J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
Source
Jabatan Psikiatri, Pusat Saraf Neurosains, Pusat Perubatan Southwestern Universiti Texas, Dallas, Texas 75390-9070, Amerika Syarikat.
Abstrak
Faktor transkripsi DeltaFosB (juga dikenali sebagai FosB2 atau FosB [bentuk pendek]) adalah pengantara penting kepekaan jangka panjang yang disebabkan oleh otak oleh pendedahan kronik kepada beberapa jenis rangsangan psikoaktif, termasuk dadah penyalahgunaan, tekanan, dan kejutan elektroconvulsif . Satu ciri yang berbeza dari DeltaFosB ialah, sekali terangsang, ia berterusan di dalam otak untuk jangka masa yang agak lama tanpa adanya rangsangan selanjutnya. Mekanisme yang mendasari kestabilan ini, bagaimanapun, masih tidak diketahui. Di sini, kami menunjukkan bahawa DeltaFosB adalah faktor transkripsi yang relatif stabil, dengan separuh hayat kira-kira 10 h dalam budaya sel. Tambahan pula, kami menunjukkan bahawa DeltaFosB adalah fosfoprotein di otak dan bahawa fosforilasi residu serine yang sangat konservatif (Ser27) dalam DeltaFosB melindunginya daripada degradasi proteasomal. Kami menyediakan beberapa bukti yang menunjukkan bahawa fosforilasi ini diasingkan oleh kasein kinase 2. Penemuan ini merupakan bukti pertama bahawa DeltaFosB adalah fosforilasi dan menunjukkan bahawa fosforilasi menyumbang kepada kestabilannya, yang merupakan inti keupayaannya untuk memeterai adaptasi yang tahan lama di otak.
Pengenalan
Faktor transkripsi ΔFosB, yang juga ditetapkan FosB2 atau FosB [bentuk pendek], adalah cecair Splice terminus terpotong C gen awal segera fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu dan Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Seperti FosB panjang penuh, ΔFosB mempunyai domain asas yang mengikat DNA dan ritsleting leucine di mana ia dimilkan dengan protein Jun untuk membentuk kompleks kompleks-1 (AP-1) kompleks transkripsi, yang mengatur ekspresi banyak gen (Morgan dan Curran, 1995; Rylski dan Kaczmarek, 2004). Walaupun tidak mempunyai bahagian dari domain transactivation yang terdapat di terminal C FosB, fungsi ΔFosB sebagai penggerak transkripional yang kuat dan penindas dalam sel-sel berbudaya dan di dalam otakDobrazanski et al., 1991; Nakabeppu dan Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung dan Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔFosB didorong ke tahap yang tinggi dalam cara yang spesifik di rantau otak selepas kronik, tetapi tidak akut, pendedahan kepada pelbagai rangsangan psikoaktif, termasuk tekanan, lesi tertentu, ubat antipsikotik dan antidepresan, ubat penyalahgunaan, dan ganjaran semula jadi (Hope et al., 1994b; Hiroi dan Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). Induksi ΔFosB telah dikaitkan secara langsung dengan kesan fungsi beberapa rangsangan pada otak. Kekerapan ΔFosB walaupun tanpa rangsangan tambahan membezakannya dari semua faktor transkripsi keluarga Fos yang lain, yang disebabkan secara cepat sebagai tindak balas kepada rangsangan akut, merosakkan kembali ke tahap basal dalam masa beberapa jam, dan secara umumnya menunjukkan desensitisasi selepas rangsangan kronik (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi dan Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Ini menjadikan ΔFosB sebagai calon yang menarik untuk memeterai beberapa perubahan jangka panjang dalam ekspresi gen yang mendasari penyesuaian neuron yang stabil yang disebabkan oleh rangsangan kronik tertentu.
Oleh sebab kehadiran ΔFosB yang berpanjangan berlaku tanpa keterlibatan mRNA (Chen et al., 1995), kami membuat spekulasi bahawa, tidak seperti FosB panjang dan semua protein keluarga Fos yang lain, yang secara intrinsik tidak stabil, ΔFosB mungkin merupakan faktor transkripsi yang luar biasa stabil (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Selain itu, analisis imunoblot terhadap tisu otak yang dirangsang dengan akut - berbanding dengan tisu otak yang dirangsang mencadangkan bahawa ΔFosB beralih dengan ketara Mr (jisim molekul) dari ~33 kDa dalam keadaan akut ke ~ 35-37 kDa semasa rawatan kronik (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Oleh kerana tidak ada bukti untuk wujudnya mRNA tambahan yang dapat dikodkan untuk pelbagai isoforms, kami selanjutnya membuat spekulasi bahawa ΔFosB diubahsuai secara transparan dan mungkin ini menyumbang kepada kestabilan yang luar biasa. Walau bagaimanapun, setakat ini, tiada analisis biokimia mengenai perolehan atau pengubahsuaian posttranslational ΔFosB telah dilaporkan. Matlamat kajian ini adalah untuk menentukan sama ada ΔFosB adalah phosphoprotein dan sama ada fosforilasi memainkan peranan dalam kestabilannya.
Seksyen SebelumSeksyen seterusnya
Bahan dan Kaedah
Talian sel mamalia dan DNA membina.
Sel-sel PC12 (Clontech, Mountainview, CA) dibiakkan dalam DMEM glukosa tinggi mengandungi l-glutamin (L-Gln) dan ditambah dengan serum bovine janin 5 (FBS), serum kuda 10 (kedua-duanya dari Invitrogen, Carlsbad, , 100 U / ml penisilin, dan streptomycin 100 μg / ml (kedua-duanya dari Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Sel-sel HeLa (Koleksi Kebudayaan Jenis Amerika, Manassas, VA) telah dibiakkan dalam DMEM glukosa tinggi yang mengandungi L-Gln dan ditambah dengan 10% FBS, penisilin, dan streptomycin. Kedua-dua garisan sel dikekalkan di 37 ° C dalam CON yang lembap% CON2 suasana.
Untuk pemindahan transient dengan DNA, sel-sel PC12 atau HeLa telah dijadikan benih ke enam plat telur (dilapisi dengan kolagen I untuk sel-sel PC12) untuk mencapai pertemuan 90-100 pada hari berikutnya dan kemudian dihantar melalui Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Dalam beberapa eksperimen (lihat Buah ara. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB secara transiently dinyatakan dalam sel PC12 melalui jangkitan dengan herpes simplex virus rekombinan (HSV).
ΔFosB dan FosB cDNA diperoleh daripada pTetop-constructs kita sendiri (Chen et al., 1997), dan subcloned ke vektor pcDNA3.1 (Invitrogen). Pembentukan pcDNA3.1-ΔFosB / FosB ini digunakan untuk ungkapan dalam sel-sel mamalia dan sebagai templat untuk mutagenesis yang diarahkan oleh tapak. Rekombinan HSV-ΔFosB telah disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini (Neve et al., 1997), dan penyediaan mempunyai titer ~ 1 × 108 pfu / ml.
Eksperimen pulse-chase.
Kira-kira 24 h selepas jangkitan / pemindahan, sel-sel (PC12 atau HeLa) dalam enam plat telaga dicuci dua hingga tiga kali dengan 2 ml PBS dan diinkubasi pada 37 ° C untuk ~ 1 h dalam 2 ml DMys / Met bebas DMEM (Invitrogen) ditambah dengan 5% yang diulas FBS (Hyclone, Logan, UT) untuk mengurangkan kolam intrasel Met & Cys. Pada akhir tempoh "kelaparan" ini, ubat-ubatan (jika sel akan dirawat) telah ditambahkan, dan sel-sel dilabel (pulse) dengan 12-25 μCi 35S Penyediaan Pelabelan Protein (PerkinElmer, Wellesley, MA) untuk ~ 1 h pada 37 ° C untuk melabelkan semua protein yang disintesis. Radiolabel kemudiannya dibuang dengan membasuh sel dua hingga tiga kali dengan 2 ml PBS, dan 35Protein S-label diikuti (mengejar) dengan menggantikan medium dengan medium "sejuk" (nonradioactive) ditambah dengan 5% FBS dan menuai sel-sel pada pelbagai titik masa. Rawatan sel telah dikekalkan sepanjang mengejar. Semua angka eksperimen ini menunjukkan jumlah permulaan yang sama dari pelbagai protein untuk mengoptimumkan perbandingan kadar perolehan mereka.
Rawatan penyembuhan elektroconvulsive haiwan dan kronik.
Tikus jantan dewasa Sprague Dawley (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) dirawat sekali sehari dengan elektrokonvulsif sawan (ECS) untuk 7-9 d. ECS telah dilaksanakan seperti yang dinyatakan sebelum ini (Hope et al., 1994a) dengan menggunakan Ugo Basile (Comerio VA, Itali) unit ECS dengan tetapan berikut: kekerapan, pulsa 100 / s; nadi dengan, 0.5 ms; tempoh kejutan, 1.0 s; dan semasa, 75 mA. Haiwan kawalan syam dirawat selari dengan menggunakan elektrod telinga-klip tanpa arus elektrik.
