Pembentukan tulang belakang dendritik yang disebabkan oleh cocaine dalam D1 dan D2 yang mengandung reseptor dopamin yang mengandungi spin sederhana dalam nukleus accumbens (2006)

Proc Natl Acad Sci US A. Feb 28, 2006; 103 (9): 3399-3404.
Diterbitkan dalam talian Feb 21, 2006. doi:  10.1073 / pnas.0511244103
PMCID: PMC1413917
Neurosains
Artikel ini telah dikutip oleh artikel lain dalam PMC.

Abstrak

Perubahan yang disebabkan oleh psikostimulan disebabkan oleh dendritik duri pada dopaminoceptive neurons dalam nukleus accumbens (NAcc) telah dihipotesiskan sebagai tindak balas neuron adaptif yang dikaitkan dengan tingkah laku ketagihan yang tahan lama. NAcc sebahagian besarnya terdiri daripada dua subpopulations yang berbeza dari neuron berduri bersaiz sederhana yang menyatakan tahap tinggi sama ada dopamine D1 atau reseptor D2. Dalam kajian ini, kami menganalisis ketumpatan tulang belakang dendritik selepas rawatan kokain kronik di neuron berdenyut bersaiz sederhana D1 atau D2 yang berlainan di NAcc. Kajian ini menggunakan tikus transgenik yang menyatakan EGFP di bawah kawalan sama ada promoter reseptor D1 atau D2 (Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP). Selepas 28 hari rawatan kokain dan hari pengeluaran 2, ketumpatan tulang belakang meningkat pada kedua-dua neuron positif Drd1-EGFP- dan Drd2-EGFP. Walau bagaimanapun, peningkatan kepadatan tulang belakang dikekalkan hanya dalam hari-hari neuron Drd1-EGFP positif 30 selepas pengeluaran dadah. Terutamanya, peningkatan ekspresi ΔFosB juga diperhatikan dalam neuron Drd1-EGFP- dan neuron Drd2-EGFP selepas hari pengeluaran ubat 2 tetapi hanya dalam neuron Drd1-EGFP selepas hari pengeluaran ubat 30. Keputusan ini menunjukkan bahawa peningkatan ketumpatan tulang belakang yang diperhatikan selepas rawatan kokain kronik stabil hanya dalam neuron yang mengandungi reseptor D1 dan bahawa ekspresi ΔFosB dikaitkan dengan pembentukan dan / atau penyelenggaraan dendritik duri pada D1 serta neuron yang mengandungi reseptor D2 dalam NAcc.

Laluan dopaminergik mesolimbi terdiri daripada neuron di kawasan tegegalal ventral yang menyerap nukleus accumbens (NAcc), tuberkul olfactory, korteks prefrontal, dan amygdala (1), manakala neuron dopaminergik nigrostriat dalam substantia nigra (pars compacta) memberikan unjuran naik ke striatum dorsal (2). Psychostimulants meningkatkan konsentrasi dopamine sinaptik dalam NAcc: kokain, dengan menghalang pengambilan dopamin dari celah sinaptik, dan amphetamine, dengan mempromosikan pembebasan dopamin dari terminal saraf (3-5). Pentafiran psikostimulus yang berulang dan terulang mengakibatkan tindak balas tingkah laku yang meningkat (pemekaan) kepada kesan perangsang akut ubat-ubatan ini (6-8). Kebanyakan garis bukti mencadangkan bahawa perubahan adaptif dalam sistem dopaminergik kawasan tegegalal NACC adalah penting untuk perubahan dalam kepekaan yang bergantung kepada pengalaman yang mendasari kelakuan yang disebabkan oleh dadah.

Sebagai tambahan kepada dopamin, glutamat diperlukan untuk perkembangan pemekaan tingkah laku sebagai tindak balas kepada psychostimulants (9, 10). Neuron berkilat bersaiz sederhana (MSNs) dalam striatum ventral menerima unjuran glutamatergik yang mengujakan dari korteks prefrontal yang sinaps ke kepala dendritik duri. MSN juga merupakan sasaran utama untuk aksop dopaminergik yang sinaps ke leher tulang belakang (1, 11, 12). Oleh itu, dendritik duri di MSN mewakili ruang selular di mana penghantaran dopaminergik dan glutamatergik pada mulanya terintegrasi.

Dopamine bertindak pada dua subfamili reseptor utama, subfamili D1 (subjek D1 dan D5) dan subfamili D2 (D2, D3, dan D4 subtipe) (13). Dalam striatum punggung, kajian anatomi telah menunjukkan bahawa MSN striatonigral mengandungi paras reseptor D1 yang tinggi (bersama-sama dengan bahan P dan dynorphin), sedangkan MSN striatopallidal terutamanya menyatakan reseptor D2 (bersama-sama dengan enkephalin)14-17). Unjuran daripada NAcc adalah lebih kompleks daripada striatum dorsal, dengan bahagian shell dan teras NAcc memproyeksikan ke subspesial yang berbeza dari pallidum ventral dan ke kawasan tegmental ventral dan substantia nigra (18). Manakala reseptor D2 dan enkephalin sangat dinyatakan dalam unjuran ke pallidum ventral, reseptor D1 dan bahan P didapati sama diagihkan dalam unjuran ke pallidum ventral dan kawasan tegegal ventral (19). Kajian agonis dan antagonis yang terpilih untuk reseptor D1 atau D2 menunjukkan bahawa kedua-dua reseptor D1 dan D2 diperlukan untuk perubahan perilaku psikostimulus yang bergantung kepada20-25). Walau bagaimanapun, peranan reseptor ini kelihatan berbeza. Sebagai contoh, rangsangan reseptor D1 membekalkan cocaine mencari yang disebabkan oleh suntikan kokain dan kokain yang berkaitan dengan kokain, sementara rangsangan reseptor D2 memudahkan pengambilan semula kokain (26-28).

