Nat Neurosci. 2011 janvāris; 14 (1): 22 – 24.
Publicēts tiešsaistē 2010 December 5. doi: 10.1038 / nn.2703
Anotācija
Dorsālā striatum ir svarīga loma narkomānijas attīstībā; tomēr precīza izpratne par striatopallīds (netiešs) un striatonigrāls (tiešais) ceļš neironi, kas regulē uzvedību, joprojām ir nenozīmīgi.
Izmantojot jaunu pieeju, kas balstās uz inženierijas izstrādāta GPCR (hM4D), mēs parādījām, ka hM aktivizācija4D receptoriem ar klozapīnuN-oksīda (CNO) spēcīgi samazināta striatāla neironu uzbudināmība. Kad hM4D receptorus selektīvi ekspresēja vai nu tiešos, vai netiešos ceļojuma neironos žurkām, CNO nemainīja akūtas lokomotoriskās atbildes reakciju uz amfetamīnu, bet izmainīja uzvedības plastiskumu, kas saistīts ar atkārtotu ārstēšanu. Konkrēti, īslaicīgi traucējot striatopallīda neironu aktivitāti, tika veicināta uzvedības sensibilizācija, bet striatonigrālo neironu uzbudināmības samazināšanās traucēja tās noturību. Šie rezultāti liecina, ka akūtu zāļu iedarbību var analizēt no uzvedības pielāgojumiem, kas saistīti ar atkārtotu zāļu iedarbību, un izceļ šīs pieejas lietderību, lai dekonstruētu neironu ceļa devas uzvedībai, piemēram, sensibilizācijai.
Neskatoties uz narkotiku atkarības negatīvajām sekām, psihostimulantu lietošana un ļaunprātīga izmantošana joprojām ir izplatīta. Progresēšana no sākotnējās zāļu iedarbības uz regulāru lietošanu un galu galā līdz kompulsīvai, ierastai uzvedībai un inhibējošas kontroles zaudēšanai ietver vairākas molekulārās adaptācijas diskrētām neirocircēm.1,2,3. Skriemelis ir identificēts kā galvenā vieta daudzām uzvedības un neirobioloģiskām adaptācijām, kuras, domājams, veido galvenos procesus, kas mediē atkarību1,2,3. Lielākā daļa neironu striatumā (~ 95%) ir GABAerģiski vidēja lieluma projekcijas neironi (MSN) tcepure atšķiras ar savu neiropeptīdu ekspresiju un veido divus galvenos efektīvos ceļus4.
- Striatopallidal MSN satur enkefalīnu (ENK) un veido netiešu ceļu
- tā kā striatonigrāli MSN satur dinorfīnu (DYN) un vielu P un veido tiešo ceļu.
Daudzi konceptuālie modeļi izvirza hipotēzi, ka šīs MSN populācijas pretojas viena otrai gan mehāniski, gan funkcionāli5,6. Tomēr ir maz empīrisku pierādījumu, kas apstiprinātu viņu atšķirīgo lomu uzvedības kontrolē, jo šīs šūnu populācijas ir fiziski sajauktas un morfoloģiski neatšķiramas, padarot selektīvās manipulācijas tehniski neiespējamas.
Lai izpētītu šo striatālo šūnu populāciju lomu uzvedības veidošanā, kas rodas pēc atkārtotas pakļaušanas narkotisko vielu iedarbībai, mēs apvienojām divas jaunas stratēģijas: vīrusu vektorus, kas izmanto vai nu ENK, vai DYN gēna stimulētājus, lai novirzītu transgēna ekspresiju uz striatopallidal vai striatonigral neironiem. attiecīgi un inženierijas GPCR (Gi / o- cilvēka muskuļu muskuss M4 DRAUDS; Dizaineru receptoru, kuru tikai aktivizē dizainera zāles; hM4D)7 ko aktivizē citādi farmakoloģiski inerts ligands, klozapīns-N-oksīds8,9 (CNO; 1a. Att). Pēc ekspresijas kultivētos neironos, CNO ievadīšana stimulē Gi / o-savienots hM4D receptori, tādējādi aktivizējot kālija 3 (Kir3) kanālu iekšēju rektifikāciju, izraisot membrānas hiperpolarizāciju un īslaicīgu neironu apklusināšanu9.
