Proc Natl Acad Sci US A. 2005 Februari 1; 102(5): 1737-1742.
Abstrak
Cocaine, ubat penyalahgunaan, meningkatkan tahap dopamin sinopik di striatum dengan menyekat pengambilan dopamin pada terminal akson. Kinase 5 yang bergantung kepada Cyclin (Cdk5) dan pengaktifnya p35, protein yang terlibat dalam fosforilasi substrat dalam neuron postmitotik, telah didapati dikawal selia selepas pendedahan kronik kepada kokain. Untuk mengkaji semula kesan induksi Cdk5 dan p35 pada isyarat dopamine striatal, kami menghasilkan dua garis tikus transgenik bebas di mana Cdk5 atau p35 telah terlalu tertekan dalam neuron. Kami melaporkan di sini bahawa peningkatan aktiviti Cdk5, sebagai akibat daripada p35 tetapi bukannya overexpression Cdk5, membawa kepada pelemahan isyarat dopamine-mediated cocaine. Peningkatan fosforilasi yang dikendalikan oleh Cdk5 fosfoprotein dopamine dan cAMP yang dikawal, 32 kDa jisim molekul (DARPP-32) pada Thr-75, disertai dengan penurunan fosforilasi DARPP-32 pada Thr-34. Peningkatan fosforilasi Cdk5 yang disandarkan kinase kinase 1 yang dikawal oleh signal ekstraselular pada Thr-286 diiringi oleh penurunan pengaktifan kinase XASUM / 1 yang dikawal oleh isyarat ekstraselular. Kesan-kesan ini menyumbang kepada pelemahan phosphorylation yang disebabkan oleh kokain protein-mengikat unsur tindak balas CAMP serta induksi c-fos yang lebih rendah di striatum. Keputusan ini menyokong idea bahawa aktiviti Cdk2 terlibat dalam ekspresi gen diubah selepas pendedahan kronik kepada kokain dan dengan itu memberi kesan kepada perubahan jangka panjang dalam fungsi neuron yang mendasari ketagihan kokain.
Cocaine meningkatkan tahap dopamin synaptic di striatum dan mengubah ungkapan gen dalam neuron dopaminoceptive dengan mengaktifkan jalur intraselular yang menyebarkan isyarat awal dari penerima D1 dopamin ke nukleus (1). Pendedahan kronik terhadap kokain naik-mengatur beberapa faktor transkripsi, menyebabkan perubahan jangka panjang dalam ekspresi gen yang dianggap mendasari penyesuaian neuron dalam kecanduan kokain (2). ΔFosB, dikenal pasti sebagai faktor transkripsi (3), telah ditunjukkan untuk mempertingkatkan tindak balas tingkah laku haiwan ke kokain (4, 5). Oleh itu, pengenalpastian gen sasaran yang dikawal oleh ΔFuB induksi dijangka menyumbang kepada pemahaman yang lebih besar mengenai mekanisme molekul yang mendasari ketagihan kokain. Baru-baru ini, rawatan kronik haiwan dengan kokain telah ditunjukkan untuk mengawal selia ekspresi kinase 5 bergantung kepada kinetik (Cdk5) dan pengaktifnya p35 di striatum melalui induksi ΔFosB (6, 7).
Cdk5 adalah ahli keluarga Cdk kinase serine / threonine. Tidak seperti Cdks lain yang merupakan pengawal selia utama perkembangan kitaran sel, Cdk5 terutama terlibat dalam fosforilasi substrat dalam neuron postmitotik (8). Kekhususan neuronal kegiatan Cdk5 dicapai melalui persatuan dengan aktivatornya, sama ada p35 atau p39, yang kebanyakannya dinyatakan dalam neuron pascaotik (8). Di samping peranan penting Cdk5 dalam perkembangan otak (9, 10), it juga telah terbabit dalam penghantaran dopaminergik dalam otak selepas bersalin (11, 12). Penghambatan keputusan aktiviti Cdk5 dalam pembebasan dopamin yang semakin meningkat di striatum, menunjukkan fungsi presynaptic Cdk5 sebagai pengawal selia negatif pelepasan dopamin (11). Tambahan pula, Cdk5 memodulasi keberkesanan isyarat dopamine postsynaptik oleh phosphoprotein phosphorylating dopamine dan cAMP-regulated phosphoprotein, massa molekul 32 kDa (DARPP-32) pada Thr-75, yang menukar DARPP-32 menjadi perencat kinase yang bergantung kepada cAMP (PKA) (12).