32 Pelabelan metabolik P.
Untuk pelabelan kepingan otak, tikus dipenggal, otak dibelah dengan cepat, dan irisan kortikal depan 300 μm disediakan dengan mikroslicer DSK (Ted Pella, Redding, CA). Kepingan-kepingan itu diinkubasi di dalam tiub plastik di dalam 2 ml fosfat-kekurangan CSF buatan (ACSF) dan dikekalkan pada 30 ° C di bawah gelembung lembut berterusan dengan O2/ CO2 campuran (Hemmings et al., 1989). Kepingan (dua keping setiap tiub) dilabelkan dengan 1.3 mCi untuk 8-10 h pada kehadiran atau ketiadaan asid okadaik (100 ng / ml). Pada akhir inkubasi ini, kepingan-kepingan dibilas sekurang-kurangnya tiga kali dengan ACSF yang sejuk dan kemudian dihomogenkan dengan sonication dalam buffer 250 μl buffer radioimmunoprecipitation (RIPA) buffer [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v Iget, 0.5% (w / v) sodium deoxycholate, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA] sebelum digunakan dengan SDS sehingga 0.6%, koktel inhibitor protease untuk sel mamalia (digunakan pada 5 μl / Sigma-Aldrich), koktel inhibitor fosfatase I dan II (digunakan pada 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF, dan 2% gliserol. Homogenates kemudian direbus untuk min 15 dan dibersihkan oleh centrifugation di 15,000 × g untuk min 15. Kepekatan protein dalam supernatan yang dihasilkan telah dinilai menggunakan assay protein BCA (Pierce, Holmdel, NJ).
Bagi 32P pelabelan sel-sel berbudaya, ~ 24 h selepas jangkitan / pemindahan, sel-sel dicuci dua hingga tiga kali dengan medium bebas fosfat dan diinkubasi dalam medium ini untuk ~1 h. Selepas tempoh kebuluran ini, 0.2-0.3 mCi of 32PH3PO4 (PerkinElmer) ditambah kepada setiap sumur, dan sel dilabel untuk 4-12 h bergantung kepada jenis eksperimen (lihat Rajah 1-7 untuk spesifikasi). Sel-sel kemudian dibasuh tiga kali dengan PBS dan dilepaskan pada ais untuk 15 min dengan 50 μl penampan RIPA ditambah. Lysates dikumpulkan dengan mengikis dan diluluskan kali 10 melalui jarum 25 ga kepada DNA ricih, direbus untuk 10 min, dan disentrifugasi pada 15,000 rpm untuk min 15-30 pada 4 ° C. Lysates yang dibersihkan (supernatan) telah dipindahkan ke tiub baru dan ujian protein BCA (Pierce) dilakukan. Semua angka eksperimen menunjukkan jumlah protein liar jenis-jenis liar (WT) dan S27A ΔFosB yang sama untuk mengoptimumkan perbandingan perbandingan fosforilasi relatif mereka.
Rawatan kimia dan sel kultur.
Asid okadaik (OA; Sigma-Aldrich) telah dibubarkan dalam etanol dan digunakan pada kepekatan akhir 100 ng / ml. 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) dibubarkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO; Sigma-Aldrich) dan digunakan dalam kultur sel pada kepekatan akhir 50 μm. Spermin (Sigma-Aldrich) dibubarkan di dalam air dan digunakan pada kepekatan akhir 200 μm. Calphostin-C (Biomol) telah dibubarkan dalam DMSO dan digunakan pada 0.2 μm, manakala XORUM X-Atom (PMA; Promega, Madison, WI) phorbol X dibubarkan di DMSO dan digunakan pada 12 μm. peptida perencatan myristoylated-autocamtide-13 (m-AIP; Biomol) telah dibubarkan dalam air dan digunakan pada kepekatan akhir 0.1 dan 2 μm. Spektrum protein kinase inhibitor H-1 dan H-10 (Biomol) telah dibubarkan dalam air dan digunakan pada kepekatan akhir 7 dan 8 μm, masing-masing. MG150 (Calbiochem, San Diego, CA) dan epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) masing-masing dibubarkan dalam DMSO dan digunakan pada kepekatan akhir 200 dan 132 μm, masing-masing. Dalam semua eksperimen, DMSO (kenderaan) telah ditambahkan ke sel-sel seperti yang diperlukan untuk mengekalkan jumlah yang berterusan DMSO merentasi rawatan. Untuk 32Eksperimen pelabelan P, ubat-ubatan itu ditambah serta-merta sebelum label dan disimpan untuk baki tempoh pelabelan. Untuk eksperimen pulse-chase, ubat-ubatan telah ditambah pada masa Cys / Met "kelaparan," disimpan melalui tempoh pelabelan, dan kemudian menambah kembali ke medium mengejar. Inhibitor proteasome telah dinyalakan setiap 3-4 h sepanjang mengejar untuk mengimbangi perolehan cepat peptida-peptida ini.
ΔFosB immunoprecipitation, immunoblotting, dan autoradiography.
Untuk imunoprecipitations, lysates dicairkan 1: 5 dengan RIPA biasa untuk membawa kepekatan SDS turun ke 0.1% sebelum meneruskan dengan immunoprecipitation (IP). Untuk membatasi pengekalan tidak spesifik, lysates pertama dibersihkan oleh imunoprecipitating dengan IgG dan protein nonimmune G-Sepharose (Sigma-Aldrich) sekurang-kurangnya 4 h. ΔFosB kemudiannya diimunisasi dari lysates yang dibuang menggunakan antibodi poliklonal kambing yang mengiktiraf epitope dalaman yang terdapat di kedua-dua FosB dan ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA) di 0.5-1 IgG Ig per 10 μg protein lysate (50-300 μg jumlah protein) dalam jumlah keseluruhan 0.5 ml. IP dicampur perlahan pada 4 ° C pada rotor sekurang-kurangnya 8 h dan kemudian 15 μl protein G-Sepharose ditambah dan IP dicampurkan sekurang-kurangnya satu lagi 4 h. IP telah dipukul oleh pemintalan pada 3000 × g untuk 3-5 min pada 4 ° C, dibasuh tiga kali dengan ml 0.5 RIPA biasa sejuk dan dua kali dengan PBS yang mengandungi 0.1% Tween 20. IP kemudian dihidupkan kembali dalam 0.5 ml PBS sejuk, dipindahkan, dipelbur dalam tiub baru, dan protein immunoprecipitated kemudian dihilangkan dengan penambahan 15-25 μl 2 × mengurangkan buffer sampel protein Laemmli. Protokol IP ini menghasilkan hujan yang spesifik dan berkesan hampir semua ΔFosB di lysate. Protein imunopraktik telah tertakluk kepada SDS-PAGE dengan memuat seluruh IP pada gel Kriteria 12.5% Tris-HCl (Bio-Rad, Hercules, CA), dan kemudian dipindahkan ke PVDF atau nitrocellulose. Selepas pemindahan, membran adalah udara kering dan 32P- dan 35Band-protein protein S-radio diperhatikan oleh autoradiografi menggunakan filem autoradiografi Kodak (Rochester, NY), dan juga dengan phosphorimaging menggunakan Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Jumlah (tidak fosforilasi dan fosforilasi) ΔFosB dalam lysates sel atau homogenat otak telah dikesan oleh immunoblotting sama ada protein imunopencipit (menggunakan membran yang sama digunakan untuk mengesan 32Protein P-label), atau jumlah protein lysate / homogenat yang sama tertakluk kepada SDS-PAGE dan dipindahkan ke PVDF atau nitrocellulose. Membran pertama disekat dengan menghidupkannya dengan 1% (w / v) susu tanpa lemak (Bio-Rad) di PBS ditambah dengan 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) untuk 1 h pada 25 ° C. Membran kemudiannya diimunkan pada malam di 4 ° C dengan antibodi poliklonal antibodi anti-FosB kita sendiri yang dihasilkan daripada asid amino 1-16 dari FosB / ΔFosB (digunakan pada 1: 10,000). Selepas pengeraman primer, membran telah dibasuh empat kali untuk min 5 dengan penampan penyekat, dan kemudian diinkubasi pada 25 ° C untuk ~ 1 h dengan anti-arnab kambing IgG konjugated kepada peroksidase lobak (digunakan pada 1: 5000 dalam penyekat penyekat, dari Vektor Makmal, Burlingame, CA). Membran kemudian dibasuh tiga kali untuk 10 min dengan penampan penyekat dan satu kali untuk min 5 dengan PBS. Jumlah protein protein ΔFosB divisualisasikan pada filem Kodak MR oleh kemiluminescence (Pierce) dan / atau dengan pengesanan pendarfluor menggunakan reagen ECL-Plus (Amersham Biosciences) dan Storm PhosphorImager.
Overexpression dan pembersihan rekombinan ΔFosB dari sel-sel serangga.
ΔFosB telah diekspresikan dalam sel-sel serangga Sf9 sebagai terminal N yang diberi nama hexa-His-tagged protein (N-His (6) ΔFosB) menggunakan sistem ekspresi baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) dan mengikuti arahan pengilang. Ringkasnya, cDNA ΔFosB (residu 2-237) yang didahului oleh tag N-terminal afiniti MGHHHHHHAG telah subcloned dalam vektor pFASTBacTM1, yang digunakan untuk menghasilkan baculovirus rekombinan. Sel Sf9 telah dijangkiti virus rekombinan, dan N-His (6) ΔFosB telah disucikan dari lysates sel oleh beberapa langkah kromatografi termasuk kromatografi afiniti menggunakan lajur nikel (Qiagen, Valencia, CA), pertukaran anion menggunakan lajur mono-Q (Amersham Biosains), dan saiz pengecualian menggunakan lajur gel-penapisan (Amersham Biosciences).
