DeltaFosB secara tidak langsung mengawal aktiviti promoter Cck (2010)

Brain Res. 2010 Mei 6; 1329: 10-20.

Diterbitkan dalam talian 2010 Mac 11. doi:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,1 Megan Wald,1 Madison Paddock,1 Elizabeth Hoffman,1 Rachel Arey,2 Scott Edwards,2 Sade Spencer,2 Eric J. Nestler,3 and Colleen A. McClung2, *

Maklumat Pengarang ► Maklumat hak cipta dan Lesen ►

Versi terakhir penerbitan artikel ini boleh didapati di Otak Res

Lihat artikel lain di PMC itu memetik artikel yang diterbitkan.

Pergi ke:

Abstrak

Beberapa perubahan biokimia, struktur, dan tingkah laku yang penting yang disebabkan oleh pendedahan kronik terhadap ubat-ubatan penyalahgunaan nampaknya dimediasi oleh faktor transkripsi yang sangat stabil ΔFosB. Kerja terdahulu telah menunjukkan bahawa overexpression ΔFosB pada tikus untuk minggu 2 menyebabkan peningkatan dalam ekspresi banyak gen di striatum, yang kebanyakannya kemudian dikurangkan selepas minggu 8 ekspresi ΔFosB. Menariknya, sebilangan besar gen ini juga diatur dalam tikus yang menggambarkan faktor transkripsi CREB. Tidak jelas dari kajian ini, bagaimanapun, ΔFosB jangka pendek mengawal gen ini melalui CREB. Di sini kita dapati bahawa minggu-minggu 2 daripada overexpression ΔFosB meningkatkan ekspresi CREB di striatum, kesan yang hilang oleh minggu 8. Induksi awal dikaitkan dengan peningkatan CREB yang mengikat kepada penganjur gen sasaran tertentu di rantau otak ini. Menghairankan, satu gen yang disyaki sasaran CREB berdasarkan laporan terdahulu, cholecystokinin (Cck), tidak dikawal oleh CREB di striatum. Untuk menyiasat lebih lanjut peraturan Cck berikut ΔFosB overexpression, kami mengesahkan bahawa overexpression ΔFosB jangka pendek meningkatkan kedua-duanya Cck aktiviti promoter dan ekspresi gen. Ia juga meningkatkan aktiviti pengikatan di tapak pengikat CREB (CRE) yang diletakkan di dalam Cck promoter. Bagaimanapun, sementara tapak CRE diperlukan untuk ungkapan asas normal Cck, ia tidak diperlukan untuk induksi ΔFoB Cck. Diambil bersama, keputusan ini mencadangkan bahawa sementara induksi ΔFosB jangka pendek meningkatkan ekspresi CREB dan aktiviti pada promoter gen tertentu, ini bukan satu-satunya mekanisme yang mana gen diatur dalam keadaan ini.

Kata kunci: nukleus accumbens, transkripsi, ketagihan

Pergi ke:

PENGENALAN

Pendedahan kronik terhadap dadah penyalahgunaan menyebabkan perubahan biokimia dan struktur di beberapa kawasan otak. Perubahan ini difikirkan melibatkan perubahan dalam profil ekspresi gen dalam sistem mesolimbi. Sistem ini terdiri daripada neuron dopaminergik bahawa projek dari kawasan ventral tegmental (VTA) di tengah otak hingga neuron berduri sederhana di nukleus accumbens (NAc) (stratum ventral) serta beberapa kawasan otak lain. Perubahan dalam aktiviti dua faktor transkripsi, protein pengikat unsur tindak balas CAMP (CREB) dan ΔFosB (protein keluarga Fos), telah dicadangkan untuk memeterai banyak perubahan biokimia, struktur, dan tingkah laku yang dilihat dengan pendedahan kronik terhadap dadah penyalahgunaan ( diulas oleh Nestler, 2005).

CREB adalah faktor transkripsi di mana-mana yang merupakan ahli keluarga CREB / ATF. Homodimer CREB mengikat variasi urutan CRE (consensus: TGACGTCA) yang terdapat dalam promotor banyak gen. Fosforilasi CREB (terutamanya di serine 133, walaupun tapak-tapak lain telah dikenalpasti) boleh dirangsang oleh beberapa cascades isyarat termasuk bahagian bawah reseptor dopamin (Cole et al., 1995). Apabila fosforilasi di serum 133, CREB merekrut protein pengikat CREB pengikat (CBP) atau protein berkaitan yang membawa kepada peningkatan ekspresi gen (dikaji semula oleh Johannessen et al., 2004). Pendedahan kronik terhadap ubat-ubatan penipuan atau psikostimulan menyebabkan peningkatan pesat dalam aktiviti CREB dalam nukleus accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), penyesuaian berfikir untuk mengurangkan sifat ganjaran ubat ini dan untuk menyumbang kepada keadaan emosi negatif penarikan dadah (Nestler, 2005).

Lpenyesuaian yang berterusan terhadap ubat-ubatan penyalahgunaan dianggap sebahagiannya disederhanakan oleh ΔFosB, varian sambutan yang sangat stabil dari FosB (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Ahli keluarga Fos dimeriahkan dengan ahli keluarga Jun untuk membentuk kompleks penggerak protein 1 (AP-1). Kompleks transkripsi AP-1 mengikat variasi unsur tindak balas AP-1 (konsensus: TGACTCA) untuk mengawal transkripsi (dikaji semula oleh Chinenov dan Kerppola, 2001). Walaupun pendedahan akut terhadap ubat-ubatan penderaan membawa kepada induksi jangka pendek (jam) anggota Fos-keluarga (serta peningkatan aktiviti CREB), pendedahan ubat berulang menyebabkan pengumpulan yang sangat stabil ΔFosB (Hope et al., 1994; Perrotti et al., 2008), ungkapan yang berterusan selama berminggu-minggu.

Tikus bi-transgenik secara mendadak menggambarkan baik ΔFosB atau CREB dalam striatum dewasa memaparkan banyak fenotip biokimia dan tingkah laku yang dilihat pada haiwan yang terdedah kepada psikostimulus atau ubat penyalahgunaan yang lain. Apenyimpangan perubahan ekspresi gen dalam haiwan transgenik ini telah mengenal pasti banyak gen yang dikawal oleh jangkaan overexpression jangka pendek (2 weeks) dari ΔFosB, perubahan yang dikaitkan dengan pengurangan ganjaran dadah. Perubahan dalam ekspresi gen dan tindak balas tingkah laku dengan jangka pendek ΔFosB sangat mirip dengan yang dilihat pada haiwan yang terlalu menekankan CREB untuk 2 atau 8 minggu (McClung dan Nestler, 2003). Sebaliknya, jangkaan jangka panjang (8 weeks) daripada ΔFosB menurunkan ekspresi banyak gen yang sama dan membawa kepada peningkatan ganjaran dadah (Kelz et al., 1999; McClung dan Nestler, 2003).

Satu gen yang dikenal pasti dalam kajian ini adalah cholecystokinin (Cck), neuropeptida yang dihasilkan di beberapa kawasan otak, termasuk striatum (Hokfelt et al., 1980). CCK boleh memodulasi penghantaran dopaminergik (Vaccarino, 1992), terlibat dalam ganjaran dadah dan tetulang (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002), dan didorong oleh striatum oleh kokain kronik (Ding dan Mocchetti, 1992). Selain itu Cck promoter telah terbukti responsif kepada kompleks CREB dan AP-1 (Haun dan Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Oleh kerana banyak gen (termasuk Cck) yang menunjukkan peningkatan ungkapan berikutan kedua-dua CREB dan ekspresi ΔFosB jangka pendek diketahui atau disyaki CREB sasaran gen (McClung dan Nestler, 2003), kami mahu menentukan sama ada ungkapan ΔFosB jangka pendek membawa kepada pengawalseliaan gen ini (dengan fokus pada Cck) melalui peraturan CREB atau melalui mekanisme gen yang lebih kompleks.

