Proc Natl Acad Sci US A. 2014 Apr 22; 111 (16): E1648 – E1655.
Publicēts tiešsaistē 2014 Mar 24. doi: 10.1073 / pnas.1315542111
PMCID: PMC4000785
Neirozinātnes
John W. Muschamp,a,1 Jonathan A. Hollander,b Jennifer L. Thompson,c Džordžs Vorens,b Linda C. Hassinger,a Sara Onvani,a Theodore M. Kamenecka,b Stephanie L. Borgland,c Paul J. Kenny,b un William A. Carlezon, Jr.a
Skatīt “Dinorfīna un hipokretīna cotransmisijas pretējas lomas pret atalgojumu un motivāciju”111. sējumā 5765. lpp.
Skatīt “PNAS Plus nozīmīguma paziņojumi”111. sējumā 5771. lpp.
Šis raksts ir bijis citēts citiem PMC izstrādājumiem.
Nozīme
Hipokretīns (oreksīns) un dinorfīns ir neiromodulatori, kuriem ir svarīga loma ietekmes un motivācijas regulēšanā. Orexīns ir kritisks atalgojumam un ir saistīts ar narkotiku meklēšanu, savukārt dinamorfs mediē negatīvu noskaņojumu un ir iesaistīts depresīvās valstīs. Ņemot vērā šīs pretējās sekas, ziņojumi par to, ka abi peptīdi ir izteikti tajos pašos neironos un ir korelēti, ir pretpasākumi. Šeit mēs parādām, ka oreksīns un dinorfīns tiek ekspresēti vienā un tajā pašā sinaptiskajā vezikulā un ka šī kolokalizācija būtiski ietekmē atalgojumu, zāļu lietošanu un impulsīvo uzvedību. Fakts, ka oreksīns aizsprosto dinorfīna depresijas līdzīgu iedarbību, būtiski maina oreksīna funkcionālo lomu smadzenēs.
Anotācija
Hipocretīns (oreksīns) un dinamorfīns ir neiropeptīdi ar pretēju rīcību uz motivētu uzvedību. Okseksīns ir iesaistīts arousal un atalgojuma situācijās, savukārt dinorfīns ir iesaistīts depresīvās valstīs. Mēs parādām, ka, neskatoties uz pretējām darbībām, šie peptīdi tiek iepakoti tādās pašās sinaptiskās vezikulās hipotalāmā. Oreksīna funkcijas pārtraukšana mazina sānu hipotalāma (LH) stimulēšanas pozitīvo ietekmi, novērš kokaīna izraisītu impulsivitāti un samazina kokaīna pašpārvaldi. Vienlaicīga dinorfīna funkcijas pārtraukšana novērš šīs uzvedības izmaiņas. Mēs arī parādām, ka oreksīnam un dinorfīnam ir pretējas darbības attiecībā uz ventrālās tegmentālās zonas (VTA) dopamīna neironu uzbudināmību, kas ir nozīmīgs oreksīna saturošu neironu mērķis, un ka intra-VTA oreksīna antagonisms izraisa kokaīna pašregulācijas un LH pašstimulācijas samazināšanos dinorfīnu antagonismu. Mūsu atklājumi identificē unikālu šūnu procesu, ar kura palīdzību oreksīns var apturēt korelēta dinorfīna atalgojuma sliekšņa paaugstinošo iedarbību un tādējādi rīkoties pieļaujamā veidā, lai atvieglotu atlīdzību.
Orexin veicina uzbudinājumu (1), un tas ir saistīts ar pārtikas apbalvošanas ietekmi (\ t2, 3), seksuālā uzvedība (4) un narkotiku lietošana (5, 6). To ražo galvenokārt hipotalāmā (7) un iedarbojas uz oreksīna 1 receptoriem (OX1R) un OX2R (pazīstams arī kā Hcrt-R1 un Hcrt-R2), kas izpaužas daudzās smadzeņu zonās, ieskaitot vidus smadzeņu ventrālo tegmentālo zonu (VTA).8). Savukārt Dynorphin ir izteikts plaši, veicina depresijas līdzīgu uzvedību, un tai ir būtiska nozīme stresa averso seku starpā.9, 10). Kappa-opioīdu receptoru (KORs), receptoru, kuros darbojas dinorfīnu darbība, aktivizēšana (11), var mazināt ļaunprātīgas izmantošanas narkotiku \ t12, 13) ar darbībām, kas, vismaz daļēji, ir saistītas ar vidus smadzeņu dopamīna (DA) sistēmām (\ t14, 15). Neskatoties uz šķietami pretējo ietekmi uz motivāciju, ir pierādījumi, ka šie peptīdi var darboties vienlaicīgi; piemēram, gan oreksīns, gan dinorfīns tiek atbrīvoti hipotalāma elektriskās stimulācijas laikā (16). Tāpat kā DA neironi, oreksīna un dinamorfīna neironi palielina savu aktivitāti, reaģējot uz stimuliem, piemēram, atlīdzību un stresa faktoriem (17). Šī neiropeptīda koekspresijas modeļa funkcionālā ietekme uz smadzeņu atalgojuma sistēmām, un, savukārt, uz motivētu uzvedību ir slikti saprotama, jo oreksīns un dinorfīns tradicionāli netiek pētīti kopā. Ņemot vērā to pretējo ietekmi uz uzvedību un neironu fizioloģiju, pētot vienu pašu, var pieļaut, ka dominējošais stāvoklis viena peptīda iedarbībā uz otru var izraisīt ļoti atšķirīgus uzvedības fenotipus ar jutīgumu. Piemēram, dominējošā oreksīna signalizācija var veicināt jutīguma jutīgumu un atlīdzības meklēšanu, turpretim dominējošā dinamorfīna signalizācija var samazināt jutīguma jutīgumu un anergiju. Tā kā šīm valstīm ir liela nozīme psihiskām slimībām, piemēram, atkarībai un depresijai, kur atlīdzības apstrāde ir traucēta, mēs centāmies pārbaudīt, kā šie peptīdi atsevišķi un kombinācijā ietekmē motivētu uzvedību un VTA DA ķēdi, kas tos regulē. Lai to izdarītu, mēs izmantojām EM, lai raksturotu peptīdu kolokalizāciju mikrostrukturālā līmenī, kā arī uzvedības paņēmienus, kas novērtē smadzeņu atlīdzības shēmu, impulsu kontroles un narkotiku lietošanas jutību pēc oreksīna - dinorfīna sistēmas farmakoloģiskās vai ģenētiskās manipulācijas. Turklāt mēs izmantojām elektrofizioloģiju, lai noteiktu, kā vienlaicīga oreksīna un dinorfīna klātbūtne atsevišķi vai kombinācijā ar antagonistiem to receptoros ietekmē VTA DA neironu uzbudināmību.