In vitro kajian fosforilasi.
In vitro tindak balas fosforilasi untuk kursus masa dan analisis stoikiometri dilakukan dalam isipadu 30 μl yang mengandungi substrat 10 μm (N-His (6) ΔFosB atau substrat kawalan positif), 250 μm ATP, dan 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, penimbal yang dibekalkan oleh pengilang kinase, dan salah satu kinase berikut: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / Calbiochem) atau p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Reaksi kursus masa dilakukan dengan membuang aliquot 5 μl dari larutan reaksi pada titik masa yang ditentukan dan menambah jumlah yang sama 4 × mengurangkan buffer sampel protein Laemmli. Parameter kinetik Michaelis-Menten untuk tindak balas CK2 ditentukan di bawah keadaan keadaan mantap tegar keadaan empiris. Reaksi ini dilakukan untuk min 15 dalam jumlah 10 μl yang mengandungi enzim 2 ng / μl, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, dan N-His (6) ΔFosB kepekatan dari 2.5-30 μm. Semua reaksi dilakukan di 30 ° C dalam mandi air. Selepas SDS-PAGE dan pewarnaan gel dengan Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), gel telah kering, dan 32Penggabungan P-fosfat dinilai oleh analisis phosphorimaging (lihat di bawah, Kuantifikasi data, perhitungan, dan statistik).
Peta fosfopeptida dua dimensi dan analisis asid phosphoamino.
Kedua-dua analisis ini dilakukan seperti yang diterangkan oleh Ploegh dan Dunn (2000). Secara ringkas, serpihan gel kering yang mengandungi 32P-berlabel ΔFosB (sama ada dari vitro tindak balas atau dari immunoprecipitates sel-sel berlabel metabolik), telah dikeluarkan, direhodrasi semula, dibasuh, dan dirawat dengan pencernaan yang tryptic. Supernatan yang mengandungi produk pencernaan tryptic adalah lyophilized dan lyophilate dibasuh beberapa kali dan disokong semula dalam 10 μl buffer electrophoresis, pH 1.9. Sampel (3 μl) dilihat pada plat kromatografi nipis selulosa (TLC) (Analtech, Newark, DE) dan dipisahkan dalam satu dimensi oleh elektroforesis dan dimensi lain dengan menaikkan TLC. Peta fosfopeptida yang dihasilkan telah digambarkan oleh autoradiography dan phosphorimaging. Untuk analisis asid fosfoamino, 2 μl daripada pencernaan tryptic yang telah disuplai semula dalam penampan elektroforesis kemudian dipecahkan oleh hidrolisis HCl pada 105 ° C untuk min 25 dalam 3 m HCl di bawah N2 suasana. Reaksi itu telah dihentikan oleh pencairan enam kali dalam air, dan campuran itu telah dimansuhkan. Lofofilat telah dilancarkan semula di 5 μl penampan elektroforesis, pH 1.9, dan ditemui pada plat TLC selulosa berserta piawaian fosfo-Ser, -Thr, dan -Tyr. Elektroforesis dilakukan lebih separuh daripada panjang plat TLC menggunakan penampan elektroforesis, pH 1.9, dan kemudian plat telah dipindahkan ke pH 3.5 buffer, dan elektroforesis dilakukan untuk diselesaikan. Piawaian asid fosfoamino divisualisasikan dengan menyembur plat TLC dengan larutan 1% (v / v) ninhydrin dalam aseton, dan 32Sampel asid amino yang diberi label P telah divisualisasikan oleh kedua-dua autoradiography dan phosphorimaging.
siRNA yang disebabkan oleh CK2α knock-down.
Kami menggunakan kaedah gangguan RNA untuk secara selektif mengetuk tahap CK2 (Di Maira et al., 2005). Sel-sel PC12 telah dibenamkan ke plat enam padu kolagen yang dilapisi untuk mencapai ~70-80% pada keesokan harinya, apabila transiently ditransfeksi dengan 20 nm (kepekatan akhir) sama ada siRNA atau siRNA yang tidak ditujukan ke arah mRNA pemangkin α subunit Tikus CK2, menggunakan 5 μl ejen transfection SilentFectin (Bio-Rad) dan mengikuti arahan pengeluar. Kira-kira 24 h kemudian, sel-sel transien ditransfeksi dengan ΔFosB plasmid, seperti yang dinyatakan di atas. Kira-kira 24 h kemudian (~48 h selepas transfection siRNA), sel-sel telah tertakluk sama ada 32Pelabelan metabolisma P atau analisis nadi seperti yang diterangkan di atas. Berikut adalah empat siRNA CK2α yang digunakan dengan hasil yang sama: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3' (Dharmacon, Lafayette, CO). Sebagai kawalan negatif, kami menggunakannya Silencer kawalan negatif #3 siRNA dari Ambion (Austin, TX). Tahap pengetatan CK2 dipantau oleh imunoblotting menggunakan anti-CK2 antibodi poliklonal (katalog # 06-873 dari Upstate) semalaman di 1: 1000 pencairan. β-Tubulin digunakan sebagai kawalan pemuatan dan dikesan dengan antibodi monoklonal (katalog # 05-661 dari Upstate) semalaman di 1: pengenceran 20,000.
Mutagenesis yang diarahkan oleh tapak.
Mutasi Ser27 ke Ala atau Asp telah dicapai dengan menggunakan kit Mutagenesis Directed Site Change (Stratagene, La Jolla, CA) dan mengikuti arahan pengeluar. Untuk memperkenalkan mutasi Ser27 dalam protein ΔFosB tetikus, primer mutagenesis berikut digunakan. Ser27 ke Ala: (primer terbalik) 5'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. Ser27 ke Asp (primer ke hadapan) 5'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. Pangkalan mutasi adalah berani, dan kodon Ser27 diuraikan.
Bioinformatik.
Tapak fosforilasi berpotensi dan kinase untuk ΔFosB telah dicari dengan menghantar urutan protein tetikus kepada pangkalan data khusus termasuk ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), dan NetPhosK (Blom et al., 2004).
Pengiraan data, pengiraan, dan statistik.
Jumlah protein yang terdapat dalam membran PVDF atau nitrocellulose dikalkimumkan menggunakan Storm PhosphorImager dan perisian ImageQuant yang disertakan (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). Dalam budaya sel dan kajian fosforilasi keping otak, nilai yang diperolehi untuk 32P-label protein kemudian dibahagikan dengan nilai-nilai yang diperolehi untuk jumlah ΔFosB, dan dinyatakan sebagai nisbah. Di dalam vitro kajian fosforilasi, jumlah 32P-labeled ΔFosB setiap mol ΔFosB (stoikiometry) dikira seperti yang dinyatakan sebelum ini (Sahin et al., 2004). Semua pengukuran telah diambil dalam pelbagai lineariti instrumen yang digunakan. Parameter kinetik dikira menggunakan model Michaelis-Menten, di mana V = VMax[S] / ([S]+KM) dan VMax = k2[EJumlah]. Separuh hayat (t1/2) daripada ΔFosB dan FosB dianggarkan dari plot pulsa-mengejar (menggunakan regresi tak linear yang paling sesuai dengan titik data) dan sesuai dengan masa yang jumlah baki protein adalah 50% asal. Dalam semua angka, hasil yang ditunjukkan mewakili sekurang-kurangnya dua hingga tiga eksperimen bebas. Dalam semua grafik, data yang ditunjukkan adalah purata ± SEMs (3 ≤ n ≤16). Kepentingan statistik perbezaan ditaksir menggunakan pasangan yang tidak berpasangan t ujian, diperbetulkan untuk perbandingan banyak, dan asterisk menunjukkan p ≤ 0.05.
Seksyen SebelumSeksyen seterusnya
Hasil
ΔFosB adalah faktor transkripsi yang luar biasa stabil
Walaupun kami telah meramalkan sebelumnya bahawa ΔFosB adalah faktor transkripsi yang stabilNestler et al., 2001), analisa langsung mengenai profil perolehan protein belum dikemaskini. Untuk mengatasi masalah ini, kami menjalankan eksperimen pulse-chase menggunakan sel PC12, yang telah digunakan secara meluas sebagai garis sel seperti neuron, di mana ΔFosB secara transiently dinyatakan melalui jangkitan dengan virus herpes simplex rekombinan (HSV-ΔFosB). Protein yang disintesis baru metabolik dilabelkan dengan 35S-Met / Cys, dan corak degradasi 35S-labeled ΔFosB (35S-ΔFosB) dipantau oleh imunoprecipitated dari lysates sel yang diperolehi pada pelbagai titik masa selepas penyingkiran asid amino radiolabel. Analisis imunoprecipitates oleh SDS-PAGE dan autoradiography mendedahkan bahawa separuh hayat ΔFosB dalam sel PC12 adalah ~ 10 h (Rajah 1). Penemuan ini menunjukkan bahawa separuh hayat ΔFosB adalah lebih tinggi daripada faktor transkripsi yang paling boleh dirasakan (lihat Perbincangan), termasuk FosB yang penuh dengan panjang, yang separuh hayat dalam budaya sel telah dilaporkan ~ 90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Di samping itu, perlu diperhatikan bahawa degradasi ΔFosB tidak sesuai dengan kurva kurus eksponen tahap pertama, tetapi ia adalah biphasic, bermula dengan kadar penurunan yang perlahan. Ini menunjukkan kewujudan lebih daripada satu spesis ΔFosB dan / atau lebih daripada satu laluan degradasi.