Pergi ke:

KEPUTUSAN

Overexpression Δ FosB secara sementara meningkatkan tahap CREB

Kami menggunakan pemusnah Barat untuk menyiasat sama ada jangkaan overexpression ΔFosB meningkatkan tahap protein CREB di striatum tikus. Untuk kajian ini, kami menggunakan tikus bi-transgenik (garisan 11A) yang membawa kedua-dua transgenena NSE-tTA dan transgenena TetOp-ΔFosB. Dalam ketiadaan doxycycline, tikus ini menunjukkan peningkatan teguh dalam ekspresi ΔFosB dalam neuron positif dynorphin di striatum (Kelz et al., 1999). Kaedah pengekspresusan ΔFosB ini telah didokumentasikan secara meluas dan membolehkan overexpression khusus rantau, yang sama dengan induksi FFB yang dilihat pada haiwan yang terdedah kepada kokain kronik (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Kami mendapati bahawa dalam tikus 11A overexpressing ΔFosB, tahap protein CREB telah dikawal dengan ketara selepas minggu ekspresi 2 dan tahap ini dikembalikan kepada baseline selepas minggu ekspresi 8 (Rajah 1A, n = 8). Untuk menentukan sama ada perubahan tahap CREB dengan ekspresi ΔFosB jangka pendek dapat ditiru di sistem lain, kami secara sementara meluahkan ΔFosB secara berlebihan pada sel PC12 dan mendapati bahawa tahap CREB meningkat dengan ketara (p <0.05) jika dibandingkan dengan kawalan (Rajah 1B, n = 4). Keputusan ini menunjukkan bahawa ekspresi ΔFosB jangka pendek meningkatkan tahap protein CREB.

Rajah 1

Rajah 1

Tahap CREB meningkat dengan overexpression ΔFosB. Analisis blot Barat daripada lysates dari (A) tikus tetikus dari tikus 11A dari dox untuk minggu 2 atau 8 atau (B) Sel PC12 menggambarkan lebih tinggi ΔFosB. Data dalam A ditunjukkan sebagai perubahan peratus berbanding dox berbanding ...

Kedua-dua ΔFosB dan CREB mengikat kepada para promoter gen sasaran tertentu di striatum berikut jangkaan ΔFosB jangka pendek

Kami menggunakan ujian ChIP (chromatin immunoprecipitation) tisu striatal untuk menentukan sama ada pengikatan ΔFosB atau CREB berlaku pada penganjur gen sasaran tertentu dan jika pengikatan ini meningkat berikutan overexpression ΔFosB jangka pendek. Kami menganalisis mengikat di BDNF and Cck promoter, kerana kedua-dua gen sangat menonjol berikutan jangkaan overexpression jangka pendek ΔFosB, overexpression CREB, atau rawatan kokain kronik (McClung dan Nestler, 2003). Kami juga menganalisis mengikat di CDK5 promoter, kerana ia adalah sasaran langsung yang diketahui ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Akhirnya, kita mengukur mengikat pada prodynorphin promoter, kerana kajian terdahulu telah mendapati bahawa ia boleh terikat oleh ΔFosB dan CREB dalam keadaan yang berbeza (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

Analisis ChIP dilakukan pada striata dari tikus 11A overexpressing ΔFosB untuk minggu 2 menggunakan antibodi yang mengiktiraf CREB atau ΔFosB. Di bawah keadaan biasa, kami mendapati bahawa ΔFosB mengikat kepada CDK5 and prodynorphin penganjur, sementara tiada pengikatan mengesan di BDNF or Cck promoter (Jadual 1). Tambahan pula, overexpression ΔFosB meningkatkan pengikatan ΔFosB pada CDK5 promotor, tetapi tidak di prodynorphin promoter. Kami kemudian mengukur CREB mengikat pada para promoter ini dan mendapati bahawa CREB mengikat kepada CDK5, BDNF and prodynorphin promotor, tetapi tidak kepada Cck promoter, di striatum normal, dan bahawa overexpression ΔFosB untuk minggu 2 meningkatkan CREB mengikat pada BDNF and prodynorphin promotor, tetapi bukan CDK5 promoter. Diambil bersama, hasil ini menunjukkan bahawa ΔFosB dan CREB boleh mengikat kedua-dua penganjur gen tertentu seperti prodynorphin and CDK5Walau bagaimanapun, pengikatan CREB adalah khusus kepada para promoter lain seperti BDNF. Tambahan pula, overexpression ΔFosB membawa kepada kenaikan dalam ΔFosB mengikat pada para promoter tertentu, seperti yang dijangkakan, tetapi juga untuk CREB yang mengikat kepada promoter tertentu, selaras dengan induksi CREB yang dikendalikan ΔFosB yang diperhatikan pada titik kali ini.

Jadual 1

Jadual 1

Mengikat protein pengawalan putative kepada pelbagai promoter dalam tikus yang menggambarkan ΔFosB selama dua minggu.

Kerja sebelumnya telah menunjukkan bahawa perubahan dalam ekspresi gen yang disebabkan oleh jangkaan overexpression jangka panjang ΔFosB dikaitkan dengan pengubahsuaian chromatin, khususnya, asetilasi histon H3, pada penganjur gen tertentu (Kumar et al., 2005). Untuk menentukan sama ada ini boleh menyebabkan perubahan dalam ekspresi gen pada jangka masa lebih pendek ΔFosB, kita mengukur pengikatan histon histon H3 (pengubah histon yang berkaitan dengan chromatin aktif transkripsi), atau histon histon H3 (Lys9, pengubahsuaian histon yang dikaitkan dengan transkripsi chromatin tidak aktif). Kami mendapati bahawa overexpression daripada ΔFosB untuk minggu 2 menyebabkan tiada perubahan dalam mengikat asetilasi H3 pada mana-mana penganjur gen dikaji (Jadual 1). Kami mendapati pengurangan ketara dalam mengikat H3 histon di at prodynorphin penganjur, tetapi tidak mengikat pada Cck promoter dan tiada perubahan dalam mengikat pada CDK5 and BDNF promotor, mencadangkan bahawa ini bukan mekanisme umum yang mana ΔFosB, dalam jangka pendek, mengawal ekspresi gen. Kami terkejut dan tertarik pada hakikat bahawa kami tidak mendapati perbezaan dalam ujian Chip kami yang boleh menyumbang kepada peningkatan Cck Ekspresi mRNA dalam tikus 11A selepas minggu 2 ekspresi ΔFosB dan memutuskan untuk menyiasat lagi mekanisme ini.

Pertambahan jangka masa akan meningkat Cck ungkapan dalam pelbagai sistem

Pencirian mikroarray tikus 11A bi-transgenik overexpressing ΔFosB di striatum mendapati bahawa Cck tahap ekspresi meningkat berikutan minggu ke atas 2 overexpression dan kemudian secara beransur-ansur berkurangan dengan tempoh lebih lama ΔFosB ekspresi (Rajah 2A, n = 3). Kami mengesahkan kesan ini Cck menggunakan masa nyata PCR pada kumpulan haiwan yang berasingan di 2 dan 8 minggu dan mendapati hasil pada dua titik masa sama dengan analisis microarray (data tidak ditunjukkan).