Keabnormalan tingkah laku yang dikaitkan dengan ketagihan psychostimulant sangat lama. Oleh itu, terdapat banyak minat dalam mengenal pasti perubahan yang disebabkan oleh dadah yang berpanjangan pada tahap molekul dan struktur dalam litar neuron yang dikawal oleh dopamin dan glutamat (29-32). Terutama, pendedahan jangka panjang terhadap kokain atau amphetamine telah didapati untuk meningkatkan bilangan titik cawangan dendritik dan duri MSN di NAcc (33-35). Perubahan struktur ini telah ditunjukkan untuk bertahan sehingga ≈1-3.5 bulan selepas pendedahan dadah terakhir (30, 35) dan telah dicadangkan untuk mengatasi perubahan jangka panjang dalam kepekaan sinaptik yang berkaitan dengan pendedahan psikostimulus.

Matlamat kajian ini adalah untuk mengkaji pengubahsuaian kokain yang disebabkan oleh kokain dendritik dalam subpopulasi MSN accumbal yang menyatakan sama ada reseptor D1 atau D2. Dalam kajian ini, kita telah menggunakan tikus transgenik buatan bakteria bakteria (BAC) yang menyatakan EGFP di bawah kawalan sama ada promoter reseptor dopamine D1 (Drd1-EGFP) atau D2 (Drd2-EGFP)36). Hasilnya menunjukkan bahawa, walaupun ketumpatan tulang belakang yang meningkat pada mulanya berlaku di MSNs yang mengandungi MSNs yang mengandungi reseptor D1 dan MSN yang mengandungi reseptor D2, ketumpatan tulang belakang yang berubah-ubah stabil hanya dalam neuron yang mengandungi reseptor D1. Lebih-lebih lagi, kita mendapati perubahan yang sama dalam ungkapan faktor transkripsi ΔFosB, menunjukkan bahawa ΔFosB mungkin terlibat dalam pembentukan dan / atau penyelenggaraan dendritik duri pada D1 serta neuron yang mengandungi reseptor D2 di NAcc.

Hasil

Analisis MSN dalam Tikus Transgenik Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP BAC.

Corak unjuran MSN dari strokes dorsal dan ventral di tikus transgenik Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP BAC telah dicirikan melalui analisis ekspresi GFP (36). Ekspresi beragam GFP di MSNs striatum dorsal sepadan secara umumnya kepada reseptor D1 atau D2 endogen, masing-masing36). Kami selanjutnya menganalisis ungkapan berbeza GFP dalam NAcc dalam tikus Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP (Rajah 1a and b). Walaupun ≈58% neuron di NAcc menyatakan GFP dalam tikus Drd1-EGFP (Rajah 1a), ≈48% daripada neuron di NAcc dinyatakan GFP dalam tikus Drd-2-EGFP (Rajah 1b). MSN mewakili 90-95% daripada semua neuron di NAcc (12, 37). Reseptor D1 hanya dinyatakan dalam MSN, dan reseptor D2 dinyatakan dalam MSN dan dalam interneuron cholinergic, yang mewakili 1-3 neuron striatal (37). Mengambil kira faktor-faktor ini, keputusan menunjukkan bahawa, minima, ≈10-15% MSN di NAcc berkemungkinan menyatakan kedua-dua reseptor D1 dan D2.

Rajah. 1. 

Analisis MSN dalam tikus Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP. (a and b) Tetap otak tetap dari NAcc daripada Drd1-EGFP (a) atau Drd2-EGFP (b) BAC tikus transgenik telah diimunkan untuk GFP dan NeuN (sebagai penanda neuron umum). Imej yang digabungkan menunjukkan, dalam kuning, kolokalisasi ...

Analisis Spin Dendritik dalam Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP Tikus.

Ekspresi GFP dalam tikus Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP berguna untuk mencemarkan badan sel neuron. Walau bagaimanapun, isyarat GFP dalam dendrit dan dendritik duri adalah terlalu lemah untuk membolehkan analisis mereka selepas immunostaining dengan antibodi anti-GFP. Pengiriman balistik yang dikawal oleh zarah-pewarna pendarfluor baru-baru ini telah digunakan untuk melabel populasi neuron secara cepat dan cekap (38). Seluruh neuron boleh dilabel menggunakan teknik ini, dan kaedahnya kelihatan sama dengan Golgi-Cox pewarnaan. Untuk menganalisis morfologi neuron dendritik di NAcc, irisan accumbal tetap dilabelkan dengan pewarna pendarfluor lipofilik 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) dengan menggunakan pistol gen. Satu contoh MSN yang ternoda ditunjukkan di dalam Rajah 1c. Di bawah syarat-syarat yang digunakan, kita secara amnya melihat berlabel neuron tanpa sebarang dendrit yang bertindih dari neuron berlabel lain. Pada perbesaran yang lebih tinggi, morfologi dendritik terperinci, termasuk dendritik duri, dapat diperhatikan (Rajah 1d).