Lihat versi yang lebih besar:
Rajah 1.
ΔFosB adalah faktor transkripsi yang luar biasa stabil. Separuh hayat ΔFosB ialah ~ 10 h dalam budaya sel. ΔFosB dinyatakan dalam sel-sel PC12 dengan sama ada jangkitan dengan HSV-ΔFosB atau transfection sementara dengan plasmid yang mengandungi ΔFosB, dan sel-sel telah menjalani eksperimen pulse-chase seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Kaedah. Hasil yang sama diperolehi tanpa mengira kaedah yang digunakan untuk mengatasi ΔFosB. Angka menunjukkan kursus masa (dan autoradiogram wakil) ΔFosB degradasi. Data yang diplot adalah ± SEM purata sekurang-kurangnya titik data individu 15 yang diperoleh dari sekurang-kurangnya lima percubaan bebas. Sebagai perbandingan, separuh hayat penuh FosB yang dilaporkan ditunjukkan.
ΔFosB adalah fosfoprotein dalam otak
Kami telah membuat hipotesis bahawa pengubahsuaian posttranslational daripada ΔFosB boleh menyumbang kepada kestabilan yang jelas. Kerana phosphorylation telah ditunjukkan untuk memodulasi aktiviti transkripsi faktor dalam banyak cara, termasuk kestabilan mereka (untuk kajian, lihat Desterro et al., 2000; Whitmarsh dan Davis, 2000), kami menyiasat sama ada ΔFosB adalah phosphoprotein. Untuk tujuan ini, ungkapan ΔFosB diinduksi pada otak tikus menggunakan ECS kronik, rawatan yang dikenali untuk mendorong tahap tinggi ΔFosB, terutamanya dalam korteks hadapan (Hope et al., 1994a). Satu hari selepas rawatan ECS yang lalu, apabila tahap ΔFosB kekal tinggi, irisan kortikal frontal tipis disediakan dan metabolik dilabelkan dengan 32P-orthophosphate. Set selari selari tidak dilancarkan, dan ini digunakan untuk mengesan jumlah ΔFosB. Selepas immunoprecipitation dengan antibodi anti-FosB / ΔFosB yang spesifik dan pemisahan protein imunopraktutan oleh SDS-PAGE, fosforilasi 32P-labeled ΔFosB dikesan oleh autoradiography, manakala jumlah ΔFosB dikesan oleh immunoblotting. Analisis ini mendedahkan bahawa ΔFosB adalah fosforilasi di otak, seperti yang dibuktikan oleh spesifik 32K band berlabel P ~ 35 kDa hadir dalam sampel otak yang dirawat secara kronik, tetapi hampir tidak dapat dikesan dalam kawalan yang dirawat sham (Rajah 2A). Ini konsisten dengan hakikat bahawa, jika tiada rangsangan kronik, tahap asas ΔFosB adalah sangat rendah. Kekhususan tindak balas imunoprecipitation digambarkan oleh kekurangan isyarat dalam endapan IgG tanpa imun.
Lihat versi yang lebih besar:
Rajah 2.
ΔFosB adalah fosfoprotein dalam otak. A, ΔFosB adalah fosforilasi dalam otak. Endogenous ΔFosB diinduksi pada otak tikus oleh rawatan ECS kronik seperti yang diterangkan dalam Bahan dan Kaedah. Irisan kortikal frontal metabolik dilabelkan dengan 32PH3PO4 selama beberapa jam. Selepas homogenisasi kepingan, ΔFosB telah diimunisasi semula, dan fosforilasi ΔFosB (32P-ΔFosB) dikesan oleh autoradiography (panel atas). Jumlah ΔFosB dalam immunoprecipitates bukannya dikesan oleh immunoblotting (panel bawah). Sebagai kawalan negatif, immunoprecipitate haiwan yang dirawat palsu dan IgG nonimmun ditunjukkan. B, Tapak fosforilasi Calon dan kinase dengan skor ramalan yang sama untuk tetikus ΔFosB protein sequence diperolehi oleh analisis bioinformatik. Laman calon dengan skor prediksi yang lebih tinggi diserlahkan dalam urutan protein dan disenaraikan di dalam jadual. Dokumen pengikat DNA (asas) dan leucine DNA adalah berani dalam urutan protein. C, D, Fosforilasi ΔFosB meningkat oleh penindas Ser / Thr phosphatase OA. C, 32Tahap P-ΔFosB dalam immunoprecipitates dari irisan kortikal depan yang dilabelkan dalam ketiadaan (Ctr) atau kehadiran 100 ng / ml OA (graf dan panel atas) dikesan oleh autoradiography. Panel bawah menunjukkan jumlah ΔFosB yang dikesan dalam immunoprecipitates daripada irisan tidak dilabel oleh immunoblotting. D, Sel PC12 dijangkiti HSV-ΔFosB atau HSV-LacZ (vektor) dan metabolik dilabelkan dengan 32PH3PO4 dalam ketiadaan (Ctr) atau kehadiran 100 ng / ml OA. 32Tahap P-ΔFosB dalam immunoprecipitates dikesan oleh autoradiography (graf, panel atas). Panel bawah menunjukkan jumlah ΔFosB yang dikesan dalam lysates sel oleh immunoblotting.
Sebagai langkah pertama ke arah penjelasan yang kinase dan tapak yang terlibat dalam fosforilasi ΔFosB, kita menundukkan urutan asam amino kepada beberapa analisis bioinformatik. Ini menunjukkan bahawa, walaupun ΔFosB tidak mengandungi laman kandidat fosforilasi Tyr, ia mengandungi beberapa laman konsensus Ser / Thr kinase, termasuk tiga tapak CaMKII, tiga tapak CK2, dan dua tapak PKC dengan skor prediksi fosforilasi yang sangat tinggiRajah 2B). Sekiranya, sebagaimana yang diramalkan melalui bioinformatika, ΔFosB hanya difosfilasi pada residu Ser atau Thr, maka fosforilasinya mesti dimodulasi dengan ketara oleh aktiviti fosfatase Ser / Thr. Untuk menguji hipotesis ini, kami melabelkan irisan kortikal hadapan dengan 32P-orthophosphate dalam kehadiran atau ketiadaan OA, perencat fosfatase protein Ser / Thr. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2C, OA menyebabkan peningkatan besar (~ 2.5-fold) dalam 32P-ΔFosB. Ia juga menyebabkan sedikit peningkatan dalam paras ΔFosB, yang konsisten dengan laporan terdahulu yang menghubungkan kesan karsinogenik OA ke kemampuannya untuk mendorong beberapa gen awal segera termasuk protein Fos (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Hasil bersihnya adalah peningkatan keseluruhan yang ketara (~ 60%) dalam tahap ΔFosB fosforilasi.
Kami kemudian menyiasat sama ada, dalam sel PC12, yang lebih sesuai untuk manipulasi eksperimen, ΔFosB menunjukkan corak fosforilasi yang serupa dengan yang dilihat di dalam otak. Kami menyatakan ΔFosB dalam sel PC12 melalui jangkitan dengan HSV-ΔFosB dan metabolik dilabelkan sel-sel dengan 32P-orthophosphate di hadapan atau tidaknya OA. Ekspresi dan imunopresitasi yang berjaya dari protein dari sel-sel yang dijangkiti HSV-ΔFosB ditunjukkan oleh kehadiran kedua-dua imunoblot (Rajah 2D, panel bawah) dan autoradiograph (panel atas) band ~35 kDa, tidak terdapat dalam sel-sel yang dijangkiti vektor. Seperti yang diperhatikan di otak, OA menyebabkan peningkatan kecil dalam jumlah ΔFosB tetapi peningkatan yang lebih tinggi (kira-kira dua kali ganda) dalam 32P-ΔFosB, menghasilkan kenaikan bersih (~ 50%) yang ketara dalam fosforilasi ΔFosB. Selanjutnya, selaras dengan ramalan bioinformatik, rawatan sel PC12 dengan penghambat phosphatase Tyr tidak menyebabkan perubahan ketara dalam 32Tahap P-ΔFosB (data tidak ditunjukkan). Bersama-sama, penemuan ini mendedahkan bahawa ΔFosB adalah fosforilasi pada sisa Ser dan / atau Thr di dalam otak dan dalam sel-sel PC12 dan mengesahkannya sebagai sistem kultur sel yang baik untuk selanjutnya mengkaji profil fosforilasi dan degradasi ΔFosB.