Rajah 2

Rajah 2

Overexpression jangka pendek dari ΔFosB meningkat Cck ekspresi gen. (A) Cck Ekspresi mRNA di striatum berikutan overexpression ΔFosB dalam tikus 11A untuk minggu 1, 2, 4, atau 8. Analisis mikroarray dilakukan pada sampel striat dan Cck tahap ...

Untuk menyiasat keupayaan ΔFosB untuk mengawal selia Cck ungkapan, kami menggunakan sel PC12 yang transien dipindahkan dengan a Cck-luciferase reporter plasmid dan sama ada plasmid ungkapan ΔFosB atau jumlah pCDNA yang sama. Kedua-dua (n = 5-9) dan tiga (n = 11-13) hari dari overexpression ΔFosB menghasilkan peningkatan ketara dalam Cckungkapan lipatan. Di samping itu, tiga hari pendedahan overnight ΔFosB menghasilkan lebih banyak lagi CckInduksi liliferase apabila dibandingkan dengan dua hari overexpressionRajah 2B). Overexpression daripada ΔFosB tidak mendorong ekspresi luciferase promoterless (data tidak ditunjukkan). Di bawah tiada syarat rawatan adalah pengurangan dalam Cck-Luciferase aktiviti jelas. Keputusan ini menunjukkan bahawa ekspresi ΔFosB jangka pendek meningkatkan aktiviti Cck promoter, dan daun tidak dijawab mekanisme yang mana menekan overexpression ΔFosB jangka panjang Cck ungkapan.

ΔFosB overexpression meningkat mengikat di tapak pengikat CREB yang diletakkan di dalam Cck promoter

Penganalisis kami mendapati bahawa Cck ungkapan meningkat berikutan ungkapan ΔFoB jangka pendek, bagaimanapun, ujian ChIP kami mendapati bahawa kedua-dua CREB atau ΔFosB tidak mengikat Cck promoter. Untuk menentukan sama ada terdapat sebarang perubahan dalam protein yang mengikat pada Cck promoter berikutan overexpression ΔFosB, kami menggunakan ujian pergerakan pergerakan electrophoretic (EMSA) dengan probe yang mengandungi tapak seperti CRE seperti yang disertakan dalam Cck promoter. Menggunakan ekstrak nuklear dari striata tikus 11A overexpressing ΔFosB untuk minggu 2, kami mendapati peningkatan mengikat ke lokasi CRE putative dalam Cck promoter (Rajah 3 A, C, n = 4). Menariknya, tikus 11A overexpressing ΔFosB untuk minggu 8, yang menunjukkan penurunan dalam Cck ungkapan, juga menunjukkan peningkatan mengikat di laman web ini (Rajah 3B, C, n = 4). Sebagai perbandingan, kita mengkaji mengikat ke laman web CRE konsensus dalam tikus yang menggambarkan lebih tinggi ΔFosB untuk minggu 2 dan mendapati CRE mengikat kuat dalam ekstrak striatal, tetapi tidak ada kenaikan mengikat ΔFosB induksi (Rajah 3F, n = 4). Oleh itu, walaupun peningkatan yang didorong oleh ΔFosB dalam jumlah CREB total yang dilihat pada masa ini, keputusan ini adalah sejajar dengan ujian ChIP kami yang mendapati peningkatan CREB yang mengikat pada para promoter berikutan ΔFosB overexpression adalah khusus untuk gen tertentu sahaja dan bukan fenomena global . Untuk menentukan sama ada CREB terikat kepada Cck promoter dalam analisis EMSA kami, kami melakukan ujian supershift dengan antibodi khusus CREB. Dalam persetujuan dengan ujian ChIP kami, kami tidak menemui apa-apa pengikatan CREB kepada a Cck siasatan yang mengandung tapak CRE yang diletakkan di assay EMSA, sementara CREB secara signifikan mengikat dan meninggikan laman web CRE konsensus (Rajah 3D, E, n = 4). Aktiviti DNA mengikat di Cck penganjur juga tidak terjejas oleh antibodi kepada ΔFosB (data tidak ditunjukkan), di bawah syarat-syarat yang ditunjukkan dalam beberapa kajian terdahulu untuk menghalang ΔFosB mengikat ke laman web AP-1 bona fide (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Kami juga melakukan pengujian ChIP pada striata haiwan 11A berikutan minggu 8 ekspresi ΔFosB dan masih tidak dapat mengikat CREB atau ΔFosB di Cck promoter (data tidak dipaparkan). Oleh itu, ekspresi ΔFosB menyebabkan peningkatan protein mengikat pada Cck promoter selepas minggu ekspresi 2 dan 8; Walau bagaimanapun, identiti faktor-faktor ini masih tidak diketahui.

Rajah 3

Rajah 3

Protein mengikat di Cck promoter. (A, B) Pergerakan elektroporetik menggunakan ujian menggunakan Cck Laman web seperti CRE dengan tisu striatal dari haiwan yang terlalu menekankan ΔFosB untuk minggu 2 (A) atau 8 weeks (B). Dalam (A), persaingan dengan pesaing yang berlainan tidak berlabel ...

Tapak CRE yang diletakkan di dalam Cck promoter tidak bertanggungjawab untuk meningkatkan aktiviti promoter

Oleh kerana kita mendapati peningkatan protein mengikat dengan menggunakan serpihan Cck promotor, yang mengandungi laman web CRE yang tertunda, berikutan overexpression ΔFosB, kami mahu menentukan sama ada laman web ini diperlukan untuk meningkat Cck ungkapan berikut ekstremasi ΔFosB. Untuk menguji kemungkinan ini, kami mengalihkan sel PC12 dengan a Cck-luciferase plasmid yang mengandungi laman utamanya CRE atau satu yang mengandungi mutasi di tapak yang akan menghapuskan sebarang interaksi dengan CREB. Menariknya, mutasi tapak seperti CRE menurunkan basal Cck aktiviti promoter oleh 32% (Rajah 4A, n = 9), tetapi tidak menjejaskan Cck induksi promoter oleh ΔFosB overexpression (Rajah 4B, n = 11-13). Ini menunjukkan bahawa, walaupun Cck promoter memerlukan tapak CRE-seperti utuh untuk aktiviti basal penuh, peningkatan aktiviti promoter yang diinduksi oleh overexpression ΔFosB tidak memerlukan urutan CRE-seperti.

Rajah 4

Rajah 4

. Cckseperti CRE tapak tidak perlu Cck induksi oleh ΔFosB. (A) Cck-Luciferase aktiviti diukur 2 hari selepas pemindahan dengan sama ada normal Cck-luciferase atau di mana laman web seperti CRE bermutasi. * p <0.05 (B) Cck-luciferase ...

cFos mengikat kepada Cck promoter

Kajian terdahulu telah mendapati bahawa cFos mRNA meningkat dengan ungkapan ΔFosB jangka pendek, bagaimanapun, selepas ekspresi ΔFosB yang berpanjangan, keupayaan rawatan kokain untuk mendorong cFos di striatum dikurangkan (McClung dan Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Oleh itu, kemungkinan bahawa cFos menyumbang kepada peningkatan dalam Cck ungkapan berikut ungkapan ΔFosB jangka pendek. Kami melakukan pemeriksaan Chip dengan antibodi khusus untuk cFos dan mengukur cFos mengikat pada Cck promoter dengan dan tanpa ekspresi ΔFosB jangka pendek. Walaupun kami mendapati bahawa cFos tidak mengikat kepada Cck promoter, pengikatan ini tidak meningkat dengan ketara berikutan overexpression ΔFosB (Rajah 5, n = 5). Ini menunjukkan bahawa sejak cFos mengikat Cck penganjur, ia boleh menyumbang kepada peraturan umum Cck ungkapan, tetapi kemungkinannya tidak terlibat dalam pengawasan Cck promoter oleh ΔFosB.

