PLoS Viens. 2010; 5(10): e15401.
Anotācija
Modeļa pabeigšana, spēja ielādēt pilnīgas atmiņas, ko ierosina daļējas norādes, ir atmiņas procesa būtiska iezīme. Tomēr par šo procesu pamatā esošajiem molekulārajiem un šūnu mehānismiem ir maz informācijas. Lai izpētītu dopamīna lomu atmiņā, mēs esam analizējuši dopamīna transportera heterozigotiskās knockout peles (DAT).+/−) un konstatēja, ka, lai arī šīm pelēm ir normāla mācīšanās, konsolidācija un atmiņa atmiņā pilnās norādes apstākļos, tām ir raksturīgi specifiski modeļa pabeigšanas trūkumi daļēja norādes apstākļos. Šo atmiņas atsaukšanas deficīta formu dopamīna transportētāja heterozigotās nokaušanas pelēs var mainīt ar nelielu dopamīna antagonista haloperidola devu, vēl vairāk apstiprinot, ka nespēja atgūt atmiņas modeļus ir dopamīna nelīdzsvarotības rezultāts. Tāpēc mūsu rezultāti atklāj, ka smalka smadzeņu dopamīna līmeņa kontrole ir kritiska modeļa pabeigšanai asociatīvās atmiņas atsaukšanas laikā.
Ievads
Atmiņas atgādināšana ietver iepriekš iegūtās informācijas kopsavilkumu [1], [2]. Atkarībā no atsaukšanas stāvokļa atmiņas iegūšana var notikt ar lielāko daļu vai visiem iepriekš sastopamajiem norādījumiem, kas saistīti ar mācīšanos (piemēram, redzot personu un vienlaikus dzirdot viņa balsi vai atkārtoti apmeklējot savu dzimto pilsētu, kas gandrīz neko nemaina utt.). No otras puses, daudzos gadījumos atmiņas iegūšana parasti notiek tikai tad, ja ir tikai sākotnējo norāžu apakškopas (piem., Tiek rekonstruētas vecpilsētas vecpilsētas ielu kartes, kad tikai daži vecie orientieri palika nemainīgi). To sauc par modeļa pabeigšanu, kurā smadzenes rekonstruē un izgūst visus atmiņas modeļus no daļējiem ārējiem norādījumiem vai pašiniciatīviem iekšējiem procesiem. Pašlaik maz ir zināms par faktiskajiem molekulārajiem un šūnu mehānismiem, kas ir pamatā atmiņas atsaukšanas modeļa pabeigšanai. Tomēr jaunie pētījumi norāda, ka monoamīna signalizēšanai var būt nozīme atmiņas iegūšanā [3].
Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, kā modulējošam neirotransmiteram dopamīnam ir nozīme atmiņas moduļa pabeigšanas regulēšanā daļējas izsaukšanas laikā. Dopamīns ir galvenais neirotransmiters, kas var ietekmēt izziņu, emocijas un kustības. Nenormāla dopamīnerģiskā pārnešana ir saistīta ar vairākiem psihiskiem un neiroloģiskiem traucējumiem, ieskaitot uzmanības deficīta un hiperaktivitātes traucējumus (ADHD), šizofrēniju un Parkinsona slimību. [4]-[8]. Lai gan dopamīnerģiskie neironi rodas tikai no ventrālās tegmentālās zonas un materiālās nigras kompakta, to izvadi tiek projektēti gandrīz visur smadzenēs, tostarp prefrontālā garozā, vidējā īslaicīgā daivā un hipokampā, reģionos, kas zināmi aktivizēti atmiņas retrievas laikā.l [3], [9]-[14].
Jāatzīmē arī tas, ka dopamīns tika uzskatīts par funkcionāli izšķirošu uzmanību un darba atmiņu, ko saista iepriekšminētie smadzeņu reģioni [15]-[18]kas abas bija saistītas ar atmiņas atgūšanas procesu daļējos cue apstākļos [19]. Kā primārais šūnu mehānisms, lai izbeigtu dopamīna signalizāciju, dopamīna transporteris (DAT), kas atrodas neironu presinaptīvajos terminālos, atjauno dopamīnu no sinaptiskā plaisa atpakaļ dopamīnerģiskajos neironos. Kā tāds, DAT ir kritiska molekula, kas regulē dopamīna sinaptiskos līmeņus un tādējādi nosaka dopamīna iedarbību uz laiku vietējās nervu ķēdēs. Patiešām, dopamīna transportiera gēna ģenētiskā nokļūšana rada nopietnus traucējumus. Homozigotiskās DAT-KO peles cieš no acīmredzamām novirzēm, tostarp augšanas palēnināšanos, spēcīgu lokomotorisko hiperaktivitāti un daudziem citiem traucējumiem, tostarp deficītu pieradumos un sociālajā mijiedarbībā, kā arī zarnu motilitātes, elpošanas kontroles uc traucējumiem. [6], [20], [21]. Kopējie defekti homozigotiskajās DAT-KO pelēs ir padarījuši to mazāk piemērotu, lai pārbaudītu dopamīna lomu atmiņas procesu regulēšanā.