rezultāti
Orexin un Dynorphin ir cotransmiteri.
Mēs apstiprinājām oreksīna un dinamorfīna ekspresiju vienā un tajā pašā peles sānu, perifornālās un dorsomedijas hipotalāmu neironā, izmantojot fluorescences mikroskopu (18) (Fig. 1A). Citu smadzeņu ķēdēs ir aprakstīti neironi, kas izpauž vairākus raidītājus, un tie var būt neironu pamats filtrēšanas mehānismiem, ar kuriem izpaužas koekspressēti neirotransmiteri, izmantojot diferenciālos degšanas ātrumus (19). Izmantojot EM, mēs atklājām, ka oreksīns un dinorfīns tiek kolokalizēti tajās pašās sinaptiskās vezikulās. Lielākā daļa saslimšanas gadījumu tika novēroti bezmielinizētos, varikozos aksonos procesos, kur imūnās iezīmes tika konstatētas vezikulās vai to tuvumā. Neironu šūnu ķermeņos nozīmīga marķēšana bija saistīta ar Golgi kompleksu, turpretim blakus esošajos kodolos netika konstatēts neviens no tiem.Fig. 1 B un C). Dendriti saturēja arī abiem peptīdiem saistītu vezikulu marķējumu, kas liecina par šo raidītāju iespējamu dendritisku izdalīšanos. Neliels skaits mikrostrukturālu profilu, kas uztverti aksonu termināli ar marķējumu abiem peptīdiem, kas atrodas lielos (N100 nm) vezikulos, kas atrodas ārpus asimetrisko sinapšu atbrīvošanas zonas (Fig. 1 B un C), sniedzot atbalstu secinājumam, ka oreksīna un dinamorfīns darbojas kā cotransmiteri un ka normālos apstākļos tie tiek atbrīvoti kopā, nevis diferencēti kā šūnu šaušanas frekvences funkcija.
Okseksīna blokādes atalgojuma sliekšņa paaugstināšanas efekts tiek mainīts ar Dynorphin blokādi.
Lai noskaidrotu šī unikālā raidītāja izteiksmes modeļa funkcionālo nozīmi, mēs pārbaudījām, vai traucējumi oreksīna un dinamorfīna signalizācijā var ietekmēt sarežģītu uzvedību, kas atspoguļo normālu un novirzošu motivāciju. C57BL / 6 pelēm, kas apmācītas veikt intrakraniālu pašstimulāciju (ICSS), kas pastiprināta ar sānu hipotalāmu (LH) stimulāciju (20), OX blokāde1Rs ar N- (2-metil-6-benzoksazolil) -N-1,5-naftiridin-4-il urīnvielu (SB334867) gaismas fāzes laikā izraisīja atkarību no devas robežvērtībām (Fig. 2A; vienvirziena atkārtoti pasākumi ANOVA devai: F3,12 = 4.44, P <0.02). ICSS sliekšņu palielināšanās atspoguļo ārstēšanas izraisītu stimulācijas atalgojošās ietekmes samazināšanos, depresijai līdzīgu pazīmi, kas norāda uz samazinātu jutību pret atlīdzību (20). Šis efekts nebija saistīts ar sedāciju vai citiem nespecifiskiem uzvedības traucējumiem, jo ICSS atbildes reakcijas rādītāji netika ietekmēti.Fig. 2B; vienvirziena atkārtoti pasākumi ANOVA devai: F3,24 = 0.33, P > 0.80).