Pemerhatian ini menunjukkan bahawa Cdk5 dan p35 adalah pengawal selia hiliran pengaktifan isyarat dopamin yang berpanjangan selepas pendedahan kronik terhadap kokain dan seterusnya dalam ketagihan kokain. Untuk mengatasi peranan Cdk5 pada isyarat dopamin yang striatal, kami menghasilkan dua baris tetikus transgenik di mana sama ada Cdk5 atau p35 telah diekspresi secara khusus dalam neuron di bawah kawalan promoter p35. Penemuan kami menunjukkan bahawa aktiviti Cdk5 telah dikawal selia dengan peningkatan paras protein p35 tetapi tidak protein Cdk5, menunjukkan bahawa tahap protein p35 adalah pengehadan kadar untuk aktiviti Cdk5. Kami menyediakan di sini dalam vivo bukti bahawa peningkatan aktiviti Cdk5, akibat daripada overexpression p35, membawa kepada pelemahan pengurangan dopamine kokain yang ditujukan kepada nukleus menerusi perencatan cascade PKA dan kinase yang dikawal oleh isyarat ekstraselular (ERK).
Bahan dan Kaedah
Antibodi. Antibodi poliklonal kepada Cdk5 (C-8) dan p35 (C-19) dibeli dari Bioteknologi Santa Cruz. Antibodi yang bergantung kepada fosforilasi dan bebas-ikatan kepada ERK kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, dan protokol pengikat elemen tindak balas CAMP (CREB) diperoleh daripada Technology Signal Cell (Beverly, MA). Antibodi untuk phospho-Thr-34 DARPP 32 (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), jumlah DARPP-32 (12), dan c-fos (14) digunakan seperti yang diterangkan. Antibodi untuk actin dibeli dari Sigma.
Haiwan Eksperimen. Kami sebelum ini mengkloning gen p35 tetikus Cdk5r1, yang mengkodekan protein p35, dan mencirikan struktur genomanya (15). Untuk menghasilkan tikus transgenik dengan overexpression neuronal p35 (Tgp35), 6-kb EkoRI-EkoFragmen RI yang mengandungi rantau promoter 1.2-kb telah subcloned ke pGEM9Z (-) plasmid, dan tag 45-bp yang diperoleh dari SV40 dimasukkan ke dalam KpnSaya laman web di bahagian bawah poli (A+) isyarat (Rajah 1A). Teg mengandungi a SpeSaya laman web untuk genotip haiwan. Serpihan 6-kb dikeluarkan dari plasmid dan disucikan, diikuti oleh suntikan pronuclear transgene untuk menghasilkan tikus transgenik. Untuk memeriksa profil ungkapan transgene di bawah kawalan kawal selia penganjur 1.2-kb p35 dalam vivo, tikus transgenik berganda (Tgp35; p35 - / -) dijana lebih lanjut dengan menggunakan strategi pembiakan dua langkah di mana tikus Tgp35 telah dihasilkan semula dalam latar belakang p35-null endogenous. Model tetikus lain yang digunakan dalam kajian ini termasuk p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/-, dan tetikus transgenik dengan overexpression neuronal Cdk5 (TgCdk5)9, 16, 17). Genotip tikus ini ditentukan dengan melakukan analisis blot Selatan atau PCR pada DNA genomik yang diasingkan dari biopsi ekor. Tikus ditempatkan di bawah siklus gelap 12-h / 12-h. Semua penjagaan diberikan dengan mematuhi garis panduan Institut Kesihatan Negara mengenai penjagaan dan penggunaan haiwan makmal dan eksperimen.
Analisis Blot Selatan. DNA genomik yang diekstrak daripada biopsi ekor dicerna dengan EkoRI dan SpeSaya, electrophoresed pada gel agarose% 0.9, dan dipindahkan ke membran nilon. Membran itu telah hibridisasi dengan rawak 32Siasatan P dilabelkan pada 42 ° C dalam sekelip mata. Proksi 485-bp untuk genotip p35 knockout (p35 - / -) dan tikus Tgp35 dihasilkan oleh PCR dengan menggunakan primer berikut: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'dan 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Membran hibridized dibasuh dua kali dalam 2 × SSC / 0.1% SDS pada 42 ° C untuk min 10, dan dua kali dalam 0.1 × SSC / 0.1% SDS pada 65 ° C untuk min 20, dan terdedah kepada filem x-ray.
