Ghrelin receptoru (GHS-R1A) antagonists mazina morfīna atalgojuma īpašības un palielina opioīdu peptīdu līmeni atalgojuma zonās pelēm (2015)

Akūta un hroniska atkarību izraisošu zāļu iedarbība būtiski ietekmē mezolimbisko dopamīna sistēmu, kas ir svarīga smadzeņu atlīdzības sistēmu atslēga (Nestler, 2005). Šo ietekmi ierosināja, lai vismaz daļēji pamatotu narkomānijas attīstību (Wise, 2004). Narkomānija izraisa plašu kaitīgu ietekmi gan uz indivīdu, gan sabiedrību, un ir nepieciešamas jaunas farmakoloģiskas iejaukšanās, kas risina šo lielo sabiedrības veselības problēmu (Koob un Le Moal, 2001). Precizējot signalizācijas sistēmas, kas mediē atkarību izraisošo zāļu spēju aktivizēt mezolimbisko dopamīna sistēmu, var identificēt unikālas ārstēšanas stratēģijas vielu lietošanas traucējumiem.

Pētījumi rāda, ka kopējie neirobioloģiskie mehānismi regulē pārtikas un atkarību izraisošo zāļu uzņemšanu un atalgojumu (Morganstern et al., 2011), ierosinot, ka pārtikas regulēšanas gut – smadzeņu peptīdi, piemēram, ghrelin, ietver atalgojuma starpniecību. Sākotnēji tika pierādīts, ka ghrelīns izraisa augšanas hormona izdalīšanos (Kojima et al., 1999) un izraisa aptaukošanos žurkām (Tschop et al., 2000). Līdz šim ir labi zināms, ka ghrelin palielina uzturu, izsalkumu, kā arī stimulē apetīti līdz hipotalāma ķēdes (pārskatu sk. Egecioglu et al. (2011)). Papildus hipotalāmam, grelīna receptori (GHS-R1A) tiek izteikti ar atlīdzību saistītās jomās, piemēram, amigdalā, striatumā, prefrontālajā garozā, ventrālā tegmentālā zonā (VTA) un hipokampā (pārskatu skatīt Engel un Jerlhag (2014) grelīna fizioloģiskā loma pārsniedz enerģijas homoeostāzes regulēšanu. Patiešām, tika pierādīts, ka oreksigēnais peptīds grelīns ir mezolimbiskās dopamīna sistēmas aktivators, kā arī alkohola, nikotīna, amfetamīna un kokaīna atlīdzības, motivācijas un uzņemšanas regulators pelēm (pārskatu sk. Engel un Jerlhag (2014)).

Opioīdi, tāpat kā citas atkarību izraisošās zāles, aktivizē mezolimbisko dopamīna sistēmu, kas izraisa dopamīna izdalīšanos līdz μ- un / vai δ-opioīdu receptoru aktivācija kodolā accumbens (NAc) (Hirose et al., 2005, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999) un VTA, iespējams, samazinot GABA - dopamīna neironu (Johnson un North, 1992) inhibīcija. Turklāt akumbālās κ-opioīdu receptori regulē mezolimbiskās dopamīna sistēmas aktivitāti (Chefer et al., 2005, Spanagel et al., 1992). Atkārtota opioīdu iedarbība rada vairāku neirotransmiteru, tostarp opioīdu peptīdu, adaptācijas izmaiņas atalgojuma zonās, kas veicina atkarības attīstību (De Vries un Shippenberg, 2002). Žurkām GHS-R1A farmakoloģiskā nomākšana mazina morfīna izraisīto dumbamīna izdalīšanos, kā arī stereotipisko uzvedību (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Pašreizējās eksperimentu sērijas pirmās daļas mērķis bija izpētīt GHS-R1A antagonista JMV2959 akūtu ietekmi uz morfīna spēju izraisīt lokomotorisko stimulāciju, dopamīna izdalīšanos un kondicionētu vietu izvēli pelēm. Šī pētījuma otrās daļas mērķis bija novērtēt atkārtotas JMV2959 vai ghrelin terapijas ietekmi uz opioīdu peptīdu līmeni (Met-enkephalin-Arg).⁶Phe⁷ (MEAP), dinamorfīns B (DynB) un Leu-enkefalīns-Arg⁶ (LeuArg)) ar atalgojumu saistītās jomās, tostarp amygdala, striatum, prefrontālā garozā, VTA un hipokampā.