Kami kemudian menggunakan gabungan label dan imunohistokimia DiI untuk GFP sama ada pada tikus transgenik Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP, yang mungkin dilakukan dengan menggunakan konsentrasi detergen yang rendah untuk permeabilisasi tisu (lihat Kaedah). Melalui perbandingan yang teliti mengenai kesan NI dan GFP dalam badan sel MSN, kita dapat mengenal pasti neuron DiI- dan GFP positif atau DiI positif dan GFP negatif dalam Drd1-EGFP (Rajah 2a) atau Drd2-EGFP (Rajah 2b) tikus. Untuk kajian berikut, kami menganalisis morfologi dendritik dalam hanya neuron DiI- dan GFP positif dari tikus Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP.

Rajah. 2. 

Analisis dendritik duri pada tikus Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP. Neuron di NAcc sama ada tikus Drd1-EGFP (a) atau tikus Drd2-EGFP (b) pertama dilabelkan dengan DiI (merah) dan kemudian tertakluk kepada imunohistokimia menggunakan antibodi anti-GFP (EGFP, hijau). Hanya ...

Keputusan Rawatan Kokain Kronik dalam Ketumpatan Tebal Meningkat di MSN Accumbal Menegaskan Sama ada Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP.

Tikus Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP disuntik berulang kali dengan kokain (30 mg / kg) atau garam selama empat minggu berturut-turut (lihat Kaedah). Dua hari (2WD) atau 30 hari (30WD) selepas rawatan dadah yang terakhir, otak diproses untuk label DiI dan imunohistokimia seperti yang diterangkan di atas. Kajian terdahulu melaporkan bahawa rawatan kronik dengan amphetamine meningkat kepadatan tulang belakang pada distal tetapi bukan proksimal dendrites MSNs di NAcc (35). Oleh itu, kami mengehadkan analisis kami kepada dendrite distal (iaitu mereka yang mempunyai cawangan kedua atau ketiga), termasuk kawasan terminal. Apabila dianalisis di 2WD, kepadatan tulang belakang didapati meningkat dalam MSNs Drd1-EGFP-positif (128% daripada kumpulan asin) (Rajah 3a and c) dan pada tahap yang lebih rendah dalam neuron positif Drd2-EGFP (115% daripada kumpulan asin) (Rajah 3 b and d). Selepas 30WD, kepadatan tulang belakang meningkat dikekalkan dalam neuron Drd1-EGFP positif (118% kawalan saline) (Rajah 3 a and c) tetapi tidak dalam neuron positif Drd2-EGFP (Rajah 3 b and d).

Rajah. 3. 

Kenaikan kokain kronik yang meningkat dalam kepadatan tulang belakang dalam MSNs Drd1-EGFP- atau Drd2-EGFP-positif di NAcc. (a and b) Drd1-EGFP (a) atau Drd2-EGFP (b) tikus dirawat dengan saline (Sal) atau kokain (Coc, 30 mg / kg) untuk minggu 4. Otak tikus 2WD atau 30WD telah diproses ...

Morfologi dendritik duri adalah berubah-ubah dari segi panjangnya dan lebar kepala tulang belakang. Oleh itu, kami mengelaskan prototaip dendritik ke dalam empat kelas tulang belakang (stubby, cendawan, nipis, dan filopodia) di 2WD dari kokain (data tidak ditunjukkan). Ketumpatan jenis cendawan (119.7 ± 4.0%, P <0.01) dan duri nipis (120.0 ± 3.4%, P <0.01) ditingkatkan dengan rawatan kokain pada MSD positif Drd1-EGFP, sedangkan ketumpatan stubby (182.4 ± 21.6%, P <0.05) dan duri jamur (122.5 ± 5.0%, P <0.01) meningkat dalam MSN positif Drd2-EGFP. Tidak ada peningkatan yang signifikan pada tulang belakang yang degil pada neuron positif Drd1-EGFP atau tulang belakang nipis pada neuron positif Drd2-EGFP.

Cocaine Chronic Mengasaskan Ekspresi ΔFosB dalam MSNs Drd1-EGFP- atau Drd2-EGFP-Positif MSN di NAcc.

ΔFosB adalah ahli keluarga Fos dari faktor transkripsi. Manakala pentadbiran akut kokain menginduksi induksi pesat dan transien beberapa isoform Fos di NAcc, pendedahan berulang kepada kokain meningkatkan tahap ΔFosB. Tambahan pula, peningkatan ekspresi ΔFosB berterusan dalam NAcc selama berminggu-minggu hingga beberapa bulan selepas pemberhentian pendedahan dadah dan telah dicadangkan untuk terlibat dalam pengawalseliaan ekspresi gen yang tahan lama, walaupun setelah pengambilan dadah berhenti (29, 39, 40).

Untuk memeriksa induksi ΔFosB di NAcc dari tikus Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP selepas rawatan kokain, kami menganalisis FosB dan ekspresi GFP dengan label dua kali (Rajah 4 and Jadual 1) Antibodi anti-FosB mengiktiraf semua bentuk FosB, tetapi kami mengandaikan bahawa peningkatan immunostain mewakili ΔFosB (lihat Kaedah untuk perbincangan lanjut). Dalam tikus yang dirawat salin, 16% daripada neuron positif Drd1-EGFP dan 15% daripada neuron positif Drd2-EGFP melambangkan immunoreactivity FosB dengan intensiti yang lemah (Rajah 4 a and b and Jadual 1). Rawatan kokain berulang diikuti oleh 2WD mengakibatkan peningkatan yang ketara dalam bilangan neuron positif Drd1-EGFP yang dicatatkan ΔFosB (55% neuron positif GFP) (Rajah 4c and Jadual 1). Peningkatan yang lebih kecil, tetapi masih ketara dalam ungkapan ΔFosB didapati dalam neuron positif Drd2-EGFP (25% daripada neuron positif GFP) (Rajah 4d and Jadual 1). Seperti perubahan pada ketumpatan tulang belakang, peningkatan ekspresi ΔFosB dikekalkan dalam neuron Drd1-EGFP positif (46% neuron positif GFP) tetapi tidak dalam neuron positif Drd2-EGFP (15% neuron positif GFP) selepas 30WD (Rajah 4 e and f and Jadual 1). Perhatikan bahawa ekspresi ΔFosB yang meningkat dalam Rajah 4f hadir dalam neuron Drd2-EGFP-negatif.