CK2 tetapi bukan fosforat PKC atau CaMKII ΔFosB vitro
Seperti yang diterangkan di atas, analisis ΔFosB asid amino mengesan skor prediksi yang tinggi untuk tapak fosforilasi CK2, PKC, dan CaMKII. Untuk menentukan yang mana kinase ini boleh fosforilasi ΔFosB, kami menjalankan satu siri vitro tindak balas fosforilasi menggunakan kinase yang dibersihkan dan rekombinan yang telah dimurnikan ΔFosB. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3A, daripada tiga kinase calon, hanya CK2 fosforilasi ΔFosB secara signifikan. Di samping itu, beberapa kinase lain telah diuji (contohnya, GSK3 dan p70S6K) tetapi gagal memfosforasikan dengan ΔFosB (data tidak ditunjukkan). Pencirian tambahan tindak balas CK2 oleh analisis masa kursus mendedahkan bahawa kinase ini dapat memangkinkan penggabungan ~ 0.5 mol fosfat per mol ΔFosB (Rajah 3B). Hakikat bahawa CK2 boleh memfosforasikan ΔFosB vitro kepada stoikiometri yang agak besar (~ 50%) adalah mencadangkan tindak balas fisiologi yang berkaitan. Kami kemudian mengkaji kinetika tindak balas ini dengan menginkubasi CK2 dengan adanya peningkatan jumlah ΔFosB yang telah disucikan, dan kami menentukan bahawa fosforori CK2 ΔFosB dengan Vmaks 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 enzim, a KM daripada 18.4 μm, dan a kkucing daripada 0.2 / s (Rajah 3C). Nilai-nilai yang diperolehi untuk parameter-parameter kinetik ini seterusnya menyokong perkaitan fisiologi tindak balas ini. Sebagai contoh, KM daripada CK2 untuk DARPP32, salah satu substrat yang paling terkenal, adalah 3.4 μm, dan kkucing adalah ~0.3 / s (Girault et al., 1989); yang KM untuk julat ATP dari ~ 10-40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), dan bahawa untuk kasein berkisar dari ~ 10-50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Bersama-sama, data ini menunjukkan bahawa ΔFosB adalah substrat bona fide untuk CK2 vitro.
Lihat versi yang lebih besar:
Rajah 3.
CK2 tetapi bukan fosforat PKC atau CaMKII ΔFosB vitro. Autoradiograph (panel atas) menunjukkan produk fosforilasi, dan gel Coomassie-berwarna (panel bawah) menunjukkan jumlah ΔFosB yang hadir dalam tindak balas. A, ΔFosB dipadam semula rekombinan vitro fosforilasi oleh pelbagai kinase calon (tiga daripadanya ditunjukkan). B, Kursus masa dan analisis stoikiometri menunjukkan bahawa CK2 boleh memfosforasikan ΔFosB vitro dengan stoikiometri ~50%. C, Analisis kinetik reaksi CK2 menunjukkan bahawa ΔFosB adalah bona fide vitro substrat. Linearisasi reaksi ditunjukkan dalam plot berganda (bawah), tetapi parameter kinetik berasal dari lengkung Michaelis-Menten (atas).
CK2 memodulasi fosforilasi dan kestabilan ΔFosB dalam sel-sel utuh
Untuk menilai kaitan fisiologi fosforilasi CK2-mediated ΔFosB, kami melakukan pemetaan fosfopeptida perbandingan menggunakan vitro phosphorylated dan PC12-cell-phosphorylated ΔFosB. Selepas SDS-PAGE dan elusi gel 32P-ΔFosB (dari vitro reaksi atau dari imunoprecipitate of 32P-berlabel sel), protein dicerna dengan trypsin, dan fosfopeptida yang dihasilkan tertakluk kepada pemisahan dua dimensi. Analisis ini mendedahkan bahawa fosfopeptida utama dari tindak balas CK2 dikulit dengan salah satu daripada dua fosfopeptida utama dari ΔFosB fosforilasi dalam sel PC12 (Rajah 4A), sedangkan fosfopeptida yang dihasilkan daripada reaksi PKC atau CaMKII (data tidak ditunjukkan) tidak dilakukan. Terdapat fosfopeptida ΔFosB kedua yang terdapat di dalam peta dari sel PC12, tetapi kerana ketidakupayaan mana-mana kinase yang kita telah diuji untuk menghasilkan fosfopeptida yang sama vitro, kita tidak mengetahui dengan segera sama ada fosfopeptida kedua ini mengandungi tapak fosforilasi yang berbeza dari fosfopeptida lain atau sama ada ia mewakili peptida tryptic yang berbeza yang mengandungi tapak fosforilasi yang sama.
Lihat versi yang lebih besar:
Rajah 4.
CK2 memodulasi fosforilasi dan kestabilan ΔFosB dalam sel-sel utuh. A, CK2 tetapi tidak PKC seolah-olah memfosforasikan ΔFosB dalam sel-sel. Peta fosfopeptida dua dimensi ΔFosB yang difosforasikan oleh CK2 atau PKC vitro atau dengan sel-sel PC12 yang utuh. Anak panah menunjukkan komplikasi Peptida CK2-fosforilasi tetapi bukan PKC-fosforilasi dengan salah satu fosfopeptida ΔFosB yang diperoleh dari sel PC12. B, Phosphorylation ΔFosB dalam sel PC12 meningkat dengan merawat sel dengan spermin pengaktif CK2 yang kuat (SP) dan menurun dengan rawatan dengan DRB inhibitor CK2. Sebaliknya, phosphorylation ΔFosB dalam sel PC12 tidak terjejas oleh rawatan dengan sama ada pengaktif PKC (PMA) atau perencat khusus PKC calphostin-C (Calph). Autoradiogram wakil (panel atas) dan immunoblot (panel bawah) ditunjukkan. C-F, Kesan aktiviti CK2 pada kestabilan FOSB. Angka-angka menunjukkan masa kursus (dan autoradiogram wakil) ΔFosB degradasi. Sel PC12 secara terus menerus menyatakan ΔFosB tertakluk kepada eksperimen pulse-chase yang dilakukan semasa ketiadaan atau kehadiran DRB inhibitor CK2 (C), pengaktif spermin CK2 (D), atau inhibitor spektrum kinase yang luas H-8 (E), yang digunakan untuk mengawal kesan tidak spesifik DRB. F, Kesan mengetuk subunit pemangkin CK2 pada kestabilan ΔFosB. Sel PC12 ditransfeksi dengan sama ada siRNA (Ctr) atau penargetan siRNA yang tidak mensasarkan tikus yang disasarkan CK2α dan 24 h kemudian dihantar dengan plasmid ΔFosB. Panel atas menggambarkan immunoblots lysates sel seluruh yang menunjukkan kesan siRNA CK2 pada tahap protein CK2 dan ΔFosB. Imunoblot yang sepadan untuk β-tubulin ditunjukkan sebagai kawalan pemuatan.
Untuk menangani hubungan fisiologi CK2 sebagai kinase ΔFosB, kami merawat sel-sel PC12 ΔFosB dengan dua ubat yang memodulasi aktiviti CK2. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4B, Fosforilasi ΔFosB telah menurun dengan rawatan sel-sel PC12 dengan DRB inhibitor CK2-telapMeggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), dan meningkat dengan rawatan dengan sperma poliamina, yang dikenali sebagai pengaktif CK2 yang kuat (Cochet dan Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Sebaliknya, rawatan sel PC12 dengan inhibitor PKC calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) atau pengaktif PKC PMA (Schmidt dan Hecker, 1975; Beh et al., 1989) tidak menyebabkan perubahan ketara dalam phosphorylation ΔFosB. Dalam kes PMA, kenaikan sedikit (dan tidak signifikan) dalam 32P-ΔFosB boleh diambil kira oleh peningkatan jumlah paras ΔFosB yang disebabkan oleh ubat ini; Malah, telah dilaporkan bahawa estrogen phorbol mendorong ekspresi beberapa protein keluarga Fos, termasuk FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Tambahan pula, rawatan sel-sel dengan penghambat CaMKII sel-m tertentu tertentu-MIP (AIP)Ishida dan Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) juga tidak menyebabkan penurunan fosforilasi ΔFosB (data tidak ditunjukkan). Bersama-sama, hasil ini konsisten dengan kami vitro penemuan dan menunjukkan bahawa dalam sel utuh ΔFosB mungkin fosforilasi oleh CK2 tetapi bukan PKC atau CaMKII. Hakikat bahawa penghambatan CK2 tidak sepenuhnya menghalang fosforilasi ΔFosB menunjukkan kewujudan tapak fosforilasi tambahan dalam protein.
Kami seterusnya mengkaji sama ada CK2 memainkan peranan dalam perolehan ΔFosB dan dengan demikian dalam kestabilannya. Untuk tujuan ini, kami menjalankan eksperimen pulsa-mengejar menggunakan sel-PC12 yang menyatakan ΔFosB yang dirawat dengan sama ada perencat CK2 atau pengaktif CK2 yang digunakan dalam kajian fosforilasi. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4C, pengambilan sel dengan DRB inhibitor CK2 mempunyai kesan yang signifikan terhadap kadar perolehan ΔFosB, dibuktikan dengan perubahan bentuk kurva degradasi, dari biphasic ke lengkung yang lebih dekat dengan kerosakan eksponen. Sebaliknya, kehadiran spermin pengaktif CK2 menyebabkan penurunan ketara dalam kadar kemerosotan ΔFosB, yang membawa kepada pengumpulan protein semasa jam pertama mengejar (Rajah 4D).
Begitu pula dengan pengaktif dan kinase kinase, sperma dan DRB boleh mempunyai kesan metabolik di luar modulasi aktiviti CK2. Malah, DRB telah ditunjukkan untuk menyekat faktor-faktor transkripsi IIH (TFIIH) yang berkaitan dengan kinase (Yankulov et al., 1995), yang mengakibatkan perencatan transkripsi RNA polymerase II-mediated. Oleh kerana kesan ini dapat mempengaruhi kestabilan ΔFosB, kami menganalisis kesan spektrum kinase inhibitor H-8 (Hidaka dan Kobayashi, 1992) pada perolehan ΔFosB pada tumpuan (200 μm) yang diketahui menghalang kinase yang berkaitan dengan TFIIH tetapi tidak CK2 (Yankulov et al., 1995). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4E, rawatan dengan H-8 tidak menjejaskan kadar perolehan ΔFosB. Hasil yang sama diperoleh dengan H-7, satu lagi inhibitor spektrum kinase yang luas, digunakan pada kepekatan yang menghalang kinase yang berkaitan dengan TFIIH tetapi tidak CK2 (data tidak ditunjukkan). Data-data ini selanjutnya menyokong tafsiran bahawa pengurangan kestabilan ΔFosB yang disebabkan oleh DRB kemungkinan besar disebabkan oleh penghambatan CK2.