Tika izmantotas pieaugušo pēcdzemdību vecuma vīriešu NMRI peles (8 – 12 nedēļas vecas un 25 – 40 g ķermeņa masas; Charles River, Sulzfeld, Vācija). Īsāk sakot, visas peles tika izmitinātas grupā un uzturētas 12 / 12 h gaismas / tumšajā ciklā (gaismas iedegās septiņās stundās). Tika piegādāts krāna ūdens un ēdiens (normāls čau, Harlan Teklad, Norfolk, Anglija) ad libitum, izņemot eksperimentālo iestatījumu laikā. Katrai atsevišķai uzvedības pārbaudei, kā arī opioīdu peptīdu analīzei tika izmantotas jaunas peles. Eksperimentus apstiprināja Zviedrijas Dzīvnieku pētniecības ētikas komiteja Gēteborgā. Visi centieni tika veikti, lai samazinātu dzīvnieku ciešanas un samazinātu izmantoto dzīvnieku skaitu. Visiem dzīvniekiem tika atļauts aklimatizēties vismaz vienu nedēļu pirms eksperimentu sākuma.

Morfīna hidrohlorīds (Apoteksbolaget Sahlgrenska slimnīca; Gēteborga, Zviedrija) tika izšķīdināts šķīdinātājā (0.9% nātrija hlorīda šķīdums) un ievadīts ip ar 20 mg / kg 10 devu pirms eksperimenta uzsākšanas. Šī deva tika izvēlēta, jo mazāka deva (10 mg / kg, ip) neizraisīja lokomotorisko stimulāciju mūsu pelēs (dati nav parādīti). Iepriekš izvēlēta JMV6 deva (2959 mg / kg, ip) (sintezēta institūtā Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR5247, CNRS, Montpellier 1 un 2 universitātēs, Francijā), tika noteikta iepriekš un ir ietekme uz lokomotorisko aktivitāti, dopamīna izdalīšanos un kondicionētu vietu izvēli pelēm (Jerlhag et al., 1). JMV2009 tika izšķīdināts transportlīdzeklī (nātrija hlorīda šķīdums 2959%) un vienmēr tika ievadīts divdesmit minūtes pirms morfīna iedarbības vai dekapitācijas opioīdu peptīdu līmeņa analīzei. Izvēlētā JMV0.9 deva neietekmēja peles bruto uzvedību nevienā eksperimentā. Par uzvedības testiem JMV2959 tika ievadīts akūti, jo mūsu caurlaidīgie pētījumi liecina, ka viena JMV2959 injekcija vājina zāļu izraisīto atlīdzību (pārskatīšanai skatīt Engel un Jerlhag (2959)). JMV2014 tika ievadīts subhroniski piecas nākamās dienas opioīdu peptīdu analīzei, lai palielinātu iespēju noteikt spēcīgu efektu. Turklāt, atkārtoti ievadot injekcijas, jūs izvairīsieties no akūtas injekcijas spriedzes iespējamās sajaukšanas ar peptīdiem. Acilēts žurku ghrelīns (Bionuclear; Bromma, Zviedrija) tika atšķaidīts ar nātrija hlorīda 2959% saturu un izvēlētajai ghrelīna devai (0.9 mg / kg, ip) iepriekš tika pierādīts, ka tas izraisa atalgojumu pelēm (Jerlhag, 0.33). Visām narkotiku problēmām tika izmantots līdzsvarots dizains.

Iepriekšējie pētījumi liecina, ka morfīns izraisa kustību stimulāciju grauzējiem (Wise un Bozarth, 1987). Lokomotīvās aktivitātes tika reģistrētas astoņās skaņas vājinātās, vēdināmās un vājā apgaismojuma kastēs (420 × 420 × 200 mm, Kungsbacka mät- och reglerteknik AB; Fjärås, Zviedrija). Piecas ar piecām fotoelementu sijām rindas grīdas līmenī, radot fotoelementu noteikšanu, ļāva datorizētai sistēmai reģistrēt peles aktivitāti. Lokomotīvās aktivitātes tika definētas kā uzkrāto jauno fotoelementu staru skaits, kas pārtraukti 60 minūšu laikā. Visos eksperimentos pelēm tika atļauts pieradināt lokomotorās aktivitātes kastē vienu stundu pirms zāļu lietošanas. Nebija atšķirību starp pieradumu nevienā no ārstēšanas grupām (dati nav parādīti).

Pirmajā eksperimentu sērijā tika pētīta JMV2959 (6 mg / kg, ip) ietekme uz morfīna izraisītu (20 mg / kg, ip) lokomotorisko stimulāciju. JMV2959 tika ievadīts 20 min pirms morfīna un aktivitātes reģistrācija sākās desmit minūtes pēc pēdējās injekcijas. Katra pele saņēma vienu ārstēšanas kombināciju (nesējs / nesējs, JMV2959 / nesējs, morfīns / nesējs vai JMV2959 / morfīns; n= 8 katrā ārstēšanas kombinācijā) un tika pakļauts tikai vienam eksperimentam.

