PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstrak
Pengubahan berasaskan kokain dalam ekspresi gen menyebabkan perubahan dalam morfologi dan tingkah laku neuron yang mungkin mendasari ketagihan kokain. Kami mengenal pasti peranan penting untuk dimetilasi 3 lysine 9 (H3K9) dan dimetiltransferase lysine G9a dalam kepekaan struktural dan kelakuan yang disebabkan kokain. Pentadbiran kokain berulang mengurangkan tahap global dimetilasi H3K9 di dalam nukleus accumbens. Tpengurangannya dalam metilasi histon ditengah melalui penindasan G9a di rantau otak ini, yang dikawal oleh faktor transkripsi kokain yang disebabkan oleh kokain ΔFosB. Menggunakan mutagenesis bersyarat dan pemindahan gen-mediated virus, kami mendapati G9a downregulation meningkatkan kepelbagaian tulang belakang dendritik nukleus accumbens neurons dan meningkatkan keutamaan untuk kokain, dengan itu mewujudkan peranan penting untuk metilasi histone dalam tindakan kokain jangka panjang.
Pengenalan
Pendedahan kokain berulang dicirikan oleh perubahan berterusan dalam ekspresi gen dan morfologi neuron yang diubah dalam nukleus accumbens (NAc), komponen penting dalam litar ganjaran otak (1-2). Pengubahsuaian Chromatin adalah penting dalam perubahan transkrip yang menyimpang di rantau otak ini yang mungkin mendasari aspek ketagihan kokain (3-9). Peraturan kokain struktur kromatin dalam keputusan NAc, sebahagiannya, dari pengubahsuaian kokain yang diinduksi langsung dari jentera enzimatik kromatin, yang membawa kepada perubahan asetilasi histon dan fosforilasi (4, 7-9); Walau bagaimanapun, peranan enzim yang mengawal metilasi histon masih belum disiasat.
Analisis penganjur genom yang luas menggunakan immunoprecipitation chromatin digabungkan dengan microarrays (Chip-Chip) mengenal pasti corak histon H3 lysine 9 (H3K9) dan 27 (H3K27) yang diperincikan dalam penganjur gen spesifik di NAc berikut rawatan kokain berulang6). Oleh itu, kami memaparkan banyak lysine methyltransferases (KMTs) dan demethylases (KDMs) yang dikenali untuk mengawal H3K9 atau H3K27 metilasi (Rajah 1A). Hanya dua enzim, G9a dan GLP, memperlihatkan peraturan transkrip berterusan 24 jam selepas pentadbiran kokain berulang, apabila ekspresi kedua-dua gen tersebut telah dikurangkan dengan ketara. Kerana G9a dan GLP khususnya memangkinkan dimetilasi H3K9 (H3K9me2), downregulation mereka oleh kokain adalah konsisten dengan penurunan tahap global eukromatik H3K9me2 diperhatikan pada titik masa ini (Rajah 1B). Sebaliknya, metilasi H3K27 heterokromatik global kekal tidak berubah dengan pendedahan kokain berulang (Rajah S1 dalam menyokong bahan dalam talian). Kerana tahap aktiviti pemangkin yang tinggi kedua-duanya vitro and dalam vivo (10), kami berhasrat untuk menyiasat lagi kepentingan fungsi penindasan G9a berikutan pendedahan kokain berulang di NAc. Tahap protein G9a, seperti tahap mRNA, telah berkurangan dengan ketara jam 24 selepas pengambilan kokain berulang (Rajah S2). Walaupun ekspresi mRNA G9a dikurangkan oleh 35% dalam NAc, analisis imunohistokimia mendedahkan pengurangan% 15 yang lebih rendah dalam tahap protein G9a, selaras dengan pengurangan% 21 yang diperhatikan dalam H3K9me2 selepas pentadbiran kokain berulangRajah 1B). Ekspresi mRNA G9a juga dikurangkan dalam rantau otak ini oleh 20% berikutan pengambilan diri sendiri kokain (berulang kali)Rajah S3).
Untuk mengenal pasti sama ada perubahan dalam eukromatik H3K9me2 berkorelasi dengan pengubahan gengen dalam ekspresi gen dalam NAc, kami menggunakan analisis microarray untuk memeriksa profil ekspresi gen yang disebabkan oleh dos cabaran kokain pada haiwan dengan atau tanpa sejarah pendedahan kokain terdahulu (lihat tambahan senarai gen dalam Jadual S1-S3). Haiwan yang telah menerima kokain berulang kali dipaparkan ekspresi gen secara dramatik meningkat 1 sejam selepas cabaran kokain berbanding dengan haiwan yang terawat dengan akut (Rajah 1C). Ekspresi gen yang meningkat ini masih berlaku sebagai tindak balas kepada cabaran kokain yang diberikan setelah minggu pengeluaran 1 dari kokain berulang. Selaras dengan laporan terdahulu, peratusan kecil gen (~ 10%) memperlihatkan tindak balas transkriptional yang tidak teratur berikutan pentadbiran kokain berulang (Rajah 1C; lihat Jadual S1) (5). Untuk secara langsung menyiasat peranan Gerbang bawah G9a dalam ekspresi gen yang dipertingkatkan selepas kokain berulang, tikus menerima suntikan intra-NAc dari vektor virus Herpes simplex (HSV) yang menyatakan sama ada GFP atau G9a dan dirawat dengan kokain berulang atau kokain berulang untuk menentukan sama ada overexpression G9a adalah mencukupi untuk menghalang peningkatan ekspresi gen berasaskan kokain yang disebabkan. Dari satu set gen 12 yang dipilih secara rawak memaparkan tahap ekspresi tinggi setelah kokain berulang, kita melihat bahawa G9a berkurangnya ekspresi 50% daripada gen iniJadual S4).