Untuk terus mewujudkan peranan CK2 dalam perolehan ΔFosB, kami menyiasat akibat mengetuk CK2 melalui siRNA. Kami melakukan eksperimen ini menggunakan sel PC12 yang pertama ditransfeksi dengan kawalan (tidak menargetkan) siRNA atau siRNA yang mensasarkan mRNA subunit pemangkin tikus CK2 (CK2α) dan 24 h kemudian transfected dengan ΔFosB. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4F, transfection dengan siRNA CK2α cekap dan secara khusus mengetuk tahap protein CK2α tanpa menjejaskan tahap ΔFosB (panel atas). Analisis pulse-chase mendedahkan bahawa mengetuk turun CK2 mengakibatkan peningkatan yang ketara dalam kadar pusing ganti ΔFosB seperti yang dibuktikan oleh degradasi protein yang lebih cepat. Hakikat bahawa menghalang aktiviti CK2 (sama ada melalui rawatan DRB atau siRNA) meningkatkan perolehan ΔFosB dan mengakibatkan kehilangan komponen laju kelembapan biphasic, sedangkan pengaktifan CK2 meningkatkan fasa perlahan kurva, memberikan sokongan yang kuat untuk idea bahawa CK2 memainkan peranan dalam mengawal selia ΔFosB kestabilan.
Fosforatori CK2 ΔFosB pada Ser27
Untuk mula mengenalpasti tapak pada ΔFosB fosforilasi oleh CK2, kami menjalankan analisis asid fosfo-amino rekombinan ΔFosB yang difosforilasi oleh CK2 vitro dan ΔFosB fosforilasi dalam sel PC12. Eksperimen-eksperimen ini mendedahkan bahawa, dalam kedua-dua kes, satu-satunya asid fosfo-amino yang dikesan adalah phospho-Ser (Rajah 5A). Dapatan ini, bersama-sama dengan stoikiometri yang diperolehi untuk CK2 vitro tindak balas fosforilasi (~50%) (Rajah 3B) dan kehadiran hanya satu titik penting pada peta fosfopeptida CK2 (Rajah 4A), mencadangkan bahawa fosforilasi CK2 daripada ΔFosB mungkin terhad kepada sisa serina tunggal. Kesimpulan ini konsisten dengan analisis tapak konsensus fosforilasi (Rajah 2B), yang meramalkan hanya satu calon serine, iaitu, Ser27, untuk CK2. Analisis taksonomi mendedahkan bahawa Ser27 sangat dipelihara melalui evolusi di kalangan ahli keluarga Fos (Rajah 5B), menunjukkan bahawa ia mungkin mempunyai fungsi fisiologi yang penting.
Lihat versi yang lebih besar:
Rajah 5.
CK2 Phosphorylates ΔFosB pada Ser27. A, Analisis asid Phosphoamino CK2-fosforilasi (vitro) dan ΔFosB sel-sel fosforilat PC12 menunjukkan bahawa, dalam kedua-dua kes, sisa utama fosforilasi adalah serina. BAnalisis silang spesies FosB / ΔFosB asid amino menunjukkan pemuliharaan tinggi Ser27 di kalangan ahli keluarga Fos dari manusia ke zebrafish (sorotan gelap). Bagaimanapun, residu berasid pada kedudukan + 3, yang diperlukan untuk tapak konsensus CK2, tidak dipelihara (sorotan ringan). C, Sel-sel HeLa transiently transfected dengan jenis liar ΔFosB (WT) atau ΔFosB yang mengandungi mutasi titik untuk menggantikan Ser27 dengan Ala (S27A). Sel telah metabolik dilabelkan dengan 32PH3PO4 dan dirawat dengan kenderaan atau dengan sperma (SP) untuk mengaktifkan CK2. Autoradiogram wakil (panel atas) dan immunoblot (panel bawah) daripada immunoprecipitates ΔFosB yang ditunjukkan. Immunoprecipitate sel-transfected cells (vektor) ditunjukkan.
Untuk menentukan sama ada Ser27 adalah fosforilasi dalam ΔFosB, kami memetik residu ini kepada Ala, dan menganalisis kesannya terhadap status fosforilasi protein. Untuk tujuan ini, kami menggunakan sel HeLa (yang boleh ditransfeksi dengan kecekapan yang lebih tinggi) untuk secara terus menerus menyatakan sama ada WT atau S27A mutant ΔFosB. Kira-kira 24 h selepas pemindahan, sel-sel telah metabolik dilabelkan dengan 32P-orthophosphate, dan lysates sel-sel telah disediakan. Berikutan immunoprecipitation dan SDS-PAGE, 32P-ΔFosB dikesan oleh autoradiografi dan jumlah ΔFosB oleh immunoblotting. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5C (panel bawah), ΔFosB tidak dikesan dalam sel-vektor transpektasi vektor, manakala sel-sel yang ditransfeksi dengan sama ada mutex WT atau S27A ΔFosB berjaya menyatakan protein. Kami mendapati bahawa mutasi S27A menyebabkan pengurangan ketara (~ 30%) dalam 32Tahap P-ΔFosB (Rajah 5C, panel atas dan graf), yang menunjukkan bahawa dalam sel-sel hidup, ΔFosB adalah fosforilasi pada Ser27. Dalam usaha untuk menentukan sama ada dalam sel Ser27 memang fosforilasi oleh CK2, kami membandingkan keupayaan pengaktif spermin CK2 untuk memodulasi fosforilasi WT dan S27A ΔFosB. Seperti yang telah kita perhatikan sebelum ini dalam sel PC12 (Rajah 4B), rawatan sel-sel HeLa dengan spermin meningkat dengan ketara fosforilasi protein WT. Hakikat bahawa kesan ini berkurangan secara signifikan oleh mutasi S27A (Rajah 5C) menyokong tafsiran bahawa Ser27 dalam ΔFosB adalah substrat fisiologi untuk CK2.
Fosforilasi Ser27 mengawal kestabilan ΔFosB
Setelah menegaskan bahawa kestabilan ΔFosB berkurangan apabila CK2 dihalang dan dipertingkatkan apabila CK2 diaktifkan (Rajah 4), dan phosphorylate CK2 ΔFosB pada Ser27 (Rajah 5), kami meramalkan bahawa mencegah fosforilasi tapak ini harus mengganggu kestabilan protein. Eksperimen pulse-chase yang dilakukan dengan sel HeLa secara transiently mengekspresikan mutasi WT atau S27A ΔFosB mengungkapkan, seperti yang diramalkan, mutasi S27A menghasilkan peningkatan yang signifikan dalam kadar degradasi ΔFosB, dan penurunan bersamaan dalam separuh hayat protein (Rajah 6A). Kami kemudian menyiasat sama ada mekanisme pengawalseliaan ini juga berlaku pada bar sel PC12 yang lebih saraf seperti neuron. Eksperimen-eksperimen ini mendedahkan bahawa, seperti yang telah kita perhatikan dalam sel HeLa, mutasi mata S27A menyebabkan penurunan dramatik dalam separuh hayat ΔFosB dalam sel PC12 (dari ~ 11 hingga ~ 4 h) (Rajah 6B). Hakikat bahawa ketidakstabilan ini sama dengan yang disebabkan oleh penghambatan atau knock-down CK2 (Rajah 4) memberikan sokongan lanjut untuk idea bahawa phosphorylation-mediated CK2 Ser27 mengawal kestabilan ΔFosB. Keterangan tambahan untuk peranan pengawalseliaan phosphorylation Ser27 terhadap perolehan protein ΔFosB diperoleh menggunakan Ser27 phosphomimetic untuk mutasi Asp (S27D). Mutasi S27D dianggap phosphomimetic, kerana ia meletakkan kumpulan negatif yang besar (carboxyl) pada asid amino 27 dan dengan itu sebahagiannya meniru fosforilasi Ser27. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6C, mutasi S27D menyebabkan kesan mutlak mutasi S27A dan menghasilkan protein yang lebih stabil daripada protein WT. Begitu juga dengan kesan yang diperolehi selepas pengaktifan CK2 (Rajah 4D), mutasi S27D mengakibatkan pengumpulan dan dengan itu meningkatkan paras ΔFosB semasa jam pertama mengejar.
Lihat versi yang lebih besar:
Rajah 6.
Fosforilasi Ser27 mengawal kestabilan ΔFosB. A, C, Analisis pulse-chase menunjukkan kesan fosforilasi Ser27 pada kadar perolehan ΔFosB. Profil degradasi dan anggaran separuh hayat jenis liar ΔFosB (WT), Ser27 kepada Ala mutant (S27A), dan SerksNUMX phosphomimetic kepada mutan Asp (S27D) ditunjukkan. Penemuan yang sama diperolehi dalam sel HeLa (A) dan sel PC12 (B, C).