Rajah. 4. 

Kokain kronik mendorong ekspresi ΔFosB dalam MSNs Drd1-EGFP- atau Drd2-EGFP-positif di NAcc. Drd1-EGFP (a, c, dan e) atau Drd2-EGFP (b, d, dan f) tikus dirawat dengan masin atau kokain kronik seperti yang diterangkan di dalam Rajah 3. 2WD (c and d) atau 30WD (e and ...
Jadual 1. 

Pengkajian neuron positif EGFP yang menyatakan ΔFosB

Perbincangan

Penyesuaian yang tahan lama dalam neurotransmission dopaminergik dipercayai mendasari kelakuan ketagihan yang dikaitkan dengan ubat psikostimulan. Khususnya, peningkatan psikostimulan yang disebabkan oleh ketumpatan tulang belakang dendritik MSN di NAcc telah dihipotesiskan untuk dikaitkan dengan penyusunan semula penyambungan sinaptik (30). NAcc sebahagian besarnya terdiri daripada dua subpopulations berbeza MSNs yang menyatakan tahap tinggi sama ada reseptor D1 atau D2 dopamin. Dalam kajian ini, kami telah menganalisis ketumpatan tulang belakang dalam MSNs yang mengandungi D1 atau D2 yang berbeza dalam NAcc selepas rawatan kokain kronik. Keputusan yang diperoleh menunjukkan bahawa, walaupun kepadatan tulang belakang yang meningkat pada mulanya berlaku di MSNs yang mengandungi reseptor D1 dan MSN yang mengandungi reseptor D2, ketumpatan tulang belakang yang diubah hanya stabil dalam neuron yang mengandungi D1-reseptor. Lebih-lebih lagi, kita mendapati corak perubahan yang sama dalam ungkapan faktor transkripsi ΔFosB dalam MSN yang mengandungi reseptor D1 dan D2.

Kajian-kajian ini menggunakan tikus transgenik BAC yang menyatakan GFP dalam subpopulasi spesifik MSN di bawah kawalan sama ada promotor reseptor D1 atau D2. Lebih-lebih lagi, kami membangunkan satu kaedah double-labeling yang menggabungkan immunohistochemistry untuk GFP dengan pelabelan balistik neuron menggunakan DiI. Kajian terdahulu telah menggunakan kaedah Golgi-Cox untuk menganalisis kesan psikostimulus pada kepadatan tulang belakang34), dan kaedah DiII yang digunakan di sini memberi hasil yang bersamaan dengan kuantitatif. Kami membangunkan kaedah double labeling kerana pewarnaan Golgi tidak sesuai dengan imunohistokimia. Immunostaining biasanya memerlukan permeabilisasi tisu dengan detergen, satu proses yang biasanya membawa kepada solubilisasi pewarna lipofil dari membran (38). Walau bagaimanapun, dalam kajian semasa kami, pemadaman GFP tidak memerlukan konsentrasi detergen yang tinggi untuk permeabilisasi tisu dan dengan itu boleh digunakan bersama dengan label pewarna lipophilic. Kaedah dua-pelabelan kami harus berguna secara amnya untuk mengkaji perubahan struktur dalam dendritik duri, contohnya apabila digunakan untuk analisis garis tikus transgenik BAC di mana GFP dinyatakan dalam populasi neuron khusus dalam korteks (36).

Walaupun masih agak kontroversial, dipercayai bahawa reseptor D1 dan D2 sebahagian besarnya secara anatomis dipisahkan kepada neuron unjuran langsung (striatonigral) dan tidak langsung (striatopallidal)17, 41). Pencirian awal penyetempatan GFP dalam tikus Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP adalah konsisten dengan kesimpulan ini (36). Selain itu, analisis kami terhadap jumlah neuron positif GFP di NAcc dari tikus Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP adalah selaras dengan kesimpulan bahawa ≈50% MSN hanya menyatakan reseptor D1, bahawa ≈35-40% hanya menyatakan reseptor D2, dan itu ≈10-15% coexpress kedua-dua D1 dan D2 reseptor. Nilai coexpression ini adalah sama dengan yang ditunjukkan oleh kajian striatum dorsal yang menggabungkan analisis patch-clamp neuron striatal tunggal dengan teknik RT-PCR untuk mengasingkan dan menguatkan mRNAs (≈17% coexpression of enkephalin dan bahan P)42). Perlu diingatkan bahawa kajian semasa kami tidak menangani persoalan ekspresi reseptor D3, D4, dan D5, ataupun mereka menangani isu tahap rendah ekspresi reseptor D1 di MSN yang menyatakan tahap reseptor D2 yang tinggi atau sebaliknya.