Interesanti, ka heterozigotas peles (DAT)+/− pelēm), kas joprojām ir funkcionālā DAT gēna alēle, šķiet, ir visai normāli to kopējā bruto uzvedībā [6], [20], [21]. Tādējādi DAT+/− peles var sniegt vērtīgu modeli dažu delikātu, bet svarīgu fenotipu, piemēram, asociācijas atmiņas procesu, un ar tiem saistītu mehānismu, ko regulē dopamīnerģiskās shēmas, pētīšanai. Šeit mēs izmantojām uzvedības paradigmu kopumu, lai novērtētu dopamīna nelīdzsvarotības funkcionālās sekas uz modeļa pabeigšanas asociācijas atmiņas atsaukšanas laikā.
rezultāti
Lai izpētītu dopamīna lomu atmiņas izguvēšanā, mēs izmantojām heterozigotu dopamīna transportera knockout peles (DAT).+/−). Lai novērtētu viņu atklātā lauka lokomotorisko aktivitāti, mēs izmantojām pamata uzvedības mērījumus.Attēls 1A), rotarod izrādes (Attēls 1B un 1C) un konstatēja, ka šīs heterozigotas peles ir pilnīgi normālas. Mēs arī apstiprinājām, ka DAT+/− pelēm ir atšķirīgas izrādes trauksmes līmenī, ko mēra ar paaugstinātu labirints (1D attēls).
Turklāt mēs novērtējām DAT pamatizglītības un atmiņas funkcijas+/− pelēm. Pirmkārt, mēs izmantojām jaunā objekta atpazīšanas testu un novērojām, ka šīs peles 1 dienas saglabāšanas testos parādīja pilnīgi normālus uzvedības rādītājus, salīdzinot ar to savvaļas tipa pakaišu kontrolieriem (1E attēls). Turklāt šīm pelēm ir arī normāla 1 dienas bailes, kas ir atkarīgas no savvaļas tipa kontroles pelēm (Attēls 1F). Tāpēc šie rezultāti liecina, ka DAT+/− pelēm ir normāla mācīšanās un atmiņas funkcija šajās divās primārās atmiņas testu formās.
Telpiskās atsauces atmiņas tests iepriekš tika izmantots, lai novērtētu atmiņas atgādinājuma modeli. Mēs esam pakļauti DAT+/− pelēm un savvaļas tipa kontrolēm. Izmantojot iepriekš aprakstīto telpiskās atskaites atmiņas protokolu [22], mēs apmācām šīs peles slēptās platformas ūdens labirints. Apmācība sastāvēja no četriem izmēģinājumiem dienā, ar vienu stundu intervālu starp izmēģinājumiem. Mēs atklājām, ka gan DAT+/− pelēm un savvaļas tipa pelēm 10 dienas sesiju laikā ar līdzīgiem peldēšanas ātrumiem parādījās līdzīga mācīšanās un atmiņas konsolidācija.Attēls 2A un 2B).
Pēc tam mēs pārbaudījām viņu atmiņu par slēpto platformu atrašanās vietu, izmantojot zondes testu (P1) 11 dienā, vienu dienu pēc pēdējās treniņa pabeigšanas. Mērot pēc kvadrantu noslogojuma, abi DAT+/− pelēm un to kontroles pakaišu biedriem bija iespēja fokusēt meklēšanu mērķa kvadrantā pilnīgu cues (Attēls 3A). Turklāt, DAT+/− peles arī demonstrēja spēcīgu izvēli fantoma platformas zonā, un atšķirības nebija salīdzinājumā ar vadības platformas noslogojumu (Attēls 3B). Turklāt, kā paredzēts, abi DAT+/− pelēm un savvaļas tipa pakaišiem bija ievērojams krustojumu skaita pieaugums (Attēls 3C). Tādējādi visi šie mērījumi liecina, ka DAT+/− peles var iemācīties šo uzdevumu normāli un iegūt šo asociācijas atmiņu parasti pilna līmeņa apstākļos.