Lai pārbaudītu vīrusu pārnēsātāju šūnu fenotipa specifiskumu, mēs izmantojām divkāršās iezīmes imūnsistēmas fluorescences mikroskopiju pēc vīrusu muguras striatum infūzijas (1), kas izsaka hemaglutinīna marķēto hM4D receptori, kurus kontrolē vai nu ENK veicinātājs (5. LppENK-hM4D) vai DYN veicinātāju (1. lpp.)DYN-hM4D). Mēs noskaidrojām, ka pENK-hM4D ekspresija galvenokārt notika ENK saturošos MSN (90% hemagglutinīna šūnu bija ENK +, 85 no 94; 6% no hemagglutinin šūnām bija viela P +, 4 no 70 šūnām; 1b) tā kā pDYN-hM4D ekspresija galvenokārt notika P vielu saturošos MSN (95% hemagglutinīna šūnu bija viela P +, 109 no 115 šūnām; 5% no hemagglutinīna šūnām bija ENK +, 5 no 97 šūnām; 1i att). Līdzīgi rezultāti tika iegūti pēc veicinātājiem specifisku vīrusu infūzijas, kas ekspresē zaļu fluorescējošu olbaltumvielu (5. lpp.)ENK-GFP un pDYN-GFP; Papildu FIG. 2a un 3a).
Ņemot vērā to, ka striatopallidal MSN galvenokārt projicē uz globusa pallidus ārējo (GPe) un striatonigral MSN galvenokārt projicējas uz activia nigra pars reticulata (SNpr), šajos smadzeņu reģionos mēs izmantojām retrogrāda marķiera Fluoro-Gold injekcijas, kam sekoja divkāršu marķējumu fluorescējoša imūnhistoķīmija. lai apstiprinātu, ka pENK un pDYN vīrusi izraisīja ceļam specifisku infekciju. Mēs novērojām, ka pENK-GFP šūnas, kas ir lokalizētas ar striatālā fluoro-zelta ekspresiju pēc infūzijas GPe, bet ne SNpr (Papildu 2b. Att) tā kā pDYN-GFP šūnas, kas ir lokalizētas ar striatālā fluoro-zelta ekspresiju pēc uzlējumiem SNpr, bet ne GPe (Papildu 3b. Att). Vīrusu vektoru ekspresija nemainīja ENK + vai vielas P + neironu skaitu vīrusu infekcijas reģionā, kas liek domāt, ka šo promotoru izmantošana vīrusu mediētā gēna pārnešanai netraucēja endogēno neiropeptīdu līmeni. Visi šie rezultāti pierāda, ka pENK un pDYN vīrusu pārnēsātāji ekspresē gēnus atbilstoši nodalītās striatālās šūnu populācijās.
Kaut gan hM4Ir pierādīts, ka uz D receptoriem balstītas metodes modulē citu neironu tipu aktivitāti9, nav pētīta viņu spēja ietekmēt striatūriskos neironus. Tāpēc ar hM mēs inficējām striatūras vidēja mēroga neironus4D receptori, kas atrodas herpes simplex vīrusa (HSV) veicinātāja kontrolē, pēc divām dienām sagatavoja muguras striatum korona šķēles un pārbaudīja, kā hM4D-izteikti vidēja spināla striatūra neironi reaģē uz CNO. Mēs novērojām, ka vietēja CNO (10 μM) lietošana izraisīja membrānas potenciāla hiperpolarizāciju (~ 7 mV, sākotnējais membrānas potenciāls tika noregulēts līdz –80 mV; 1c) un samazināja neironu ieejas pretestību pēc CNO pielietošanas (1d. Att), kas liek domāt, ka kālija vadītspēju (ti, Kir3 starpniecību strāvu) aktivizē CNO hM4D receptorus ekspresējošie neironi. Turklāt CNO perfūzija ievērojami samazināja izsaukto darbības potenciālu skaitu hM4D ekspresējošie neironi, bet ne kontroles šūnās, tādējādi efektīvi nomācot vīrusu inficēto neironu funkcionālo izvadi hM ekspresija4Tikai D receptori nemainīja ieejas pretestību (P = 0.84) vai darbības potenciāla šaušana (P = 0.64). (1f. Attēls, g). Kopumā šie dati liecina, ka līdzīgi hipokampu neironiem9, hM4Uz D / CNO balstīta metode var efektīvi samazināt žurku striatūra neironu uzbudināmību.