Beberapa kajian terdahulu telah mengkaji penyataan neuronal psychostimulant-induced Fos expression dan peranan reseptor D1 dan D2 (43-45). Kajian-kajian tersebut menyokong kesimpulan bahawa Fos dan induksi FFBB dimediasi dengan pengaktifan reseptor D1. Walau bagaimanapun, penyetempatan selular Fos dipengaruhi oleh konteks alam sekitar di mana ubat psikostimulan diberikan (46, 47). Sebagai contoh, amphetamine atau kokain yang diberikan di kandang rumah mendorong gen awal segera (termasuk Fos) secara sengaja dalam sel-sel positif P-positif yang menyerupai reseptor D1. Sebaliknya, ubat-ubatan ini boleh mendorong ekspresi Fos dalam MSN yang mengandungi D1 dan D2 yang terdapat dalam persekitaran novel. Protokol yang digunakan dalam kajian semasa kami tidak termasuk suntikan dadah berpasangan dengan pendedahan kepada persekitaran baru. Walau bagaimanapun, kita tidak boleh menolak beberapa jenis tegasan bergantung konteks yang bertanggungjawab untuk ekspresi ΔFosB dalam MSN yang mengandungi reseptor D2.

Ciri-ciri yang ketara pada hasil sekarang ialah corak ketumpatan tulang belakang yang meningkat dan ekspresi ΔFosB. Ketumpatan tulang belakang dan ungkapan ΔFosB pada mulanya berlaku dalam MSN yang menyatakan Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP. Walau bagaimanapun, perubahan ini hanya stabil dalam neuron yang mengandungi reseptor D1. Satu penjelasan yang mungkin untuk pemerhatian yang meningkatkan ketumpatan tulang belakang dan ungkapan ΔFosB secara transiently dijumpai dalam neuron yang mengandungi reseptor D2 adalah bahawa ini berlaku dalam pecahan kecil MSN yang menyerupai reseptor dopamine D1 dan D2. Oleh itu, sifat sementara peningkatan ini mungkin dikaitkan dengan kesan antagonis dari pengaktifan D2 reseptor pada laluan isyarat yang bergantung kepada D1 (48). Adalah penting bahawa perubahan ketumpatan tulang belakang dan ungkapan ΔFosB dapat diterbalikkan, yang mungkin mencerminkan keupayaan jalur isyarat yang bergantung kepada reseptor D2 untuk mempengaruhi kestabilan ΔFosB.

Pemerhatian bahawa terdapat perubahan selari dalam ungkapan ΔFosB dan ketumpatan tulang belakang adalah konsisten dengan idea bahawa ΔFosB terlibat dalam pembentukan awal dan penyelenggaraan dendritik duri pada neuron yang mengandung reseptor D1 di NAcc. Ungkapan ΔFosB dikendalikan oleh jalur isyarat yang bergantung pada D1 / DARPP-32 / PP1 di MSN (49). Beberapa kajian menunjukkan bahawa ΔFosB memainkan peranan penting dalam tindakan psikostimulan yang memberi ganjaran dan locomotor39), mungkin dengan mempengaruhi ungkapan pelbagai gen yang merangkumi reseptor neurotransmitter, memberi isyarat protein, dan protein yang terlibat dalam pengawalan morfologi neuron (50). Walau bagaimanapun, mekanisme molekul tertentu yang terlibat dalam pembentukan tulang belakang akibat kokain yang kronik tidak diketahui sekarang. Kajian terdahulu kami telah menunjukkan bahawa infusi intraaccumbal dari perencat Cdk5 roscovitine melemahkan kenaikan kokain yang disebabkan oleh ketumpatan tulang belakang51). Lebih-lebih lagi, Cdk5 adalah gen sasaran hiliran untuk ΔFosB dan telah terlibat dalam perubahan penyesuaian ganti rugi yang berkaitan dengan rawatan kokain kronik (52). Oleh itu, perubahan dalam fosforilasi yang bergantung kepada Cdk5 adalah mekanisme yang mendasari pembentukan tulang belakang yang disebabkan oleh kokain dan / atau kestabilan tulang belakang. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55), dan spinophilin (56) adalah substrat untuk Cdk5 dan semuanya terlibat dalam peraturan morphogenesis tulang belakang (57-60). Pencirian lanjut ini dan substrat Cdk5 yang lain di duri diharapkan dapat memberi gambaran tentang mekanisme yang terlibat dalam pengawalan pembentukan tulang belakang oleh psikostimulus.

Kaedah

Haiwan.

Tikus yang membawa transgene EGFP di bawah kawalan sama ada reseptor D1 atau D2 dihasilkan oleh projek transgenik Gensat BAC (36). Tikus transgenik yang digunakan dalam kajian ini adalah minggu 4-5 dan berada di latar belakang Swiss-Webster. Tikus dikekalkan dalam siklus cahaya / gelap 12: 12-h dan ditempatkan dalam kumpulan 2-5 dengan libitum iklan makanan dan air. Semua protokol haiwan sesuai dengan Institut Panduan Kesihatan Nasional untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Rockefeller University.

Rawatan Dadah.

Rawatan kokain kronik (30 mg / kg, setiap hari) dilaporkan menghasilkan peningkatan ketumpatan tulang belakang MSN dalam kedua-dua inti dan cangkang NAcc dari tikus, tetapi dos yang lebih rendah (15 mg / kg) meningkat kepadatan tulang belakang hanya dalam cangkang (61). Oleh itu, kami menggunakan dos kokain yang lebih tinggi untuk mendorong pengubahsuaian struktur di kedua-dua bahagian NAcc. Tikus menerima satu suntikan (ip) 30 mg / kg kokain-HCl (atau garam) setiap hari untuk 5 hari berturut-turut, diikuti oleh hari tanpa suntikan 2, dan prosedur ini diulangi untuk 4 minggu berturut-turut. Suntikan telah dijalankan di kandang rumah. 2WD atau 30WD, otak tikus diproses untuk pelabelan DiI dan / atau imunohistokimia.