Rajah 5

Rajah 5

cFos mengikat kepada Cck promoter. Ujian imunoprecipitation Chromatin dilakukan dengan antibodi khusus untuk cFos menggunakan tisu striatal daripada ΔFosB overexpressing tikus sama ada pada dox, atau selepas penyingkiran dox minggu 2. Analisis PCR masa sebenar adalah ...

Pergi ke:

PERBINCANGAN

Kajian ini mengesahkan dan memperluaskan penemuan sebelumnya yang menunjukkan bahawa ΔFosB mengawal ekspresi gen di striatum dan kami mendapati bahawa ia berbuat demikian melalui pelbagai mekanisme selepas ekspresi jangka pendek. Kami menunjukkan bahawa, selepas minggu ke atas overexpression 2, ΔFosB mengikat langsung kepada para promoter dalam gen tertentu yang membawa kepada perubahan dalam ekspresi (iaitu CDK5). Tambahan pula, ia meningkatkan tahap protein CREB, kesan yang dilihat dalam sel-sel kultur serta striatum, yang membawa kepada peningkatan CREB yang mengikat pada promoter gen lain (iaitu dynorphin and BDNF). Dalam kajian terdahulu, kita mendapati bahawa overexpression jangka pendek ΔFosB di striatum membawa kepada banyak perubahan ungkapan gen yang sama yang didapati apabila CREB terlalu tertekan, dan membawa kepada respon tingkah laku yang sama dalam ukuran keutamaan kokain (McClung dan Nestler, 2003). Oleh itu, penemuan sekarang bahawa ΔFosB membawa kepada induksi CREB, serta mengikat CREB kepada penganjur gen tertentu, membantu menjelaskan mengapa banyak perubahan ungkapan gen dikongsi oleh dua faktor transkripsi ini.

Induksi CREB oleh ΔFosB menarik, kerana telah menunjukkan bahawa ubat penyalahgunaan mendorong perubahan serum 133-fosforilasi CREB peringkat (Mattson et al., 2005) dan meningkatkan transkripsi CRE-mediated (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), tanpa mengubah keseluruhan CREB. Adalah mungkin bahawa perubahan dalam tahap CREB mungkin bersifat sementara, dan, dengan itu, mudah dilepaskan dalam kajian lain. Di tangan kita, kita telah melihat kenaikan kokain yang disebabkan oleh CREB mRNA dalam eksperimen tertentu, bagaimanapun, kesan ini sangat berubah-ubah (pemerhatian yang tidak diterbitkan). Oleh kerana kedua-dua tikus transgenik 11A dan sel PC-12 menunjukkan induksi CREB berikutan jangkaan overexpression jangka pendek ΔFosB, ini menunjukkan bahawa CREB memang disebabkan oleh ΔFosB (atau sasaran ΔFosB), menyediakan mekanisme lain untuk menjelaskan perubahan yang disebabkan oleh dadah dalam gen ungkapan.

Yang menghairankan, kami mendapati bahawa kedua-dua CREB atau ΔFosB mengikat kepada Cck promoter walaupun Cck ungkapan jelas dikawal selaras dengan ekspresi ΔFosB jangka pendek. Cck adalah neuropeptida yang banyak dinyatakan dalam kedua-dua VTA dan NAc (Hokfelt et al., 1980) dan mungkin terlibat dalam tindak balas tingkah laku terhadap dadah penyalahgunaan (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). Dalam ujian kultur sel, yang Cck promoter telah dicirikan secara meluas dan telah ditunjukkan sebagai respons kepada ahli keluarga CREB dan AP-1 (disemak oleh Hansen, 2001). Haun dan Dixon (1990) menunjukkan bahawa kompleks AP-1 boleh mengikat kepada Cck Laman web CRE-seperti vitro, dan kemudiannya ditunjukkan dengan menggunakan sel-sel neuroblastoma SK-N-MC, bahawa mutasi tapak seperti CRE mengurangkan respons respons promoter ke cFos / cJunRourke et al., 1999). Malah, kami juga mendapati peningkatan Cck aktiviti promoter (Rajah 2) dan mengikat di atau sekitar elemen CRE-seperti (Rajah 3) apabila overexpression daripada ΔFosB, ahli keluarga AP-1 yang lain, tetapi kami tidak dapat mengikat ΔFosB langsung kepada Cck promoter dalam vivo or vitro, walaupun pada masa lampau.

Banyak kerja telah menunjukkan peranan untuk CREB dalam peraturan Cck aktiviti promoter. The Cck Tapak seperti CRE dilestarikan di seluruh vertebrata (Hansen, 2001) dan, dalam beberapa ujian kultur sel, kedua-dua kompleks CREB dan AP-1 mengikat tapak ini dan perlu untuk Cck aktiviti promoter (Haun dan Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Selain itu, beberapa aktivator yang dikenali sebagai Cck ungkapan (termasuk bFGF, PACAP, peptones, dan depolarisasi) telah ditunjukkan untuk bertindak melalui CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall, et al, 2000; Bernard, et al., 2001; Gevrey, et al., 2002; Hansen, et al., 2004). Kami Cck-luciferase data gen reporter menyokong peranan penting untuk laman web CRE-seperti dalam peraturan Cck aktiviti promoter, kerana mutasi laman web ini mengurangkan asas Cck aktiviti promoter dan CckEkspresi liliferase yang diakibatkan oleh VP16-CREB, bentuk aktif CREB, hilang apabila laman web ini bermutasi (pemerhatian yang tidak diterbitkan). Oleh itu, kami terkejut mendapati bahawa CREB tidak muncul untuk mengikat Cck promoter dalam ekstrak striatal sama ada pada garis dasar atau pada jangka masa ΔFosB jangka pendek apabila tahap CREB meningkat. Ini berpendapat bahawa tahap CREB per se bukanlah satu-satunya faktor dalam menentukan jumlah mengikat di laman web ini, dan ini disokong oleh kerja orang lain (Cha-Molstad, et al., 2004). Sejak promoter yang lain, sebelum ini dikenal pasti gen sasaran CREB, seperti BDNF and prodynorphin, mengikat CREB, kami yakin dengan penemuan kami bahawa CREB tidak mengikat kepada Cck promoter dalam ekstrak nuklear yang striatal. Selanjutnya, induksi Cck-luciferase aktiviti oleh ΔFosB tidak bergantung pada laman web CRE-seperti utuh, menunjukkan bahawa ΔFosB tidak mengatur Cck ungkapan dengan mengawal pengikatan langsung CREB kepada Cck promoter.

