Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Apr. 300 (4): R876 – R884.
Publicēts tiešsaistē 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Anotācija
Mēs jau iepriekš ziņojām, ka insulīna ievadīšana hipotalāmu loka kodolā samazina saharozes motivāciju, ko novērtē ar pašpārvaldes uzdevumu žurkām. Tā kā centrālās nervu sistēmas (CNS) aktivācijas modelis saistībā ar saharozes pašregulāciju nav novērtēts, šajā pētījumā mēs mēra c-Fos ekspresiju kā neironu aktivācijas indeksu. Mēs apmācījām žurkas barības presēšanai saharozei saskaņā ar fiksētu attiecību (FR) vai progresīvo attiecību (PR) grafiku un kartēto C-Fos imūnreaktivitātes izpausmi CNS, salīdzinot ar c-Fos ekspresiju apstrādātajās kontrolēs. Mēs novērojām unikālu c-Fos ekspresiju mediālajā hipotalāmā (loka, paraventriculārā, retroshēzijas, dorsomediālā un ventromedija kodolā) saistībā ar PR darbības sākumu un c-Fos ekspresiju sānu hipotalāmā un gultas kodolā. stria terminalis saistībā ar FR darbības sākumu. C-Fos ekspresija palielinājās gan FR, gan PR žurkām. Mūsu pētījums uzsver gan hipotalāma enerģijas homeostāzes shēmu, gan limbisko shēmu nozīmi pārtikas atlīdzības uzdevuma veikšanā. Ņemot vērā mediālo hipotalāmu lomu enerģijas bilances regulēšanā, mūsu pētījums liecina, ka šī shēma var veicināt atalgojuma regulēšanu plašākā enerģijas homeostāzes kontekstā.
ir konstatēts, ka mezolimbiskā dopamīnerģiskā (DA) shēma, ieskaitot ventrālo tegmentālo apgabalu (VTA) un projekcijas uz striatuma un kortikālo vietu, ir ļoti svarīga daudzu ļaunprātīgas lietošanas zāļu kategoriju motivēšanā vai atalgošanā (13, 22-24, 26, 48). Jaunākie pētījumi no mūsu laboratorijas un citiem liecina, ka šai shēmai ir arī svarīga loma pārtikas motivācijas vai atalgojuma aspektos. Funkcionālo un anatomisko mijiedarbību ar shēmām, kas regulē enerģijas homeostāzi, iesaka ziņojumi par pārtikas atlīdzības modulāciju ar dzīvnieku uzturvērtību (10, 14, 16, 43). Atlīdzības modulāciju, tostarp pārtikas atlīdzību, uzturvērtības vai vielmaiņas stāvokļa ietekmē stipri ietekmē neirālie un endokrīnie signāli, tostarp insulīns (15), leptīns (11, 18, 21, 30, 32), ghrelin (35), melanīna koncentrējošais hormons (MCH) (\ t45) un oreksīns (5, 7): pēdējo gadu laikā ir pierādīts, ka šo signālu klātbūtne centrālajā nervu sistēmā (CNS) ir klātbūtne receptoriem, to bioķīmiskā un šūnu efektivitāte un in vivo vai uzvedības efektivitāte.
Ir pierādīts, ka paplašinātajai limbiskajai shēmai ir nozīme barības un pārtikas atlīdzības nodrošināšanā (2, 19, 28). Tomēr ir arī citas KNS vietnes. Jāatzīmē, ka sānu hipotalāmu (LH) jau sen ir zināms, ka tā ir vieta, kas mediē barošanas un paš stimulēšanas uzvedību (4, 31). Okseksergie neironi un leptīna signalizācija LH ir identificēti kā svarīgi barošanai un pārtikas atlīdzībai (5, 29, 30). Nesen mēs novērojām, ka insulīns, kas ievadīts vai nu trešajā smadzeņu vēdera dobumā, vai arī hipotalāmu (ARC) kaulā esošajā kodolā, var samazināt pašsajūtas saharozi, bet insulīna ievadīšana VTA vai kodolkrāsās neietekmēja šo specifisko atlīdzības paradigmu (15). Tādējādi, šķiet, ka vairākām hipotalāmām vietām var būt nozīmīga loma motivētajā pārtikas meklēšanā un iegūšanā, un saskaņā ar to varētu domāt, ka hipotalāma reģioni ir būtiski aktivizēti saistībā ar pārtikas pašpārvaldi. Lai sāktu pārbaudīt šo hipotēzi, C-Fos ekspresija ir sakārtota žurku CNS, kas apmācīti saharozes pašpārvaldes paradigmā, pēc fiksētu attiecību (FR) apmācības vai pēc pakāpenisku attiecību (PR) apmācības, stingrāks uzdevums motivācijas novērtēšanai (20).
MATERIĀLI UN METODES
Priekšmeti.
Priekšmeti bija Albino žurku tēviņi (325–425 g) no Simonsena (Gilroy, CA). Žurkas tika uzturētas uz chow ad libitum. Viņi tika uzturēti 12:12 h gaiši tumšā ciklā ar apgaismojumu 6:7, un tika apmācīti un pārbaudīti laikā no XNUMX:XNUMX līdz pusdienlaikam pēc ēšanas un pēcabsorbcijas stāvoklī. Visas žurkām veiktās procedūras atbilda Nacionālo veselības institūtu vadlīnijām par dzīvnieku aprūpi, un tās apstiprināja VA Puget Sound veselības aprūpes sistēmas Pētniecības un attīstības komitejas Dzīvnieku aprūpes un lietošanas apakškomiteja.