Untuk mengenal pasti peristiwa transkrip hulu yang mengetengahkan penindasan kokain yang diulang berulang daripada ekspresi G9a, kami menyiasat peranan yang mungkin untuk ΔFosB, produk sambatan yang sangat stabil gen awal yang segera fosB. ΔFosB berkumpul di NAc selepas pendedahan berulang kepada kokain, di mana ia telah dikaitkan dengan peningkatan hadiah kokain (11). ΔFosB boleh bertindak sebagai aktivator transkrip atau penindas bergantung kepada gen sasaran yang terlibat (3, 5, 6, 12). Menggunakan bitransgenic NSE-tTA × tetOP-ΔFosB tikus, di mana ekspresi ΔFosB dapat diinduksi secara selektif dalam stigat NAc dan dorsal haiwan dewasa (13), kami mengkaji kesan ekspresi ΔFosB terhadap peraturan cocaine H3K9me2 dan KMT di NAc. Overexpression ΔFosB mencukupi untuk mengurangkan tahap kedua-dua H3K9me2 (Rajah 1D) dan ekspresi G9a (Rajah 1E), dengan itu meniru kesan kokain berulang. Sebaliknya, ΔFosB tidak mengurangkan ekspresi GLP di rantau otak ini dan tidak memberi kesan kepada SUV39H1 dan EZH2, enzim trimethylating utama untuk H3K9 dan H3K27, masing-masingRajah S4). Untuk mengesahkan data ini menggunakan sistem overexpression ΔFosB bebas, tikus dewasa liar dewasa menerima suntikan intra-NAc dua hala vektor virus yang berkaitan dengan Adeno (AAV) yang menyatakan sama ada GFP atau ΔFosB. Overexpression yang diperantarai oleh virus ΔFosB menurunkan tahap ekspresi G9a di rantau otak ini (Rajah 1E).
Peraturan yang dinyatakan dan khusus G9a mendorong kami untuk menyiasat sama ada mengubah ekspresi G9a khususnya dalam neuron NAc mengawal tindak balas tindak balas terhadap kokain. Tikus Wildtype menerima suntikan intra-NAc vektor HSV yang menyatakan GFP atau G9a dan kemudiannya dianalisis dengan menggunakan paradigma keutamaan tempat kokain yang tidak berdaya, yang memberikan ganjaran dadah tidak langsung. Overkemresi virus G9a dalam neuron NAc telah disahkan mengikuti ujian tingkah laku (Rajah 2A). Overexpress G9a dengan ketara menurunkan keutamaan untuk kokain berbanding dengan haiwan yang terlalu menekankan GFP (Rajah 2B), dan meningkatkan tahap H3K9me2 dalam NAc (Rajah 2C). Overexpression dari mutan mati secara catalytic G9a (G9aH1093K) (14) tidak menjejaskan keutamaan kokain (Rajah 2B) dan tidak menjejaskan tahap H3K9me2 di rantau otak ini (Rajah 2C).
Untuk mengkaji lebih lanjut peranan G9a dalam kesan tingkah laku kokain, dan lebih khusus untuk meniru penindasan kokain yang diulang berulang ekspresi G9a di NAc, dewasa G9afl / fl tikus (14) menerima suntikan intra-NAc vektor AAV yang menyatakan Cre recombinase atau GFP sebagai kawalan. AAV-Cre mengetuk G9a di NAc, yang disahkan secara immunohistokimia (Rajah S5), dengan ketara meningkatkan kesan kokain di eksperimen penyaman tempat dan menurunkan tahap H3K9me2 dalam NAc (Rajah 2D, E). Perencat farmakologi yang tersedia secara komersil G9a dan GLP, BIX01294 (15-16), digunakan untuk menentukan sama ada penghambatan enzim juga mempengaruhi tindak balas tindak balas terhadap kokain. Malah, perencatan farmakologi G9a dan GLP meningkatkan keutamaan kokain dan menurunkan H3K9me2 dalam NAc (Rajah 2F, G).
Pentadbiran kokain berulang meningkatkan kepadatan dendritik duri pada neuron sederhana berdecit NAc (17), satu proses yang dikaitkan dengan perubahan fungsional pada sinaps glutamatergic excitatory ke neurons ini (18-19) dan respons tingkah laku yang sensitif kepada ubat (17, 20). Oleh itu, kami menghafal bahawa pengurangan aktiviti G9a dalam NAc oleh kokain berulang dapat menengahi keupayaan kokain untuk mengawal ketumpatan tulang belakang dendritik neuron NAc. Dengan menggunakan immunoprecipitation chromatin (Chip) dengan antibodi anti-G9a, kami mengenal pasti beberapa sasaran gen G9a yang ditakrifkan dalam NAc, yang masing-masing telah dikaitkan dengan kepekaan dendritik yang disebabkan kokain (Rajah 3A) (20-26). Kami mendapati bahawa pengambilan kokain berulang menurun secara signifikan G9a mengikat, serta tahap H3K9me2, pada promoter gen ini (Rajah 3B). Sebaliknya, pentadbiran kokain akut dengan cepat merekrut G9a kepada beberapa promoter gen yang sama, selaras dengan ekspresi G9a yang meningkat pada jam NAN 1 selepas dos kokain akut (Rajah S6). Walaupun G9a mengikat pada promoter gen tertentu berhubungan dengan perubahan dalam ekspresinya, ia tetap tidak jelas sama ada peristiwa sedemikian ditiru oleh tahap global G9a diubah dalam NAc dan / atau oleh perbezaan dalam pengambilan G9a berikutan akut vs mengulangi kokain pentadbiran.