Lai noteiktu, vai delikāts dopamīna līdzsvars ir būtisks, lai pabeigtu modeli daļējos cue apstākļos, otro zondes testu (P2) veica nākamajā dienā, noņemot trīs no četrām distālās cues (12 diena). Lai izvairītos no jebkādas iespējamās izzušanas no iepriekšējās atsaukšanas sesijas, vēl viens bloka (4 pētījums) apmācība tika piegādāta 1 stundu pēc P1 zondes testa. Šīs daļējas cue zondes izmēģinājuma laikā, kamēr kontroles peles turpināja koncentrēt meklēšanas laiku mērķa kvadrantā, nevis citos kvadrantos, DAT+/− pelēm bija tikai izredzes līmeņa veiktspēja, ko mēra ar mērķa kvadrantu noslogojumu (3D attēls). Turklāt fantoma platformas teritoriju noslogojuma mērījumi apstiprināja, ka šie DAT+/− peles tika traucētas, atceroties platformas atrašanās vietu (3E attēls). Šo atgūšanas deficītu pierādīja arī tas, ka netika palielināts platformu šķērsošanas vietu skaits (Attēls 3F), savukārt savvaļas tipa pakaiši bija pilnībā spējīgi veikt daļēju dedzināšanu. Tāpēc šie dati liecina, ka DAT+/− pelēm trūkst telpisko atsauču atmiņu daļējas cue apstākļos.
Visbeidzot, mēs jautājām, vai šajās DAT varētu atjaunot modeli+/− izmantojot farmakoloģiskās metodes. Ir ziņots, ka dopamīna antagonista, haloperidola, zema deva varētu būt noderīga dažu dopamīna traucējumu mazināšanai. [20]. Iemesls ir tāds, ka zemā haloperidola deva var nedaudz mazināt paaugstinātā dopamīna ietekmi uz heterozigotiskām pelēm, kurām ir nepietiekama dopamīna atpakaļsaistība, jo viena normālā dopamīna transportiera gēna alēle ir zaudēta. Mēs izmantojām to pašu peles komplektu glābšanas eksperimentam. 13 dienā un 14 dienā iepriekš minētās peles tika pakļautas trešajai zondes pētījumam (P3) pilna laika apstākļos un ceturtā zondes pētījumā (P4) daļēji cue apstākļos. Atkal, lai novērstu jebkādu izmiršanu, kas varētu notikt zondes izmēģinājuma laikā, mēs veicām vēl vienu bloku (4 pētījumus) apmācībai 1 stundu pēc P2 vai P3 zondes testa pabeigšanas. P3 zondes testa mērķa kvadranta noslogojuma mērījumi liecina, ka gan DAT+/− peles un kontroles pakaiši, kas koncentrēja savu meklēšanu mērķa kvadrantā, pilna cues klātbūtnē (Attēls 4A). Turklāt to parasto atmiņas atsaukšanu atkal apliecināja platformas noslogojuma mērīšana (Attēls 4B), kā arī platformu šķērsošanas vietu skaits (Attēls 4C). Tādējādi šīs mutācijas peles pilnībā varēja iegūt telpisko atmiņu pilna līmeņa apstākļos.
14 dienā mēs noņemām trīs no četrām distālām norādēm un veica ceturtās zondes pētījumus (P4) daļējā cue stāvoklī. Mēs ievadījām DAT+/− pelēm intraperitoneāli ar zemu haloperidola devu (0.002 mg / kg ķermeņa svara) 30 minūtes pirms aiztures testiem. Savvaļas tipa pakaiši saņēma kontroli kā sāls šķīdumu. Mēs atklājām, ka DAT+/− peles koncentrēja savu meklēšanas laiku mērķa kvadrantā un parādīja statistiski līdzīgus rezultātus salīdzinājumā ar savvaļas tipa kolēģiem (4E attēls). Arī fantoma platformas telpu noslogojuma mērījumi vēl vairāk pamatoja šo DAT+/− peles var atcerēties platformas atrašanās vietu (Attēls 4F). To normālu atmiņu atkal apstiprināja arī platformu šķērsojumu skaita pieaugums, kas bija tādā pašā līmenī kā savvaļas tipa pelēm (Attēls 4G). Tādējādi šie eksperimenti liecina, ka DAT sākotnēji novērotie modeļa pabeigšanas deficīti+/− pelēm var izraisīt dopamīna nelīdzsvarotība.