SB334867 izraisīto atalgojuma sliekšņu paaugstināšanās tika novērsta, iepriekš apstrādājot ar nor-binaltorfimīnu (norBNI) [divvirzienu atkārtoti pasākumi ANOVA medikamentam (starp subjektu faktoru) × deva SB (subjektiem faktoru) mijiedarbībā: F3,24 = 3.98, P <0.01], kas ilgstoši bloķē dinamorfīnu darbību KOR (10). Šie dati liecina, ka oreksīna signalizācijas zudums atklāj latentās antirefardās sekas korelēts dinorfīns. NorBNI lietošana vien nemazināja atalgojuma sliekšņus. Lai gan šī iedarbība var būt saistīta ar unikālu norBNI un citu prototipisku KOR antagonistu farmakodinamiku (10), tas var arī norādīt, ka procesos, kas modulē smadzeņu atalgojuma shēmu aktivitāti vai ir tikai oreksīna toni (bez korelēta dinorfīna iedarbības), ir lieks, ka nepietiek, lai nodotu atdeves signālu no stimulācijas vietas sānu hipotalāmā. Sākotnēji šie secinājumi var šķist pretrunā ar citu darbu, kas pārbaudīja SB334867 par ICSS slieksni tumšās fāzes laikā (21). Tomēr ir ievērojams pierādījums tam, ka oreksīna funkcijas samazināšanās var radīt sekas, kas atkarīgas no tā, vai dzīvnieki tiek pārbaudīti to gaišajā vai tumšajā fāzē. Piemēram, pārtika un ūdens saglabā atalgojuma efektu orexin KO pelēm, kad testēšana notiek tumšās fāzes laikā, bet ne gaismas fāzē (22), laiks, kad mēs veicām visas mūsu uzvedības pārbaudes.
Lai lokalizētu sistēmiskās SB334867 un norBNI ievadīšanas ietekmi uz ICSS, atsevišķa peles grupa tika implantēta ar LH stimulējošiem elektrodiem un VTA vadu kanāliem. SB334867 mikroinfūzija VTA izraisīja ievērojamu atalgojuma sliekšņa pieaugumu, kas liecina par mazāku atalgojuma jutību. Lai gan vien VTA norBNI vien neietekmēja ICSS sliekšņus, tas bloķēja turpmākās SB334867 infūzijas sliekšņa paaugstināšanas efektu (Fig. 2C; vienvirziena atkārtoti pasākumi ANOVA narkotikām: F3,9 = 10.98, P <0.01). Lai gan zāļu intrakraniālās infūzijas parasti nedaudz samazināja atbildes reakcijas maksimālo ātrumu, salīdzinot ar sistēmiskām zāļu injekcijām, šie efekti nesasniedza statistisku nozīmīgumu (Fig. 2D; vienvirziena atkārtoti pasākumi ANOVA narkotikām: F3,9 = 1.03, P = 0.112).
Impulsiju regulē Oxxin un Dynorphin Transmission.
Impulsiju raksturo trūkumi, kas kavē atalgojuma meklēšanu, un augsts impulsivitātes līmenis ir daudzu psihisku slimību kopīga iezīme (23). Arī ļaunprātīgas izmantošanas narkotikas, tostarp kokaīns, var izraisīt impulsa paaugstināšanos, kas, domājams, veicinās atkarības attīstību.24). Ņemot vērā korelēta oreksīna un dinorfīna galveno lomu, kontrolējot jutīgumu pret LH stimulācijas pozitīvo ietekmi ICSS testā, mēs pieņēmām, ka mijiedarbība starp šiem diviem neiropeptīdiem var ietekmēt sākotnējo impulsivitāti un kokaīna izraisīto deficītu šajā uzvedībā. Impulsiju var izmērīt grauzējiem, mērot priekšlaicīgas reakcijas 5 izvēles sērijas reakcijas laika uzdevumā (5-CSRTT) (25), dzīvnieku modelis, kas ir analogs nepārtrauktas veiktspējas testam, ko izmanto, lai pētītu cilvēka uzmanību. Priekšlaicīga reakcija šajā testā parasti ir zema normālos apstākļos, un to pastiprina zāles, kas paaugstina DA transmisiju (26). Mēs izmantojām 5-CSRTT, lai pārbaudītu orexīna-dinorfīna sistēmas ieguldījumu spontānas un kokaīna izraisītas impulsīvas uzvedības jomā. Lietojot atsevišķi, SB334867 vēl vairāk samazināja jau mazo spontāno priekšlaicīgo reakciju skaitu (Fig. 3A; F3,21 = 4.89, P <0.01). Šie samazinājumi notika, ja nebija ietekmes uz reakcijas precizitāti (F3,21 = 1.45, P = 0.25), granulu atgūšanas latentums (F3,21 = 0.91, P = 0.44), vai stimulu izmēģinājumu skaits pabeigts (F3,21 = 1.46, P = 0.25), norādot, ka tie nav saistīti ar pazeminātu modrību vai motoru spējām. Tomēr norBNI administrācija mainīja SB334867 ietekmi uz priekšlaicīgu reaģēšanu (Fig. 3B; F3,18 = 0.45, P = 0.71), kas liecina, ka nepanesama dinorfīna transmisija ir būtiska šo pretpulsīvo iedarbību ietekmējoša. NorBNI, lietojot atsevišķi vai kombinācijā ar SB334867, neietekmēja atbildes precizitātes mērījumus (F3,18 = 0.66, P > 0.58), latentums (F3,18 = 3.09, P > 0.06) vai pabeigto stimulu izmēģinājumu skaits (F3,18 = 2.38, P > 0.10). Pirmapstrāde ar SB334867 arī novērsa kokaīna izraisīto priekšlaicīgu reakciju divkāršu pieaugumu (Fig. 3C; F6,24 = 5.84, P <0.01). Šie dati sniedz pierādījumus tam, ka oreksīna neirotransmisija var regulēt impulsīvu uzvedību gan sākotnējā, gan kokaīna stimulētajā stāvoklī ar dinamorfīnu jutīgā veidā.
Dynorphin mediē samazinātu kokainu pašpārvaldi OX1R-Null pelēm.