Berdasarkan kepada peraturan G9a mengenai pelbagai gen yang berkaitan dengan plastik di NAc, kami memeriksa secara langsung sama ada penyelenggaraan ekspresi G9a di rantau otak ini berikutan pengambilan kokain berulang adalah mencukupi untuk menghalang pembentukan tulang belakang dendritik yang disebabkan kokain. Menggunakan protokol rawatan kokain sebelum ini menunjukkan untuk mempromosikan induksi tulang belakang dendritik di NAc (20), kami memeriksa ketumpatan tulang belakang pada haiwan yang disuntik dengan HSV-GFP atau HSV-G9a. Dalam persetujuan dengan penemuan sebelumnya, kami melihat peningkatan ketara dalam ketumpatan tulang belakang dendritik dalam NAc berikut rawatan kokain, kesan yang telah disekat sepenuhnya oleh overexpress G9a (Rajah 3C). G9a overexpression sahaja tidak mencukupi untuk mengurangkan ketumpatan tulang belakang NAc dendritik dengan ketiadaan kokain. Untuk melengkapkan data ini, G9afl / fl tikus menerima suntikan intra-NAc HSV-Cre dan ketumpatan tulang belakang dikuantifikasi dan dibandingkan dengan haiwan yang menerima HSV-GFP jika tiada kokain. Knockdown ekspresi G9a ketara peningkatan tulang belakang pada neuron berduri medium NAc (Rajah 3C).
Memandangkan bukti bahawa GKNUMXa downregulation di NAc selepas kokain berulang ditengahi oleh ΔFosB, kita seterusnya mengkaji sama ada faktor transkripsi ini juga terlibat dalam pengawalan dendritik dendritik NAc. Walaupun ΔFosB tidak dikaitkan sebelum ini kepada kepekaan dendritik seperti itu, beberapa sasarannya, termasuk subkumpulan Cdk5 dan NFbitB, telah sangat terlibat (20-23), dan ekspresi berterusan FosB dalam neuron NAc berkorelasi dengan kepadatan tulang belakang dendritik yang meningkat selepas rawatan kokain berulang (27). Pertama, kami mendapati bahawa induksi ΔFosB dalam bitransgenic tikus tanpa ketiadaan kokain, yang menurunkan ekspresi G9a dan H3K9me2 (Rajah 1D, E), menurunkan G9a mengikat kepada pelbagai gen yang berkaitan dengan plastik, yang kebanyakannya telah ditunjukkan sebagai sasaran langsung ΔFosB sendiri (Rajah 3D) (3, 6). Kami seterusnya menunjukkan bahawa overexpression virus daripada ΔFosB dalam NAc ketumpatan tulang belakang dendritik meningkat dengan ketara di bawah keadaan basal, serupa dengan pemerhatian kokain yang berulang selepas itu (Rajah 3E). Sebaliknya, overexpression dalam NAc of ΔJunD, protein mutan negatif yang dominan yang menangkis ΔFosB aktiviti transkrip, menyekat keupayaan kokain berulang untuk meningkatkan pembentukan tulang belakang dendritik di NAc (Rajah 3C).
Pengamatan kami bahawa ΔFosB mengawal ekspresi G9a dalam NAc, dan ΔFosB dan G9a mengawal selia beberapa gen sasaran yang sama, membawa kita untuk memeriksa interaksi lain antara ΔFosB dan G9a. Selepas kokain akut, apabila tahap G9a meningkat, mengikat G9a kepada fosB gen meningkat, sementara selepas kokain berulang, apabila ekspresi G9a ditindas, G9a mengikat kepada fosB gen telah menurun (Rajah 3A). Mengurangkan pengikatan G9a selepas kokain berulang tidak diperhatikan c-fos, di mana pengikatan G9a meningkat dengan kokain berulang (Rajah S7). Ini konsisten dengan fakta bahawa, tidak seperti fosB, c-fos tertindas, tidak diinduksi, oleh pendedahan psikostimulus kronik (5). Overexpression ΔFosB dalam tikus bitransgenic mencukupi untuk mengurangkan pengikatan G9a dengan ketara kepada fosb gen (Rajah 3D). Tambahan lagi, overexpress G9a mencukupi untuk mengurangkan ungkapan ΔFosB yang meningkat berikutan pentadbiran kokain berulang (Jadual S4). Data ini mencadangkan gelung autoregulatory di mana G9a pada mulanya mengehadkan induksi ΔFosB oleh pentadbiran kokain akut. Walau bagaimanapun, kerana ΔFosB berkumpul dengan pendedahan ubat berulang, ia menekan G9a dan dengan itu memencilkan induksinya sendiri.
Sebagai kesimpulan, kami telah menunjukkan bahawa methylation lysine lysine dalam NAc secara kritikal terlibat dalam mengawal selia gen neuron sebagai tindak balas terhadap kokain. Penindasan G9a dan H3K9me2 berikutan pentadbiran kokain berulang-ulang mempromosikan keutamaan kokain, sebahagiannya, melalui pengaktifan transkrip gen pelbagai yang dikenali untuk mengawal bentuk-bentuk yang menyimpang dari plastisitas dendritik. Memperoleh pemahaman yang lebih baik mengenai gen-gen yang dikawal melalui mekanisme tersebut akan meningkatkan pengetahuan kita tentang asas biologi kompleks ketagihan dadah dan boleh membantu dalam pembangunan rawatan yang lebih berkesan daripada gangguan ketagihan.