Lai izslēgtu iespēju, ka P4 zondes pētījumā ar haloperidolu injicētā fenotipa rezultāti bija saistīti ar pārspīlēšanu atkārtotu zondes testu laikā, mēs izmantojām citu DAT komplektu.+/− un kontrolēt pakaišus un atkārto visu eksperimentu. Kā paredzēts, abi DAT+/− pelēm un to savvaļas tipa pelēm 10 dienas treniņu laikā bija labi mācīšanās ātrumi (Attēls 5A). 11 dienā pēc tam šīs peles tika pakļautas pilna izsaukuma testiem, nav būtiskas atšķirības atmiņas saglabāšanas testu rezultātos starp DAT+/− pelēm un kontroles pakaišiem, ko mēra ar kvadrantu aizņemšanu (Attēls 5B), mērķa kvadrantu noslogojums (Attēls 5C) un platformu šķērsošanas vietu skaitu (5D attēls). Vienu stundu pēc pilna cue zondes testa pabeigšanas mēs pārkvalificējām šīs peles ar vēl vienu treniņu bloku, lai novērstu jebkādu izmiršanas efektu. 12 dienā šīs peles tika pakļautas daļēja izsaukuma testiem. Zemu haloperidola (vai sāls šķīduma) devu kontrolēm injicēja pelēm intraperitoneāli 30 minūtes pirms daļējas izmeklēšanas. Mēs atklājām, ka šī ārstēšana patiešām ir izraisījusi normālas darbības mutantu pelēs. Mutantu un kontroles pelēm bija līdzīgi rezultāti kvadrantu aizņemšanā (5E attēls), mērķa kvadrantu noslogojums (Attēls 5F) un platformu šķērsošanas vietu skaitu (Attēls 5G). To peldēšanas ātruma mērījumi arī neatklāja atšķirības (Attēls 5H). Tāpēc šie dati nepārprotami parādīja, ka izglābtais daļējais cēlums ir DAT+/− pelēm ar haloperidolu nebija saistīts ar atkārtotu pārspīlēšanu vairāku zondes izmēģinājumu laikā.
diskusija
Lai gan dopamīna sistēma ir ļoti svarīga daudzu kognitīvo procesu regulēšanai [8], [16]-[18], [23]-[25]mūsu pašreizējais pētījums pirmo reizi sniedz pierādījumus tam, ka dopamīna nelīdzsvarotība, ko izraisa viena normālā dopamīna transportiera gēna alēle, asociācijas telpiskās atmiņas atgādinājuma laikā izraisīja specifisku deficīta deficītu. Šis atmiņas atsaukšanas deficīts ir redzams tikai daļēji telpā-cue apstākļos, bet ne pilna līmeņa apstākļos. Turklāt šis atmiņas atsaukšanas deficīts, šķiet, atspoguļo ļoti specifisku atmiņas deficīta formu, jo vispārējie uzvedības aspekti (atklātā lauka kustība, rotorods un trauksme) un citas atmiņas formas, piemēram, konteksta bailes kondicionēšana un jaunu objektu atpazīšana, joprojām ir normālas.
Pastāv vairāki iespējamie molekulas un šūnu scenāriji, kas var kopīgi veicināt novēroto telpisko daļējo-cue izraisītu atsaukšanas deficītu, starp kuriem dopamīns tiek uzskatīts par galveno šīs molekulas pamatā esošo molekulu, jo uzmanība un darba atmiņa, ko galvenokārt kontrolē dopamīna signāliem, ir izšķiroša nozīme telpisko atmiņu atgūšanā [15]-[18], [26]. Ir labi zināms, ka dopamīnerģiskie neironi, kuru izcelsme ir tikai no ventrālās tegmentālās zonas un materiālās nigras kompakta, projektē gandrīz visur smadzenēs, ieskaitot prefrontālo garozu, mediālo laika lodi un hipokampu. [5], [19], [27]-[28]reģioni, kas zināmi, ka tie aktivizējas atmiņas izguves laikā, kā arī uzmanības procesi [3], [9]-[14], [29], [30]. Ņemot vērā plašos pierādījumus tam, ka dopamīns ir būtisks uzmanības un darba atmiņas dēļ [15]-[18] un ka tiek uzskatīts, ka DAT gēna ģenētiskais polimorfisms ir saistīts ar ADHD [31]-[33], iespējams, ka gan uzmanībai, gan darba atmiņai var būt nozīme atmiņas izgūšanas pabeigšanā daļējas norādes apstākļos, izmantojot DAT starpniecību regulētu dopamīnu. Tādējādi atmiņas modeļa pabeigšanas deficīts, kas novērots DAT heterozigotām mutantēm pelēm, var būt saistīts ar peles nespēju apmierināt paaugstinātās uzmanības prasības daļējas uz kiju balstītas atmiņas atsaukšanas laikā sinaptisko dopamīna traucējumu rezultātā.