Lai novērtētu JMV2959 ietekmi uz morfīna atalgojošo ietekmi jaunās pelēs, kondicionētu vietu preferenču testus veica pelēm, kā aprakstīts iepriekš (Jerlhag, 2008). Īsi sakot, tika izmantota divkameru CPP iekārta ar 45 lx apgaismojumu un atšķirīgiem vizuāliem un taustes signāliem. Vienu nodalījumu noteica melnbaltas svītrainas sienas un tumšs laminēts grīdas segums, bet otram bija balta krāsota koka grīda un koka tekstūra. Procedūra sastāvēja no iepriekšējas kondicionēšanas (1 diena), kondicionēšanas (dienas 2 – 5) un pēc kondicionēšanas (6 diena). Iepriekšējas sagatavošanas laikā pelēm tika ievadīts ip ar transportlīdzekli un tika ievietots kamerā ar brīvu piekļuvi abiem nodalījumiem 20 min laikā, lai noteiktu sākotnējo vietu (vai sānu) izvēli. Kondicionēšana (20 min sesijas laikā) tika veikta, izmantojot neobjektīvu procedūru, kurā morfīns (20 mg / kg) tika savienots ar vismazāk vēlamo nodalījumu un transportlīdzekli ar vēlamo nodalījumu. Visas peles saņēma vienu morfīna injekciju, kā arī transportlīdzekli katru dienu, un injekcijas tika mainītas no rīta līdz pēcpusdienai līdzsvara projektā. Pēcs kondicionēšanas laikā pelēm (n= 16) injicēja ar JMV2959 (6 mg / kg, ip) vai vienādu tilpumu transportlīdzekļa šķīduma un 20 min vēlāk ievietoja viduslīnijā starp diviem nodalījumiem ar brīvu piekļuvi abiem nodalījumiem 20 min (radot šādas ārstēšanas grupas); Morph-Veh un Morph-JMV2959).

Stāvokļa vietas preference tika aprēķināta kā starpība% no kopējā laika, kas pavadīts zāļu pāra savienojumā (ti. vismazāk vēlams) nodalījums pēc kondicionēšanas un pirms kondicionēšanas.

Ņemot vērā, ka JMV2959 mazina morfīna inducēto lokomotorisko stimulāciju un kondicionētu vietu izvēli pelēm, tika pētīta JMV2959 (6 mg / kg, ip) ietekme uz morfīna izraisītu (20 mg / kg, ip) dopamīna izdalīšanos. in vivo mikrodialīze brīvi kustīgās pelēs. Ekstracelulāro dopamīna līmeņu mērījumiem peles vienpusēji implantēja ar mikrodialīzes zondi, kas novietota kodolā. Tāpēc peles tika anestēzētas ar izoflurānu (Isofluran Baxter; Univentor 400 anestēzijas vienība, Univentor Ldt., Zejtun, Malta), novietotas stereotaksiskajā rāmī (David Kopf Instruments; Tujunga, CA, ASV) un turēja uz apsildes paliktņa, lai novērstu hipotermija. Xylocain adrenalīnu (5 μg / ml; Pfizer Inic; Ņujorka, ASV) izmantoja kā vietējo anestēziju un karprofēnu (Rimadyl, 5 mg / kg ip) (Astra Zeneca; Gēteborga, Zviedrija), lai mazinātu jebkādas iespējamās sāpes. Galvaskauss tika atklāts, un viens caurums zondei un viens enkura skrūvei tika izurbts. Zonde pēc nejaušības principa tika mainīta vai nu pa kreisi, vai pa labi. Kodolam accumbens (Franklin un Paxinos, 1.5) tika izmantotas 0.7 mm koordinātas, kas atrodas priekšpusē bregmai, ± 4.7 sānu virzienā uz viduslīniju un 1997 mm zem smadzeņu virsmas. Zondes eksponētais dialīzes membrānas gals (20,000 kDa ar 310 / 220 μm, HOSPAL, Gambro, Lund, Zviedrija) bija 1 mm. Visas zondes tika ķirurģiski implantētas divas dienas pirms eksperimenta. Pēc operācijas peles tika turētas atsevišķos sprostos līdz testa dienai (Macrolon III).

Testa dienā zonde tika pievienota mikroperfūzijas sūknim (U-864 šļirces sūknim; AgnThós AB) un perfūzēta ar Ringera šķīdumu ar ātrumu 1.5 μl / min. Pēc vienas stundas pieradināšanas pie mikrodialīzes komplekta katru 20 min. Tika savākti perfūzijas paraugi. Sākotnējais dopamīna līmenis tika definēts kā trīs secīgu paraugu vidējais lielums pirms pirmās zāļu / transportlīdzekļa izsaukšanas, un kāpuma dopamīna pieaugums tika aprēķināts kā procentuālais pieaugums no sākotnējā. Pēc sākotnējiem paraugiem (–40 min līdz 0 min), pelēm tika injicēts JMV2959 vai nesējs (0 min), kam sekoja morfīns vai transportlīdzekļa injekcija (20 min). Pēc šo zāļu ievadīšanas tika savākti vēl astoņi 20 min paraugi. Kopīgi šādas ārstēšanas grupas (n= 8 katrā grupā): transportlīdzeklis - transportlīdzeklis (Veh – Veh), transportlīdzeklis – morfīns (Veh – Morph), JMV2959-transportlīdzeklis (JMV2959-Veh) un JMV2959-morfīns (JMV2959-Morph).