Kā papildu koncepcijas pierādījumu mēs pārbaudījām, vai hM4D receptori bloķēs neirotransmisiju labi izveidotā shēmā, kur neironu aktivitāti prognozējami izraisa uzvedībai svarīgi stimuli. Attiecīgi ar hM mēs inficējām ventrālā tegmentālā apgabala (VTA) neironus4D receptori, kurus kontrolē HSV promotors, kas spēcīgi izpaužas dopamīna neironos10, un izmantoja ātras skenēšanas ciklisku voltammetriju, lai izmērītu izmaiņas dopamīna izdalīšanās uzkrāšanās kodolā pēc negaidītas pārtikas atlīdzības piegādes11. CNO ievadīšana ievērojami samazināja pārtikas granulu izraisītu dopamīna izdalīšanos uzkrāšanās kodolā, salīdzinot ar nesēju (4). Visbeidzot, mēs pārbaudījām, vai samazinās specifisku neironu šūnu tipu aktivitāte striatumā in vivo varētu mainīt amfetamīna spēju stimulēt Fos ekspresiju. Psihostimulatori, piemēram, amfetamīns, ir spēcīgi c-fos striatumā12 un palielinās c-fos gan striatonigrālajos, gan striatopaldiālajos neironos mūsu eksperimentālajos apstākļos13. Papildus tam, ka tas tiek izmantots kā neironu aktivitātes marķieris, tiek ierosināta arī psihostimulējošafos Tiek uzskatīts, ka tai ir svarīga loma neironu adaptāciju ierosināšanā un uzturēšanā, kas saistīti ar psihomotorisko sensibilizāciju1,14. Mēs noskaidrojām, ka ar CNO starpniecību aktivizēta pENK-hM4D receptori ievērojami samazināja kopējo amfetamīna izraisīto c-Fos šūnu skaitu striatumā (1k. Att un 5a papildinājums). Šis samazinājums notika abos hemaglutinīna pozitīvos neironos (ti, tajos, kas ekspresē hM4D receptori) un hemaglutinīna-negatīvie neironi (ti, tie, kas neizpauž hM4D receptori; 1l att), kas liecina par neironu savstarpējās sarunu efektu starp hM4D ekspresējošie neironi un neinficētie neironi. Ievērojams amfetamīna izraisīto c-Fos šūnu skaita un hemagglutinīna pozitīvo c-Fos šūnu skaita samazinājums tika novērots arī tad, kad hM4D receptori tika aktivizēti tiešā ceļa neironos (1n. Attēls, o un Papildu 5b. Att). Svarīgi ir tas, ka šos efektus neizraisa tikai jauna receptora vīrusu ekspresija, jo abu pENK-hM4D vai lppDYN-hM4D receptoriem bez CNO apstrādes nebija nekādas ietekmes uz amfetamīna izraisīto Fos šūnu skaitu (Papildu vīģes 6 un 7). Tādējādi šie atklājumi pierāda, ka hM aktivizēšana notiek ar CNO starpniecību4D receptori var izraisīt arī neironu aktivitātes samazināšanos, samazinot neirotransmiteru izdalīšanos un vājinot intracelulāro signālu.
Atkārtota atkarību izraisošu zāļu iedarbība var izraisīt progresīvu un pastāvīgu reakcijas uz izturēšanos palielināšanos, ko bieži dēvē par uzvedības sensibilizāciju. Svarīgi ir tas, ka sensibilizācija ietver dažas no tām pašām neironu ķēdēm, kas saistītas ar cilvēku atkarības attīstību3. Šeit mēs izmantojam mūsu jaunos rīkus, lai izpētītu striatūra neironu aktivitātes shēmas specifiskās slāpēšanas ietekmi uz amfetamīna sensibilizācijas attīstību. Mēs izvirzījām hipotēzi, ka tiešajam un netiešajam ceļa neironam ir pretējas lomas, kur striatonigrālie neironi veicina sensibilizāciju un striatopaldiālie neironi nomāc sensibilizāciju atbilstoši viņu konceptuāli piedāvātajām lomām attiecīgi uzvedības aktivizēšanā un kavēšanā.5,6. Attiecīgi mēs pārbaudījām, vai bioķīmiski samazinošā striatopaldaļas neironu neironu uzbudināmība izraisīs sensibilizāciju amfetamīna dozēšanas režīmā, kas izraisa sensibilizācijas sliekšņa līmeni, un vai striatonigrālo neironu neironu uzbudināmības samazināšana novērstu sensibilizāciju protokolā, kas parasti rada spēcīgu sensibilizāciju.