Ketidakmampuan kami untuk mengesan CREB berinteraksi dengan Cck promoter disokong oleh Renthal et al. (2009), yang menggunakan pendekatan Chip-chip untuk melihat perubahan global dalam CREB fosforilasi (pCREB) dan ΔFosB mengikat striatum selepas pendedahan kokain kronik. Dalam eksperimen ini, kompleks protein DNA telah diimunisasi semula dengan antibodi ΔFosB atau pCREB dan DNA yang dicetuskan, selepas dilabelkan, telah hibridisasi kepada microarray promoter. Walaupun banyak sasaran gen CREB yang telah dikenal pasti dengan pendekatan ini (contohnya, BDNF, prodynorphin), Cck tidak dikenalpasti. Di samping itu, ia telah menunjukkan bahawa pengikatan CREB ke laman web CRE konsensus berbeza-beza antara garis sel yang berbudaya (Cha-Molstad, et al., 2004). Semua kajian terdahulu yang menemui interaksi CREB dengan Cck promoter telah dijalankan dalam budaya sel (bukan otak dari mana sampel EMSA dan Chip kami diperoleh) dan menggunakan ujian geseran gel untuk menyiasat interaksi protein-DNA. Walaupun EMSA dapat menilai potensi faktor untuk mengikat urutan DNA, pengujian ChIP memberikan pandangan baru pada interaksi ini dalam vivo. Tambahan lagi, kebanyakan data menunjukkan induksi sama ada Cck aktiviti promoter atau CREB mengikat kepada Cck promoter diperoleh daripada sel-sel yang telah dirangsang oleh faktor-faktor seperti peptones (Bernard et al., 2001), depolarization (Hansen, et al., 2004), atau pelbagai pengaktifan cascades isyarat intraselular termasuk cAMP dan ERK (Hansen et al., 1999). Dalam eksperimen kami, satu-satunya "rangsangan" yang digunakan adalah overexpression daripada ΔFosB, yang mencukupi untuk mendorong Cck ungkapan. Diambil bersama, ini menunjukkan bahawa keupayaan CREB untuk mengikat (dan berpotensi mengawal) Cck promoter sangat bergantung kepada jenis sel dan pengaktifan laluan isyarat tertentu. Di samping itu, Cck Elemen promoter seperti CRE (sekurang-kurangnya dalam sel-sel PC12 yang tidak diinduksi dan di stiker tetikus) bukan sasaran langsung sama ada CREB atau ΔFosB. Menariknya, pengawalseliaan FosB ungkapan oleh CREB juga khusus untuk jenis sel dan jenis rangsangan. Satu kajian oleh Andersson et al. mendapati bahawa suntikan CREB antisense oligonucleotides ke striatum tikus sebahagiannya menghalang induksi FosB berikut pentadbiran kokain (Andersson et al., 2001). Walau bagaimanapun, mereka juga mendapati keupayaan L-Dopa untuk mendorong FosB ungkapan dalam striatum 6-OHDA tidak dipengaruhi oleh kehadiran antigen oligonucleotides CREB.

Oleh kerana CREB dan ΔFosB seolah-olah secara tidak langsung mengawal selia Cck penganjur, dan perubahan dalam struktur kromatin telah didokumenkan sebagai tindak balas kepada pelbagai rangsangan yang mendorong ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), kami berpendapat bahawa ΔFosB secara tidak langsung boleh memodulasi aktiviti promoter dengan mengubah struktur kromatin. Walau bagaimanapun, dalam tikus menggambarkan ΔFosB selama minggu-minggu 2, tidak ada perubahan dalam asetilasi H3 histon di Cck promoter (Jadual 1). Ini disokong oleh data cip Chip Renthal et al. (2009), yang tidak melaporkan perubahan H3 acetylated di Cck promoter pada tikus yang terdedah kepada kokain kronik. Sejak itu Cck promoter aktif di striatum, tidak ada pengekstrakan histone methylated yang terperangkap H3 dijangka atau diperhatikan. Menariknya, kami juga tidak melihat perubahan disebabkan oleh overexpression ΔFosB dalam mengikat H3 asetilasi pada BDNF promoter (yang menunjukkan peningkatan CREB mengikat) atau di CDK5 and prodynorphin promoter (yang menunjukkan peningkatan ΔFosB mengikat). Memandangkan terdapat pelbagai perubahan histon yang dikaitkan dengan perubahan dalam aktiviti promoter (dikaji semula oleh Rando dan Chang, 2009), terdapat kemungkinan pengubahsuaian kromatin lain yang dikaitkan dengan induksi gen ini. Mana-mana pengubahsuaian chromatin tunggal, walaupun sering meramal tahap aktiviti promoter, mungkin tidak berubah semasa pengaktifan gen tertentu. Dalam kerja-kerja masa hadapan, ia akan menjadi menarik untuk melihat perubahan potensi lain dalam struktur kromatin di sekelilingnya Cck promoter berikutan overexpression ΔFosB. Menariknya, kokain kronik (mungkin melalui ΔFoB induksi) telah ditunjukkan untuk menggambarkan sirtuin 1 dan 2, kelas deacetylases histone III yang muncul untuk mengubah fisiologi neuron, isyarat ERK, dan respon tingkah laku terhadap kokain (Renthal et al., 2009). Induksi deacetylase histon akan mempunyai keupayaan untuk secara serentak mengawal ekspresi sejumlah besar gen melalui perubahan global dalam struktur kromatin.

Seorang calon yang mungkin terlibat dalam Cck peraturan berikut ΔFosB overexpression adalah anggota keluarga AP-1 cFos. Ungkapan cFos dikawal oleh CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004), dan overexpression cFos (konsisten dengan overexpression rakan kongsi cjun yang mengikatnya) meningkat Cck aktiviti promoter (Rourke et al., 1999). Oleh itu, peningkatan paras CREB disebabkan jangka hayat ΔFosB overexpression dapat meningkatkan tahap cFos dan mengakibatkan peningkatan yang mengikat kepada Cck Laman web CRE-seperti. cfos mRNA diinduksi pada tikus selepas dua minggu dari overexpression ΔFosB (McClung dan Nestler, 2003) dan menurunkan tikus yang terdedah kepada cocaine kronik atau jangka panjang ΔFosB overexpression (Renthal et al., 2008). Di sini kita dapati bahawa cFos mengikat secara langsung kepada Cck promoter dalam tisu striatal, bagaimanapun, overexpression ΔFosB tidak banyak meningkatkan pengikatan. Ini menunjukkan bahawa sementara cFos boleh melibatkan pengawalseliaan Cck ungkapan secara umum, perubahan dalam pengikatan cFos sahaja tidak mungkin mekanisme yang mana ΔFosB mengawal selia Cck ungkapan. Walau bagaimanapun, boleh difahami ΔFosB sama ada, perubahan pasca translasi dalam cFos (contohnya fosforilasi diubah) atau mendorong ekspresi pasangan yang mengikat (seperti cJun) atau protein pengaktivator. Walau bagaimanapun, sejak laman web CRE-seperti utuh (yang sebelum ini telah ditunjukkan sebagai tapak yang mengikat untuk kompleks AP-1, lihat Haun dan Dixon, 1990) tidak diperlukan untuk peningkatan Cck Aktiviti promoter yang dilihat dengan overexpression ΔFosB (seperti yang dinilai dalam eksperimen gen wartawan kami), ia menjadi alasan bahawa faktor-faktor trans-acting lain juga dikawal oleh ΔFosB.

. Cck Fragmen promoter yang digunakan dalam eksperimen gen pelapor luciferase kami mengandungi tapak mengikat Sp1 yang dipelihara dan kotak E (ditinjau oleh Hansen, 2002). Secara khususnya, urutan E-box telah ditunjukkan untuk mengikat banyak faktor transkripsi (dikaji semula oleh Forrest dan McNamara, 2004). Menggunakan sel PC12, kita telah melihat bahawa mutasi E-box berkurangan Cck aktiviti promoter, tetapi tidak mengubah tindak balas promoter kepada ΔFosB (data tidak ditunjukkan). Menariknya, a CckReporter -luciferase yang mengandungi mutasi di kedua tapak CRE dan E-box tidak mempunyai aktiviti basal yang dapat dikesan dan tidak bertindak balas terhadap overexpression ΔFosB (pemerhatian tidak diterbitkan). Satu lagi pengantara berpotensi tindakan ΔFosB pada Cck promotor adalah ATF, bentuk tertentu yang diketahui disebabkan oleh striatum oleh pendedahan psychostimulant kronik (Green et al., 2008). Walau bagaimanapun, kami tidak menemui sebarang bukti untuk induksi ΔFosB ATFs (data tidak ditunjukkan), dan ATFs tidak akan dijangka mengikat ke laman web CRE seperti yang bermutasi Cck promoter.