Dopamīna līmenis dializātos tika noteikts ar HPLC, izmantojot elektrochemisku noteikšanu. Sūknis (Gyncotec P580A; Kovalent AB; V. Frölunda, Zviedrija), jonu apmaiņas kolonna (2.0 × 100 mm, Prodigy 3 μm SA; Skandinaviska GeneTec AB; Kungsbacka, Zviedrija) un detektors (Antec Decade; Antec Leyden; Zoeterwoude , Nīderlande), kas aprīkoti ar VT-03 plūsmas šūnu (Antec Leyden). Mobilā fāze (pH 5.6), kas sastāv no sulfonskābes 10 mM, citronskābes 200 mM, nātrija citrāts 200 mM, 10% EDTA, 30% MeOH, tika vakuumā filtrēta, izmantojot 0.2 μm membrānas filtru (GH Polypro; PALL Gelman Laboratory; Lund, Zviedrija). Pārvietojamā fāze tika piegādāta ar plūsmas ātrumu 0.2 ml / min, nokļūstot degaseerā (Kovalent AB), un analizējamā viela tika oksidēta pie + 0.4 V.

Pēc mikrodialīzes eksperimentu pabeigšanas peles tika atdalītas, un zondes tika perfūzētas ar pontamīna zilā zilā krāsā 6BX, lai atvieglotu zondes lokalizāciju. Smadzenes tika uzstādītas uz vibroslices ierīces (752 M Vibroslice; Campden Instruments Ltd., Loughborough, Apvienotā Karaliste) un sagrieztas 50 μm sekcijās. Zondes atrašanās vietu noteica ar bruto novērošanu, izmantojot gaismas mikroskopu. Pārbaudīja precīzu zondes atrašanās vietu (Franklin un Paxinos, 1997), un statistiskajā analīzē tika izmantotas tikai peles ar pareiziem izvietojumiem.

Tika pētīta JMV2959 iedarbība uz MEAP, DynB un LeuArg līmeņiem atalgojuma jomās. Peles injicēja ar JMV2959 (6 mg / kg, ip, n= 8) vai vienāds transportlīdzekļa tilpums (ip, n= 8) piecām nākamajām dienām. 20 min pēc pēdējās injekcijas peles tika nogalinātas un no šīm pelēm tika savāktas smadzenes. Atsevišķas peles injicēja ar ghrelīnu (0.33 mg / kg, ip, \ t n= 8) vai vienāds transportlīdzekļa tilpums (ip, n= 8) piecām nākamajām dienām. Piecas minūtes pēc pēdējās injekcijas peles tika nogalinātas, un no šīm pelēm tika savāktas smadzenes. Amygdala, striatum, prefrontālā garoza, VTA un hipokamps tika ātri sadalīti un uzreiz tika uzlikti uz sausā ledus un pēc tam uzglabāti –80 ° C temperatūrā līdz turpmākai apstrādei.

Homogenizācijas un peptīdu ekstrakcijas procedūras tika ievērotas standarta procedūrā, kas iepriekš aprakstīta detalizēti (Nylander et al., 1997). Īsāk sakot, saldētiem paraugiem pievienoja karstu (95 ° C) etiķskābi (1 M). Paraugus sildīja ūdens vannā (95 ° C) 5 min, atdzesēja uz ledus un pēc tam homogenizēja ar Branson Sonifier (Danbury, CT, ASV). Homogenāts tika atkārtoti uzsildīts 95 ° C temperatūrā 5 min un atdzesēts uz ledus pirms centrifugēšanas 15 min 4 ° C un 12,074 ×g Beckman GS-15R centrifūgā (Fullerton, CA, ASV). Ekstrakti tika tālāk attīrīti saskaņā ar iepriekš aprakstīto procedūru (Nylander et al., 1997). Tika savāktas divas frakcijas: III frakcija (Leu-Arg un MEAP) un frakcija V (DynB). Paraugus žāvēja vakuuma centrifugā (Savant SpeedVac Plus SC210A; Thermo Scientific Inc., Waltham, MA ASV) un uzglabāja saldētavā (-20 ° C) līdz peptīdu analīzei.