Saharozes pašpārvalde.
Procedūras tika balstītas uz mūsu publicēto metodiku (15) un tika veikti ar barotām žurkām. Eksperimentā tika iekļauti trīs posmi: automātiskā formēšana, lai uzsāktu apmācību, FR apmācība un pakāpeniskas attiecības (PR) apmācība, izmantojot Richardsonas un Roberta PR algoritmu (38). PR algoritms prasa 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX utt.) svira nospiež, lai panāktu atlīdzības piegādi sesijas laikā (38). Žurkas tika apmācītas pašregulēt 5% saharozi (0.5 ml atalgojums), kas ievadīts šķidruma pilienu traukā. Operant kastes, ko kontrolē Med Associates (Gruzija, VT) sistēma, bija divas sviras, bet tikai viens svira (aktīvs, ievelkams svira) aktivizēja infūzijas sūkni. Tika ierakstītas arī citas sviras (neaktīva, stacionāra svira). Kā jau iepriekš tika novērots, neaktīvā sviras spiedienu skaits bija ļoti zems (mazāk par 10 presēm / sesiju). Saharozes šķīdums tika ievadīts šķidrā traukā iekšķīgai lietošanai (Med Associates, St. Albans, VT). Sākotnējā apmācība tika veikta 1-h sesiju laikā ar nepārtrauktu pastiprināšanas grafiku (FR1: katrs sviras nospiešana tika pastiprināta). Katra sesija sākās ar aktīvās sviras ievietošanu un baltā mājas gaismas apgaismojumu, kas palika visu sesiju. 5 signāls (2900 Hz, 20 dB virs fona) un gaisma (7.5 W baltā gaisma virs aktīvās sviras) diskrēta savienojuma cue kopā ar katru atlīdzības piegādi, 20 s laiks beidzas ar saharozes piegādi. FR mācības tika veiktas 10 dienām; stabila reakcija tiek sasniegta līdz piektajai sesijai. PR apmācība tika veikta par maksimālo iespējamo 3 h / dienā 10 dienām. PR sesijas beidzās pēc 30 min bez aktīvas sviras nospiešanas, kurā brīdī mājas gaisma tika automātiski izslēgta un aktīvais svira tika ievilkta; žurkas tika izņemtas no kamerām un atgrieztas viņu mājās. "Stop laiks" ir norādīts Tabula 2 ir laiks, kad sistēma tika izslēgta; līdz ar to pēdējais aktīvās sviras spiediens būtu bijis 30 min. pirms apstāšanās laika. Uzvedības dati (Tabula 2) ir vidējie rādītāji sesijas 6-10 FR mācībām un. \ t sesijas 1-9 PR apmācībai. Kontrolējamas žurkas tika noņemtas no dzīvojamās telpas un ievietotas tīrā operantajā kamerā ar mājas gaismu uz 60 min, procedūras telpā, lai modelētu žurkām, kas paši ievadīja saharozi. Viņiem netika dota nekāda lieta, lai ēst vai dzert, kamēr viņi atradās operanta kastēs, un viņiem nebija piekļuves svirām.
Pēdējā dienā žurkas ievietoja kamerās atbilstoši apmācības dienām un turēja kamerās 90 minūtes, pēc tam tās tika noņemtas anestēzijai, perfūzijai un sekojošai imūnhistoķīmijai. Kontroles žurkas tāpat ieveda procedūras telpā un 90 minūtes turēja tīrā operanta kamerā, atbilstoši apmācības dienām, pēc tam tās anestēzēja un perfuzēja. Tūlīt pēc pēdējās 90 minūšu sesijas žurkas dziļi anestezēja ar inhalāciju ar izoflurānu un perfūzijas ar 0.9% NaCl, kam sekoja auksts 4% paraformaldehīda šķīdums. Anestēzijas un eitanāzijas laiks tika balstīts uz zināmo c-Fos olbaltumvielu maksimālās ekspresijas laika kursu 90–120 minūtes pēc notikuma. Tādējādi c-Fos ekspresija atspoguļotu CNS aktivizēšanos uzvedības uzdevuma sākumā, nevis būtu rezultāts tam, ka dzīvnieki piedzīvo uzdevumu un uzņem saharozi. Smadzenes vairākas dienas tika noņemtas un pēc tam piestiprinātas paraformaldehīdā; pēc tam tos ievietoja 20% saharozes-PBS, pēc tam tos ievietoja 30% saharozes-PBS šķīdumā. Smadzenes tika sadalītas uz kriostata (Leica CM 3050S kriostats) imūnhistoķīmijai.
c-Fos imūnhistoķīmija un kvantitācija.