Mūsu atzinums, ka dopamīna nelīdzsvarotība izraisīja atmiņas iegūšanas deficītu, ir interesants arī, ņemot vērā klīnisko demenci, kas novērota Parkinsona pacientiem. Šķiet, ka šie pacienti saglabā spēju iemācīties, nostiprināt un saglabāt jaunu atmiņu, bet viņiem ir izteikti traucēta atmiņu iegūšana, īpaši ar daļēju ārēju norāžu vai pašiniciatīvas atsaukšanas palīdzību. [34], [35]. Šis deficīts ir sevišķi dziļi, kad nebija skaidru norādījumu [8], [23], [34]-[36], tādējādi vēl vairāk norādot, ka dopamīns varētu būt iesaistīts atmiņas atsaukšanas procesā. Šāda veida atmiņas trūkuma dēļ Parkinsona pacientiem ir izteikts pretstats atmiņas traucējumiem citās neirotransmiteru sistēmās. [37] vai agrīna demence Alcheimera slimniekiem, kuriem parasti ir apgrūtināta jaunu atmiņu apguve un nostiprināšana, saglabājot spēju atsaukt vecās atmiņas [34], [35]. Tas liecina par nepieciešamību izstrādāt dažādas terapeitiskās stratēģijas, jo atmiņas ķēdēs ir atšķirīgas neaizsargātības pret atšķirīgiem molekulāriem un laika procesiem.
Mūsu demonstrācija, ka modeli var pilnībā izglābt, injicējot haloperiodolu atsaukšanas brīdī, pastiprina ideju par līdzsvarotu dopamīna līmeņu lomu atmiņas atgūšanā. Šis farmakoloģiskās glābšanas eksperiments sniedz papildu pierādījumus par īpatnību laikā, kas izraisa daļēju uzbrukuma deficītu. Jāatzīmē, ka dopamīna disfunkcija DAT+/− peles un Parkinsona pacienti ir diezgan atšķirīgi viens no otra, tomēr abi šie faktori izraisa modeļa atrašanas deficītu. Šī vienotība sniedz kolektīvu atbalstu priekšstatam, ka dopamīna sistēmas delikātais līdzsvars ir ļoti svarīgs atmiņas iegūšanai, un disbalanss abos virzienos (uz augšu vai uz leju) radītu deficītu atmiņas shēmas pabeigšanā atsaukšanas laikā. Svarīgi ir tas, ka mēs vēlamies norādīt, ka mūsu pašreizējā analīze nav jāinterpretē kā pierādījums DAT peļu mutāciju izmantošanai par Parkinsona slimības modeli. No otras puses, in vivo dopamīna mērīšana DAT homozigotiskajās pelēm, kas liecina par ievērojamu dopamīna izdalīšanās samazināšanos, [38]-[40]. Tas norāda, ka spēja pārvērst nervu aktivitātes pārrāvumu dopamīna signālos dažādos nokauto peļu smadzeņu reģionos var būt nepietiekama. Ir iedomājams, ka samazinātas dopamīna attiecības izmaiņas var izraisīt mainītas fizioloģiskas izmaiņas dedzināšanas modeļos neironu ķēdēs, kas iesaistītas atmiņas apstrādē. Pašlaik nav zināms, vai līdzīgas izmaiņas notiek arī DAT heterozigotās nokaušanas pelēm vai Parkinsona slimības pacientiem.