DynB, LeuArg un MEAP imunoreaktīvie (ir) līmeņi tika analizēti ar labi noskaidrotiem radioimunoanalīzēm, un protokoli ir sīki aprakstīti citur (Nylander et al., 1997). DynB testā brīvo un antivielu saistīto peptīdu atdalīšanai izmantoja kazu anti-trušu IgG (GARGG; Bachem, Bubendorf, Šveice). Dyn antiserums (113 +) tika izmantots 1: 600000 galīgajā atšķaidījumā. Krustotā reakcija ar lielo Dyn bija 100% un ar DynB (1-29) 1%. Netika novērota krusteniska reakcija ar citiem opioīdu peptīdiem. LeuArg un MEAP testos tika izmantota ogles suspensija, lai atdalītu brīvu un saistītu peptīdu. LeuArg antiserumam (91: 6D +, galīgais atšķaidījums 1: 60000) krusteniskā reakcija bija mazāka par 0.01% Leu-enkefalīnam un MEAP, 0.02% DynB, 0.04% DynA un 0.08% alfa-neoendorfīnam. 90: 3 1 galīgajā atšķaidījumā tika izmantots MEAP antiserums 160: 000D (II). Krusteniska reaktivitāte ar Met-enkefalīnu, Met-enkefalīns-Arg⁶, Met-enkefalīns-Arg⁶Gly⁷Leu⁸, Leu-enkefalīns un Leu-enkefalīns-Arg⁶ bija <0.1%

Kopumā galvenā mijiedarbība tika konstatēta lokomotorās aktivitātes iedarbībai pelēm pēc morfīna (20 mg / kg) un JMV2959 (6 mg / kg) (F (3,27) = 7.409) sistemātiskas ievadīšanas. P= 0.0009; n= 8 transportlīdzekļiem, JMV2959-Veh, JMV2959-Morph un n= 7 attiecībā uz Veh-Morph). Kā parādīts Skaitlis 1A, posthoc analīze atklāja, ka pirmapstrāde ar vienu JMV2959 injekciju (P<0.001) ievērojami vājināja morfīna izraisīto kustību stimulāciju (P<0.01 Transportlīdzeklis – transportlīdzeklis vs Veh – Morph). Izvēlētajai JMV2959 devai nebija ietekmes uz lokomotorisko aktivitāti salīdzinājumā ar transportlīdzekļu terapiju (\ tP> 0.05). Lokomotorās aktivitātes atbildes reakcijās ar transportlīdzekļiem ārstētām pelēm un ar JMV2959-morhpīnu ārstētām pelēm nebija atšķirības (P> 0.05).

  

Skaitlis 1

GHS-R1A antagonists JMV2959 mazina morfīna izraisīto lokomotorisko stimulāciju, dopamīna atbrīvošanos un kondicionētu vietu izvēli pelēm. (A) Morfīna izraisīta (20 mg / kg ip) lokomotorā stimulācija tika samazināta ar vienu JMV2959 injekciju (6 mg / kg ip).n= 7 – 8 katrā grupā; **P<0.01, ***P<0.001 vienvirziena ANOVA, kam seko Bonferroni post-hoc tests). (B) Morfīna izraisīta (20 mg / kg ip) stāvokļa izvēle (CPP) tika vājināta ar akūtu vienreizēju JMV2959 (6 mg / kg ip) injekciju pelēm (n= 8 katrā grupā, *P<0.05, nesaistīts t-tests). (C) Vispirms mēs parādījām morfīna (20 mg / kg ip) nozīmīgu efektu, lai palielinātu dopamīna izdalīšanos salīdzinājumā ar nesēju ārstēšanu (laika intervāls 40–180 min (P<0.001), transportlīdzeklis – transportlīdzeklis vs Veh – Morph). Kā parādīts (C), pirmapstrāde ar JMV2959 (6 mg / kg ip) mazināja morfīna izraisīto dopamīna izdalīšanās palielināšanos, salīdzinot ar transportlīdzekļa pirmapstrādi laika intervālā 40 – 100 un 140 – 180 min (^##P<0.01, ^{# # #}P <0.001, JMV2959-Morph salīdzinājumā ar Veh – Morph apstrādi). Izvēlētajai JMV2959 devai nebija nozīmīgas ietekmes uz akumbālā dopamīna izdalīšanos, salīdzinot ar nesēju ārstēšanu jebkurā laika intervālā (P> 0.05, transportlīdzeklis – transportlīdzeklis vs JMV2959-Veh). JMV2959 samazināja, bet ne pilnībā bloķēja, morfīna izraisīto akumbālās dopamīna izdalīšanos laika intervālā 60-140 (*P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, JMV2959-Morph salīdzinājumā ar Veh – Morph apstrādi). Bultas apzīmē JMV2959, transportlīdzekļa un morfīna injekcijas laika punktus. Dati analizēti ar divvirzienu ANOVA, kam sekoja Bonferroni post-hoc tests (n= 8 katrā grupā). Veh-veh (Square), Veh-Morph (rombs), JMV2959-Veh (Trīsstūris), JMV2959-Morph (aplis). Visas vērtības ir vidējais ± SEM.