Mēs izmantojām mūsu noteikto metodoloģiju, lai kvantitatīvi noteiktu imūnreaktīvo c-Fos proteīnu smadzeņu sekcijās (12). Visu smadzeņu sākotnējais kvalitatīvais ekrāns tika veikts ar c-Fos izteiksmi. 12-μm veselu smadzeņu koronālas sekcijas tika mazgātas 3 reizes PBS (Oxoid, Hampshire, UK). Pēc tam 1 h sekcijas tika bloķētas istabas temperatūrā PBS, kas satur 5% normālu kazu vai ēzeļu serumu. Pēc tam sadaļas vairākas reizes nomazgāja PBS un inkubēja naktī pie 4 ° C primārajos antivielu šķīdumos, kas pagatavoti PBS. Sekcijas mazgāja trīs reizes PBS un pēc tam inkubēja tumsā istabas temperatūrā sekundārā antivielu šķīdumā, kas sagatavots PBS 1 h. Sekcijas vēlāk mazgāja PBS un uzstādīja un nosegās Vectashield cietā komplekta montāžas vidē (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Sekciju digitālie attēli tika iegūti, izmantojot Nikon Eclipse E-800 fluorescences mikroskopu, kas pievienots Optiphot kamerai, un izmantojot Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) programmatūru.
Pēc tam mēs pievērsāmies ierobežotam skaitam jomu, kas liecina par acīmredzamu atšķirību starp apstākļiem, kvantitāciju un neironu fenotipu. Konkrētāk, mēs koncentrējāmies uz kodolu un čaumalu (NAc); stria terminalis (aBNST, pBNST) priekšējā un aizmugurējā gultnes kodols; mediālie hipotalāma reģioni [Ventromedial nucleus (VMH), dorsomedial hipotalāms (DMH), paraventricularis kodols (PVN), retrochiasmatic area (RCh) un ARC]; sānu hipotalāmu (LH), ieskaitot muguras un vēdera zonas un perifornālo (peF) apgabalu; VTA; smadzeņu kāts [zemākas olīvu, hipoglosāla (nXII) kodols no vientuļš trakts, sānu retikālais kodols un C1 / A1 adrenalīna / noradrenalīna kodoli]. Atlases 12-μm sekcijas tika novērtētas c-Fos izteiksmei un kvantitācijai saskaņotās sekcijās un reģionos, balstoties uz Paxinos un Watson atlasi (34). Lūdzu apskati Tabula 1 specifiskām stereotaksiskām koordinātām. Analīzes galvenais mērķis bija salīdzināt katru uzvedības uzdevumu ar attiecīgo kontroli (PR pret ĶTR; FR vs FRC). Lai optimizētu iespējamās atšķirības atkarībā no uzvedības un kontroles apstākļiem, analīzei tika izvēlēti PR un FR grupu maksimālie izpildītāji. Tādā veidā tika analizētas 4 / 12 PR un 3 / 12 FR žurkas: šīm žurkām bija aktīvs sviras preses numurs (primārais uzvedības beigu punkts), kas bija lielāks par vienu standarta novirzi virs vidējās vērtības attiecīgajai uzvedības grupai. Tika analizēta arī kontroles žurku apakšgrupa (5 PRC un 3 FRC žurkas, kas bija procedūras telpā vienlaicīgi ar FR vai PR žurkām). Ar FR procedūru (“FRext”) tika ņemta papildu grupa no trim žurkām, lai atdarinātu PR procedūras pievienoto ilgumu (ti, kopumā 20 dienas, kad PR žurkas tiek ņemtas ar FR un pēc tam PR), lai novērtētu, vai FR un PR atšķirības bija saistītas ar uzvedības uzdevumu vai procedūras ilgumu. FRext smadzenes netika analizētas un sistemātiski pārbaudītas, bet specifiski interesējošie reģioni tika analizēti ar pārējām četrām grupām, lai varētu veikt salīdzinošu kvantitāciju, kā norādīts konkrēti rezultātos.
Kvantitatīvai noteikšanai (40 × palielinājumā) atlasīti atlases reģioni. ImagePro Plus programmatūra (Media Cybernetics) tika izmantota, lai attēlotu vēlamā apgabala attēlu. Aprēķināšanai tika noteikta teritorija, un tika konstatēts pozitīvo šūnu skaita slieksnis. Identisko laukumu un fonu (slieksni) izmantoja no attiecīgajām eksperimentālajām grupām, un pozitīvo šūnu (kvantitatīvās) programmatūras skaitīšana tika veikta tajā pašā sesijā visām eksperimentālajām grupām, lai novērstu starpsesijas izmaiņas fona iestatījumos. Statistiskajai analīzei skaitļi tika ņemti no atsevišķa žurkas tikai tad, ja katras zonas atbilstošās vai pilnās sekcijas (kā definēts. \ T Tabula 1) bija pieejami; dati par konkrētu apgabalu netika ņemti no žurkas, ja šajā jomā bija nepilnīga divpusēja pārstāvība.
Kvalitatīva divkāršā marķējuma imunofluorescences analīze.