Fosforilasi Ser27 menstabilkan ΔFosB dengan menghalang degradasi proteasomal
Untuk memulakan penjelasan mekanisme oleh mana fosforilasi Ser27 menstabilkan ΔFosB, kita meneliti keupayaan inhibitor proteaseome MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) dan epoxomicin (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) untuk memodulasi kadar degradasi ΔFosB mutan WT dan S27A. Eksperimen pulse-chase telah dijalankan menggunakan sel PC12 yang dijangkiti dengan HSV rekombinan yang menyatakan sama ada WT atau S27A ΔFosB dan dirawat dengan baik DMSO atau salah satu daripada dua inhibitor proteasome. Eksperimen-eksperimen ini mendedahkan bahawa walaupun kadar degradasi protein WT relatif tidak sensitif terhadap kehadiran salah satu daripada dua inhibitor proteasome (Rajah 7A), bahawa mutan S27A adalah sensitif terhadap ubat-ubatan ini (Rajah 7B). Ini menunjukkan bahawa, tidak seperti protein WT, mutan S27A adalah sasaran kemusnahan proteasom. Sesungguhnya, rawatan sel dengan MG132 atau epoxomicin sepenuhnya membalikkan kesan mutasi S27A terhadap kadar kemerosotan ΔFosB, dibuktikan dengan peningkatan dalam separuh hayat mutan S27A dari ~ 4 hingga ~9 h untuk MG132 dan ~ 12 h untuk epoxomicin (Rajah 7B). Bersama-sama, penemuan ini menunjukkan bahawa phosphorylation of ΔFosB pada Ser27 melindungi protein dari degradasi proteasomal dan oleh karenanya penting untuk kestabilan yang luar biasa.
Lihat versi yang lebih besar:
Rajah 7.
Fosforilasi Ser27 menstabilkan ΔFosB dengan menghalang degradasi proteasomal. A, B, Analisis Pulse-chase dengan sel-sel PC12 yang dijangkiti HSV yang menunjukkan profil degradasi dan anggaran separuh hayat jenis liar ΔFosB (A) atau S27A ΔFosB (B) dengan ketiadaan atau kehadiran kedua-dua dua inhibitor proteasome [MG132 dan epoxomicin (Epoxo)]. Perhatikan hakikat bahawa ubat tidak mempunyai kesan yang signifikan terhadap perolehan jenis liar ΔFosB, sedangkan rawatan sel dengan sama ada protein inhibitor mengakibatkan penstabilan S27A ΔFosB. C, Model untuk peranan phosphorylation Ser27 dalam keupayaan ΔFosB untuk memeterai kepekaan otak jangka panjang. Setelah diinduksi, sebahagian daripada ΔFosB akan stabil di otak oleh fosforilasi CK2 yang dimediasi S27. Ini mengakibatkan pengumpulannya, yang seterusnya menghasilkan perubahan jangka panjang dalam ekspresi gen. Perubahan stabil dalam ekspresi gen menyumbang kepada penyesuaian tingkah laku yang stabil. Sebaliknya, dephosphorylation S27 oleh Ser / Thr phosphatases PP1 dan / atau PP2A menyebabkan ketidakstabilan protein dan pemprosesannya oleh mesin proteasomal.
Seksyen SebelumSeksyen seterusnya
Perbincangan
Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa ΔFosB mempunyai separuh hayat ~ 10 h dalam kultur sel, yang menjadikannya stabil berbanding dengan FosB penuh panjang dan kebanyakan faktor transkripsi yang boleh diinduksi, yang separuh hayat dalam budaya sel boleh menjadi pendek sebagai beberapa minit dan jarang melebihi 3 h (Hann dan Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts dan Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Di samping itu, kami mendapati bahawa ΔFosB adalah fosforilasi di otak dan fosforilasinya sensitif terhadap asid oksaik PP1 / PP2A. Kajian budaya sel kami menunjukkan bahawa kestabilan ΔFosB dimodulasi oleh CK2, dengan aktiviti CK2 yang lebih tinggi menstabilkan protein. Akhir sekali, penemuan kami mencadangkan bahawa phosphorylate CK2 ΔFosB pada terminal N yang sangat dipelihara serine (S27) dan menunjukkan bahawa phosphorylation S27 melindungi ΔFosB daripada degradasi proteasomal. Oleh itu, kami mencadangkan satu model di mana fosforilasi ΔFosB pada S27 oleh CK2 adalah mekanisme pengawalseliaan yang kritikal bagi perolehan ΔFosB (Rajah 7C). Penstabilan fosforilasi sedemikian oleh ΔFosB adalah penting secara fungsional, kerana peningkatan tahap ΔFosB di kawasan otak tertentu telah ditunjukkan untuk mengawal selia gen pelbagai neuron secara langsung dalam vivo dan untuk melaksanakan kesan tingkah laku yang kuat dalam model haiwan beberapa gangguan neuropsychiatrik (lihat Pengenalan).
Walaupun phosphorylation adalah cara yang cepat dan boleh diubah untuk mengawal aktiviti transkrip dari beberapa faktor transkripsi tertentu, seperti CREB (unsur tindak balas unsur pengikat cAMP) (Bohmann, 1990), memodulasi degradasi faktor transkripsi menyediakan peraturan yang lebih kuat (kurang mudah dibalikkan)Desterro et al., 2000). Faktor transkripsi yang aktiviti fungsinya dikawal pada tahap kemerosotan mereka termasuk NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), dan c-Fos (Ferrara et al., 2003), dalam kalangan yang lain. Dalam banyak keadaan, fosforilasi adalah pengawal selia utama kestabilan faktor transkripsi, seperti yang ditunjukkan untuk c-Fos (Okazaki dan Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Antigen-Fen berkaitan-1 (Fra-1) (Vial dan Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), dan p53 (Buschmann et al., 2001). Kajian kami seterusnya menambah ΔFosB ke senarai ini faktor transkripsi yang aktiviti fungsionalnya dikawal melalui kestabilan fosforilasi yang bergantung.
CK2 adalah kinase Ser / Thr aktif yang terdapat di mana-mana dan aktif yang mempunyai> 300 substrat yang diakui sejauh ini dan terlibat dalam pelbagai proses biologi, termasuk kematian sel dan kelangsungan hidup (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), respons tekanan selular (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), dan pembaikan DNA dan pembentukan semula kromatin (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Lebih daripada satu pertiga daripada substrat putative CK2 adalah protein yang terlibat dalam pengawalan ekspresi gen (Meggio dan Pinna, 2003). Malah, CK2 telah terbukti menjadi kinase nuklear yang menonjol (Krek et al., 1992) (untuk semakan, lihat Yu et al., 2001) dan berinteraksi dengan domain bZIP beberapa faktor transkripsi (Yamaguchi et al., 1998). Fosforilasi-mediated CK2 juga telah ditunjukkan untuk memodulasi degradasi (sama ada meningkatkan atau menurunkannya) daripada banyak protein, termasuk IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres dan Pulido, 2001), lens connexin (Yin et al., 2000), protein yang berkaitan dengan kromatin HMG1 (Wisniewski et al., 1999), dan beberapa faktor transkripsi seperti HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997), dan c-Myc (Channavajhala dan Seldin, 2002). CK2 paling banyak terdapat dalam otak (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), dan aktivitinya telah terlibat dalam banyak aspek fungsi otak, termasuk survival saraf (Boehning et al., 2003), pembezaan (Nuthall et al., 2004), fungsi saluran ion (Jones dan Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), dan potentiasi jangka panjang dan kepekaan neuron (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman dan Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Walaupun bukti yang semakin meningkat ini untuk peranan CK2 dalam pengawalan fungsi neuron, sedikit diketahui tentang apa yang mengawal aktivitinya. CK2 dianggap aktif secara aktif, dengan regulasi keupayaannya memfosforatkan substrat tertentu yang kebanyakannya bergantung kepada perubahan dalam penyetempatan intraselular (contohnya, sitosol vs nukleus)Ahmed dan Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Maklumat ini menimbulkan persoalan penting mengenai isyarat apa yang diperlukan untuk mendorong akumulasi FosB di otak selepas rangsangan kronik (Rajah 7C). Satu keperluan mengulangi pengaktifan fosB gen dan induksi ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Data kami menunjukkan bahawa fosforilasi CK2 daripada ΔFosB adalah kritikal untuk kestabilannya, menunjukkan bahawa isyarat kedua mungkin diperlukan untuk kesan jangka panjang ΔFosB pada ekspresi gen, iaitu isyarat yang merangsang fosforilasi protein oleh CK2. Ini mungkin melibatkan pengaktifan CK2 oleh beberapa mekanisme yang tidak diketahui atau translocationnya kepada nukleus. Sebagai alternatif, fosforilasi CK2 ΔFosB mungkin secara konstitutif, kerana protein ΔFosB diterjemahkan sebagai tindak balas kepada setiap rangsangan, sebahagian daripadanya mendapat fosforilasi dan dengan itu stabil, supaya dengan rangsangan berulang ia berkumpul ke tahap yang tinggi dalam neuron terjejas.
Penemuan kami menunjukkan bahawa CK2 dan S27 mungkin bukan satu-satunya kinase dan tapak yang bertanggungjawab untuk fosforilasi ΔFosB, kerana perencatan CK2 atau mutasi S27A tidak dapat sepenuhnya mencegah fosforilasi ΔFosB. Dengan tanda yang sama, fakta bahawa mutasi S27A menghasilkan pengurangan% 30 dalam phospho-ΔFosB berpendapat bahawa S27 adalah tapak fosforilasi utama pada protein. Walau bagaimanapun, kami menyiasat tapak kinase dan fosforilasi lain di ΔFosB. Akhirnya, ia akan menjadi penting juga untuk menganalisis fosforilasi S27 dan mana-mana laman fosforilasi lain dalam ΔFosB di otak dalam vivo selepas pelbagai jenis rangsangan kronik, contohnya, melalui penggunaan spektrometri massa atau antibodi fosfosifik.