Neaizsargātība pret atkarību ir ievērojami palielinājusies impulsīviem indivīdiem, un tiek uzskatīts, ka kokaīna izraisītais impulsivitātes pieaugums veicinās atkarības rašanos (23, 27). Turklāt oreksīna pārraide un dinorfīna pārraide ir neatkarīgi ietekmējusi kokaīna un citu ļaunprātīgas lietošanas narkotiku atalgojuma iedarbību (28-32). Mēs pieņēmām, ka mijiedarbība starp oreksīna un dinorfīna pārraidi var tieši kontrolēt zāļu lietošanu. Lai izpētītu šo iespēju, pētījām iv kokaīna pašpārvaldi ģenētiski modificētās pelēs, kurām nebija OX1R (OX1R- / -). Šīs genotipa pelēm ir ievērojami mazāka kokaīna lietošana plašā devu diapazonā (0.1 – 1 mg / kg infūzijas veidā), bet tie nemainīgi reaģē uz pārtikas atlīdzību, izmantojot tos pašus stiprinājuma grafikus (33), kas liecina, ka kokaīna lietošanas samazināšana nav sekundāra ietekme uz uzvedības rādītāju deficītu. Turklāt OX1R- / - aptuveni trīs sākotnējās kokaīna lietošanas sesijās pelēm ir normāls kokaīna pašpārvaldes ātrums, bet pēc tam strauji parādās kokaīna lietošanas samazināšanās (33). Mēs apstiprinājām šo fenotipu ar devu 0.3 mg / kg uz infūziju, norādot, ka signalizācija notiek ar OX1Rs ir izšķiroša loma kokaīna pašpārvaldes uzvedības veidošanā un uzturēšanā [Fig. 4; divvirzienu atkārtoti pasākumi ANOVA, genotips (starp subjektu faktoru) × zāļu ārstēšana (subjektiem): F1,12 = 12.91, P <0.01]. Tāpat kā priekšapstrāde ar norBNI atjaunoja normālu ICSS un impulsīvu uzvedību pelēm, kurām tika piešķirts SB334867, tas daļēji atjaunoja arī kokaīna pašpārvaldi OX1R- / - pelēm, sniedzot unikālu piemēru, kurā uzvedības deficīts, ko rada ģenētiskā ablācija viena neirotransmitera sistēmas funkcijā, tiek izglābts ar citas blokādes palīdzību. Šie rezultāti liecina, ka OX1R- / - pelēm, dinorfīna neparedzētās darbības mazina kokaīna atalgojošās īpašības un tādējādi samazina zāļu pašpārvaldi. Interesanti, ka OX1R+ / + (kontroles) pelēm, norBNI negaidīti samazināja kokaīna pašpārvaldi. Viens no iespējamiem šī efekta izskaidrojumiem ir tāds, ka dinorfīnam, ko atbrīvo neoreksīna neironi, piemēram, tā sauktie „tiešie” striatonigrālie vidējie smadzeņu neironi, ir pretēja ietekme uz kokaīna uzņemšanu un faktiski var veicināt kokaīna ietekmi. Divu KOR-populāciju esamība ar pretēju lomu kokaīna atalgojumā arī izskaidro, kāpēc norBNI tikai daļēji mainīja kokaīna lietošanas uzvedības deficītu, kas atklāts OX1R KO peles. Alternatīvi, KOR antagonisms samazina kokaīna izņemšanas aversu vai stresu.34), kas veicina narkotiku lietošanas modeļus (\ t17). Neskatoties uz to, šie dati liecina, ka dinorfīna depresīvais efekts dominē, ja nav bojāta oreksīna signalizācija, kas samazina kokaīna ietekmi, bet oreksīna ietekme atvieglo kokaīna ietekmi, pagarinot to ilgumu, ja nav dinorfīna signalizācija.
Oxxin un Dynorphin var izlīdzināt pretestību VTA DA neironiem.
Smadzeņu struktūras, kas saņem ieeju no hipotalāma oreksīna un dinorfīna neironiem, potenciāli var tikt pakļautas abiem peptīdiem, un tādējādi tām ir pretēja ietekme uz neironu uzbudināmību (35, 36). Cik lielā mērā viena peptīda ietekme dominē pār citiem, iespējams, ir atkarīga no daudziem faktoriem, ieskaitot katra peptīda relatīvo pārpilnību, ekstracelulārās telpas ilgmūžību un receptoru ekspresiju dažādās mērķa neironu populācijās, kā arī mijiedarbību starp receptoriem un to intracelulārajiem signalizācijas mehānismiem postsinaptiskajās šūnās. Impulsa un kokaīna atlīdzību vismaz daļēji regulē DA neironi VTA (26), kas ir nozīmīgs hipotalāmu oreksīnu saturošu šūnu mērķis (\ t37). Turklāt oreksīna infūzija VTA uzlabo zāļu meklēšanu (6). Lai novērtētu katra peptīda relatīvo ieguldījumu VTA neironu aktivitātē, tika veikti elektrofizioloģiski ieraksti no DA šūnām C57BL / 6 peles smadzeņu šķēlītēs, kas pakļautas oreksīnam un dinorfīnam atsevišķi vai kopā. Kā paredzēts, oreksīns, lietojot atsevišķi, bija vienmērīgi eksitējošs, savukārt dinamorfīns izraisīja tikai inhibējošu iedarbību (Fig. 5 A un B; F2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). Reģistrēto DA neironu populācijā lielākā daļa reaģēja uz abu peptīdu piesātinātajām koncentrācijām, lai gan neliela minoritāte bija selektīvi atsaucīga tikai uz oreksīnu vai dinorfīnu (Fig. 5B). Ievērojami, ja abi peptīdi tika pielietoti divējādiem jutīgiem neironiem (n = 10), netika novērota neto ietekme uz \ tFig. 5A), kas liek domāt, ka katra peptīda pretējās sekas piesātinātās koncentrācijās efektīvi atceļ viena otru pēc korelīzes. Neskatoties uz oreksīna klātbūtni, četri no 10 neironiem parādīja preferenciālu dinorfīna inhibīciju, turpretim vienu šūnu oreksīns galvenokārt ierosināja (> 1.5 reizes vairāk), neskatoties uz dinorfīna klātbūtni (Fig. 5 A un C). Kopumā, lai gan vairāk šūnu reaģēja uz oreksīnu nekā dinorfīns, tām šūnām, kas bija jutīgas pret abiem peptīdiem, netika mainītas šaušanas ātrums, kad tika pielietots oreksīns un dinorfīns, kas liecina, ka katra peptīda pretējā ietekme ir līdzsvarota VTA DA kopā. pētīti neironi.