No žurkām, kurās kvantitatīvi noteica c-Fos, tika noņemtas smadzeņu daļas, lai veiktu dubulto marķējumu imūnhistoķīmijai. Tā kā mēs nevēlējāmies traucēt dzīvnieku uzvedību, tie netika iepriekš apstrādāti ar kolhicīnu, lai optimizētu peptīdu neirotransmiteru vizualizāciju. Tāpēc neironu fenotipu vizualizācija, kas aktivizēti saistībā ar pašpārvaldes uzdevumu, bija ierobežota. Tomēr, lai sāktu aktivēto neironu fenotipu novērtēšanu vairākās CNS vietās, digitālie attēli (iegūti, kā aprakstīts iepriekš sadaļā) tika uzņemti ar 20 ×, 40 × vai 60 × (kā norādīts figūru leģendās) palielinājumā. . Glutamāta dekarboksilāzes (GAD), tirozīna hidroksilāzes (TH), CRF, neiropeptīda Y (NPY), ar Agouti saistītā peptīda (AgRP) un triptofāna hidroksilāzes divkāršās krāsošanas procedūra bija salīdzināma ar c-Fos imūnreaktivitātes testu tās pašu, izņemot to, ka c-Fos-Ab un vienas citas primārās antivielas maisījumu izmantoja inkubācijai uz nakti 4 ° C temperatūrā; tāpat abas sekundārās antivielas atradās vienā šķīdumā un inkubēja 1 stundu tumsā istabas temperatūrā. Oreksīna testā tika izmantota 20 minūšu 50% etanola mazgāšana pirms bloķēšanas posma. Sākotnējie optimizācijas testi tika veikti, lai noteiktu primāro antivielu atbilstošu atšķaidījumu. Izmantotās primārās antivielas bija trušu anti-c-Fos (1: 500) (sc-52) un peles anti-c-Fos (1: 800) (abas no Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); peles anti-GAD (1: 1,000), peles anti-tirozīna hidroksilāzes (1: 500) un aitu anti-triptofāna hidroksilāzes (visas no Chemicon, Temecula, CA); trušu anti-CRF (1: 500) (dāvana no Dr Wylie Vale, Salk Institute, CA); trušu anti-NPY (1: 1,000 1), trušu anti-AGRP (1,000: 1 5,000) un kazu anti-oreksīns A (3: 488 1) - visi no Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). Izmantotās sekundārās antivielas bija Cy500 konjugēts kazas prettrusis vai antipele (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Alexa Fluor 1 kazas antipele vai prettruša vai ēzeļa anti-aitas IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) ; visas sekundārās antivielas tika atšķaidītas ar 2,500: 488. c-Fos / MCH dubulto imūnkrāsošanu pārbaudīja sērijveidā; pirmkārt, MCH (1: 500 primārā antiviela, Millipore) ar Alexa-5-kazas prettrušu (1: 500) sekundāro antivielu. Slaidus atkārtoti bloķēja ar 3% normālu kazas serumu un iekrāsoja anti-c-Fos (20: 50) un cyXNUMX-kazas anti-trušus kā sekundāras antivielas. MCH testam tika izmantota XNUMX minūšu XNUMX% etanola mazgāšana pirms bloķēšanas posma.
Statistiskās analīzes.
Grupas dati tekstā, tabulās un skaitļos ir parādīti kā vidējie rādītāji ± SE. Nozīme ir definēta kā P ≤ 0.05. Statistiski salīdzinājumi tiek veikti starp eksperimentālajām grupām (FR pret PR) vai starp eksperimentālajām grupām un attiecīgajām kontrolēm (PR pret PRC; FR pret FRC), izmantojot nesaistītus Studentu t-pārbaude. Pīrsona korelācijas koeficienti starp aktīvo sviru nospiešanu un c-Fos ekspresiju dažādos smadzeņu reģionos, kā arī c-Fos ekspresijas korelācija starp dažādiem smadzeņu reģioniem vienādos eksperimentālos apstākļos tika aprēķināti, izmantojot StatPlus: mac LE statistiskās analīzes programmu Mac OS versijai. 2009. gads - AnalystSoft. Mēs pārbaudījām lineāras korelācijas (Pīrsona R statistiku) starp c-Fos izteiksmi dažādos CNS reģionos. Mēs arī pārbaudījām c-Fos izteiksmes korelāciju dažādos aktivētos CNS reģionos un uzvedībā. Šīm korelācijām tika izmantoti FR un PR dati no žurkām, kurām tika veikta c-Fos kvantitatīvā noteikšana.
REZULTĀTI
c-Fos kvantitācija.
Kā jau iepriekš minēts, aktīvo sviru presu skaits bija ievērojami lielāks attiecībā pret PR un FR veiktspēju (Tabula 2), un saharozes atlīdzību skaits bija lielāks FR darbības laikā. PR žurku sesijas ilgums bija aptuveni 90 min (apstāšanās laiks - 30). Tabula 3 uzskaita C-Fos imūnreaktīvo šūnu skaitu visos CNS reģionos, kur tika veikta kvantitatīva noteikšana. FR un PR žurku c-Fos ekspresijas modelis ir apkopots Fig. 1. Bija nozīmīga mediālā hipotalāma (MHmalciņš, ARC, PVN, RCh, DMH un VMH kompozīcija) žurkām, kas iesaistītas PR sviras piespiešanā, bet vispārējā aktivācija žurkām, kas iesaistītas FR svirā, piespiež saharozi, salīdzinot ar attiecīgajām kontrolēm. PR žurku mediālajā hipotalāmā šī aktivācija notika PVN, ARC un VMH (Fig. 2). FR sviras nospiešana, bet ne PR sviras piespiešana, bija saistīta ar ievērojamu aktivāciju LH (balstoties galvenokārt uz aktivāciju perifornālajā zonā). Gan aktīvās sviras, gan hipotalāma c-Fos ekspresija bija salīdzināma starp FRext un FR grupām (MHmalciņš, 946 ± 26 un 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 un 186 ± 10; LHmalciņš, 468 ± 79 un 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 un 173 ± 15), kas liecina, ka atšķirība ekspresijas modelī starp FR un PR grupām nav saistīta ar apmācības / pieredzes ilgumu, bet gan ar instrumentālā uzdevuma raksturu. FR grupā bija ievērojams c-Fos ekspresijas pieaugums BNST, kas novērots gan aBNST, gan pBNST. Gan FR, gan PR sviru piespiešana bija saistīta ar palielinātiem c-Fos-imunopozitīviem neironiem NAc apvalkā; c-Fos skaitļi tika ievērojami palielināti NAc kodolā no žurkām, kas nodarbojas ar FR sviru nospiešanu, un nezināma tendence palielināt c-Fos izteiksmi žurkām, kas iesaistītas PR sviras nospiešanā. c-Fos VTA nepalielinājās ar PR uzdevumu, lai gan FR uzdevumā tika novērota nenozīmīga tendence pieaugt. Visbeidzot, c-Fos ievērojami palielinājās hipoglosāla (galvaskausa nerva XII) kodolā ar PR, bet ne FR.