Lai gan ir zināms, ka telpiskās atmiņas atgādināšanas laikā aktivizējas neirālās ķēdes, ir iespējams, ka tā piesaista vairākus reģionus, tostarp prefrontālo garozu, mediālo laika garozu un hipokampu. Tas labi sader ar anatomiskiem pierādījumiem, ka dopamīnerģiskie izvadi no ventrālā tegmentāla apgabala lielā mērā ietekmē ventrālo CA1 zonu un entorinālo garozu.[13], [28]. Šai prefrontāla-hipokampālā-VTA cilpai var būt izšķiroša nozīme kontekstuālās iepazīšanās radīšanā, kas savukārt veicina modeļa pabeigšanu daļējas cue balstītas telpiskās atmiņas atsaukšanas laikā, veicinot dopamīna regulētu uzmanību [3], [14], [26], [28]. Turpmākajos pētījumos būs svarīgi vēl vairāk definēt anatomiskās lokus, no kuriem izriet novērotā modeļa pabeigšanas deficīts. Īpaši interesanti būtu izpētīt kandidātvietas, piemēram, priekšējo cingulāro garozu, laika garozu un hipokampu, izmantojot farmakoloģiskās, ģenētiskās un liela mēroga in vivo ierakstīšanas metodes. [11], [41]-[44]. Svarīgi ir arī novērtēt, vai ģenētiskā kompensācija vai lēnas izmaiņas mutantu smadzenēs veicina novēroto atsaukšanas deficītu. Ir arī pazīmes, ka arī citas neirotransmiteru sistēmas var būt kritiski saistītas ar atmiņas atgūšanu [3], [37], [45], [46], un būtu ļoti interesanti pārbaudīt un salīdzināt to dinamiskās mijiedarbības starp daļēju cue-trigger modeli pabeigšanu un pilnu cue balstītu atmiņas izguves. Visbeidzot, mūsu pētījums liecina, ka delikāts līdzsvars dopamīna līmeņos ir būtisks, lai pabeigtu modeli asociatīvās telpiskās atmiņas atsaukšanas laikā.
Materiāli un metodes
Ētiskie paziņojumi
Visi pētījumā aprakstītie dzīvnieku darbi ir veikti saskaņā ar NIH vadlīnijām un apstiprināti Institūcijas IACUC komitejā Gruzijas Medicīnas koledžā (apstiprinājuma AUP numurs: BR07-11-001).
Mutantu peles ražošana un genotipēšana
DAT peles bija dāsna dāvana no Čikāgas universitātes Dr. XiaoXi Zhuang laboratorijas. DAT heterozigotu knockout peles vaislas un genotipizēšana ir tāda pati kā aprakstīta [6]. Mūsu eksperimentiem gan vīriešu, gan sieviešu dzimuma peles tika vienādi izmantotas ar 1 attiecību![[attiecība]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
1. PCR attiecībā uz DAT+/− pelēm sekoja protokols, kā aprakstīts [6]. Visas peles tika uzturētas standarta apstākļos (23.1 ° C, mitrums 50.5%) Gruzijas Medicīnas koledžas dzīvnieku novietnē. Visi eksperimenti tika veikti ar skaņu izolējošu un specializētu telpu. Visi eksperimentētāji bija akli pret katra dzīvnieka genotipu.
Jaunu objektu atpazīšanas uzdevums
Eksperimentālais protokols bija tāds pats kā iepriekš aprakstīts [37], [47]. Īsumā, peles tika individuāli pieradinātas pie atvērta lauka (20 × 20 × 10 augstas collas) 3 dienām. Apmācības laikā atklātā laukā tika ievietoti divi jauni objekti, un dzīvniekam tika atļauts izpētīt 15 min. Tika ierakstīts laiks, kas pavadīts katra objekta izpētē. Vienu stundu atcelšanas testu laikā dzīvnieks tika ievietots atpakaļ tajā pašā kastē, kurā viens no pazīstamajiem objektiem treniņa laikā tika aizstāts ar jaunu objektu un ļāva brīvi izpētīt 15 min. Lai noteiktu atpazīšanas atmiņu, tika izmantots preferenču indekss, laiks, kas pavadīts, pētot kādu no diviem objektiem (treniņu sesija), vai jaunais laiks (saglabāšanas sesija), kas pārsniedz kopējo laiku, kas pavadīts abu objektu izpētē.
Atvērtā lauka un Rota-stieņa testi
Protokoli bija tādi paši, kā aprakstīts [48]. Atvērtā lauka aktivitātes mērīšanai peles tika ievietotas atklātā laukā, kas izgatavots no melnās kastes 14 × 14. Kaste tika atzīmēta ar 2 × 2 collu maziem kvadrātveida tīkliem (7 kvadrāti ar 7 laukumiem kopā ar 49 kvadrātiem kopā). Dzīvnieku atklātā lauka aktivitāte tika mērīta ar krustojumu skaitu, ko peles ir nokārtojušas 3 minūšu laikā. Rota stieņa testa mērīšanai peles tika ievietotas paātrinošā rotējošā koka stienī. Stienis ir 12 collas garš un 1 collas diametrs. Sākotnējais apgriezienu skaits bija pie 4 apgriezieniem minūtē un pēc tam vienmērīgi paātrinājās līdz 40 apgriezieniem minūtē. Veiktspēja tika mērīta pēc laika (sekundēs), ko pelēm izdevās palikt uz rotējošā stieņa piecu minūšu vai vienas stundas atgādinājuma testu laikā.