Bahan dan Kaedah
Haiwan dan rawatan
Melainkan dinyatakan sebaliknya, tikus ditempatkan empat hingga lima sangkar dalam koloni dengan kitaran cahaya / siku gelap 12 (lampu dari 7: 00 AM hingga 7: 00 PM) pada suhu malar (23 ° C) dengan iklan libitum akses kepada air dan makanan. Semua protokol haiwan telah diluluskan oleh IACUC di kedua Pusat Perubatan UT Southwestern dan Sekolah Perubatan Mount Sinai.
Untuk eksperimen kokain [immunohistochemitry, pembongkaran barat, PCR kuantitatif (qPCR), analisis mikroarray dan immunoprecipitation chromatin (Chip)], tikus C8BL / 10J lelaki 57-minggu yang telah digunakan. Haiwan yang menerima suntikan harian sama ada 'saline' (rawatan 6 saline, ip), kokain 'akut' (rawatan 7 saline + satu rawatan 6 mg / kg kokain-HCl, ip) atau 'berulang' kokain (rawatan 20 7 mg / cocaine-HCl, ip). Tikus dikorbankan sama ada jam 20 atau jam 1 berikutan rawatan akhir. Untuk kajian mikroarray, haiwan dirawat setiap hari dengan 'saline' (rawatan 24 saline, ip), kokain 'akut' (rawatan 15 saline + rawatan 14 1 mg / kg kokain-HCl, ip) Rawatan 20 saline + rawatan 7 8 mg / kg kokain-HCl, ip) atau 'pengulangan berulang + akut' kokain (rawatan 20 7 mg / kg rawatan kokain-HCl + 20 saline + rawatan cabaran 7 1 mg / kg kokain-HCl, ip) dan dikorbankan jam 20 selepas rawatan terakhir. Dalam eksperimen tingkah laku, tikus telah ditempatkan secara langsung selepas pembedahan dan dirawat dengan 1 mg / kg kokain-HCl, ip seperti yang diterangkan di bawah. Untuk analisis tulang belakang dendritik dan pengesahan mikroarray berikutan jangkitan HSV-GFP dan HSV-G10a-GFP, tikus dirawat dengan 'saline' (rawatan 9 saline, ip) atau 'kokain berulang' (rawatan 5 5 mg / kg kokain-HCl, ) sepanjang hari 20, kerana protokol suntikan ini sebelum ini telah ditunjukkan untuk meningkatkan ketumpatan tulang belakang pada neuron nukleus accumbens (NAc) dalam jangka masa ekspresi transgene virus Herpes simplex virus (HSV)Tambahan ref S1). Tikus yang digunakan untuk analisis tulang belakang dendritik dikorbankan 4 jam selepas rawatan terakhir.
Untuk mendorong pemalsuan transkrip G9a setempat kepada neuron NAc, kami menggunakan homozygous tikus untuk alel G9a floxed, yang telah diterangkan secara terperinci di tempat lain (S2). Rekombinasi yang dicetuskan oleh Creation menghasilkan exon 22 kepada splicing out-of-frame 25 yang membawa kepada kerosakan yang tidak berasas-mediated transkrip mutasi. Kami menggunakan tikus G9a yang telah dilancarkan sepenuhnya ke tikus C57BL / 6J. Tikus telah disortirisak ke dalam NAc dengan vektor virus yang berkaitan dengan Adeno (seratype 2) yang menyatakan GFP atau Cre-GFP antara umur 7 dan 10 minggu. Analisis imunohistokimia digunakan untuk mengesahkan kecekapan penggabungan semula Cre-mediated (lihat Tambahan Gambar S5). Kami menggunakan AAV menyuntik haiwan 21 hari selepas pembedahan kerana penggabungan semula dalam G9a tikus floxed stabil dan maksimal pada masa ini, selaras dengan laporan yang diterbitkan (S3-S4). Eksperimen overexpression G9a dan ΔJunD juga dijalankan menggunakan vektor virus HSV yang menyatakan sama ada GFP, wildtype G9a-GFP, mati secara perlahan G9aH1093K-GFP atau ΔJunD-GFP (lihat S2 untuk butir-butir berkaitan pembangunan G9a). HSV overexpressing tikus telah digunakan 3 hari selepas pembedahan sejak overexpression adalah maksimal pada titik masa ini, seperti diperhatikan melalui immunohistochemistry. Oleh kerana sifat ekspresi HSV sementara dan sifat yang lebih stabil dari ekspresi AAV, vektor HSV digunakan dalam eksperimen yang memerlukan ekspresi transgene jangka pendek, sementara vektor AAV digunakan dalam eksperimen yang memerlukan tempoh lanjutan ekspresi transgene. Kedua-dua vektor telah ditunjukkan, dalam kajian terdahulu, untuk menjangkiti hanya sel-sel sel neuron di dalam kawasan otak yang disuntik, tanpa sebarang jangkitan neuron afferent atau efferent.
Untuk eksperimen tingkah laku menggunakan inhibitor farmakologi G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), tikus telah disemai dengan sterotaxial dengan dua pam mini subkutan, serta panduan dua hala kannula, ke NAc. Pam mini diaktifkan jam 12 sebelum implantasi memulakan penghantaran berterusan (0.25 μl / jam) sama ada kenderaan (5 hydroxypropyl β-cyclodextrin) atau ubat untuk hari 14, di mana penilaian tingkah laku masa dilakukan.