Pirmajā pētījumā mēs izmantojām ārstēšanas shēmu, kas GFP kontrolēs ierosina lokomotoro sensibilizācijas slieksni (četras zāļu iedarbības). Pēc zāļu izdalīšanās perioda tika ievadīta mērena izaicinošā amfetamīna deva (2 mg / kg), ja nenotika CNO izraisīta neironu aktivitātes vājināšanās, lai noteiktu, vai sensibilizācija ir pastāvīga. Ar CNO starpniecību aktivizēta pENK-hM4D receptori amfetamīna terapijas laikā nemainīja akūtu lokomotoro reakciju uz amfetamīnu (2a). Tomēr ar CNO saistītie neironu aktivitātes traucējumi netiešā ceļa neironos atviegloja ievērojami spēcīgākas sensibilizācijas attīstību salīdzinājumā ar GFP kontrolēm (2b). Šī sensibilizācijas pastiprināšanās tika turpināta ar amfetamīna izaicinājumu, kas tika veikts nedēļu vēlāk, ja netika apstrādāta CNO (Att. 2c, d). Šos efektus var saistīt ar hM samazinātu striatopaldaālo neironu aktivitātes samazinājumu no CNO4D receptori, jo hM4D receptoru ekspresija bez CNO apstrādes neizraisa lokomotoro sensibilizāciju pret šo vieglo amfetamīna dozēšanas režīmu (6).
Lai noteiktu, vai striatonigrālie neironi var regulēt reakciju uz zālēm pretējā veidā, mēs nākamreiz pārbaudījām bioķīmiski mazinošās striatonigrālo neironu uzbudināmību dorsomediālajā striatumā amfetamīna zāļu ārstēšanas shēmas laikā, kas rada spēcīgu sensibilizāciju GFP kontrolē (sešas zāļu iedarbības) ), kā arī zemas izaicinošās amfetamīna devas (0.5 mg / kg) laikā, ja neeksistē neironu aktivitātes traucējumi ar receptoru starpniecību. Tāpat kā netiešā ceļa slāpēšanas gadījumā, ar CNO saistītā tiešā ceļa neironu uzbudināmības samazināšanās amfetamīna terapijas laikā nemainīja akūtu lokomotoro reakciju uz amfetamīnu (2e). Kaut arī sensibilizācijas attīstība šķita līdzīga GFP kontrolēm pēc CNO izraisītas pDYN-hM4D receptori ārstēšanas fāzē (2f), sensibilizācija pDYN-hM4D grupa, bet joprojām tika stingri uzturēta GFP kontrolē (2g. Att). Šos efektus var saistīt arī ar hM izraisīto striatonigrālo neironu aktivitātes samazināšanos no CNO4D receptori, jo hM4D receptoru ekspresija, neveicot CNO ārstēšanu, netraucēja lokomotoro sensibilizācijas attīstību, jo sensibilizācija tika novērota ārstēšanas fāzē un, reaģējot uz zālēm (7). Šie dati liecina, ka striatonigrālie neironi var būt īpaši svarīgi, lai regulētu ilgstošu uzvedības pielāgošanos, kas ir atkārtotas narkotiku lietošanas sekas.
Noslēgumā jāsaka, ka šie dati sniedz pirmos pierādījumus par striatopaldiālo un striatonigrālo neironu kritiskajām un pretstatītajām lomām narkotiku pieredzes atkarīgās uzvedības plastiskuma regulēšanā.. Turklāt tas, ka neironu kavēšana neietekmē akūtu lokomotoro reakciju uz amfetamīnu, sniedz papildu pierādījumus tam, ka mehānismi, kas regulē akūtu reakciju uz zālēm, atšķiras no tiem, kas modulē ilgstošās adaptācijas, kas notiek ar atkārtotu zāļu iedarbību. Visbeidzot, fenotipiski specifisko vīrusu vektoru savienošana pārī ar dizaineru receptoriem, kas spēj mainīt neironu aktivitāti, neatgriezeniski netraucējot šūnu funkcijas, nodrošina jaunu un spēcīgu pieeju atkarības molekulārā pamata dekonstruēšanai.
Pateicības
Šo darbu atbalstīja NIH dotācijas K99 DA024762 (SMF), T32 GM07266 un T32 GM07108 (DE), T32 AA009455 un F32 DA026273 (MJW), R21 DA021793 (PEMP), R01 (NEMX), R023206 ) un R19 DA82441 (JFN), balvu par sasniegumiem koledžas zinātniekiem (DE) un NARSAD izcilā pētnieka balvu (BLR)
Zemsvītras piezīmes
Konkurējošo interešu paziņojums
Autori paziņo, ka viņiem nav konkurējošu finanšu interešu.
Atsauces
;