Paaugstināts plus labirints testi
Protokoli bija tādi paši, kā aprakstīts [49]. Paaugstinātais plus labirints ir izgatavots no nerūsējošā tērauda, kas ir nokrāsots melnā krāsā, un sastāv no četrām rokām (divas atvērtas bez sienām un divas ar 15.25 cm augstām sienām) 30 cm gara un 5 cm platumā. Katrs labirints rokturis ir piestiprināts pie izturīgām metāla kājām tā, ka tas ir paaugstināts 40 cm virs galda, uz kura tas atrodas. Aktivitāte tika ierakstīta ar digitālo kameru (Logitech kamera, modeļa Nr. N231), kas novietota 130 cm virs labirints. Pārbaude notika gaišā gaismā (viena 40-W un viena 60-W mīkstā baltā spuldze, abas leņķveida, lai radītu netiešo apgaismojumu labirintā) cirkadiancikla cikla laikā (starp 0900 h un 1400 h). Testa laikā labirints tika iztīrīts ar 5% etiķskābi. Balts troksnis (30 dB) maskēja ārējos fona trokšņus. Testa dienā dzīvnieki tika ievietoti testēšanas telpā viņu mājas būros, un pēc tam katrs dzīvnieku pāris tika izņemts no mājas būra un ievietots atsevišķā turēšanas būrī 5 min pirms ievietošanas labirintā. Dzīvnieki tika novietoti individuāli labirints centrā, kur galvas stāvoklis tika līdzsvarots starp pelēm, un uzvedība tika reģistrēta 5 min. laiks, kas pavadīts atklātā rokā un slēgtajā rokā (kad visas četras grauzēju ķepas atrodas uz atvērtas vai slēgtas rokas), tika reģistrēts un analizēts.
Konteksta bailes kondicionēšana
Bailes kondicionēšana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [45]. Eksperiments tika veikts bailes kondicionēšanas sistēmā, kamerā, kas atrodas skaņas vājinātā kārbā ar mājas gaismu uz griestiem un nerūsējošā tērauda režģa grīdas (Coulbourn Instruments, Whitehall, PA). Režģa grīda tika savienota ar trieciena ģeneratoru un dzirdams signāls radies no skaļruņa, kas piestiprināts pie kameras sienas. Visi stimuli tika kontrolēti automātiski, izmantojot personālo datoru ar grafiskās valsts programmu. Bildes priekšā tika ievietota videokamera, lai ierakstītu uzvedību. Peles tika apstrādātas 3 dienās un pēc tam pieradušas pie apmācības kameras 5 min. Izmantotais stimulējošais stimuls (CS) bija 85 dB skaņa pie 2.8 kHz, bet beznosacījumu stimuls (US) bija nepārtraukts sajaukts kāju šoks 0.8 mA 2 s. Pēc vienreizējas izbeigšanas CS / ASV, dzīvnieks palika kamerā citam 30 s, lai mērītu tūlītēju sasaldēšanu. Saglabāšanas testa laikā katra pele tika ievietota atpakaļ tajā pašā kamerā, un sasalšanas atbildes tika reģistrētas 5 min (konteksta iesaldēšanas reakcija). Visi testi tika ierakstīti ar sarkanu gaismu. Kopējais sasalšanas laiks tika mērīts kā baiļu atmiņas indekss. Sasaldēšanas uzvedība tika definēta kā pilnīga kustības trūkums, izņemot elpošanu. Sasaldēšanas uzvedība tika novērtēta pēc programmatūras (Coulbourn Instruments) un pārvērsta par sasalšanas reakciju [iesaldēšanas reakcija 
= (kopējais iesaldēšanas laiks / kopējais testēšanas laiks) × 100%].