Rawatan Dadah. Cocaine (Sigma) telah dibubarkan dalam salin steril. Haiwan-haiwan telah disuntik dengan kokain (15 mg / kg) atau jumlah salin yang sama pada umur 3 bulan dan dibunuh oleh pemenggalan pada titik masa yang berlainan (15, 30, 60, dan min 120) selepas suntikan. Otak cepat dikeluarkan dan sejuk di PBS ais sejuk. Striata kemudian dibedah dan tertakluk kepada analisa blot Utara atau Barat. Untuk analisis imunohistokimia, seksyen striatal diperolehi daripada tikus 2 selepas suntikan.
Analisis Blot Utara. Jumlah RNA diekstrak dari striata dengan reagen TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) dan tertakluk kepada analisis blot Utara seperti yang dijelaskan (18). Untuk pengesanan mRNA c-fos, fragmen 189-bp tetikus c-fos cDNA digunakan sebagai probe seperti yang dijelaskan (19). Tahap c-fos mRNA dikuantifikasi dengan mengukur ketumpatan optik jalur tertentu dengan menggunakan sistem analisis imej dengan perisian imej nih, Versi 1.62.
Analisis Blot Barat. Tisu-tisu striatal di sonicated dalam 1% SDS dan direbus untuk min 10. Kepekatan protein dalam setiap sampel ditentukan oleh ujian protein BCA (Pierce). Jumlah protein yang sama dipisahkan oleh SDS / PAGE sebelum dipindahkan ke membran nitroselulosa. Membran telah disekat di 1 × PBS yang mengandungi susu skim 5% dan 0.05% Tween 20 dan diinkubasi dengan antibodi utama semalaman di 4 ° C. Inkubasi dengan konjugated anti-mouse atau arnab IgG (Sigma) dilakukan pada suhu bilik untuk min 60. Isyarat dikesan oleh chemiluminescence (Pierce) yang dipertingkatkan, dan kepadatan optik daripada band-band tersebut dikira seperti yang dijelaskan di atas.
Cdk5 Kinase Assay. Lysates striatal telah disediakan dengan penyangga lisis yang terdiri daripada 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / ml leupeptin / fosfatase inhibitor (campuran inhibitor fosfatase I dan II, Sigma). Lysates telah diimunisasi dengan antibodi anti-Cdk5 (C-8) atau anti-P35 (C-19). Immunoprecipitates Cdk5 disediakan oleh inkubasi 300 μl lysate (bersamaan dengan 300 μg protein) dengan antibodi anti-Cdk5 (3 μg) semalaman di 4 ° C diikuti dengan inkubasi selanjutnya dengan 25 μl Protein A-agarose manik (50 buburan% dalam buffer lysis; Santa Cruz Biotechnology) untuk 3 h pada 4 ° C. Untuk penyediaan imunoprecipitates p35, 500 μl lysate (bersamaan dengan 1 mg protein) diinkubasi dengan antibodi anti-p35 (3 μg) seperti yang diterangkan di atas. Immunoprecipitates dibasuh dua kali dengan penyangga lisis dan dua kali dengan penampan kinase yang terdiri daripada 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspended pada 60 μl buffer kinase. Aktiviti kinase diukur dengan menggunakan histon H1 sebagai substrat (18).
Imunohistokimia. Tikus telah dibiakkan oleh suntikan ip avertin (250 mg / kg, Fluka) dan penampan transcardially dengan penampan sodium fosfat 0.1 M, pH 7.4, diikuti oleh Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), penekanan tidak bersambung silang. Otak yang disisihkan terus diperbetulkan pada malam yang sama pada 37 ° C. Kemudian, otak tertanam dalam parafin, dipotong ke dalam bahagian coronal 5-μm-tebal dan tertakluk kepada imunohistokimia dengan menggunakan teknik kompleks avidin-biotin-peroksidase (Vector Laboratories) dengan diaminobenzidine sebagai substrat. Bahagian-bahagian itu diinkubasi dengan antibodi poliklonal yang dibersihkan afiniti terhadap c-fos semalaman di 4 ° C. Keistimewaan pewarnaan telah dinilai dengan penolakan antibodi utama.