c-Fos ekspresija tika novērota citos CNS reģionos, tostarp amygdalā un smadzeņu garozā (Fig. 3). Tomēr ekspresija tika novērota gan kontroles apstākļos, gan saistībā ar PR un FR uzdevumiem, norādot, ka procedūras nespecifiskie aspekti (apstrāde, pārvietošanās procedūras telpā) varētu būt izraisījuši šo aktivāciju. Kvantitācija šajos reģionos netika veikta. Tāpat tika novērota aktivācija smadzeņu cilmes reģionos, kas nav nXII, bet radās saistībā ar gan kontroles, gan ar uzdevumu saistītiem apstākļiem, kā arī liecina par lomu nespecifiskā uzvedībā vai uzvedības aktivizēšanā.
Mēs pārbaudījām korelācijas starp c-Fos ekspresiju dažādos CNS reģionos. Apvienojot datus no sviras nospiešanas grupām, mēs atradām negatīvu korelāciju starp c-Fos izteiksmi LH un VMH; tādējādi VMH aktivācija bija saistīta ar samazinātu kopējo LH (Pearson's) aktivāciju R, −0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Mēs arī novērojām nozīmīgu pozitīvu korelāciju starp c-Fos ekspresiju LH perifēriskajā reģionā un VTA (Pearson's R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), kas atbilst zināmam monosinaptiskam savienojumam starp šiem diviem reģioniem (skat. Diskusiju skat. 2 un 13). Mēs atradām nozīmīgu negatīvu korelāciju starp c-Fos ekspresiju VTA un NAc apvalkā neatkarīgi no tā, vai tas tika pārbaudīts atsevišķi attiecībā uz FR veiktspēju (Pearson's R, −0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) vai PR veiktspējai (Pīrsona R, −0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), kas atbilst zināmām savstarpējām ieejām starp striatāla reģioniem un materiālo nigru un VTA (2, 13). Mēs arī pārbaudījām korelācijas starp c-Fos ekspresiju dažādos CNS reģionos un uzvedību. Apvienojot datus no sviras nospiešanas grupām, mēs novērojām nozīmīgu pozitīvu korelāciju starp c-Fos ARC un aktīvo sviru nospiešanu (Pearson's R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Neironu identifikācija, kas aktivizēti ar saharozi un saharozes motivācija.
Smadzeņu stumbā c-Fos-pozitīvie neironi neuzrādīja pozitīvu imūnfiltrāciju TH, kas ir ātruma ierobežojošs enzīms epinefrīnam un norepinefrīnam (un dopamīnam); līdz ar to, šķiet, ka šie katecholamīnerģiskie neironi nav aktivizēti ar FR vai PR uzdevumiem. Tomēr dažiem c-Fos pozitīviem neironiem bija pozitīva imūnfiltrācija triptofāna hidroksilāzei, kas liecina, ka tika aktivizēts serotonīna neironu populācija. Kā parādīts Fig. 4, ARC, c-Fos-pozitīvo šūnu ķermeņus ieskauj AGRP krāsotas šķiedras, un tika novērots līdzīgs NPY šķiedras / c-Fos imūnfilmas paraugs (nav parādīts). PVN, c-Fos-pozitīvie neironi parādījās CRF pozitīviem neironiem, bet kolokalizācija netika novērota (dati nav parādīti). Fig. 5 uzrāda gan oreksīna, gan MCH imūnfilmu LH. Okseksu neironi tika konstatēti gan dLH, gan peLH. Lai gan peLH novēroja MCH-pozitīvos neironus, LH šajā reģionā nebija kolokalizācijas ar c-Fos. Tomēr mēs novērojām c-Fos kolokalizāciju oreksīna pozitīvajos neironos, kas atrodas peLH (Fig. 6, tops) un ļoti ierobežota c-Fos kolokalizācija ar MCH vLH (Fig. 6, apakša). Jāuzsver, ka gan lokalizācija, gan kolokalizācija ar c-Fos var tikt novērtēta par zemu peptīdu neirotransmiteru, piemēram, CRH, dēļ, jo žurkas netika ārstētas ar kolhicīnu. Visbeidzot, kodolā un korpusā (Fig. 7), gan FR, gan PR žurkām tika novērota c-Fos, kas saista ar GAD, kas ir sintētiskais neirotransmitera GABA enzīms. THT notika spēcīga krāsošana VTA ietvaros; tomēr c-Fos-pozitīvie neironi tika novēroti reti, un tie nešķiet tikai kolokalizēti ar TH.