Satu kaveat kajian ini adalah kita menggunakan sistem bi-transgenik untuk mengungkap ΔFosB dan oleh itu seseorang mesti konservatif dalam melukiskan persamaan antara paradigma ini dan pentadbiran kokain kronik. Walau bagaimanapun, tikus transgenik 11A mampu memberi peluang yang unik untuk melihat kesan spesifik ΔFosB di striatum, kerana overexpression terhad kepada rantau otak ini (Chen et al., 1998), manakala pentadbiran kokain menginduksi perubahan dalam pelbagai bidang otak yang kemudiannya boleh menjejaskan striatum. Tambahan lagi, beberapa kajian telah mendokumenkan fenotip tingkah laku dan molekul yang sama dalam tikus 11A jika dibandingkan dengan haiwan bukan transgenik yang dirawat dengan kokain kronik (Kelz et al., 1999; McClung dan Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Selain itu, Bibb et al. (2001) melaporkan kadar striat yang sama Cdk5 induksi mRNA dan protin dalam strain 11A yang sama jika dibandingkan dengan ular yang tidak dirawat kokain, yang tidak transgenik, serta perubahan yang sama dalam sasaran CDK5, p35 dan DARPP-32.

Sebagai kesimpulan, kami mendapati bahawa ungkapan ΔFosB jangka pendek membawa kepada induksi gen di striatum melalui pelbagai mekanisme. Ini termasuk promoter langsung mengikat, induksi protein dan aktiviti CREB, pengubahsuaian chromatin, sebagai tambahan kepada laluan belum ditentukan.

Pergi ke:

PROSEDUR EKSPERIMENTAL

haiwan

Binatang 11A bi-transgenik lelaki (NSE-tTA x Tetop-ΔFosB) telah digunakan dalam kajian ini dan dicirikan dalam Kelz et al., 1999. Untuk mengungkap ΔFosB, tikus telah dikeluarkan dari doxycycline antara 3 dan 6 minggu umur, sementara tikus kawalan dikekalkan pada doxycycline. Semua tikus adalah kumpulan yang ditempatkan dan diselenggarakan pada 12: 12 kitaran cahaya / gelap, lampu pada 7 am dan lampu di 7 pm, dengan iklan lib akses kepada makanan dan air. Semua eksperimen tikus telah mematuhi protokol yang diluluskan oleh jagaan haiwan dan penggunaan jawatankuasa Pusat Perubatan Universiti Southwestern Texas di Dallas.

Plasmid reporter dan ekspresi

The wildtype (WT) Cck wartawan promoter-luciferase telah disediakan dengan memasukkan sebilangan kecil fragmen PCR 200 ke dalam vektor pGL3-luc (Promega). Serpihan ini diperolehi daripada DNA genomik tetikus (primer: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3', dan 5 'TACCTTGGGGGGGAAATCG 3') dan mula-mula dimasukkan ke dalam pGEM-T Easy vektor (Promega, #A1360). Potongan promoter kemudiannya diklon ke laman enzim Kpn1 / Xho1 pGL3-luc.

Untuk mewujudkan mutasi titik CRE di Cck promoter, primer mutagenik yang ditujukan ke laman web seperti CRE yang dilaporkan sebelumnya (sense primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', primer antisense: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACGGetainagagasiAntara pemetaanAntara pemetaanAntara pemetaanAngkatanAtak (s) . Ini menukar laman web seperti CRE (ACTGCGTCAGC) yang dilaporkan menjadi ACTGAGCTCC. Semua plasmid wartawan disahkan oleh penjujukan DNA. Plasmid ekspresi ΔFosB mengandungi urutan ΔFosB panjang penuh yang dimasukkan ke dalam laman pengklonan berganda pCDNA 3 dan telah dijelaskan sebelumnya (Ulery dan Nestler, 2007).

Budaya sel dan transfusi DNA

Sel pheochromocytoma tikus (PC12) dikekalkan dalam medium E-Fagle yang dimodifikasi oleh Dulbecco, ditambah dengan 12% serum kuda, 10% serum sapi janin, dan 5% penisilin / streptomisin pada 1 ° C dan 37% CO2. Sel-sel dipindahkan melalui elektropori menggunakan elektroporator BTX 360 (350V, 0 ohm, dan 850 μF) dalam 800 μL larutan garam fosfat Dulbecco dalam cuvettes jurang 4 mm dengan 10 μg pelapor dan 5 μg konstruk ekspresi. Plasmid vektor kosong (pCDNA) digunakan untuk menormalkan jumlah DNA. Selepas transfeksi, sel-sel ditumbuhkan pada hidangan bersalut kolagen 35 mm untuk jangka masa yang ditunjukkan.

Ujian Luciferase

Dua atau tiga hari selepas transfeksi, sel dibasuh 3 kali dalam larutan garam fosfat Dulbecco, dilenyapkan (menggunakan 25 mM glisilglikin, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), dikumpulkan, dan dibersihkan melalui sentrifugasi. 30 μL of lysate digabungkan dengan penampan assay 140 μL luciferase (25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM potassium phosphate, 1 mM coenzyme A, pH 7.8). Aktiviti pencahayaan diukur menggunakan pembaca pendarfluor mikroplat FLx-800 selepas suntikan automatik luciferin 40 μL 1 mM secara automatik. Aktiviti Luciferase telah dinormalisasi kepada jumlah kandungan protein seperti yang ditentukan oleh ujian protein BioRad.

Pemindahan elektroforetik pergeseran

Ekstrak nuklear dari irisan striatum dua hala dari tikus 11A bi-transgenik (bahawa di mana mengekalkan atau mematikan doxycycline untuk 2 atau 8 minggu)McClung dan Nestler, 2003) disediakan menurut Huang dan Walters (1996). 32Probe oligonucleotide double-stranded P dilancarkan dengan menggunakan protokol sistem Promega Gel Shift Assay (#E3300) dan probe telah disucikan menggunakan Roche Quick Spin Columns. Kesepakatan konsensus CRE dan AP-1 adalah dari Promega (#E328A dan E320B, masing-masing) dan Cck Urutan CRE adalah (Cck-CRE rasa: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cec-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Reaksi mengikat dan elektroforesis dilakukan menggunakan pengubahsuaian prosedur sistem Promega Gel Shift Assay (#E3300). 50,000 CPM dari probe dilabel digabungkan dengan ekstrak nuklear μg 10. DNA pesaing atau antibodi sejuk telah ditambah sebelum pengenalan probe radiolabel. Untuk eksperimen supershift, 2 μg antibodi CREB (Upstate Biotechnology # 06-083) telah digunakan. Reaksi telah elektroforik pada gel polyacrylamide 4%, kering, dan terdedah kepada filem (menggunakan skrin mengintensifkan untuk jam 1 hingga hari 2).