Hasil
Pembentukan Tikus Transgenik dengan Overexpression Neuronal p35. Transgene yang digunakan untuk mencapai ekspresi saraf yang meningkat p35 terdiri daripada fragmen 6-kb daripada gen p35 tetikus clone yang mengandungi promoter 1.2-kb dan keseluruhan urutan pengekodan p35 (Rajah 1 A). Genotip tikus telah ditentukan oleh analisis blot Selatan dengan menggunakan penyelidikan yang direka untuk membezakan tikus p35 - / - dan Tgp35 dari tikus jenis liar (Rajah 1 A and B). Untuk memeriksa ekspresi transgene di bawah kawalan promoter 1.2-kb p35, kami menghasilkan tikus transgenik berganda (Tgp35; p35 - / -) di mana ekspresi p35 didorong hanya dari transgene. Ekspresi p35 dalam Tgp35; p35 - / - tikus diperhatikan hanya di dalam otak (Rajah 1C), di mana corak ungkapan ruang adalah serupa dengan tikus jenis liar (Rajah 1D). Kekurangan p35 telah terbukti menghasilkan struktur pelapisan yang tidak normal dalam korteks serebrum dan hippocampus tikus (10). Bagaimanapun, tikus Tgp35; p35 - / - menunjukkan penyelamatan lengkap fenotip otak p35 - / -Rajah 1E). Data-data ini menunjukkan bahawa promoter 1.2-kb p35 menguasai ungkapan transgene dengan profil ekspresi yang sama dengan p35 dari gen p35 endogen.
Tahap Protein p35 Adalah Kadar-Batasan untuk Up-Regulasi Aktiviti Cdk5. Kami mengkaji kesan dos gen pengekodan p35 dan Cdk5 pada ekspresi protein dalam ekstrak striatal dari tikus p35 - / -, p35 +/-, jenis liar, Tgp35, Cdk5 +/-, dan TgCdk5 pada usia 3 bulan. Tahap protein p35 dan Cdk5 berkorelasi baik dengan dos gen, masing-masingRajah 2 A and B). Tikus Tgp35 menunjukkan peningkatan ≈1.6-kali ganda dalam tahap protein p35 berbanding tikus jenis liar, sedangkan tahap protein Cdk5 tidak terjejas oleh tahap protein yang berbeza P35. TgCdk5 tikus menunjukkan kenaikan ≈1.9-lipat dalam tahap protein Cdk5 berbanding dengan tikus jenis liar, sedangkan tahap protein p35 tidak dipengaruhi oleh tahap protein Cdk5 yang berlainan. Untuk mengkaji kesan jumlah protein p35 yang berlainan pada aktiviti Cdk5, Cdk5 telah diimunkan semula daripada ekstrak striatal dengan antibodi anti-Cdk5 dan aktiviti kinase diukur. Begitu juga untuk mengkaji kesan jumlah protein Cdk5 yang berlainan pada aktiviti kinase, p35 telah diimunisasi daripada ekstrak striatal dengan antibodi anti-p35, dan aktiviti kinase diukur. Aktiviti Cdk5 berkorelasi baik dengan tahap protein p35 tetapi tidak dengan tahap protein Cdk5 (Rajah 2 C and D). Keputusan ini menunjukkan bahawa jumlah protein p35 adalah faktor pengurangan kadar untuk aktiviti Cdk5. Oleh itu, kami menggunakan tikus Tgp35 untuk menyiasat kesan peningkatan aktiviti Cdk5 pada isyarat dopamin yang striatal.