DISKUSIJA
Šajā pētījumā mēs izmantojām tiešā agrīna gēna, c-Fos, ekspresiju, lai novērtētu akūtas CNS aktivācijas modeli, kas saistīts ar saharozes pašpārvaldes sviras nospiešanas darbību, vai nu kā relatīvi nenozīmīgu uzdevumu (FR) vai pakāpeniski sarežģītāks uzdevums, kas domāts, lai atspoguļotu motivētas motivācijas meklējumus, piemēram, saharozi, un stingri iesaistīt limbisko shēmu (22, 24, 49) (PR). Hipotalāma aktivizācijas modeļi abos uzdevumos bija atšķirīgi: FR uzdevumā dominēja LH / limbiskā aktivācija un PR uzdevumā dominēja mediālā hipotalāma / limbiskā aktivācija (skat. Fig. 1). Tam ir vairāki iespējamie iemesli. Pirmkārt, šīs paradigmas varētu “kartēt” kā kvalitatīvi atšķirīgu pieredzi CNS. Žurkas, kas apmācītas FR sniegumā, gaida vieglu un augstu atalgojumu. Atalgojošas pārtikas paredzēšana būtiski ietekmēs FR žurkām novēroto c-Fos modeli. Acīmredzamā aktivitātes modeļa kvalitatīvā atšķirība liecina, ka otrā iespēja - ka PR dzīvniekiem vienkārši ir vairāk pieredzes ar uzdevumu - ir mazāk ticama, un to apstiprināja mūsu c-Fos mērīšana žurku hipotalāmā, kas saņēma 20 FR sesijas. , kas parādīja darbību, kas līdzīga FR grupai, nevis PR grupai. Abas šīs iespējas var pārbaudīt, sistemātiski palielinot FR apmācības grūtības un novērtējot izmaiņas CNS aktivizēšanā, tādā gadījumā varētu paredzēt kvalitatīvas izmaiņas aktivizācijas modelī. Tomēr, lai gan mācību pieredzes skaits var neņemt vērā CNS aktivizēšanas modeli, vidējais saharozes atalgojuma skaits sesijā var būt: PR uzdevums var tikt vienkārši iemācīts kā „mazāk atalgojoša” pieredze, un tas varētu būt funkcionāli saistīts ar LH aktivācijas trūkums. Tādējādi CNS aktivizēšanas modelis sesijas sākumā var atspoguļot interoceptīvo stāvokli, piemēram, nosacītās vietas paradigmas: aktivācijas spēks limbiskajās shēmās ir saistīts ar mācīšanos un motivāciju. Mēs novērojām c-Fos ekspresijas mainīgumu FRC dzīvnieku mediālajā hipotalāmā. Īpaši PVN robežās šī variabilitāte varētu būt maskēšanas aktivācija FR žurkām, kurām novēroja tendenci palielināt c-Fos pret FRC žurkām (Tabula 3). Tomēr vispārējā mediālā hipotalāma aktivācija FR un FRC dzīvniekiem neatšķīrās.
Jāatzīmē, ka, lai gan mūsu mērķis bija identificēt CNS vietnes, kas veicina uzvedības sākumu, laika izšķirtspēja ir nedaudz apsvērta. Kā aprakstīts zemāk, tagad ir saprotams, ka dažādus instrumentālo vai operantu uzvedības apakškomponentus ietekmē dažādu neironu populāciju aktivizēšana (13, 23, 33, 49). Mēs nevaram pilnībā izslēgt, ka aktivizēšana ļoti tūlītējas barošanas nospiešanas vai atalgojuma dēļ varētu būt nedaudz ietekmējusi aktivizācijas modeļus, ko mēs novērojām. Mūsu secinājumi ir pamats turpmākām izmeklēšanām par specifisku CNS vietu lomu dažādos pašpārvaldes uzdevuma aspektos vai komponentos, kā arī par šādiem pētījumiem, citu tūlītēju agrīnu gēnu noteikšanu ar dažādiem “ieslēgšanas” un “izslēgšanas” laikiem (36) būs ļoti noderīga.
Korelācijas, ko mēs konstatējām c-Fos izteiksmē starp dažādiem smadzeņu reģioniem, atbalsta zināmo hipotalāma un primāro limbisko reģionu funkcionālo savienojumu šim konkrētajam atalgojuma uzdevumam, piemēram, starp LH un VMH, un starp LH perifornisko reģionu un VTA (skatiet diskusiju atsaucēs. 2 un 13). Mēs arī pārbaudījām c-Fos izteiksmes korelāciju dažādos aktivētos reģionos un uzvedību. Korelācija starp c-Fos ARC un aktīvās sviras presēm atbilst labi definētajai ARC loma pārtikas uzņemšanai (1); ar mūsu iepriekšējo novērojumu, ka insulīna injekcija tieši ARC samazinājās saharozes pašpārvaldē (15); ar iepriekšējiem ziņojumiem par ARC un tā endorfīno neironu kritisko lomu kokaīna pašpārvaldes iegūšanā un izpildē (40-42); un ar ARC prognozētajām prognozēm NAc (17). Tādējādi ARC var būt svarīga loma motivētā uzvedībā, lai meklētu un iegūtu daudzus atalgojuma stimulus, tai skaitā, bet ne tikai, pārtiku. Visbeidzot, mēs novērojām nozīmīgu PVN un VMH aktivāciju ar PR saharozes meklējumiem. Tas atbilst šo mediālo hipotalāmu kodolu labi raksturotajām lomām pārtikas uzņemšanas regulēšanā, tiešā sinaptiskā savienojamībā ar ARC un identificētajiem savienojumiem ar limbisko shēmu (1, 27, 37).