Skatīt lielu attēlu | Skatīt Hi-Res attēlu | Lejupielādēt PowerPoint Slide

Morfīna izraisīto (20 mg / kg) (Morph – Veh) labvēlīgo vietu preferenci nozīmīgi mazināja akūta vienreizēja JMV2959 (6 mg / kg) (Morph-JMV2959) injekcija pēc kondicionēšanas dienas (P= 0.025, n= 8 katrā grupā; Skaitlis 1B).

Dopamīna mērenie mikrodialīzes mērījumi pelēm atklāja vispārēju ārstēšanas galveno iedarbību (\ tF(3,33) = 24.15, P<0.0001), laiks F(11,308) = 7.05, P<0.0001) un ārstēšanas × laika mijiedarbība (F(11,308) = 8.63, P<0.0001) (Skaitlis 1C; n= 8 katrā grupā). Morfīns palielināja dopamīna izdalīšanos, salīdzinot ar transportlīdzekļu ārstēšanu laika intervālā 40 – 180 min (P<0.001). Kā parādīts Skaitlis 1C šī iedarbība tika samazināta, iepriekš apstrādājot ar JMV2959 laika intervālā 40 – 80 (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) un 160–180 min (P<0.001). JMV2959 samazināja, bet pilnībā nenobloķēja morfīna izraisīto accumbal dopamīna izdalīšanos, jo starp transportlīdzekļa ārstēšanu un JMV2959-morfīna terapiju laika intervālā 60–80 bija atšķirība (P<0.01), 100 (P<0.001), 140 (P<0.01) un 160 min (P<0.05). Izvēlētajai JMV2959 devai nebija nozīmīgas ietekmes uz akumālā dopamīna izdalīšanos, salīdzinot ar nesēju ārstēšanu jebkurā laika intervālā (P> 0.05).

Šis pētījums vēl vairāk apstiprina hipotēzi, ka oreksigēna peptīda fizioloģiskā loma ietver atlīdzības regulējumu. Patiešām, mēs parādījām, ka GHS-R1A antagonista perifēra ievadīšana mazina morfīna spēju izraisīt lokomotorisko stimulāciju, palielina dopamīna līmeni NAc un inducē kondicionētu vietu izvēli pelēm. Mēs arī konstatējām, ka subhroniska JMV2959, bet ne ghrelin, ārstēšana palielināja MEAP audu līmeni VTA, DynB hippocampus un LeuArg in striatum, sniedzot pirmo pierādījumu, ka ghrelin signalizācijas spēja regulēt pastiprinājumu var ietvert opioīdu peptīdus. .

Šeit sniegtie dati parāda, ka GHS-R1A antagonisms ietekmē morfīna spēju aktivizēt pelēm mezolimbisko dopamīna sistēmu. Saskaņā ar konstatējumiem, kas parāda, ka JMV2959 bloķē morfīna spēju palielināt akumbāla dopamīna ārpusšūnu līmeni un izraisīt stereotipisku uzvedību žurkām (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Atbalstot, centrālā grelīna ievadīšana palielina lūzuma punktu, bet ne aktīvo sviru nospiešanu skaitu progresīvās attiecības pastiprināšanas grafikā žurkām, kuras pašas lieto heroīnu (Maric et al., 2012). Apgalvojumu, ka grelīna signalizācija ir atkarība no narkotikām, papildus apstiprina atklājumi, kas parāda, ka JMV2959 samazina žurku uzņemšanu, kā arī motivāciju lietot alkoholu un ka amfetamīna, kokaīna un nikotīna izraisīto atlīdzību bloķē GHS-R1A antagonisms grauzējiem ( pārskatu sk. Engel un Jerlhag (2014)) un ka ar grelīnu saistītu gēnu polimorfismi ir saistīti ar alkohola, smēķēšanas un amfetamīna uzņemšanu (pārskatu sk. Engel un Jerlhag (2014)).

Pašreizējie konstatējumi ar paaugstinātu opioīdu peptīdu līmeni striatumā, VTA un hipokampā pēc subhroniskas JMV2959 terapijas liecina, ka pirmoreiz mijiedarbība starp opioīdu peptīdiem un ghrelin signalizāciju. Endogēnie opioīdi ir saistīti ar ne tikai opioīdu izraisītiem, bet arī citiem ļaunprātīgas izmantošanas un dabisku atlīdzību izraisošiem efektiem un adaptīviem procesiem, kas novēroti pēc atkārtotas zāļu iedarbības (Trigo et al., 2010, Van Ree et al., 2000). Patiešām mesolimbiskās dopamīna sistēmas darbību regulē endogēni opioīdi gan VTA, gan NAc līmenī (Hirose et al., 2005, Spanagel et al., 1992), un ir pierādīts, ka darbības ir tiešas vai netiešas izmantojot citus raidītājus (Charbogne et al., 2014).