Fosforilasi Cocaine-DARPP-32 di Thr-34 Dihidupkan dalam tikus Tgp35. Fungsi DARPP-32 bergantung kepada keadaan fosforilasinya di beberapa laman web (20). Phosphorylates PKA DARPP-32 pada Thr-34, sedangkan fasforori Cdk5 DARPP-32 pada Thr-75. Oleh itu, kita mengkaji keadaan phosphorylation DARPP-32 dalam ekstrak striatal dari liar-jenis dan tikus Tgp35. Tahap phospho-Thr-75 DARPP-32 lebih tinggi dalam tikus Tgp35 (Rajah 3A; 1.6 ± 0.2-lipat di atas nilai tikus jenis liar). Kami seterusnya menilai kesan peningkatan aktiviti Cdk5 pada isyarat dopamine striatal. Kami memeriksa pengaktifan PKA yang disebabkan oleh cocaine dalam tikus Tgp35 dengan menganalisis keadaan fosforilasi DARPP-32 pada Thr-34. Tahap phospho-Thr-34 DARPP-32 telah meningkat pada tikus 15 liar jenis selepas suntikan kokain (Rajah 3B; 1.8 ± 0.2-lipat di atas paras basal). Walau bagaimanapun, kesan kokain pada phosphorylation Thr-34 DARPP-32 dilemahkan dalam tikus Tgp35 (1.2 ± 0.3-kali ganda di atas paras basal). Keputusan ini menunjukkan bahawa peningkatan aktiviti Cdk5 meresap pengaktifan PKA yang disebabkan oleh kokain mungkin melalui fosforilasi DARPP-32 di Thr-75 (6, 12). Ia juga mungkin bahawa peningkatan dalam aktiviti presemaptic Cdk5 menyebabkan penurunan pembebasan dopamin, dan ini menyumbang kepada kesan pengurangan kokain. Terutama, satu suntikan kokain tidak mempengaruhi tahap protein p35 dan Cdk5 serta aktiviti kinase (Rajah 3 C and D). Ini adalah berbeza dengan kajian terdahulu di mana pendedahan kronik terhadap kokain telah ditunjukkan untuk mengawal selia ekspresi p35 dan Cdk5 (6).
Up-Regulasi Kegiatan Cdk5 Attenuates Pengaktifan Teras Cocaine ERK1 / 2. Bukti terkini menunjukkan bahawa pengaktifan penerima dopamin dalam striatum juga mengaktifkan cascade isyarat lain, termasuk laluan ERK (21, 22), yang mempunyai peranan penting dalam tindak balas tingkah laku terhadap kokain (23). Oleh itu, kami mengkaji sama ada aktiviti Cdk5 boleh menjejaskan pengaktifan kokain yang diakibatkan oleh laluan ERK. Pengaktifan laluan ERK diperhatikan selepas suntikan cocaine dalam ekstrak striatal dari tikus jenis liar, seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan fosforilasi MEK1 / 2 di Ser-217 dan Ser-221 (1.5 ± 0.2-lipat di atas paras basal) dan ERK1 / 2 pada Thr-202 dan Tyr-204 (fosforilasi ERK2: 1.5 ± 0.2-lipat di atas paras dasar) (Rajah 4 A and B). Walau bagaimanapun, pengaktifan teraruh kokain MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-lipat di atas paras basal) dan ERK1 / 2 (fosforilasi ERK2: 1.2 ± 0.2-lipat di atas paras basal) dilemahkan dalam tikus Tgp35 (Rajah 4 A and B). Selain itu, tahap asas fosfor-ERK1 / 2 lebih rendah dalam tikus Tgp35 (0.8 ± 0.2-lipat di bawah nilai tikus jenis liar), manakala trend ini tidak signifikan secara statistik. Hasilnya yang terakhir mungkin disebabkan oleh fosforilasi yang bergantung pada Cdk5 MEK1 pada Thr-286, mengakibatkan penurunan aktiviti pemangkin (24). Untuk menilai kemungkinan ini, kita mengkaji keadaan fosforilasi MEK1 pada Thr-286 dan mendapati bahawa tahap fosfo-Thr-286 MEK1 yang lebih tinggi hadir dalam ekstrak striatal dari tikus Tgp35 (Rajah 4C; 1.3 ± 0.1-lipat di atas nilai tikus jenis liar). Tambahan pula, keadaan phosphorylation MEK1 di Thr-286 tidak diubah oleh suntikan kokain tunggal, selaras dengan penemuan bahawa aktiviti Cdk5 tidak terjejas oleh rawatan (Rajah 3D).