Telpiskās atskaites atmiņas testi
Telpiskās atsauces atmiņas tests bija slēptās platformas ūdens labirints. Mēs sekojām protokolam, kā aprakstīts iepriekš Nakazawa et al. [22]. Apmācība sastāvēja no četriem izmēģinājumiem dienā, vienu stundu starp izmēģinājumiem. Peles kustība tika izsekota ar videokameru un izmērīta ar programmatūru (Noldul Information Technology, Nīderlande). Visu reģistrēto un analizēto bēgļu aizkavēšanās platformai, kā arī kvadrantu aizņemšana un platformas šķērsošana. Baseinā ir diametrs 118 cm un platforma ir 9.5 cm diametrā. Tika veikti četri zondes testi. Pirmais zondes tests (P1) tika veikts nākamajā dienā pēc pēdējās treniņa pilna laika apstākļos (11 diena). Otrā zondes pārbaude (P2) tika veikta 12 dienā, daļēji cue apstākļos (noņemot trīs no četrām vizuālajām norādēm, kas karājās uz melnā aizkara sienas). Par DAT+/− pelēm, mēs veicām trešo zondes izmēģinājumu (P3) 13 dienā pilnā cue apstākļos un ceturtajā zondes pētījumā (P4) 14 dienā daļējas cue apstākļos. Vēl viens bloka (4 pētījums) treniņš tika piegādāts 1 stundu pēc P1, P2 un P3 zondes testiem, lai novērstu jebkādu izmiršanu, kas varētu notikt zondes izmēģinājuma laikā. Turklāt, lai izslēgtu iespējamo pārspīlējumu iespaidojošo efektu pirms P4 (zondes tests ar daļēju celiņu un haloperidola injekciju), mēs pakļāva citu DAT grupu+/− pelēm, kā arī viņu kontrolētajiem savvaļas tipa pakaišiem ar diviem papildu zondes testiem (izmēģinājumi P3 ′ un P4 ′). Zondes P3 pārbaude tika veikta vienu dienu pēc pēdējās apmācības sesijas pilnā stāvokļa apstākļos (10. diena). Zondes P4 ′ pārbaude tika veikta 11. dienā ar daļēju norādi. Visu mūsu zondes testu laikā platforma tika noņemta, un pelēm tika atļauts peldēties baseinā tikpat ilgi, cik tika izmantots apmācības laikā (60 sekundes). Katrā kvadrantā pavadītais laiks tika reģistrēts. Lai atjaunotu dopamīna līmeni [6], [20], [21], pelēm no DAT+/− 0.002 minūtes pirms P30 un P4 zondes izmēģinājumiem visas kontroles grupas tika intraperitoneāli ievadītas ar haloperidolu (4 mg / kg ķermeņa svara) vai ar fizioloģisko šķīdumu.
Datu analīze
Lai ņemtu vērā savstarpējās korelācijas starp atkārtotiem mērījumiem, tika izmantoti lineāri jaukti modeļi, lai novērtētu uzvedības rādītājus Morris ūdens labirintā, jaunus objektu atpazīstamību, kontekstuālās bailes kondicionēšanas un rota-rod testus. Lai noteiktu šo uzvedības mērījumu nozīmīgumu starp DAT, tika izmantota Tukey – Kramer metode+/− pelēm un kontroles metieniem. Atklātajā laukā un paaugstinātā labirinta testos genotipa efektu noteikšanai tika izmantots vienvirziena ANOVA un post hoc Dunnett tests. Nepārtraukti mainīgie tiek parādīti kā vidējā un vidējā standarta kļūda (SEM). Dati tika analizēti, izmantojot SPSS versiju 13.0 (SPSS Inc., Čikāga, IL). Atšķirības tika uzskatītas par nozīmīgām, ja P <0.05.
Pateicības
Mēs pateicamies Dr. Xiaoxi Zhuang no Čikāgas Universitātes par DAT nodrošināšanu+/− KO peles un Brianna Klein par tehnisku palīdzību eksperimentiem.
Zemsvītras piezīmes
Konkurējošās intereses: Autori ir paziņojuši, ka nav konkurējošu interešu.
Finansējums: Šo pētījumu atbalstīja NIMH (MH060236), NIA (AG024022, AG034663 un AG025918), USAMRA00002, Džordžijas pētniecības alianses un Šanhajas pašvaldības Zinātnes un tehnoloģiju komisijas (10140900500) līdzekļi (visi JZT). Ķīnas Nacionālais zinātnes fonds (81000592), Šanhajas pašvaldības Zinātnes un tehnoloģiju komisija (10DZ2272200, 09DZ2200900, 10PJ1407500 un 10JC1411200), Šanhajas Pašvaldības izglītības komisija (11ZZ103) - FL un XMS. Finansētājiem nebija nozīmes studiju plānošanā, datu vākšanā un analīzē, lēmumā par publicēšanu vai rokraksta sagatavošanā.
;