Mēs atklājām, ka ārstēšana ar subhronisku JMV2959 palielināja MEAP līmeni VTA. MEAP iegūst tikai no proenkefalīna un tika izmantots kā proenkefalīna peptīdu marķieris, kas galvenokārt aktivizē δ-opioīdu receptorus. Mēs pieņēmām, ka endogēnā MEAP līmeņa paaugstināšanās VTA pēc JMV2959 terapijas var novērst morfīna spēju samazināt mezobakciju dopamīna neironu (Johnson un North, 1992) GABA inhibīciju, kas var veicināt samazinātu morfīna izraisīto ietekmi, kas novērota pēc JMV2959. Atbalstoši, GHS-R1A atrodas uz GABAergic interneuroniem VTA (Abizaid et al., 2006). Turklāt iepriekšējie pētījumi parādīja, ka JMV2959 infūzija ar VTA, \ t līdz nezināmi mehānismi, vājina ghrelin inducēto atlīdzību (Jerlhag et al., 2011), kā arī ghrelin-mediētā saharozes uzņemšana grauzējiem (Skibicka et al., 2011), liecina, ka ventral tegmental GHS-R1A ir svarīgi atlīdzības regulēšanai. Šāda apgalvojuma atbalstam ir konstatējumi, kas liecina, ka citi badu regulējošie peptīdi, piemēram, galanīns un oreksīns, morfīna atalgojošās īpašības ir starpniecību. līdz vietējie mehānismi VTA ietvaros (Narita et al., 2006, Richardson un Aston-Jones, 2012).

In striatum, mēs noskaidrojām, ka sub-hronisks JMV2959 palielināja Ir līmeni LeuArg, liekot domāt, ka JMV2959 spēja vājināt morfīna izraisīto nosacīto vietu preferences, dopamīna atbrīvošanu un lokomotorā stimulācija ir atkarīga vismaz daļēji par pastiprinātu accumbal δ- opioīdu receptoru aktivitāte. Paaugstināts LeuArg līmenis var rasties, palielinoties dinorfīna peptīdu enzīmu konversijai uz enkefalīniem vai pastiprinātajā Dia izdalīšanā NAc kā atbildes reakcijai uz paaugstinātu dopamīnu, kam seko sadalīšanās LeuArg. Lai gan iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka mesolimbiskās dopamīna sistēmas darbība ir regulēta līdz κ-opioīdu receptorus NAc (Spanagel et al., 1992) un endogēno κ-opioīdu receptoros nodrošina tonizējošu dopamīna neirotransmisijas nomākšanu un mazina kokaīna izraisīto dopamīna izdalīšanos NAc (Chefer et al., 2005), mēs liecina, ka JMV2959 maina ir DynB līmeņus striatumā. Tādēļ ir jāveic papildu pētījumi par prodinorfīna peptīdiem, lai izskaidrotu mijiedarbību starp GHS-R1A antagonismu un dinamorfīniem.

Šajā pētījumā mēs arī parādījām, ka ārstēšana ar JMV2959 ievērojami palielina hipokampusa DynB līmeni. Ghrelin palielina atmiņas konsolidāciju, kā arī dendritisko mugurkaula veidošanos, rada ilgstošu potenciālu un veicina atmiņas atvieglošanu līdz hippokampāls GHS-R1A grauzējiem (Carlini et al., 2010, Diano et al., 2006). Turklāt GHS-R1A knockout pelēm ir uzlabota telpiskā atmiņa Morris ūdens labirints testā un traucēta konteksta atmiņa bailes kondicionēšanas paradigmā, salīdzinot ar savvaļas tipa pelēm (Albarran-Zeckler et al., 2012). Dynorphin peptīdi, tostarp DynB, ir bagāti ar hipokampu, un tie vājina ilgtermiņa potenciālu (Chavkin et al., 1985, Wagner et al., 1993), kā arī traucē telpisko mācīšanos žurkām (Sandin et al., 1998). Tāpēc mēs pieņemam, ka GHR-R1A antagonists var mazināt atalgojuma atmiņu, inhibējot hipokampu ilgstošu potenciālu. līdz DynB aktivizēšana. Kopumā šie dati nodrošina jaunu potenciālu mehānismu, ar kuru JMV2959 līdz opioīdu peptīdi var mainīt pastiprinājumu. Tomēr opioīdu receptori ir plaši izplatīti smadzenēs, kas liecina, ka citas jomas, kas nav iekļautas šajā pētījumā, var būt iesaistītas GHS-R1A regulētā morfīna izraisītā atlīdzībā. Piemēram, α-opioīdu receptoru antagonista centrālā vai intra-hipotalāma ievadīšana samazina ghrelin izraisītu pārtikas uzņemšanu, kā arī sūkšanas sūkni saharozei (Romero-Pico et al., 2013). Tomēr turpmākajos pētījumos ir jāprecizē opioīdu peptīdu nozīme citās jomās.