Lai vēl vairāk izskaidrotu iespējamo oreksīna – dinorfīna mijiedarbību VTA DA neironiem, kas bija jutīgi pret oreksīnu un dinorfīnu, mēs, alternatīvi, mēģinājām palielināt vannā pielietotā dinorfīna inhibējošo iedarbību, ārstējot ar SB334867 (S2A; F5,25 = 2.13, P <0.01) vai pastiprināt vannā uzklāta oreksīna ierosmes efektu, apstrādājot ar norBNI (S2B; F3,27 = 5.48, P <0.01). Abos eksperimentos OX1R un KOR blokāde neizdevās radīt šīs sekas, liecinot, ka SB334867 un norBNI neietekmē ietekmi, izmantojot nespecifiskas darbības. Vēl svarīgāk, šie dati liecina, ka katra peptīda tonis in vitro ir nepietiekams, lai to ietekmētu mazu molekulu antagonistu, piemēram, SB334867 un norBNI. Šis konstatējums atbilst iepriekšējam darbam, kas liecina, ka lielo, peptīdu saturošo vezikulu eksocitoze parasti notiek tikai ar augstu noturīgu sadedzināšanas frekvenci, kas parasti nesatur šķēles preparātus (38).
Lai pārliecinātos, ka norBNI neietekmēja uzvedību, izmantojot “off-target” darbības tieši pie OX1Rs, mēs tālāk izpētījām šī antagonista ietekmi uz OX1R signalizācija. Konkrētāk, mēs izmantojām fluorometriskās attēlveidošanas plāksnes lasītāja (FLIPR) testu, lai noteiktu vannā izmantoto oreksīna A, SB334867 vai norBNI spēju inducēt intracelulāras kalcija pārejas kultivētās CHO šūnās, kas ekspresē cilvēka OX.1Rs. Lai gan oreksīna A radīja paredzamo intracelulārā kalcija palielināšanos (EC50 = 0.01 μM) un SB334867 atkarībā no devas mazināja šo efektu (EC50 = 0.035 μM), norBNI neizraisīja nekādu ietekmi uz sākotnējo vai oreksīna A izraisīto intracelulārā kalcija pieaugumu. Tas liek domāt, ka norBNI ietekme uz VTA DA neironu fizioloģiju ir tikai ar ierosinātajiem KOR signālierīces mehānismiem, un medikamentam nav tiešas ietekmes uz OX.1R (39) (S3 A-C).
Oxxin – Dynorphin mijiedarbība VTA regulē kokaīna pašpārvaldi.
Mūsu elektrofizioloģijas pētījumi parāda, ka dinamiskā mijiedarbība starp oreksīnu un dinamorfīnu regulē VTA DA aktivitāti un ka VTA neironi, iespējams, kalpo kā galvenais substrāts orexin-dynorphin sistēmas iedarbībai uz motivētu uzvedību. Lai pārbaudītu šo hipotēzi tieši, mēs pārbaudījām SB334867 intravenozās infūzijas ietekmi uz iv kokaīna devu žurkām. Salīdzinot ar VTA iekšējo infūziju, VTA SB334867 iekšējais vīruss izraisīja ievērojamu kokaīna devas samazinājumu, ko bloķēja norBNI (Fig. 6; vienvirziena ANOVA: F3,24 = 11.56, P <0.01), kas liek domāt, ka neieņemta dinamorfīna darbība šajā smadzeņu zonā vājina kokaīna atlīdzību. Šie rezultāti, šķiet, ir pretrunā tiem, kas ir pierādījuši VTA iekšējās SB334867 neesamību kokaīna pašpārvaldē ar zemas piepūles fiksētas attiecības 1 (FR1) pastiprināšanas grafikiem (40). Tomēr vairāki ziņojumi liecina, ka, palielinoties uzdevumam, SB334867 efektīvāk samazina narkotiku lietošanu (2, 33). Tā kā šajā eksperimentā žurkas veica lielāku FR5 grafiku, šie rezultāti atbilst šai literatūrai. Šie dati sniedz tiešus pierādījumus tam, ka oreksīna un dinamorfīna pretstatā VTA DA neironu fizioloģijai var būt nozīmīga ietekme uz atalgojumu balstītu uzvedību.