Untuk eksperimen overexpression ΔFosB [blotting barat, qPCR, dan Chip], bitransgenic lelaki NSE-tTA × tetop-ΔFosB tikus telah digunakan (10 minggu ke minggu), di mana tidak ada doxycycline derivatif tetrakiklin (8 minggu off doxycycline), haiwan yang dipaparkan ekspresi konstitutif tegas striatal ΔFosB (S5). Overexpression ΔFosB dalam tikus ini telah disahkan melalui qPCR. Untuk mengesahkan penemuan menggunakan NSE-tTA × tetop-ΔFosB tikus, tikus jantan 8 berumur 57 yang berumur 6 berumur intra-NA yang disortir secara sterotaxically dengan vektor AAV yang menyatakan sama ada GFP atau ΔFosB-GFP. Vektor AAV telah digunakan, dalam kes ini, untuk memastikan ekspresi ΔFosB maksima pada minggu selepas 8, membolehkan perbandingan langsung antara tikus yang terinfeksi dan bitransgenic ΔFosB overexpressing tikus. Overprontaminasi virus telah disahkan menggunakan qPCR pada minggu 8 pasca pembedahan (pukulan 15-tolok NAc dibedah di bawah tapak suntikan). AAV-GFP dan AAV-ΔFosB-GFP yang menggambarkan tikus yang tidak digunakan untuk qPCR dirawat dengan saline (rawatan 14 saline, ip) atau kokain berulang (rawatan 14 30 mg / kg kokain-HCl, ip) pembedahan. 6 hari selepas rawatan terakhir, otak telah diperbaiki dengan paraformaldehyde% 4, diikat pada vibratome dan digunakan untuk analisis tulang dendritik.
Analisis blot Barat
Pukulan NAN 14-gauge diambil dari bahagian coronal 1 mm yang diperoleh menggunakan matriks otak tetikus keluli tahan karat dan di sonicated di 1 M HEPES lysis buffer (1% SDS) yang mengandungi inhibitor protease dan phosphatase. 10-Sampel 30 μg protein total elektroforesis pada gel SDS 18%. Protein dipindahkan ke membran PVDF dan diinkubasi dengan sama ada anti-H3K9me2 (tetikus monoklonal, 1: 500), anti-β-tubulin (tikus monoklonal, 1: 60,000), anti histon H3 (rabun poliklonal, 1: 5,000) anti-GFP (digunakan untuk pengesahan ekspresi virus yang sama dalam tisu ditumbuk) (anting-anting rabun, 1: 1000), anti-H3K27me3 (rabun poliklonal, 1: 500) atau anti-actin antibodies (mouse monoclonal, 1: 60,000) 4 ° C (semua membran telah disekat dalam susu 5 atau 5% serum albumin serum). Membran kemudian diinkubasi dengan antibodi menengah yang diberi label peroksidase (1: 15,000-1: 60,000 bergantung kepada antibodi utama yang digunakan) dan band-band divisualisasikan menggunakan substrat SuperSignal West Dura. Band ditaksir dengan NIH Image J Software dan band H3K9me2 dinormalisasikan kepada actin atau β-tubulin dan kepada histon total H3 untuk mengawal untuk memuatkan sama. Kokain berulang tidak memberi kesan pada tahap actin (Rajah S8) atau jumlah histone 3 (Rajah S1) di NAc. Tambahan pula, jangkitan HSV-G9a-GFP dan HSV-G9aH1093K-GFP tidak memberi kesan kepada jumlah tahap β-tubulin dalam NAc (Rajah S8).
Imunohistokimia
Tikus dipanaskan dengan dos yang mematikan hidrat chloral dan diencerkan dengan paraformaldehyde 4% sebelum dianalisis oleh imunohistokimia tunggal atau berganda seperti yang dijelaskan sebelumnya (S6). Secara ringkas, otak pasca tetap diinkubasi pada suhu bilik dalam sekelip mata dalam 30% sukrosa sebelum dipotong pada 35 μm (otak yang digunakan untuk analisis tulang belakang dendritik dipotong pada vibratome di bahagian 100 μm jika tiada 30% sukrosa). Bahagian NAc terapung bebas dibasuh dengan 1X PBS, disekat (serum keldai biasa 3%, 0.1% tritonX, 1X PBS) dan kemudian diinkubasi dengan anti-GFP (poliklonal ayam, 1: 8000) dan / atau anti-G9a , 1: 500) antibodi dalam penyelesaian menyekat. Bahagian-bahagian yang dianalisis untuk spin dendritik diinkubasi dengan antibodi anti-GFP poliklonal arnab di 1: 200. Berikutan pengeraman semalaman, bahagian NAc dibilas kali 3 untuk minit 10 dengan 1X PBS, diikuti dengan inkubasi dengan Cy2 dan / atau antibodi menengah pendarfluor Cy3 yang terkandung dalam larutan 1X PBS untuk jam 2. Seksyen yang digunakan untuk kajian morfologi diinkubasi dalam antibodi sekunder pada suhu bilik. Pewarnaan bersama nuklear dicapai dengan mengepam bahagian dalam 1X PBS yang mengandungi DAPI (1: 50,000) untuk minit 10. Seksyen sekali lagi dibasuh, diikuti oleh dehidrasi etanol dan pemasangan dengan DPX. Semua bahagian diambil menggunakan mikroskop confocal.
Pengasingan RNA dan qPCR
Pukulan NAc 14-gauge dua hala diselaraskan di Trizol dan diproses mengikut arahan pengeluar. RNA disucikan dengan lajur RNAesy Micro dan spektroskopi mengesahkan bahawa catuan RNA 260/280 dan 260/230 adalah> 1.8. RNA kemudian ditranskripsikan terbalik menggunakan Kit Skrip Bio-Rad. cDNA dikuantifikasi oleh qPCR menggunakan SYBR Green. Setiap tindak balas dijalankan dalam rangkap dua atau rangkap tiga dan dianalisis mengikuti kaedah ΔΔCt seperti yang dijelaskan sebelumnya menggunakan gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) sebagai kawalan normalisasi (S7). Lihat Jadual tambahan S5 untuk urutan primer mRNA.