Endogēnie μ-receptoru ligandi, endomorfīni un beta-endorfīns šeit netika analizēti, tāpēc mēs nevaram izslēgt JMV2959 iespējamo ietekmi uz šiem peptīdiem. Patiešām, morfīna atalgojuma īpašības ietver μ-opioīdu receptorus VTA, kā arī NAc (Hirose et al., 2005, Johnson un North, 1992, Murakawa et al., 2004, Yoshida et al., 1999). Tomēr μ-receptoru antagonists nemazina ghrelin izraisīto pārtikas devu (Naleid et al., 2005), ne ghrelin izraisītu lokomotorisko stimulāciju un dumbamīna atbrīvošanos (Jerlhag et al., 2011), kas nozīmē, ka GHSR 1A antagonists, kas regulē pastiprinājumu, neietver μ-receptorus. No otras puses, JMV2959 ietekmēja opioīdu peptīdus, kas iegūti no proenkefalīna un prodinorfīna, parādot, ka tie var būt iesaistīti GHSR-1A antagonistu izraisītajās iedarbībās.

Lai gan iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka sistēmiskā ghrelīna ievadīšana rada atlīdzību (Jerlhag, 2008), kā arī uzlabo atkarību izraisošo narkotiku atalgojuma īpašības (pārskatīšanai skatīt Engel un Jerlhag (2014)), mēs šeit parādām, ka subhroniska ghrelīna terapija nemainījās opioīdu peptīdu audu līmeņi jebkurā no pētītajām atalgojuma jomām. Sistēmiskā ghrelīna ievadīšana iedarbojas uz c-fos ekspresiju hipotalāmajās zonās, bet ne mezolimbiskajās un hipokampu zonās (Pirnik et al., 2011), un fluorescenti iezīmēta ghrelīna saistīšanās attiecas tikai uz hipotalāmu regulējošiem neironiem (Schaeffer et al., 2013 ). Kopā ar konstatējumiem, kas liecina, ka ghrelin, izņemot hipotalāmu daudzumus, nevar konstatēt dziļākajās smadzeņu zonās pēc perifēra ghrelīna ievadīšanas (Furness et al., 2011, Grouselle et al., 2008, Sakata et al., 2009, ), palielina iespēju, ka sistēmiskā ghrelin aktivizē atalgojuma sistēmu līdz netiešiem mehānismiem, kas nav atkarīgi no endogēniem opioīdiem. Atbalstot ghrelin inducētu dumbamīna dopamīna izdalīšanos, nepieciešama augšupejoša oreksigēna hipotalāma signalizācija (Cone et al., 2014), perifēro ghrelīna ievadīšana nemaina alkohola lietošanu pelēm (Lyons et al., 2008) un ka perifērās grelīna neitralizācija nemazina alkoholu -inducēts atalgojums pelēm vai alkohola lietošana žurkām (Jerlhag et al., presē). Jāapsver iespēja, ka ghrelin subhroniska lietošana palielina opioīdu peptīdu audu līmeni, tomēr tas ir detalizēti jāizpēta turpmākajos pētījumos.

Atkarību izraisošo medikamentu spēja izraisīt stimulāciju, dopamīna izdalīšanos un nosacītas vietas izvēli ir cieši saistīta ar atkarību izraisošo medikamentu pastiprinošajām īpašībām, un šie parametri tiek uzskatīti par atkarības procesa daļu (Wise, 2004). Ņemot vērā, ka mēs šeit konstatējām, ka JMV2959 mazina šos atalgojuma parametrus pelēm, mēs pieņemam, ka GHS-R1A var būt nozīmīga atkarības procesos un ka šajos procesos ir iesaistīti endogēni opioīdi. Kopā šie dati liecina, ka GHS-R1A antagonisti ir jāprecizē kā atkarība no zāļu atkarības.

JE un EJ atbalsta Zviedrijas Pētniecības padome (granta Nr. 2011-4646, 2009-2782 un 2011-4819), Zviedrijas smadzeņu fonds, LUA / ALF (granta Nr. 148251) no Sahlgrenskas Universitātes slimnīcas, Alkohols Zviedrijas alkohola mazumtirdzniecības monopola pētniecības padome un Adlerbertskas, Fredrikas un Ingrīda Thuringas, Tore Nilsson, Längmanska, Torsten un Ragnar Söderberg, Wilhelm un Martina Lundgren, NovoNordisk, Knut un Alice Wallenberg, Magnus Bergvall, Anérs, Jeansons, Åke Wiberg pamati , Zviedrijas Medicīnas biedrība, Zviedrijas Medicīnas pētījumu biedrība un Gēteborgas Psihiatrijas pētījumu fonds. Zviedrijas Alkohola mazumtirdzniecības monopola Alkohola izpētes padome un Zviedrijas Pētniecības padome (K2012-61X-22090-01-3) atbalstīja IN. Finansējuma avotiem nebija nekādas nozīmes pētījuma projektā, datu vākšanā, analīzē un interpretācijā, ziņojuma sagatavošanā un lēmumā par datu publicēšanu.