Mēs atklājām būtisku negatīvu korelāciju starp c-Fos izteiksmi VTA un NAc apvalkā, pārbaudot FR vai PR veiktspēju. Bija pārsteidzoši, ka spēcīgāka VTA aktivācija netika novērota saistībā ar PR vai FR saharozes pašregulāciju (salīdzinot ar attiecīgajām kontrolēm). Iespējams, ka šis konstatējums atspoguļo mūsu mērījumu laiku, koncentrējoties uz iespējamām CNS vietām, kas ir aktīvas uzdevuma sākumā un kurām šie dzīvnieki bija labi apmācīti. Tas atbilstu Schultz novērojumiem un44), ka dopamīna neironu aktivizācija kalpo kā negaidītu stimulu vai atlīdzību marķieris, un šī aktivācija samazinās saistībā ar apmācību. Tomēr pierādīts, ka striatāla dopamīna izdalīšanās saharozes lietošanas laikā apmācītiem dzīvniekiem notiek kā ļoti precīzs un laika ziņā diskrēts notikums (39). Tādējādi ir iespējams, ka vērojamās tendences būtu stipri nozīmīgas ar lielāku pētījumu grupu (ti, vairāk statistikas jaudas). Mēs novērojām NAc aktivāciju saistībā ar gan FR, gan PR saharozes uzņemšanu. Ir ziņots gan par NAc neironu aktivizēšanu, gan inhibēšanu saistībā ar instrumentālo atlīdzības sniegumu, un aktivācijas / aktivitātes modelis ir atkarīgs no apmācības un vides, un ir saistīts ar dažādām uzvedības sastāvdaļām (piemēram, orientēšanās, pieeja, uzņemšana).6, 33, 50). Kā minēts iepriekš, c-Fos mērīšana nenozīmētu šādu specifisku aktivitāti. Carlezon ir ierosinājis, ka „atlīdzība” pārsvarā ir saistīta ar NAc neironu aktivitātes samazināšanos, ti, vidēji smailiem neironiem (3). Tas neatbilst mūsu novērojumiem, būtiski uzlabojot NAc c-Fos, salīdzinot ar apstrādes kontrolēm un c-Fos-pozitīvajiem neironiem, kas kolokalizēti ar GAD, kas atbilst vidējas smailes neironiem (GABAergic), bet mēs neesam īpaši novērtējuši NAc neironu “inhibīciju ”. NAc aktivizācija un inhibīcija var rasties gan instrumentālo uzdevumu laikā, gan anatomiski, gan laikā. No šī pētījuma viedokļa var secināt, ka NAc ir iesaistīta instrumentālās saharozes uzņemšanā, un NAc kodols veicina motorisko aktivāciju un NAc apvalks veicina gan motora, gan motivācijas aspektus.
Mēs arī novērojām abu lielāko BNST reģionu aktivāciju (anterior un posterior) FR žurkām. BNST ir limbiskās shēmas daļa, kas modulē neuroendokrīnās atbildes uz atkārtotiem stimulēšanas pieredzi (8, 9) un plašākā nozīmē ir saistīta ar mācīšanos par atkārtotiem stimuliem. Lai gan tās loma ir izskaidrota vispusīgāk saistībā ar atkārtotiem stresa faktoriem, mūsu secinājums liecina par plašāku BNST lomu: BNST var modulēt CNS reakcijas uz atkārtotiem pozitīviem, kā arī negatīviem vai stresa stimuliem. Tā kā mēs to redzējām FR sākumā, bet ne PR, sniegums, BNST pieņemšana darbā var būt saistīta ar paaugstinātu saharozes atalgojumu par FR apmācību. Mūsu novērojumi par tiešu CRF neironu aktivizāciju liecina, ka instrumentālā reakcija uz saharozi nav būtisks stressors; tomēr c-Fos ekspresija citos PVN neironos atbilst stresa shēmu modulācijai (46). Faktiski Ulrich-Lai un kolēģi ir ziņojuši, ka, izmantojot citu uztura / barošanas paradigmu, saharozes uzņemšana modulē PVN funkciju (47). Visbeidzot, mēs novērojām hipoglosāla nerva kodola aktivāciju saistībā ar PR, bet ne FR veiktspēju. To nozīmi var spekulēt tikai; viena iespēja ir tā, ka žurkām, kas uzņem mazāk saharozes, var paaugstināties saharozes garšas nozīme.