Analisis microarray DNA
Empat kumpulan (replikasi biologi bebas 3 per kumpulan) telah digunakan untuk kajian microarray, berjumlah XARM mikroarray. Jam 12 berikutan suntikan kokain yang terakhir, haiwan-haiwan itu cepat dipenggal dan otak telah dikeluarkan dan diletakkan di atas ais. Pemisahan NAc telah diambil menggunakan pukulan jarum 1 dan cepat beku pada ais kering sehingga RNA diekstrak. Beban dua hala dikumpulkan dari empat hewan per replikasi, berjumlah tikus 15 per kumpulan. Pengasingan RNA, pemprosesan microarray, dan analisis data dilakukan seperti yang dinyatakan sebelumnya (S8). Secara ringkas, RNA diasingkan dan dimurnikan seperti yang dijelaskan di atas dan diperiksa kualitinya menggunakan Agilent's Bioanalyzer. Transkripsi terbalik, penguat, pelabelan dan hibridisasi ke array Illumina MouseWG-6 v2.0 dilakukan dengan menggunakan prosedur standard oleh teras microarray UT Southwestern. Data mentah dikurangi latar belakang dan kuantitel dinormalisasi menggunakan perisian Beadstudio. Data dinormalisasi dianalisis menggunakan perisian GeneSpring dan genelists dihasilkan dengan menggunakan kriteria kepentingan potongan perubahan 1.3 kali ganda ditambah dengan potongan nilai p yang tidak ketat p <0.05.
Kami mengekalkan keyakinan tinggi dalam data ini untuk beberapa sebab. Pertama, semua haiwan ditangani, dirawat dan dibunuh pada masa yang sama, di bawah keadaan yang sama. Juga, semua pemprosesan RNA dan array dilakukan pada masa yang sama. Kedua, kami membuat tatatanda tiga kali ganda dan menggabungkan pelbagai haiwan setiap sampel, sekali gus meminimumkan perbezaan disebabkan oleh kebolehubahan individu dan peningkatan kuasa statistik (S9). Ketiga, kriteria analisis data yang digunakan untuk kajian kami disarankan oleh projek Kawalan Mutu MikroArray, karena kriteria ini telah divalidasi untuk memberikan kebarangkalian berseratan tinggi dan reproduktibilitas inter- dan intraplatformS10-S11).
Pembinaan vektor viral
Oleh kerana kekangan saiz penyisipan vektor virus, urutan pengekodan sama ada wildtype G9a (G9a) atau mati secara berkala G9a (G9aH1093K) telah diangkut ke plasmid p1005 + HSV bicistronic yang menyatakan GFP di bawah kawalan promoter sitomegalovirus awal (CMV) awal manusia (G9a saiz penyisipan ialah ~ 3.96 kb, yang melebihi saiz sisipan maksimum bagi vektor AAV-2). Promosi IE4 / 5 memacu ekspresi G9a. Fragmen telah terbahagi kepada plasmid p1005 + HSV bicistronic melalui ligand end tumpul dengan Klenow dirawat PmeI dan EcoRI dicerna G9a (dari pcDNA3.1) dan CIP dirawat p1005 + berikut pengambilan EcoRI. Untuk pengeluaran HSV-ΔJunD-GFP, urutan pengekodan ΔJunD yang dikelilingi oleh tapak sekatan EcoRI dihasilkan oleh PCR menggunakan primer oligonucleotides yang mengandungi tapak EcoRI. Produk PCR kemudian disambungkan ke tapak EcoRI vektor p1005. Ekspresi lokal rekombinase Cre dalam neuron NAc dicapai oleh penghantaran gen yang dimediasi virus menggunakan vektor AAV seperti yang diterangkan (S12). GFP atau perpaduan N-terminal GFP ke Cre dibahagikan kepada vektor AAV-2 rekombinan yang mengandungi penganjur CMV dengan urutan penerima penderma sambilan dan isyarat polyadenylation. Semua kemasukan vektor telah disahkan oleh penjujukan dideoxy. Vektor vektor dihasilkan menggunakan kaedah triple-transfection, tanpa bantuan, seperti yang dinyatakan sebelumnya (S13). Virus dimurnikan disimpan di -80 ° C. Kualiti virus dinilai oleh titer berjangkit yang dinilai dalam sel HEK293. Virus AAV-ΔFosB-GFP disediakan serupa. Untuk HSV-Cre, ekspresi Cre didorong oleh promoter IRES, berbanding dengan penganjur IE4 / 5, untuk mengurangkan ekspresi Cre dan mencegah ketoksikan neuron (lihat S14 untuk pembinaan virus). Dalam semua kes, overexpression virus telah disahkan, kedua-duanya vitro and dalam vivo, melalui qPCR, dan virus imunohistokimik disahkan untuk memaparkan ekspresi NAc yang terhad selepas pembedahan.