diskusija
Mēs ziņojam, ka oreksīns un dinorfīns, neiropeptīdi, kas var radīt pretēju ietekmi uz motivāciju, atrodami tajās pašās sinaptiskās vezikulās. Konstatēts, ka šie neiropeptīdi ir kopēti un varbūt ir korelēti tādos pašos fizioloģiskos apstākļos (16) ir tālejošas sekas, jo tas rada iespēju, ka šis process notiek arī sistēmās, kas tradicionāli tiek konceptualizētas galvenokārt atkarībā no atsevišķiem raidītājiem. Mēs arī parādām, ka oreksīns, signalizācija caur OX1Rs mazina tā transmodera dinamorfīna galvenās funkcionālās un uzvedības sekas. Orexin-dynorphin neironi izpaužas kā tiešā agrā gēna c-Fos paaugstināts līmenis, reaģējot uz atalgojumu un atalgojuma prognozējošām norādēm (4, 6, 22), kas norāda uz augstu neironu aktivācijas līmeni, kas veicina neiropeptīdu izdalīšanos. Pēc tam mēs sniedzam pierādījumus tam, ka oreksīna korelease var apturēt dinamorfīna ietekmi uz motivētu uzvedību, izmantojot tās darbības DA neironiem VTA. Oreksīna blokāde var izraisīt dinorfīna vai KOR agonista līdzīgu iedarbību uz ICSS un ar kokaīnu saistītu uzvedību, kas ir pretrunā ar KOR antagonismu (13, 41, 42). Iepriekšējie pētījumi par katru no šiem peptīdiem izolēti apstiprina šos secinājumus. Oreksīna tieša infūzija VTA atjauno zāļu meklēšanu (6), bet KOR agonistu infūzija ar VTA rada depresijas līdzīgu efektu, piemēram, disforiju (43). Mēs hipotētiski, ka oreksīns parasti darbojas kopā ar eksitējošām atlīdzības reakcijām uz VTA [piemēram, glutamāts no prefronta garozas un citām struktūrām (44, 45)] lai pārvarētu dinamorfīna un lokālās GABA transmisijas inhibējošo ietekmi uz DA neironiem, veicinot priekšdziedzera DA izdalīšanos, kas saistīta ar atalgojumu un motivētu uzvedību.
Ir svarīgi uzsvērt, ka, lai gan šķiet, ka oreksīna transmisijas palielināšana spēj kompensēt KOR aktivācijas depresīvo ietekmi, KOR antagonisms nerada tikai savstarpēju efektu (paaugstināta atalgojuma funkcija). Mēs pieņēmām, ka tas daļēji var būt saistīts ar dažādiem SB334867 un norBNI farmakodinamiskajiem un farmakokinētiskajiem profiliem. Bijusī narkotika rāda klasisku aktivitāti un a t1/2 no ∼24 min (46), bet pēdējās pēdējās injekcijas rada funkcionālu antagonismu pret KOR, kas ilgst vairākas nedēļas (\ t10). Turklāt prototipiski KOR antagonisti, piemēram, norBNI, ir "aizspriedumi agonisti", kas vienlaicīgi var aktivizēt citus signalizācijas ceļus, piemēram, c-Jun kināzi (39), tādējādi radot akūtas sekas vai kompensējošus pielāgojumus, kas ir pietiekami, lai kompensētu augstākos oreksīna signāla līmeņus. Galīgie secinājumi par to, vai šīs blakusparādības ir savstarpējas, gaida īstermiņa darbības KOR antagonistu attīstību, kas nereaģē uz citiem intracelulāriem signālu ceļiem; šādi savienojumi pašlaik nav pieejami (10). Turklāt pašreizējie eksperimenti koncentrējas uz VTA un nevar izslēgt iespēju, ka oreksīna un dinorfīna ietekme citās struktūrās var nebūt dichomoma vai ka VTA ir vienīgā struktūra, kurā oreksīna – dinorfīna mijiedarbība ietekmē uzvedību. Piemēram, ir pierādījumi, ka oreksīns ir iesaistīts stresa reakcijā un var piedalīties kopā ar dinamorfīnu, lai radītu negatīvas emocionālas valstis, kas pavada narkotiku lietošanas pārtraukšanu (40, 47). Ir skaidrs, ka ir nepieciešami papildu darbi, lai noteiktu apstākļus, anatomiskos lokus un mehānismus, kas, šķiet, pieļauj saskaņotu vai pretēju orexīna un dinamorfīna darbību dažādās uzvedības paradigmās.