Saharozes meklējumi un saharozes lietošana ir uzskatāmi par daudzdimensiju pieredzi, kas ir dinamiska laikā, jo norīšana izraisītu perifēros signālus, kas saistīti ar saharozes kaloriju saturu, kā arī pieradināšanu un sesijas alliestēziju (25). Lai gan mūsu pētījumi ir vērsti uz perifēro endokrīno signālu ietekmi, piemēram, insulīnu un leptīnu, lai modulētu pārtikas atlīdzību, to sekas savukārt var būt tieši centralizēti raidītāji un neiropeptīdi, kuriem ir īstermiņa vai ilgtermiņa loma. barošana vai atlīdzība par pārtiku (skat. diskusiju Ref. 14). Pašreizējais pētījums sniedz zināmu ieskatu šajā jautājumā; mēs novērojām dažus neironus, kas ekspresē vai nu MCH vai oreksīnu, vai divus oreksigēnus neiropeptīdus. Faktiski šie konstatējumi var nenovērtēt MCH vai oreksīna lomu pārtikas atlīdzībā, jo imūnocitohīmija neapstrādātām žurkām neapšaubāmi ierobežoja abu šo neiropeptīdu vizualizāciju. Aktivizēto oreksīna neironu noteikšana LH kopumā saskan ar daudzajiem pētījumiem, kas piesaista oreksīna neironus barošanai, atlīdzībai par pārtiku un vispārīgāku stimulu atlīdzību (piemēram, 5, 7, 29). Mēs novērojām peFLH oreksīna neironu aktivāciju. Aston-Jones un kolēģi (5) ir sadalījušas dažādu LH oreksīna neironu populāciju lomas atalgojuma uzvedībā un ir iesaistījušas peFLH oreksīna neironus arousā, nevis atlīdzību par sevi. Tādējādi mūsu secinājums liecina par LH orexin lomu arousal, un, iespējams, orientāciju uz aktīvo sviru vai saharozes uzņemšanas norādēm.
Nākotnes apsvērumu cienīgs ir saharozes kā atalgojuma stimula unikalitāte vai vispārīgums. Joprojām ir jānosaka, vai agrīnās CNS aktivizācijas modelis, ko mēs šeit ziņojam, ir specifisks pārtikas produktam kā stimuls, vai arī vispārina citus atalgojošus stimulus. Kā jau minēts iepriekš, jo īpaši FR uzdevumā, sagaidāms, ka vairāku saharozes atlīdzību uzņemšana izraisītu vielmaiņas sekas ar hormonu izdalīšanās modulāciju (piemēram, holecistokinīns, ghrelīns, insulīns) un pārmaiņas perifēro un CNS neironu aktivizēšanā. Nav paredzams, ka šīm izmaiņām būs tieša loma agrīnajos CNS aktivizācijas modeļos, ko mēs izmērām, bet var būt nozīme mācībās par saharozes atalgojumu. Atkal, tādi neiropeptīdi kā oreksīns var būt kritiski saistīti.
Mūsu pētījums, kā zināms, ir pirmais pierādījums par specifisku mediālu hipotalāmu kodolu aktivizāciju saharozes pašpārvaldes sākumā, ieskaitot gan PVN, kas saistīts ar homeostāzi, gan stresa reakciju, un ARC, kas ir būtisks enerģijas homeostazei, uzturvielu uztveršana un pārtikas uzņemšanas regulēšana. Svarīgi ir tas, ka mēs novērojām mediālā hipotalāma un NAc aktivāciju saistībā ar PR sākumu, kas liecina, ka gan homeostatiskām, gan dažām limbiskām vietām ir nozīme saharozes pašpārvaldes uzsākšanā. Papildu limbisko shēmu vietas var tikt pieņemtas darbā vēlāk.
Perspektīvas un nozīme
Tā kā vēsturiski pētījumi par motivācijas un atalgojuma uzvedību visvairāk ietekmētu CNS limbisko shēmu, ir uzkrāts liels pierādījumu kopums, kas uzsver kritisko funkcionālo mijiedarbību starp limbisko un enerģijas homeostāzes shēmu. Pašreizējais pētījums tagad liecina par specifisku mediālu hipotalāmu kodolu iespējamo nozīmi saharozes motivētajā darbā. No šī pētījuma ekstrapolējot, turpmākajos pētījumos var novērtēt, vai mediālā hipotalāma loma ir nepieciešama un vai tās aktivizācija ir saistīta ar motivētu citu atlīdzību meklēšanu, piemēram, ļaunprātīgas izmantošanas narkotikām. Turklāt šī pētījuma rezultāti sniedz pamatojumu motivētu uzvedību izmaiņu izpētei apstākļos, kad vienlaikus ir mainījusies mediālā hipotalāma fizioloģija, piemēram, aptaukošanās gadījumā.
STIPENDIJAS
Šo pētījumu atbalstīja Valsts veselības institūti DK40963. Dr Dianne Figlewicz Lattemann ir vecākais pētnieku karjeras zinātnieks, biomedicīnas laboratorijas pētījumu programma, Veterānu lietu departaments Puget Sound veselības aprūpes sistēma, Sietla, Vašingtona. Dr. Sipolu atbalsta Latvijas Zinātnes padome Grant 04.1116.
PATEICĪBA
Mēs pateicamies Dr. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius un JE Blevins konsultācijas un noderīgas diskusijas.
ATSAUCES
;