Pembedahan Stereotaxic
Di bawah ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) anestesia, tikus diposisikan dalam alat stereotaxic haiwan kecil, dan permukaan kranial terdedah. Tiga puluh tiga jarum jarum suntikan digunakan untuk dua hala virus 0.5 μl ke NAc pada sudut 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) pada kadar 0.1 μl / min. Haiwan yang menerima suntikan HSV dibenarkan untuk pulih untuk 2 hari selepas pembedahan, sementara tikus yang digunakan untuk ujian tingkah laku menerima vektor AAV dibenarkan untuk pulih untuk 20 hari sebelum tertakluk kepada penyaman udara. Masa ini selaras dengan tempoh ekspresi transgene yang dimalarkan secara maksimum untuk kedua vektor. Untuk inframerah BIX01294, masing-masing dua mini pam diposisikan subcutaneously pada belakang tikus. Penempatan Cannulae dicapai dengan menggerudi dua lubang kranial kecil di atas NAc, dan dengan penyerahan kanula dari bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Tikus dibenarkan untuk pulih dari pembedahan untuk 4 hingga hari 5 sebelum memulakan prosedur penyaman tempat untuk kokain seperti yang dijelaskan di bawah.
Keutamaan tempat yang terkondisi
Prosedur penyaman tempat telah dijalankan seperti yang dinyatakan sebelum ini, dengan pengubahsuaian berikut (S7). Secara ringkas, 3 hari setelah penyusupan intra-NAc HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP atau HSV-GFP, tikus dimasukkan ke dalam ruang penyejuk, yang terdiri dari tiga lingkungan yang berbeza. Tikus yang menunjukkan keutamaan yang signifikan untuk kedua-dua bilik penyaman tersebut dikeluarkan dari kajian (<10% daripada semua haiwan). Kumpulan pengkondisian kemudian diimbangi untuk menyesuaikan dengan bias ruang yang masih ada. Pada hari-hari berikutnya, haiwan disuntik dengan garam dan dikurangkan ke satu ruang pada waktu petang selama 30 minit dan kemudian disuntik dengan kokain (10 mg / kg, ip) dan dikurung selama 30 minit ke ruang lain pada waktu petang selama 2 hari (dua garam dan dua pasangan kokain). Pada hari ujian, tikus dimasukkan kembali ke dalam alat tanpa rawatan selama 20 minit dan diuji untuk menilai sisi mana yang mereka gemari. Tindak balas lokomotor terhadap kokain dinilai melalui pemecahan sinar di ruang berpasangan kokain untuk memastikan keberkesanan rawatan ubat. Untuk eksperimen CAV AAV dan BIX01294, protokol yang sedikit diubahsuai digunakan. Haiwan sekali lagi disuntik dengan garam atau kokain (10 mg / kg, ip) dan dikurangkan ke ruang tertentu selama 30 minit sesi, tetapi sebaliknya hanya dikondisikan sekali sehari selama 4 hari, diikuti dengan ujian pada hari ke-5 (haiwan dikondisikan pada waktu petang dan rawatan penyaman diganti). Untuk semua kumpulan, pergerakan awal sebagai tindak balas terhadap salin dinilai untuk memastikan bahawa pergerakan tidak terjejas oleh rawatan virus atau perencat.
Pengambilan diri sendiri kokain intravena
Tikus Long-Evans remaja lelaki, dengan berat 230-250 g pada permulaan eksperimen, diperolehi. Mereka ditempatkan dalam suasana kelembapan dan suhu yang dikawal pada siklus cahaya / siklus gelap 12 yang diterbalikkan (lampu di 9: 00 am) dengan iklan libitum akses kepada makanan dan air. Tikus dibenarkan untuk menyesuaikan diri dalam persekitaran baru mereka dan dikendalikan setiap hari untuk 1 minggu sebelum percubaan bermula. Semua prosedur telah dijalankan mengikut Panduan Institut Kesihatan Negara untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Gunung Sinai. Peralatan pentadbiran diri dipasang dengan balok inframerah untuk mengukur perilaku locomotor. Pentadbiran sendiri dijalankan seperti yang dinyatakan sebelum ini (S15-S16) dengan kateter ditanamkan ke vena jugularis kanan di bawah anestesia isoflurane (2.4-2.7%). Kateter disiram dengan 0.1 ml larutan garam yang mengandungi 10 U heparin dan ampisilin (50 mg / kg). Setelah satu minggu pemulihan dari pembedahan, latihan pentadbiran diri bermula semasa fasa gelap kitaran cahaya / gelap. Haiwan diberi akses 3 jam setiap hari ke kokain (0.75 mg / kg / infusi) di bawah jadual pengukuhan ratio-1 (FR1) yang tetap, di mana 1 tekan tuas aktif menghasilkan satu infusi ubat. Tikus menstabilkan pengambilan kokain mereka setelah 6 hari (variasi <15% dalam kadar tindak balas selama 3 hari berturut-turut, dengan sekurang-kurangnya 75% memberi tindak balas pada tuas yang diperkuat). 24 jam selepas sesi pentadbiran diri terakhir, tikus dengan cepat dipenggal, otak dengan cepat dikeluarkan dan diproses untuk pengasingan RNA dan qPCR.