Pelabelan Ballistic dengan Dye Fluorescent DiI.

Tikus telah dibiakkan dengan 80 mg / kg natrium pentobarbital dan transoksial dengan 5 ml PBS, diikuti oleh perfusi pesat dengan 40 ml 4% paraformaldehyde dalam PBS (20 ml / min). Otak dengan cepat dikeluarkan dari tengkorak dan postfixed di 4% paraformaldehyde untuk min 10. Irisan otak (100 μm) dilabel oleh penghantaran balistik pendarfluor DiI (Probe Molekul) seperti yang diterangkan dalam ref. 38. Kaedah pelabelan-imunohistokimia DiI dikembangkan dengan kepekatan detergen yang rendah. Bahagian dii berlabel telah diperkestabilkan dengan 0.01% Triton X-100 dalam PBS untuk min 15 dan kemudian diinkubasi dalam serum kambing normal 0.01% Triton X-100 dan 10% dalam PBS untuk 1 h untuk meminimumkan label tidak spesifik. Bahagian-bahagian tisu kemudian diinkubasi dengan 1% serum kambing normal / 0.01% Triton X-100 dan anti-GFP antibodi (Abcam, Cambridge, MA) untuk 2 h pada suhu bilik, dibasuh, dan diinkubasi dalam pencairan 1: 1,000 FITC- antibodi sekunder konjugasi (Probe Molekul). Seksyen diletakkan pada slaid mikroskop dan coverlipped dengan medium pemasangan. Kaedah pelabelan balistik membenarkan analisis terperinci mengenai struktur tulang dendritik, dan hasil yang diperolehi secara kualitatif dan kuantitatif sebanding dengan kajian terdahulu menggunakan kaedah impregnasi Golgi-Cox dalam hirisan otak tikus34). Walau bagaimanapun, berbeza dengan kajian terdahulu, kami jarang melihat duri dua kepala di neuron Dii yang berwarna. Perbezaan ini mungkin disebabkan oleh sensitiviti kaedah pewarnaan atau kepelbagaian tetikus (kajian ini) berbanding tisu tikus (34).

Imunohistokimia.

Haiwan-haiwan telah dibiakkan dan diratakan seperti yang dijelaskan di atas. Otak dikeluarkan dan disimpan semalaman dalam 4% paraformaldehyde pada 4 ° C. Otak dipindahkan ke 30% sukrosa dalam penyelesaian PBS untuk cryoprotection. Bahagian korona (12 μm) dipotong pada microtome beku (Leica) dan kemudian diproses untuk imunohistokimia. Bahagian otak kemudian diperkestabilkan dalam 0.3% Triton X-100 dalam PBS untuk min 15 dan dibilas dua kali dalam PBS. Bahagian-bahagian itu telah diberi preparasi dalam serum kambing normal 10% pada PBS untuk 1 h pada 37 ° C, yang terdedah kepada antibodi primer (dilarutkan dalam serum kambing normal 1% dalam PBS) semalaman di 4 ° C, kemudian dicuci di PBS dan diinkubasi dengan sekunder antibodi untuk 1 h pada 37 ° C. Antibodi-antibodi berikut telah digunakan: anti-pan-FosB arnab (SC-48, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-NeuN (Chemicon) mouse, anti-GFP arnab, konjugated anti-mouse IgG (Probe Molekul). Untuk label tiga kali ganda (ΔFosB, NeuN, dan GFP), bahagian otak mula-mula dihidunkan dengan antibodi antibodi anti-pan FosB dan antibodi anti-NeuN dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder (IgG anti-arang yang terkandung rhodamine dan IgG anti-tikus cyan-conjugated ). Bahagian otak yang berlapis dua lagi diproses untuk pemanfaatan GFP menggunakan teknologi pelabelan Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Probe Molekul). Antibodi anti-pan-FosB dinaikkan ke terminal N FosB dan mengiktiraf ΔFosB dan FosB panjang penuh (FosB)62). Berdasarkan kajian terdahulu yang menunjukkan bahawa ΔFosB tetapi tidak FosB atau antigen yang berkaitan dengan Fos dinyatakan dengan tegas selepas rawatan kokain kronik, kita mengandaikan bahawa peningkatan jangka panjang dalam imunoreaktiviti merupakan ungkapan stabil ΔFosB. Bagaimanapun, identiti isyarat FosB immunoreaktif yang diperhatikan dalam tikus yang dirawat salin tidak diketahui. Analisis statistik di Malaysia Jadual 1 menggunakan Pelajar t ujian.

Analisis tulang belakang dendritik.