Mūsu dati arī atbalsta viedokli, ka abu peptīdu darbība ir modulējoša, jo vai nu OX traucējumi1Rs vai KOR samazināja, bet neatcēla pārbaudīto uzvedību. Piemēram, ICSS uzvedība saglabājās pat pie lielām SB334867 devām, pierādot, ka tikai oreksīns nav pietiekams, lai ņemtu vērā LH stimulācijas atalgojošo ietekmi. Viena iespēja ir tā, ka, lai gan oreksīns nevar uzturēt ICSS uzvedību, tas mazina tās traucējumus, kompensējot dinorfīna darbību. Oreksīna un dinamorfīna atšķirīga ekspresija ar vienu un to pašu hipotalāmu neironu populāciju var būt mehānisms, ar ko DA neironu uzbudināmība VTA var tikt regulēta ar ārējiem stimuliem, kā arī ar pieredzi vai slimībām. Kā vienu piemēru oreksīna mRNS līmenis tiek samazināts pēc hroniska sociāla stresa veida, kas izraisa depresijas līdzīgu fenotipu pelēm (48) un žurkām (49). Šis depresīvais līdzīgais fenotips varētu būt daļēji saistīts ar oreksīna ekspresijas samazināšanos, kas padara dinorfīna iedarbību vienādi. Šiem konstatējumiem ir nozīmīga ietekme uz orexīna un dinamorfīna datu interpretāciju atsevišķi, jo pielāgojumus vienā sistēmā var līdzsvarot ar pielāgojumiem otrā. Tie var arī pievienot elastību terapeitisko stratēģiju izstrādē, lai ārstētu traucējumus, sākot no narkolepsijas līdz garastāvokļa un impulsu kontroles traucējumiem. Piemēram, unikāla pieeja stāvokļu ārstēšanai, ko izraisa oreksīna disregulācija, varētu būt manipulēt ar KOR funkciju, un, otrādi, traucējumi, ko raksturo mainīta dinamorfīna funkcija, var tikt kompensēti ar oreksīna sistēmu manipulācijām.
Materiāli un metodes
Dzīvnieki.
Pieaugušo vīriešu C57BL / 6J pelēm (8 wk vecumā; Džeksona laboratorija), ko izmantoja EM eksperimentos, tika grupēti grupās (trīs līdz pieci katram būrim); tos, kas izmantoti ICSS, novietoja atsevišķi pēc operācijas. 350-CSRTT un kokaīna pašregulācijas eksperimentos tika izmantoti pieaugušie tēviņi (5 g) Sprague – Dawley (Charles River Laboratories) un tika izmitināti četrās grupās. Pieaugušo vīriešu C57BL / 6J peles (pēcdzemdību dienas 19 – 21), ko izmantoja elektrofizioloģijas eksperimentos, tika grupētas grupās (trīs līdz pieci katram būrim). OX1- / - pelēm un to OX1+ / + Littermates (6 wk vecums), ko izmantoja pašpārvaldes pētījumiem, ieguva no Jackson Laboratory un tika pārsniegtas vairāk nekā septiņas paaudzes uz C57BL / 6 pelēm. Šīs peles tika izmitinātas grupā (divas katrā būrī). Visi dzīvnieki tika turēti temperatūrā kontrolētos apstākļos uz 12-h gaismas / tumšā cikla, un uzvedības pārbaude notika 4 – 5 h gaismas ciklā; pārtika un ūdens bija pieejami ad libitum, ja vien nav norādīts citādi. Procedūras tika veiktas saskaņā ar Valsts veselības institūtiem Laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmata (50) un apstiprināja McLean slimnīcas institucionālās dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejas, Britu Kolumbijas Universitāte un Scripps Florida.
Imūnhistoķīmija un mikroskopija.
Arexin A vai prodynorphin fluorescences un sudraba pastiprinātā zelta imitācija tika veikta ar alternatīvām peles smadzeņu sekcijām saskaņā ar iepriekš paziņotajām procedūrām (51) un apstrādāti pēc standarta EM protokoliem. Pēc tam izlases veidā tika atlasīti imunoloģiski iezīmēto audu nepārklātie reģioni, un tie tika fotografēti daļiņu kvantitatīvai noteikšanai, izmantojot ImageJ programmatūru (Nacionālie veselības institūti) (SI materiāli un metodes, imūnhistoķīmija un mikroskopija).
Elektrofizioloģija.
Patch pipetes (3 – 5 MΩ) tika piepildītas ar 143 mM kālija glikonātu, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (ar pH 7.2) un 270-280 mM mOsmol. Dati tika iegūti 20 kHz un filtrēti 2 kHz, izmantojot pClamp 10.0 programmatūru (Molecular Devices). Pēc visu šūnu konfigurācijas iegūšanas šūnas tika spriegotas pie -70 mV, un tika konstatēta virkne sprieguma soļu (250 ms no –60 līdz −130 mV 10-mV soļos).Ih) strāvas. Ih tika noteikta kā strāvas maiņa starp ∼30 ms un 248 ms pēc sprieguma posma piemērošanas. VTA DA neironu raksturīgā aktivitāte tika mērīta strāvas skavas režīmā. Eksperimenti sākās, kad tika sasniegts stabils bāzes līnijas šaušanas ātrums; substrāti tika uzklāti uz 5 min un pēc tam izskaloti ar mākslīgo smadzeņu šķidrumu. Datu analīzei tika izmantots katra 3 min segmenta pēdējais 5 min. Dynorphin A (1-17; 200 nM) un oreksīns A (100 nM) tika iegūti no amerikāņu peptīda un izšķīdināti destilētā ūdenī. Iepriekš tika konstatēts, ka šīs koncentrācijas iedarbojas uz VTA šūnu aktivitāti (5, 52). Tiorphan (1 μM) un bestatīns (10 μM) tika iegūti no Sigma-Aldrich, izšķīdināti destilētā ūdenī, un tika uzklāti kopā ar dinorfīnu A (SI materiāli un metodes, elektrofizioloģija).
FLIPR tests.
OX1R aktivitāte tika novērtēta, mērot intracelulāro kalcija līmeni, izmantojot FLIPR testu, kā aprakstīts iepriekš (53) (SI materiāli un metodes, fluorometriskās attēlveidošanas plāksnes lasītāja tests).
ICSS.