Immunoprecipitation Chromatin (Chip)
Pukulan NAc segar adalah formaldehid silang silang dan disediakan untuk ChIP seperti yang digambarkan sebelumnya (S17-S18) dengan pengubahsuaian kecil. Secara ringkas, pukulan NAN 4-gauge per haiwan (haiwan 14 dikumpulkan setiap sampel) dikumpulkan, dikaitkan silang dengan formaldehid 5% dan dipadamkan dengan 1 M glisin sebelum beku pada -2 ° C. 80 hari sebelum sampel sonication, anti-arnab / tikus biri-biri (bergantung kepada antibodi pemendakan) Manik-manik magnet IgG telah disediakan dengan menginkubkan manik magnetik yang sesuai dengan sama ada anti-G1a (gred chip polyclonal Chip) atau anti-H9K3me9 (tetikus monoclonal Chip gred) antibodi semalaman di 2 ° C di bawah putaran berterusan dalam penyelesaian blok. Tisu sonication dan chromatin shearing dilakukan seperti yang diterangkan sebelumnya (S17). Berikutan sonication, kepekatan chromatin yang sama dipindahkan ke tiub baru dan ~ 5% daripada produk akhir disimpan untuk berfungsi sebagai kawalan 'input'. Selepas mencuci dan membuang semula campuran manik / antibodi yang konjugat, jumlah campuran antibodi / manik yang sama (~ antibodi / sampel 7.5) ditambahkan kepada setiap sampel kromatin dan diinkubasi untuk jam ~ 16 di bawah putaran malar pada 4 ° C. Sampel dibasuh dan dibalikkan semula silang pada 65 ° C semalaman sebelum pembersihan DNA menggunakan kit penyucian PCR. Berikutan pemurnian DNA, sampel telah tertakluk kepada qPCR dan telah dinormalisasikan kepada kawalan 'input' yang sesuai seperti yang dinyatakan sebelumnya (S17). Tikus normal imunoprecipitations IgG menggunakan antibodi anti-IgG poliklonal tetikus juga dilakukan untuk mengawal untuk pengayaan penguatan isyarat yang sesuai. Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) digunakan sebagai kawalan negatif untuk kokain dan eksperimen overexpression ΔFosB. Lihat Jadual Tambahan S5 untuk urutan utama promoter.
Analisis tulang belakang dendritik
Untuk mengkaji peranan G9a dalam pengawalan morfologi neuron dalam vivo, kami menggunakan kaedah-kaedah yang sebelum ini diterangkan dengan modifikasi berikut (S1). Tiga hari selepas suntikan HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (semua virus digunakan dalam tikus C57Bl / 6J liar), atau HSV-Cre-GFP (digunakan dalam G9afl / fl tikus), ketika ekspresi virus adalah maksimal, tikus telah diperkaya, otak telah diproteksi dan otak kemudian diikat pada 100 μm pada getaran. Bahagian-bahagian kemudiannya dihidunkan menggunakan antibodi terhadap GFP seperti yang dinyatakan di atas (lihat Immunohistochemistry). Untuk menilai kesan-kesan G9a overexpression dan knockout pada nombor tulang belakang, serta kesan overexpression ΔJunD, kita mengukur jumlah duri pada kira-kira kira-kira 1-2 neuron per neuron yang menyamai sekurang-kurangnya 299 μm dendrit sekunder dari medium NA yang mengekspresikan GFP neuron berduri (MSN). Memandangkan MSN adalah berbeza secara morfologi daripada populasi neuron lain di NAc, dan juga laporan terdahulu yang menunjukkan bahawa HSV terutamanya menjangkiti DARPP-32 mengekspresikan neuron di kawasan otak ini (S19), kami yakin MSN dinilai secara eksklusif dalam kajian ini. Bagi setiap haiwan, kami memeriksa ~ neuron 6-8 dalam haiwan 3-4 setiap kumpulan (kumpulan 7), selepas itu nilai purata diperolehi untuk setiap haiwan untuk analisis statistik. Eksperimen yang direka untuk mengkaji kesan dari overexpression ΔFosB pada ketumpatan tulang belakang NAc dilakukan dengan sama seperti yang diterangkan di atas, dengan pengecualian bahawa vektor AAV digunakan untuk menyatakan GFP atau ΔFosB-GFP untuk tempoh masa yang panjang (minggu 8). Semua imej HSV ditangkap menggunakan mikroskop confocal dengan objektif peletusan minyak 100X (imej AAV ditangkap dengan tujuan minyak 63X). Imej telah diperolehi dengan set pin lubang pada unit sewenang-wenang 1 dan saiz bingkai 1024 × 1024. Panjang dendritik diukur dengan menggunakan perisian NIH Image J, dan angka tulang belakang dikira buta oleh pengetes utama, kerana slaid dikodkan sebelum pengimbasan percubaan. Bilangan purata spin per 10 μm dendrit dikira.
Analisis statistik
ANOVA satu dan dua hala dilakukan untuk menentukan kepentingan untuk mengutamakan keutamaan tempat dan analisis tulang belakang dendritik dengan lebih daripada dua kumpulan. Ujian t pelajar digunakan untuk perbandingan lain termasuk qPCR, pembongkaran barat, analisis tulang belakang dendritik membandingkan HSV-GFP hingga HSV-Cre dalam G9afl / fl tikus, analisis mikroarray (lihat di atas) dan eksperimen imunoprecipitasi kromatin. Ujian-t pelajar yang dirancang digunakan berikutan analisis ANOVA dua hala kepadatan tulang belakang dendritik setelah ekspresi berlebihan ΔFosB dengan pengesahan kesan utama utama rawatan ubat dan virus. Semua nilai yang termasuk dalam gambar legenda mewakili min ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Analisis statistik terperinci untuk Buah ara. 1-3 dalam teks utama diberikan dalam: Rajah Rajah Terperinci Termasuk Statistik.
Nota kaki
Saya mengesahkan bahawa tiada bahan yang termasuk di dalam manuskrip yang bertajuk Peranan yang penting dalam Methyltransferase Histone G9a dalam Plastik yang disebabkan oleh Cocaine telah sebelum ini diterbitkan atau sedang dipertimbangkan di tempat lain, termasuk di Internet.
Semua kerja yang melibatkan penggunaan haiwan telah dijalankan mengikut garis panduan institusi dan IACUC di Pusat Perubatan Southwestern University of Texas dan Sekolah Perubatan Mount Sinai.
Rujukan dan Nota
;