MSN individu dalam NAcc dipilih untuk analisis tulang belakang berdasarkan beberapa kriteria. (i) Terdapat minimum atau tidak bertindih dengan sel berlabel lain untuk memastikan bahawa proses dari sel yang berbeza tidak akan dikelirukan. (ii) Sekurang-kurangnya tiga dendrit utama diperlukan untuk dilihat untuk sel yang akan digunakan untuk analisis. (iii) Dendrit distal (dendrit terminal atau dekat dengan dendrit terminal) diperiksa. Dendrit dari kedua MSN di inti dan cangkang NAcc dianalisis. Walaupun kami memerhatikan MSN berduri jarang (jenis berduri II), kami menganalisis hanya MSN berduri padat (jenis I berduri). Untuk mengira kepadatan tulang belakang, panjang dendrit (> 20 μm panjang) dikesan dengan menggunakan mikroskop confocal (Zeiss LSM 510) dengan lensa rendaman minyak (× 40). Semua gambar dendrit diambil secara berbeza z tahap (0.5-1 μm kedalaman kedalaman) untuk memeriksa morfologi dendritik duri. Semua pengukuran dibuat dengan perisian analisis imej metamorf (Universal Imaging, Downingtown, PA). Analisis statistik menggunakan ujian Kolmogorov-Smirnov.

Protrusions dari dendrites dikelaskan kepada empat jenis berdasarkan panjangnya seperti yang diterangkan dalam ref. 63 and 64. Penonjolan kelas 1, juga disebut protuberances stubby, panjangnya <0.5 μm, tidak mempunyai kepala tulang belakang yang besar, dan tampaknya tidak mempunyai leher; kelas 2, atau duri berbentuk cendawan, panjangnya antara 0.5 dan 1.25 μm dan dicirikan oleh leher pendek dan kepala tulang belakang yang besar; kelas 3, atau duri nipis, berkisar antara 1.25 dan 3.0 μm dan leher leher tulang belakang memanjang dengan kepala kecil; kelas 4, atau sambungan filopodial, adalah tonjolan filamen panjang yang tidak mempunyai kepala tulang belakang yang dapat dilihat.

Penghargaan

Kerja ini disokong oleh Geran Perkhidmatan Kesihatan Awam Amerika Syarikat DA10044 (PG dan ACN) dan oleh The Simons Foundation, Yayasan Peter J. Sharp, Yayasan Picower, dan Yayasan FM Kirby.

Singkatan

  • NAcc
  • nukleus accumbens
  • MSN
  • neuron berduri sederhana
  • BAC
  • kromosom buatan bakteria
  • Drd1
  • Dopamine reseptor yang didorong oleh promoter D1
  • Drd2
  • Dopamine reseptor yang didorong oleh promoter D2
  • DiI
  • 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate
  • 2WD
  • 2 hari selepas rawatan dadah lepas
  • 30WD
  • 30 hari selepas rawatan dadah lepas.

Nota kaki

 

Pernyataan konflik kepentingan: Tiada konflik yang diisytiharkan.

