Terrier et al., 2014). Tas papildina pētījumu, kurā iepriekš ziņots par identisku sinaptisko plastiskumu VTA DA neironos, ko izraisīja viena optiskās stimulācijas sesija vai pirmā atkarību izraisošo zāļu injekcija (Brown et al., 2010). Tiek parādīts sinaptisko adaptāciju modelis, kas visiem adaptīvajiem medikamentiem ir kopīgs.

Pārsteidzoša mūsu pētījuma iezīme ir divējāda reakcija uz pretestīgu stimulu, kas ir pietiekami spēcīgs, lai izjauktu nebūtiskas dabiskās atlīdzības patēriņu visiem dzīvniekiem. Mūsu apstākļos izturīgas peles neuzrādīja ievērojami lielāku atalgojuma pašnodošanas motivāciju, kas kontrastē ar pētījumu ar kokaīnu žurkām (Pelloux et al., 2007). Tomēr uzvedības prognozētājs pretestībai pelēm bija veltīgs sviras nospiešana 5 sekundes pirms DA neironu stimulācijas sākuma. Nespēja sagaidīt līdz atlīdzības sniegšanai var tikt uzskatīta par impulsivitātes marķieri (Dalley et al., 2011, Olmstead, 2006, Everitt et al., 2008, Winstanley, 2011, Leyton and Vezina, 2014). Mūs ieinteresēja novērojums, ka impulsīvā attieksme attīstījās tikai pēc vairākām pašstimulācijas sesijām. Tas rada iespēju, ka pretestība sodam (un paplašinot ievainojamību atkarībai) var nebūt pilnībā iedzimta, bet attīstās atkarības sākumposmā. Ja tas tā ir, tad mūsu un citu novēroto dihotomiju (Deroche-Gamonet et al., 2004) var noteikt ne tikai ģenētiskie faktori. Tas arī izskaidrotu, ka līdzīga indivīdu daļa kļūst atkarīga no ģenētiski relatīvi viendabīgiem peļu celmiem un ģenētiski noteikti daudzveidīgākām cilvēku populācijām.

Ja izturība pret sodu atklāj individuālo neaizsargātību pret atkarību, kas, domājams, pārsniedz 20% cilvēku pat ar kokaīnu (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997, George et al., 2014), tad šeit ir daudz lielāks varētu atspoguļot tiešās un selektīvās DA neironu stimulācijas spēku. Citiem vārdiem sakot, selektīva DA neironu stimulēšana var izraisīt daudz vairāk atkarību nekā jebkura narkotika. To var izskaidrot ar farmakoloģisko vielu neselektīvo darbību. Piemēram, kokaīna gadījumā monoamīni, kas nav DA, faktiski var aizkavēt atkarības izraisīšanu. Patiešām, serotonīns var pretoties DA atkarīgai adaptīvai uzvedībai, piemēram, reaģēšanai uz nosacītu atalgojumu, pašstimulāciju un nosacītu vietas izvēli (Wang et al., 1995, Fletcher and Korth, 1999, Fletcher et al., 2002), atvieglojot asociāciju norādēm uz aversīviem stimuliem (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Alternatīvi atšķirība var būt kinētiskās atšķirības starp optogenētisko pašstimulāciju un ekstracelulārā DA pieauguma farmakoloģisko indukciju. Šādas atkarības un potenciālās variācijas var pastāvēt arī starp dažādām ļaunprātīgas lietošanas narkotikām (George et al., 2014).

Lai gan mēs formāli nevaram izslēgt atšķirības DA izdalīšanās un / vai relatīvās signalizācijas jomā, lai veicinātu soda pretestības izveidošanos, šis scenārijs ir maz ticams, jo pētījumā iekļauto dzīvnieku infekcijas histoloģiskā validācija parādīja eYFP-ChR2 izpausme visā VTA. Turklāt optoģenētiskās stimulācijas protokols, kas izveidots, lai piesātinātu DA izdalīšanos, noveda pie pašstimulācijas, kuras kulminācija bija vienveidīgi sadalītas vērtības lūzuma punktam, atspoguļojot stimulējošo motivāciju.