Peles tika implantētas ar monopolāriem stimulējošiem elektrodiem vai kanāniem (PlasticsOne) ketamīna / ksilazīna (attiecīgi 80 un 10 mg / kg, ip; Sigma) veidā, kas stereotaktiski tika novirzīti uz LH (18) un / vai pretējā VTA [no bregmas: anteroposterior (AP), -3.2 mm; mediolaterālā (ML), −0.5 mm; dorsoventrāls (DV), –4.7 mm no dura]. Pēc 7-d atveseļošanās perioda pelēm tika apmācīts reaģēt uz smadzeņu stimulāciju, kā aprakstīts iepriekš (18). Zemākā frekvence, kas atbalstīja atbildes reakciju (slieksni), tika aprēķināta, izmantojot vismazāko kvadrātu rindu no labākās piemērotības analīzes. Kad peles izpildīja ICSS sliekšņu stabilitātes kritērijus (± 10% 5 secīgās dienās), tika novērtētas zāļu terapijas iedarbības. SB334867 (Scripps Florida) vai DMSO šķīdinātājs tika ievadīts alternatīvās dienās, izmantojot Hamilton šļirci (0.1 mL / kg ip), un sliekšņi tika nekavējoties kvantitatīvi pārbaudīti 15 min. NorBNI (10 mg / kg ip; Sigma) tika ievadīts sāls šķīdumā (10 mL / kg) 48 h pirms ICSS testēšanas sākuma.
5-CSRTT.
Žurkas bija ierobežotas ar pārtiku (85% no brīvā barošanas svara) un apmācītas ar datoru kontrolētām operācijas kamerām, kas novietotas ventilējamos, skaņu mazinošos skapjos (Med Associates) un 5-CSRTT procedūrās, kas veiktas, kā aprakstīts (25). SB334867 (DMSO, 0.1 mL / kg) un / vai kokaīnu (sāls šķīdumā, 1 mL / kg; Sigma) ievadīja ar ip injekciju 10 min pirms testēšanas, tāpat kā citos eksperimentos, un norBNI tika ievadīts vismaz 48 h pirms testēšanas sākums (SI materiāli un metodes, 5-Sērijas reakcijas laika uzdevuma izvēle).
IV Kokaīna pašpārvalde.
Žurkas un peles tika anestēzētas ar izoflurāna (1 – 3% tilp. Tilp.) Skābekļa tvaika maisījumu un ķirurģiski sagatavotas ar Silastic (VWR Scientific) katetriem žugulā vēnā saskaņā ar noteiktajām procedūrām (54). Tūlīt pēc katetra implantēšanas žurkām VTA tika implantētas abpusējas nerūsējošā tērauda vadošās kanulas (23 gabarīts, 17 mm garas) (no bregmas: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, −7.5 mm no duras ). Testēšana ar SB334867 vai norBNI 60 minūšu ikdienas sesijās tika veikta pēc stabilas kokaīna devas sasniegšanas (atbildes reakcijas 20 dienu laikā pēc kārtas bija <3%; SI materiāli un metodes, IV kokaīna pašpārvalde).
Statistika.
Dati ir izteikti kā vidējais ± SEM. ICSS eksperimentiem izmantoja divvirzienu atkārtotus pasākumus ANOVA, lai salīdzinātu līdzekļus starp SB334867 apstrādātiem un norBNI + SB334867 ārstētiem apstākļiem. Lai salīdzinātu līdzekļus SB334867 un norBNI + SB334867 apstākļos, tika izmantoti vienvirziena atkārtojumi ANOVA ar Newman-Keuls post hoc testiem. Visu 5CSRTT eksperimentu salīdzināšanai tika izmantoti arī vienvirziena atkārtoti pasākumi ANOVA un Newman – Keuls testi. Divvirzienu atkārtoti pasākumi ANOVA tika izmantoti, lai salīdzinātu līdzekļus starp ārstēšanas grupām kokaīna pašregulācijas eksperimentos ar OX1R KO peles. Vienvirziena atkārtoti pasākumi ANOVA un Newman – Keuls testi tika izmantoti, lai salīdzinātu vidējās atbildes uz oreksīnu un dinamorfīnu ar VTA DA neironiem. Vienreizēji atkārtoti pasākumi ANOVA un Newman-Keuls testi tika izmantoti arī, lai salīdzinātu kokaīna devu ar žurkām, kas ārstētas ar SB334867 un norBNI. Atšķirības tika uzskatītas par nozīmīgām, ja P <0.05.
Pateicības
Mēs pateicamies Dr. Garrett Fitzmaurice par noderīgiem komentāriem par manuskriptu un Miranda S. Gallo un Melissa Chen par palīdzību datu vākšanā. Šo darbu atbalstīja Nacionālie Veselības stipendiju institūti F32-DA026250 un K99-DA031767 (uz JWM), F32-DA024932 un K99-DA031222 (uz JAH), R01-DA023915 (līdz PJK) un R01-MH063266 (uz WAC) ) un Dabas zinātņu un inženierzinātņu pētniecības padomes atklāšanas dotācija (SLB).
Zemsvītras piezīmes
Interešu konflikta paziņojums: WAC ir patents (ASV patents 6,528,518; Cesionārs: McLean slimnīca), kas saistīts ar kappa-opioīdu antagonistu lietošanu depresijas traucējumu ārstēšanai. Visi pārējie autori neizsaka nekādas konkurējošas finanšu intereses.
Šis raksts ir PNAS Direct iesniegšana.
Skatiet komentāru lapā 5765.
Šajā rakstā ir pieejama papildinformācija tiešsaistē www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.
Atsauces