Immunoblotting

Untuk sel PC12, plat sel transmisi 35 mm dibasuh dalam salin Dulbecco's buffer fosfat yang sejuk dan lisat disediakan dalam penimbal lisis sejuk RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholate, 1 % Triton X-100, 0.1% sodium dodecyl sulfate) yang mengandungi protease inhibitor. Selepas pengujian sonikasi, pembersihan, dan protein Bradford, lisat didenaturasi sepenuhnya dan 50 μg setiap sampel dielektroforeskan pada gel poliakrilamida 10% SDS. Protein dipindahkan ke membran PVDF, disekat selama 1 jam dalam susu kering tanpa lemak 3% dalam garam Tris-buffer yang mengandungi 0.1% Tween-20 (susu TBS-T), dan dikesan semalaman pada suhu 4 ° C dengan antibodi primer (CREB- Bioteknologi Upstate # 06-083, digunakan pada 1: 1,000; GAPDH- Sigma # G8795, digunakan pada 1: 80,000) dicairkan dalam susu TBS-T. Selepas pencucian berganda dalam TBS-T, noda dikaji selama satu jam pada suhu bilik menggunakan antibodi sekunder terkonjugasi fosfatase alkali (Sigma) yang dicairkan 1: 5,000 dalam susu TBS-T. Selepas pencucian berganda dalam larutan garam Tris, reaksi warna dilakukan mengikut arahan BioRad (# 170-6432). Membran dikeringkan semalaman, diimbas pada pengimbas flatbed dan densitometry dilakukan menggunakan ImageJ (lihat di bawah).

Untuk ekstrak striatal, assay blot Barat telah dijalankan seperti yang diterbitkan sebelum ini (Hope et al., 1994). Tisu dikeluarkan dari tikus yang dipenggal, diletakkan di atas ais dan diikat pada matriks otak dengan ketebalan 1 mm. Pukulan tisu kemudian diambil dan dibekukan pada -80 ° C sehingga digunakan. Tisu diawasi di atas ais di dalam buffer berasaskan detergen yang diubahsuai yang mengandungi kedua-dua phosphatase dan protease inhibitors (Roche, Sigma). Selepas sonication, sampel telah denatured dalam air mendidih dan centrifuged pada 15,000xg untuk minit 15; supernatan kemudian dikumpulkan dan diproses; Jumlah kepekatan protein kemudiannya dikalkimumkan menggunakan ujian Bradford (Bio-Rad). Sampel dijalankan pada gel acrylamide / bisacrylamide 10%, dipindahkan ke membran PVDF, disekat dalam susu% 5 dan diinkubasi dengan antibodi utama (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Blots kemudiannya digambarkan menggunakan sistem chemiluminescence (Pierce). Semua sampel telah dinormalisasikan kepada GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Keluk standard telah dijalankan untuk memastikan bahawa kami berada dalam julat linear ujian.

Analisis densitometri

Untuk immunoblots PC12, analisis densitometry dilakukan menggunakan ImageJ dengan penentukuran rod. Isyarat latar belakang purata dikurangkan dari setiap pengukuran dan nisbah isyarat CREB ke GAPDH dikira untuk setiap sampel. Untuk imunoblot yang striatal dan analisis EMSA, Scion Image 1.62c digunakan dengan penolakan latar belakang.

Immunoprecipitation Chromatin (Chip)

Ujian ChIP dilakukan mengikut kaedah Tsankova et al. (2004) and Kumar et al. (2005). Secara ringkas, sampel striatal dua hala dari tikus 11A yang dikekalkan pada atau di luar doxycycline dihubungkan silang dengan 1% formaldehid dan pautan silang dipadamkan dengan glisin (kepekatan akhir 0.125 M). Sampel ini berasal dari seluruh kepingan otak yang diambil pada tahap inti nukleus dengan korteks dikeluarkan. Chromatin dipotong menjadi kira-kira 0.2 hingga 1 kb fragmen melalui sonikasi, dibersihkan dengan manik-manik Protein G (Thermo Scientific # 22852), dan sampel input dibekukan pada -80 ° C. Antara 60 dan 100 μg kromatin digunakan untuk setiap pemendakan. 5-10 μg setiap antibodi primer digunakan (CREB: Bioteknologi Upstate # 06-863, ΔFosB: Bioteknologi Santa Cruz # SC-48x, asetilasi H3: Bioteknologi Upstate # 06-599, H3 metilasi (LYS9): Teknologi Isyarat Sel, cFos: Santa Cruz Bioteknologi # SC-7202x). Kompleks antibodi-kromatin diimunisasi dengan manik-manik Protein G plus mengikut arahan pembuatan (Thermo Scientific # 22852). Setelah penghubung silang balik input dan sampel yang diendapkan, setiap sampel dikenakan PCR kuantitatif (qPCR). Penggunaan semua antibodi ini untuk ChIP telah disahkan secara meluas (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Tahap pengikatan protein pada setiap promoter kepentingan gen ditentukan dengan mengukur jumlah DNA yang berkaitan dengan qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Input atau jumlah DNA (nonimmunopencipitated) dan DNA immunoprecipitated dikuatkan dalam tiga kali ganda dengan kehadiran SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Nilai Ct dari setiap sampel diperoleh dengan menggunakan perisian Pengesan Sequence 1.1. Kuantiti relatif DNA templat dilakukan menggunakan kaedah ΔΔCt (Tsankova et al., 2004). Primer digunakan: BDNF promoter 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; Promotor AGTCCACGAGAGGGCCCCA CDK5: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; Promoter CK GTGCCCCGCTCTTGTTATTA: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorphin promoter: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Analisis statistik

Semua data disajikan sebagai kaedah ± piawai ralat min. Perbezaan statistik ditentukan oleh ujian t ekor dua pelajar (p <0.05). Apabila banyak perbandingan dibuat, nilai p disesuaikan dengan pembetulan Bonferroni.

Pergi ke:

Penghargaan

Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Will Renthal dan Arvind Kumar untuk perbincangan yang berguna. Kami juga ingin mengucapkan terima kasih kepada NIDA untuk membiayai eksperimen ini.

Pergi ke:

Nota kaki

Penafian Penerbit: Ini adalah fail PDF bagi manuskrip yang tidak diedit yang telah diterima untuk penerbitan. Sebagai perkhidmatan kepada pelanggan kami, kami menyediakan versi awal manuskrip ini. Manuskrip akan menjalani penyalinan, menaip, dan mengkaji semula bukti yang dihasilkan sebelum ia diterbitkan dalam bentuk yang boleh dihukum akhir. Harap maklum bahawa semasa kesalahan proses produksi dapat ditemukan yang dapat mempengaruhi konten, dan semua penafian hukum yang berlaku untuk pertain jurnal.