Vēl viens pārsteidzošs rezultāts ir tāds, ka elektrisko pēdu triecienu skaits korelēja ar PL neironu uzbudināmību. Samazināta piramīdveida neironu uzbudināmība un palielināta AMPAR / NMDAR attiecība šo pašu šūnu piramīdajos neironos ir novērota “atkarīgajām žurkām”, tomēr šie pētījumi nekontrolēja elektrošoku ietekmi per se (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz et al., 2013, Chen et al., 2013). Tāpēc nedisociāciju var izskaidrot ar mPFC duālo lomu gan lēmumu pieņemšanas procesos, gan baiļu integrācijā (Peters et al., 2009). Un otrādi, piramīdveida neironu uzbudināmības izmaiņas infralimbiskajā garozā korelē ar pēdu triecieniem (Santini et al., 2008). Šie pierādījumi neizslēdz iespēju, ka mPFC ir nozīmīga loma, pieņemot lēmumu par uzņemšanu. Tomēr mūsu cFos analīze un iekšējās uzbudināmības novērojumi norāda uz OFC un cingulate cortex. Turklāt neironu uzbudināmības kavēšana OFC ar DREADD novērsa izturību pret sodu. Šī cēloņsakarība ir svarīgs solis, lai izprastu šūnu mehānismus, kas ir atbildīgi par pāreju uz atkarību. Turpmākie pētījumi būs nepieciešami, lai pārbaudītu, vai tas attiecas arī uz visu atkarību izraisošo narkotiku klāstu.

Mūsu atklājumi ir saskaņā ar novērojumiem, ka OFC disfunkcija var pasliktināt izmaksu un ieguvumu lēmumu pieņemšanu (Seo un Lee, 2010, Walton et al., 2010, Fellows, 2011) un var izraisīt piespiedu uzvedību (Burguière et al., 2013 ). Cilvēkiem narkotiku lietošana ir saistīta ar traucētu lēmumu pieņemšanu un mainītu OFC funkciju (Lucantonio et al., 2012, Gowin et al., 2013). Kopumā OFC neironu darbība parādās kā galvenais noteicošais faktors pārejai uz piespiedu narkotiku lietošanu (Everitt et al., 2007). Tas neizslēdz narkotiku izraisītas plastikas lomu ierosinošos aferentos uz MSN, kas novērota šeit un citos pētījumos (Kasanetz et al., 2010). Būs interesanti novērtēt, vai manipulācijas, kuru mērķis ir kontrolēt OFC uzbudināmību, ietekmē atkarīgo motivāciju.

Šeit mēs ierosinām DA neironu pašstimulāciju kā spēcīgu modeli, lai pētītu posmus, kas noved pie atkarības. Neskatoties uz negatīvām sekām, mēs reproducējam galvenās narkotiku atkarības sastāvdaļas, piemēram, recidīvu, sinaptisko plastiskumu un neatlaidību. Lai gan modelis noteikti nav piemērots, lai pētītu iedarbību, kas raksturīga konkrētai narkotikai (piemēram, salīdziniet opioīdus ar psihostimulatoriem), tam ir vairākas priekšrocības. Tas ļauj precīzi kontrolēt atlīdzības piegādi laikā, tas ļoti specifiski aktivizē tikai VTA DA neironus, un visbeidzot, bet ne mazāk svarīgi, tas dod iespēju pētīt peles daudz ilgāku laiku nekā pašnodarbinātas zāles. Koncentrējoties uz atkarību izraisošo narkotiku kopīgo definīciju, cerība ir atšķetināt neironu mehānismus, kas ir pamatā arī no vielām atkarīgām atkarības formām (Alavi et al., 2012, Robbins and Clark, 2015), un tādējādi veicināt vispārēju teoriju par slimība. Tādējādi optoģenētisko slimību modeļi ļauj izšķirošā solī, lai rūpīgi izprastu neironu disfunkciju, kas saistīta ar vēlīnām atkarības stadijām, un vadīs jaunu, racionālu slimības, kas pašlaik nav ārstējama, ārstēšanu.

VP, JT un AH veica uzvedības eksperimentus, bet VP veica elektrofizioloģiskos ierakstus un koordinēja analīzi. Pētījumu izstrādāja un uzrakstīja visi autori.

Darbu atbalstīja Šveices Nacionālā fonda un ERC uzlabotās dotācijas (MeSSI), Carigest SA, Ženēvas Akadēmiskās biedrības un Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève dotācijas. JT ir MD doktorants, kuru apmaksā Šveices Konfederācija.

Dokuments S1. Papildu eksperimentālās procedūras un attēli S1 – S6

Galds S1. Statistiskās analīzes