Penyebaran isyarat Dopamine kepada Intius Dihidupkan oleh Peningkatan Aktiviti Cdk5. Pengaktifan berasaskan kokain yang berlebihan daripada cascades isyarat yang melibatkan PKA dan ERK membawa kepada pengaktifan seterusnya CREB faktor transkripsi dalam nukleus melalui fosforilasinya di Ser-133 (22, 25). Untuk menyiasat sama ada kesan-kesan perencangan Cdk5 yang diantarkan pada PKA dan caskasi pengaktifan ERK mungkin menumpukan pada fosforilasi CREB dalam nukleus, kita memeriksa keadaan fosforilasi CREB di Ser-133 dalam ekstrak striatal dari liar-jenis dan tikus Tgp35. Tahap dasar fosfo-CREB lebih rendah dalam tikus Tgp35 (0.7 ± 0.1-kali ganda dari tikus jenis liar) (Rajah 5). Sebagai tindak balas kepada suntikan kokain, tahap fosforus-CREB telah meningkat di striatum tikus jenis liar (1.5 ± 0.1-lipat di atas paras basal), tetapi tindak balas ini terhadap kokain dilemahkan dalam tikus Tgp35 (1.2 ± 0.1- lipat di atas tahap basal) (Rajah 5).
Fosforilasi CREB di Ser-133 menambah aktiviti transkrip melalui unsur tindak balas cAMP di rantau promoter gen tertentu, termasuk gen c-fos (26). Oleh itu, kami meneliti induksi c-fos dalam striatum liar-jenis dan tikus Tgp35 selepas suntikan kokain. Dalam tikus jenis liar, tahap c-fos mRNA meningkat kepada nilai puncak (1.8 ± 0.2-lipat di atas paras basal) 30 min selepas suntikan kokain, dan kemudiannya kembali ke paras basal oleh min 120 selepas suntikan (Rajah 6 A and B). Walau bagaimanapun, tahap c-fos mRNA adalah ≈30% lebih rendah dalam tikus Tgp35 daripada tikus jenis liar hingga min 30 selepas suntikan (Rajah 6 A and B). Induksi c-fos yang lebih rendah dalam tikus Tgp35 lebih disokong oleh imunohistokimia (Rajah 6 C-F). Pentadbiran kokain meningkatkan immunoreactivity c-fos, kuat di bahagian dorsomedial-dorsocentral striatum dan lemah di bahagian sisi, di kedua liar-jenis dan tikus Tgp35. Walau bagaimanapun, kenaikan kokain yang disebabkan oleh bilangan sel-sel c-fos-imunopositif terutamanya dilemahkan di striatum tikus Tgp35 (Rajah 6G). Bersama-sama, keputusan-keputusan ini menunjukkan bahawa peningkatan pengoksidaan cocaine terhadap dopamine striatal yang memberi isyarat kepada nukleus telah menghalangi tikus Tgp35, kemungkinan peningkatan aktiviti Cdk5.
Perbincangan
Cdk5 dan pengaktifnya p35 telah dikenalpasti sebagai gen sasaran yang dikawal selia oleh pendedahan kronik ke kokain (6). Kami melaporkan di sini bukti bahawa peningkatan aktiviti Cdk5, sebagai hasil daripada regulasi up p35 dan bukannya regulasi Cdk5, membawa kepada pelemahan isyarat dopamine-mediated di neuron-neuron striatal. Untuk mengkaji akibat dari ekspresi yang dikawal oleh Cdk5 atau p35 pada isyarat dopamine striatal, dua baris tikus transgenik, tikus TgCdk5 dan Tgp35 dianalisis. Kami mendapati bahawa aktiviti Cdk5 dikendalikan secara beransur-ansur berkadar dengan peningkatan paras protein p35 tetapi tidak terjejas oleh tahap peningkatan protein Cdk5. Laporan terdahulu kami juga telah menunjukkan bahawa aktiviti Cdk5 dalam otak tikus TgCdk5 lebih rendah daripada otak tetikus jenis liar apabila aktiviti itu diukur dengan menggunakan immunoprecipitates Cdk5 (17), menunjukkan bahawa jangkaan overexpression Cdk5 dalam peningkatan tahap monomerik Cdk5 jika tahap p35 tidak meningkat. Keputusan ini menunjukkan bahawa tahap protein p35 adalah faktor pengurangan kadar untuk aktiviti Cdk5.