Istilah pengkelasan:

Bahagian: #1 Biologi Selular dan Molekul Sistem Saraf

Pergi ke:

Rujukan

  1. Andersson M, Konradi C, Cenci MA. Protein pengikat elemen tindak balas cAMP diperlukan untuk ekspresi gen yang bergantung kepada dopamine dalam utuh tetapi bukan striatum dopamine-denervated. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
  2. Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. Kegiatan CREB dalam inti shell terkumpul mengawal tindak balas tingkah laku terhadap rangsangan emosi. Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99: 11435-40. [Artikel percuma PMC] [PubMed]
  3. MC Beinfeld, Connolly KJ, Pierce RC. Rawatan kokain meningkatkan cholecystokinin extracellular (CCK) dalam nukleus yang menimbulkan pergerakan terjaga, tikus bebas bergerak, kesan yang dipertingkatkan pada tikus yang berperilaku sensitif terhadap kokain. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
  4. Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones merangsang transkripsi gen kolecystokin usus melalui faktor tindak balas unsur adenosin monofosphat siklik. Endokrinologi. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
  5. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Kesan pendedahan kronik terhadap kokain dikawal oleh protein neuron Cdk5. Alam. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
  6. Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Pengecualian spesifik sel-jenis faktor transkripsi CREB ke elemen tindak balas cAMP. Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101: 13572-7. [Artikel percuma PMC] [PubMed]
  7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Peraturan protein delta FosB dan FosB dengan penyitaan electroconvulsive dan rawatan kokain. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, PE Shockett, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Haiwan transgenik dengan ekspresi gen yang disasarkan dan dijangka di dalam otak. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
  9. Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Induksi kinase 5 yang bergantung kepada siklik di hippocampus oleh kejutan elektroconvulsive kronik: peranan ΔFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
  10. Chinenov Y, Kerppola TK. Tutup pertemuan pelbagai jenis: Interaksi Fos-Jun yang menengahi kekhususan pengawalseliaan transkripsi. Oncogene. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
  11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Penyesuaian neuronal kepada amphetamine dan dopamin: mekanisme molekul gen prodynorphin dalam striatum tikus. Neuron. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
  12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. Pengawalan transkripsi gen CCK oleh PACAP dalam sel STC-1. Am J Physiol Gastrointest Physiol Hati. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
  13. Ding XZ, Mocchetti I. Kawalan dopaminergik kandungan mRNA cholecystokinin dalam striatum tikus. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
  14. Forrest S, keluarga McNamara C. Id, faktor transkripsi dan pembentukan lesi vaskular. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
  15. Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Keperluan-keperluan AMP- dan kinase protein yang bergantung kepada kalsium untuk pengaktifan transkrip gen cholecystokinin oleh hidrolisis protein. J Biol Chem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
  16. Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Induksi mengaktifkan faktor transkripsi (ATFs) ATF2, ATF3, dan ATF4 dalam nukleus accumbens dan peraturan kelakuan emosi mereka. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
  17. Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Limpahan dopamin dan cholecystokinin dalam nukleus tikus akrab sebagai tindak balas terhadap pentadbiran dadah akut. Sinaps. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
  18. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Protein kinase mitogen-protein dan protein kinase Jalur isyarat merangsang transkripsi cholecystokinin melalui pengaktifan protein pengikatan unsur adenosin 3′, 5′-monofosfat siklik. Mol Endokrinol. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
  19. Hansen TV, Nielsen FC. Peraturan transkripsi gen cholecystokinin neuron. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
  20. Hansen TV. Transkripsi gen cholecystokinin: elemen promoter, faktor transkripsi dan laluan isyarat. Peptida. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
  21. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl dan forskolin secara sinergistik menaikkan regulasi gen cholecystokinin melalui pengaktifan koordinat CREB dan CBP pengaktivasi. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
  22. Haun RS, Dixon JE. Peningkatan transkrip yang penting untuk ungkapan gen cholecystokinat tikus mengandungi urutan yang sama dengan unsur-296 gen manusia c-fos. J Biol Chem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
  23. Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Peranan penting gen fosB dalam molekul, selular, dan tindakan tingkah laku elektroconvulsive kronik. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
  24. Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Bukti untuk wujud bersama dopamin dan CCK dalam neuron meso-limbik. Alam. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
  25. Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Hasil rawatan elektroconvulsive kronik (ECS) dalam ekspresi kompleks AP-1 yang berpanjangan di otak dengan komposisi dan ciri-ciri yang berubah. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
  26. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Induksi kompleks AP-1 yang berpanjangan terdiri daripada protein seperti Fos yang diubah dalam otak oleh kokain kronik dan rawatan kronik yang lain. Neuron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
  27. Huang KX, Walters JR. Peraturan Dopaminergik AP-1 faktor transkripsi DNA mengikat aktiviti dalam striatum tikus. Neurosains. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
  28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Menentukan regimen CREB: analisis genom seluruh bidang pengawalseliaan faktor transkripsi. Sel. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
  29. Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Apa yang berubah CREB? Isyarat Sel. 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
  30. Josselyn SA, Vaccarino FJ. Menentang kesan antagonis CCK (A) dan CCK (B) terhadap perkembangan aktiviti yang terkondisi dalam tikus. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
  31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Bukti pengambilan reseptor CCK (A) dalam pemerolehan aktiviti yang dikonduksi oleh kokain pada tikus. Brain Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
  32. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Ekspresi faktor transkripsi deltaFosB di otak mengawal kepekaan terhadap kokain. Alam. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
  33. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, DW Self, Nestler EJ. Pengubahsuaian Chromatin adalah mekanisme utama yang mendasari kepekaan cocaine-induced in striatum. Neuron. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
  34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Fosforilasi CREB yang diakibatkan oleh kokain dalam nukleus akut tikus yang sensitif kokain didayakan dengan pengaktifan yang lebih tinggi daripada kinase yang berkaitan dengan isyarat ekstraselular, tetapi bukan protein kinase A. J Neurochem. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
  35. McClung CA, Nestler EJ. Peraturan ekspresi gen dan ganjaran kokain oleh CREB dan DeltaFosB. Nat neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
  36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: suis molekular untuk penyesuaian jangka panjang di dalam otak. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
  37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: Pengantara molekular untuk kepekaan neural dan tingkah laku jangka panjang. Brain Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
  38. Nestler EJ. Adakah terdapat laluan molekul biasa untuk ketagihan? Nat neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Mekanisme penagihan ketagihan: peranan DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. [Artikel percuma PMC] [PubMed]
  40. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, DW Self, Nestler EJ. Corak berbeza induksi DeltaFosB di otak oleh dadah penyalahgunaan. Sinaps. 2008; 62: 358-69. [Artikel percuma PMC] [PubMed]
  41. Rando OJ, Chang HY. Pemandangan luas struktur kromatin Genome. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [Artikel percuma PMC] [PubMed]
  42. Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB mengantara desensitisasi epigenetik gen c-fos selepas pendedahan amphetamine kronik. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [Artikel percuma PMC] [PubMed]
  43. Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Nestler EJ. Analisis genom seluruh kromatin oleh kokain menunjukkan peranan untuk sirtuin. Neuron. 2009; 62: 335-48. [Artikel percuma PMC] [PubMed]
  44. Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Modulasi cholecystokinin fungsi dopamin mesolimbi: peraturan tingkah laku yang bermotivasi. Toxicol Pharmacol. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
  45. Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Koperatif negatif antara juxtaposed E-box dan cAMP / TPA elemen responsif dalam promoter gen cholecystokinin. FEBS Lett. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
  46. Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Pemetaan serantau dan selular transkripsi CRE-mediated semasa pengeluaran morfin naltrexone-precipitated. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
  47. Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Peraturan transkripsi CRE-mediated dalam otak tikus oleh amphetamine. Sinaps. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
  48. Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Depolarization membran dan kalsium mendorong transkripsi c-fos melalui fosforilasi faktor transkripsi CREB. Neuron. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
  49. Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Pengubahsuaian histon di kawasan promoter gen di hippocampus tikus selepas kejutan electroconvulsive akut dan kronik. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
  50. Ulery PG, Nestler EJ. Peraturan aktiviti transkrip DeltaFosB oleh fosforilasi Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-30. [PubMed]
  51. Vaccarino FJ. Nukleus mengakui interaksi dopamine-CCK dalam ganjaran psikostimulan dan tingkah laku yang berkaitan. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207-14. [PubMed]
  52. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, MP Cassidy, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Peranan penting untuk ΔFosB dalam nukleus akrab dalam tindakan morfin. Alam Neurosci. 2006; 9: 205-11. [PubMed]