Rujukan

1. Totterdell S., Smith ADJ Chem. Neuroanat. 1989; 2: 285-298. [PubMed]
2. Smith Y., Bevan MD, Shink E., Bolam JP Neuroscience. 1998; 86: 353-387. [PubMed]
3. Heikkila RE, Orlansky H., Cohen G. Biochem. Pharmacol. 1975; 24: 847-852. [PubMed]
4. Ritz MC, Lamb RJ, Goldberg SR, Sains Kuhar MJ. 1987; 237: 1219-1223. [PubMed]
5. Nestler EJ Trends Pharmacol. Sci. 2004; 25: 210-218. [PubMed]
6. Kalivas PW, Stewart J. Brain Res. Wahyu 1991; 16: 223-244. [PubMed]
7. Pierce RC, Kalivas PW Brain Res. Wahyu 1997; 25: 192-216. [PubMed]
8. Robinson TE, Berridge KC Annu. Psikol Rev. 2003; 54: 25-53. [PubMed]
9. Wolf ME, Khansa MR Brain Res. 1991; 562: 164-168. [PubMed]
10. Vanderschuren LJ, Kalivas PW Psychopharmacology. 2000; 151: 99-120. [PubMed]
11. Sesack SR, Pickel VMJ Comp. Neurol. 1992; 320: 145-160. [PubMed]
12. Smith AD, Bolam JP Trends Neurosci. 1990; 13: 259-265. [PubMed]
13. Sibley DR, Monsma FJ, Jr. Trends Pharmacol. Sci. 1992; 13: 61-69. [PubMed]
14. Beckstead RM, Cruz CJ Neurosains. 1986; 19: 147-158. [PubMed]
16. Gerfen CR, Young WS, III Brain Res. 1988; 460: 161-167. [PubMed]
16. Gerfen CR Trends Neurosci. 2000; 23: S64-S70. [PubMed]
17. Gerfen CR, Engber TM, Mahan LC, Susel Z., Chase TN, Monsma FJ, Jr., Sibley DR Science. 1990; 250: 1429-1432. [PubMed]
18. Zahm DS Neurosci. Biobehav. Wahyu 2000; 24: 85-105. [PubMed]
19. Lu X.-Y., Ghasemzadeh MB, Kalivas PW Neurosains. 1998; 82: 767-780. [PubMed]
20. Koob GF, Le HT, Creese I. Neurosci. Lett. 1987; 79: 315-320. [PubMed]
21. Woolverton WL, Virus RM Pharmacol. Biochem. Behav. 1989; 32: 691-697. [PubMed]
22. Bergman J., Kamien JB, Spealman RD Behav. Pharmacol. 1990; 1: 355-363. [PubMed]
23. Ahli Parlimen Epping-Jordan, Markou A., Koob GF Brain Res. 1998; 784: 105-115. [PubMed]
24. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Bergman JJ Pharmacol. Exp. Ther. 1999; 291: 353-360. [PubMed]
25. De Vries TJ, Cools AR, Shippenberg TS NeuroReport. 1998; 9: 1763-1768. [PubMed]
26. Self DW, Barnhart WJ, Lehman DA, Sains EJ Nestler. 1996; 271: 1586-1589. [PubMed]
27. Khroyan TV, Barrett-Larimore RL, Rowlett JK, Spearman RDJ Pharmacol. Exp. Ther. 2000; 294: 680-687. [PubMed]
28. Alleweireldt AT, Weber SM, Kirschner KF, Bullock BL, Neisewander JL Psychopharmacology. 2002; 159: 284-293. [PubMed]
29. Nestler EJ Nat. Wahyu Neurosci. 2001; 2: 119-128. [PubMed]
30. Robinson TE, Kolb B. Neuropharmacology. 2004; 47: 33-46. [PubMed]
31. Kalivas PW Curr. Pendapat. Pharmacol. 2004; 4: 23-29. [PubMed]
32. Hyman SE, Malenka RC Nat. Wahyu Neurosci. 2001; 2: 695-703. [PubMed]
33. Robinson TE, Kolb BJ Neurosci. 1997; 17: 8491-8497. [PubMed]
34. Robinson TE, Kolb B. Eur. J. Neurosci. 1999; 11: 1598-1604. [PubMed]
35. Li Y., Kolb B., Robinson TE Neuropsychopharmacology. 2003; 28: 1082-1085. [PubMed]
36. Gong S., Zheng C., ML Doughty, Losos K., Didkovsky N., Schambra UB, Nowak NJ, Joyner A., ​​Leblanc G., Hatten ME, et al. Alam. 2003; 425: 917-925. [PubMed]
37. Zhou FM, Wilson CJ, Dani JAJ Neurobiol. 2002; 53: 590-605. [PubMed]
38. Grutzendler J., Tsai J., Gan WB Methods. 2003; 30: 79-85. [PubMed]
39. Kelz MB, Chen J., Carlezon WA, Jr., Whisler K., Gilden L., Beckmann AM, Steffen C., Zhang YJ, Marotti L., Self DW, et al. Alam. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
40. Nestler EJ Neuropharmacology. 2004; 47: 24-32. [PubMed]
41. Le Moine C., Bloch BJ Comp. Neurol. 1995; 355: 418-426. [PubMed]
42. Surmeier DJ, Song WJ, Yan ZJ Neurosci. 1996; 16: 6579-6591. [PubMed]
43. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M., Nestler EJJ Pharmacol. Exp. Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
44. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EBJ Neurosci. 1995; 15: 8167-8176. [PubMed]
45. Moratalla R., Elibol B., Vallejo M., Graybiel AM Neuron. 1996; 17: 147-156. [PubMed]
46. Badiani A., Oates MM, Hari HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Behav. Otak. Res. 1999; 103: 203-209. [PubMed]
47. Uslaner J., Badiani A., Norton CS, Hari HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2001; 13: 1977-1983. [PubMed]
48. Huff RM, Chio CL, Lajiness ME, Goodman LV Adv. Pharmacol. 1998; 42: 454-457. [PubMed]
49. Zachariou V., Sgambato-Faure V., Sasaki T., Svenningsson P., Berton O., Fienberg AA, Nairn AC, Greengard P., Nestler EJ Neuropsychopharmacology. 2005 Aug 3; 10.1038 / sj.npp.1300832.
50. McClung CA, Nestler EJ Nat. Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
51. Norrholm SD, Bibb JA, Nestler EJ, Ouimet CC, Taylor JR, Greengard P. Neuroscience. 2003; 116: 19-22. [PubMed]
52. Bibb JA, Chen J., Taylor JR, Svenningsson P., Nishi A., Snyder GL, Yan Z., Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, et al. Alam. 2001; 410: 376-380. [PubMed]
53. Nikolic M., Chou MM, Lu W., Mayer BJ, Tsai LH Alam. 1998; 395: 194-198. [PubMed]
54. Kesavapany S., Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J., Ackerley S., Leigh PN, Shaw CE, Miller CC Eur. J. Neurosci. 2001; 13: 241-247. [PubMed]
55. Morabito MA, Sheng M., Tsai LHJ Neurosci. 2004; 24: 865-876. [PubMed]
56. Futter M., Uematsu K., Bullock SA, Kim Y., Hemmings HC, Jr., Nishi A., Greengard P., Nairn AC Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 3489-3494. [Artikel percuma PMC] [PubMed]
57. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, Zhang D., Chattarji S., Kirkwood A., Tonegawa S. Neuron. 2004; 42: 773-787. [PubMed]
58. Murase S., Mosser E., Schuman EM Neuron. 2002; 35: 91-105. [PubMed]
59. Prange O., Murphy THJ Neurosci. 2001; 21: 9325-9333. [PubMed]
60. Feng J., Yan Z., Ferreira A., Tomizawa K., Liauw JA, Zhuo M., Allen PB, Ouimet CC, Greengard P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97: 9287-9292. [Artikel percuma PMC] [PubMed]
61. Li Y., Acerbo MJ, Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2004; 20: 1647-1654. [PubMed]
62. Perrotti LI, Bolanos CA, Choi KH, Russo SJ, Edwards S., Ulery PG, Wallace DL, Self DW, Nestler EJ, Barrot M. Eur. J. Neurosci. 2005; 21: 2817-2824. [PubMed]
63. Harris KM, Jensen FE, Tsao BJ Neurosci. 1992; 12: 2685-2705. [PubMed]
64. Vanderklish PW, Edelman GM Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 1639-1644. [Artikel percuma PMC] [PubMed]