Tikus Tgp35 mempamerkan induksi yang lebih rendah dari kedua-dua fosforilasi CREB dan c-fos di striatum selepas suntikan kokain akut, menunjukkan bahawa respons striatal terhadap kokain telah dihalang oleh peningkatan aktiviti Cdk5. Pelemahan isyarat dopamine-mediated di tikus Tgp35 mungkin dicapai melalui perencatan-mediated Cdk5 dari pelbagai cascades isyarat yang melibatkan DARPP-32, PKA, dan ERK. Pentadbiran kokain meningkatkan fosforilasi PKA DARPP-32 pada Thr-34 dalam tikus jenis liar, sedangkan respons ini dilemahkan dalam tikus Tgp35. Phosphorylation PKA DARPP-32 pada Thr-34 telah ditunjukkan untuk menghalang aktiviti protein phosphatase 1 (PP1), enzim yang bertanggungjawab untuk dephosphorylation Ser-133 dari CREB (27). Oleh itu, aktiviti PP1 tidak akan bertentangan melalui laluan DARPP-32 / PP1 dalam tikus Tgp35.
Pengaktifan berasaskan kokain ERK1 / 2 juga dilemahkan dalam tikus Tgp35. Terdapat beberapa mekanisme yang berbeza di mana Cdk5 dapat menghalang pengaktifan teraruh kokain dari ERK1 / 2. Pertama, phosphorylation yang bergantung kepada Cdk5 DARPP-32 pada Thr-75 dapat menghalang PKA, yang menyebabkan perencatan selanjutnya terhadap pengaktifan MEK1 / 2 yang dimediasi PKA yang diperlukan untuk pengaktifan ERK1 / 2. Satu kajian baru-baru ini juga mendapati bahawa fosforilasi DARPP-32 di Thr-34 diperlukan untuk pengaktifan pengimejan kokain ERK1 / 2 oleh pelbagai laluan yang melibatkan pengawalan tidak langsung pengaktifan MEK serta melibatkan pengawalan fosfatase diperkaya striatal, tirosin fosfatase yang bertindak secara langsung pada ERK1 / 2 (28). Sokongan untuk kemungkinan ini dicadangkan oleh penemuan bahawa fosforilasi yang diinduksi kokain MEK1 / 2 di Ser-217 dan Ser-221 telah dimansuhkan dalam tikus Tgp35. Laluan lain mungkin melalui fosforilasi Cdk5 MEK1 pada Thr-286, yang akan mengakibatkan pengurangan aktiviti pemangkin dan menyebabkan perencatan aktiviti ERK1 / 2 (24).
Perencatan aktiviti Cdk5 di striatum telah ditunjukkan untuk meminimumkan kesan tingkah laku rawatan kokain kronik pada haiwan (6). Selaras dengan hipotesis bahawa peningkatan peraturan aktiviti Cdk5 boleh menyumbang kepada penyesuaian neuron untuk menangkis kesan pengambilan kokain berulang (6), kami mendapati bahawa fosforilasi Cdk5-DARPP-32 dan MEK1 telah menyumbang kepada pengurangan pengaktifan kokain yang diinduksi oleh ERK1 / 2, mengakibatkan induksi fosforilasi CREB dan c-fos yang lebih rendah di striatum. Penemuan kami menyokong idea bahawa peningkatan aktiviti Cdk5, sebagai hasil dari peraturan-peraturan p35, boleh mengubah ekspresi gen di striatum selepas pendedahan kronik ke kokain. Ini mungkin berlaku melalui perubahan dalam aktiviti-aktiviti faktor transkripsi seperti CREB dan c-fos. Oleh itu, pengaktif Cdk5 p35, berdasarkan kesan pengurangan kadarnya pada aktiviti Cdk5, boleh menyumbang kepada perubahan jangka panjang dalam fungsi neuron yang mendasari ketagihan kokain.
Penghargaan
Kami berterima kasih kepada Drs. Mary Jo Danton, Philip Grant, dan Sashi Kesavapany untuk membaca kritikal manuskrip. Kerja ini disokong oleh Geran Institut Kesihatan Nasional Z01DE00664-05 (kepada ABK), Geran Perkhidmatan Kesihatan Awam AS DA10044, dan geran dari Yayasan Simons, Yayasan Peter J. Sharp, dan Yayasan Picower (kepada PG).
Nota
Singkatan: Cdk5, kinase 5 bergantung kepada cyclin; ERK, kinase terkawal isyarat ekstraselular; DARPP-32, fosfoprotein dopamin dan cAMP, jisim molekul 32 kDa; PKA, kinase yang bergantung kepada cAMP; MEK, ERK kinase; CREB, protein-mengikat elemen tindak balas cAMP.
Rujukan
;