Seperti yang dinyatakan di atas, S27 dalam ΔFosB sangat konservasi sepanjang evolusi dan antara protein keluarga Fos yang lain. Walau bagaimanapun, tapak konsensus untuk CK2 tidak seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5B, hanya FosB / ΔFosB (dan xenolog Zebrafish), tetapi tidak c-Fos atau Fra-2, mempunyai residu berasid pada + 3, penentu utama fosforilasi CK2 (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Oleh itu, kekurangan phosphorylation CK2 pada S27 mungkin menjelaskan mengapa protein Fos keluarga lain tidak stabil seperti ΔFosB. Walaubagaimanapun, ini tidak menjelaskan mengapa FosB yang penuh dengan panjang, yang mempunyai tapak konsensus CK2 sebagai ΔFosB, tidak stabil. Kami tidak tahu sama ada FosB penuh fosforilasi oleh CK2 mengenai residu yang dipelihara. Satu-satunya laporan FosB (Skinner et al., 1997) dan c-Fos (Okazaki dan Sagata, 1995; Chen et al., 1996) fosforilasi menggambarkan tapak di rantau C-terminal protein ini, yang tidak terdapat di ΔFosB. Potensi fosforilasi FosB penuh dan protein keluarga Fos yang lain oleh CK2 memerlukan siasatan langsung. Walau bagaimanapun, walaupun mereka fosforilasi, protein keluarga Fos yang lain diketahui mengandungi motif pada istilah C mereka yang mensasarkan protein untuk kemerosotan pesat (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Sebagai contoh, ia telah menunjukkan bahawa residual residu ~ 21 yang terdapat di terminal C semua protein keluarga Fos, tetapi tidak terdapat dalam ΔFosB, bertindak sebagai domain destabilizing untuk c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Kami mendapati bahawa walaupun urutan ini juga menjejaskan FosB penuh panjang (Carle et al., 2004), ketiadaan domain ini dalam ΔFosB tidak sepenuhnya menyumbang untuk penstabilannya. Sebaliknya, gabungan ketiadaan terminologi C ini dan fosforilasi Ser27 nampaknya menyumbang kira-kira lima kali perbezaan kestabilan antara ΔFosB dan FosB.
Walaupun degradasi protein keluarga Fos adalah rumit dan tidak difahami sepenuhnya, degradasi proteasom nampaknya merupakan laluan utama yang terlibat (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Data yang dibentangkan di sini, di mana inhibitor proteasomal tidak banyak mengubah kadar degradasi ΔFosB, berhujah bahawa, tidak seperti protein keluarga Fos yang lain, ΔFosB mengelakkan protein 26S, dan ini memainkan peranan utama dalam penstabilannya. Oleh itu, kami mencadangkan satu skim di mana kestabilan ΔFosB yang dipertingkatkan berpunca daripada gabungan dua faktor utama: (1) ketiadaan domain destabilizing C-terminal dan (2) fosforilasi S27 oleh CK2.
Ringkasnya, kajian ini menyediakan pandangan mekanistik tentang mengapa ΔFosB, produk gen awal yang terdekat fosB, tidak seperti semua ahli keluarga Fos yang lain, protein yang relatif lama. Walaupun protein keluarga Fos yang lain dianggap sebagai pengantara gandingan transkripsi rangsangan tetapi pesat (sementara)Morgan dan Curran, 1995), kestabilan relatif ΔFosB memberikan keupayaan untuk mengantarkan perubahan transkrip yang tahan lama yang disebabkan oleh rangsangan kronik. Ini menyokong pandangan bahawa fungsi ΔFosB sebagai suis molekul yang berterusan di dalam otak, secara beransur-ansur menukar tindak balas akut ke dalam penyesuaian kronik. Pengenalpastian fosforilasi Ser27 sebagai mekanisme utama untuk kestabilan ΔFosB membuka jalan baru untuk pembangunan cara untuk mengawal fungsi ΔFosB dan dengan itu memodulasi kesan jangka panjangnya terhadap keplastikan saraf dan tingkah laku.
Seksyen SebelumSeksyen seterusnya
Nota kaki
- Menerima November 21, 2005.
- Semakan yang diterima pada bulan Februari 21, 2006.
- Diterima April 2, 2006.
- Kerja ini disokong oleh Perikatan Kebangsaan untuk Penyelidikan Schizophrenia dan Anugerah Penyelidik Muda Kemurungan kepada PGU, Institut Kebangsaan Penyalahgunaan Dadah (NIDA) Anugerah Perkhidmatan Penyelidikan ke PGU, dan geran dari Institut Kesihatan Mental Negara dan NIDA kepada EJN Kami terima kasih kepada Dr. James Bibb atas bantuannya dengan vitro pemeriksaan fosforilasi, Dr Ming-Hu Han atas bantuannya dengan penyediaan irisan otak yang digunakan untuk pelabelan metabolik, dan Dr. Rachael Neve atas bantuannya dengan pembungkusan HSV rekombinan.
- Alamat semasa G. Rudenko: Institut Sains Hayat dan Jabatan Farmakologi, Universiti Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Surat-menyurat perlu ditujukan kepada Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. E-mel: [e-mel dilindungi]
Rujukan
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Pengenalpastian motif tripeptida C-terminal yang terlibat dalam kawalan degradasi proteasomal pesat proto-oncoprotein c-Fos semasa peralihan fasa G (0) -to-S. onkogen 20:7563-7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Laluan degradasi berganda untuk protein keluarga Fos. Ann NY Acad Sci 973:426-434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Mekanisme pengawalseliaan intraselular kinase protein CK2: peranan persatuan subnuklear yang disokong oleh rangsangan. Cell Mol Biol Res 40:539-545.
Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Prosedur pemurnian dan sifat kasein kinase II yang lebih baik dari otak. Neurochem Res 13:829-836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Kursus masa keupayaan imunoreaktiviti seperti DeltaFosB dan mRNA prodynorphin selepas pemberhentian rawatan dopaminomimetik kronik. Eur J Neurosci 17:661-666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Skrin ekspresi genom menunjukkan peranan global untuk kinase protein CK2 dalam pengubahsuaian kromatin. J Cell Sci 116:1563-1577.
Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Dua isozim PKC yang terdapat dalam sel HL-60 menunjukkan perbezaan dalam pengaktifan oleh TPA ester phorbol. FEBS Lett 249:264-266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Protein kinase CK2 dikelilingi dengan saluran pengaliran kecil Ca (2 +) - diaktifkan K + dan mengawal selia saluran. Sel-sel otak 43:847-858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Ekspresi jangka panjang antigen yang berkaitan dengan Fos dan ekspresi sementara FosB delta yang dikaitkan dengan sawan di hippocampus dan striatum tikus. J Neurochem 68:272-279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Ramalan glycosylation pasca translasi dan fosforilasi protein dari urutan asid amino. proteomik 4:1633-1649.
Boehning D, Moon C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Neurotransmission karbon monoksida diaktifkan oleh phosphorylation CK2 heme oxygenase-2. Sel-sel otak 40:129-137.
Bohmann D (1990) Fosforilasi faktor transkripsi: hubungan antara transduksi isyarat dan peraturan ekspresi gen. Sel Kanser 2:337-344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Jun NH2-phosphorylation kinase terminal p53 pada Thr-81 adalah penting untuk penstabilan p53 dan aktiviti transkripsi sebagai tindak balas kepada tekanan. Mol Cell Biol 21:2743-2754.
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Ketiadaan domain C-terminal keluarga Fos yang dipelihara menyumbang kepada kestabilan unik deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Interaksi fungsional protein kinase CK2 dan c-Myc dalam limfomagenesis. onkogen 21:5280-5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Peraturan protein delta FosB dan FosB dengan penyitaan electroconvulsive dan rawatan kokain. Mol Pharmacol 48:880-889.
Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Antigen berkaitan Fos kronik: varian stabil ΔFosB yang diinduksi dalam otak oleh rawatan kronik. J Neurosci 17:4933-4941.
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforilasi c-Fos di C-terminus meningkatkan aktiviti transformasinya. onkogen 12:1493-1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Toksin phosphatase 1 / 2A inhibitor asid okadaik meningkatkan fosforilasi CREB dan Elk-1 dan ungkapan c-fos dalam striatum tikus dalam vivo. J Neurochem 89:383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Fosforilasi protein yang ditengahi poliamina: sasaran yang mungkin untuk tindakan poliamina intrasel. Mol Cell Endocrinol 30:247-266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Ciri-ciri katalitik dan molekul jenis G casein kinase yang sangat bersih dari tisu paru-paru lembu. Biochim Biophys Acta 743:1-12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Overprestasi jenis spesifik sel Striatal terhadap DeltaFosB meningkatkan insentif untuk kokain. J Neurosci 23:2488-2493.
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Pengambilan diri kokain meningkatkan preprodynorphin, tetapi tidak c-fos, mRNA dalam striatum tikus. NeuroReport 4:543-546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Peraturan faktor transkripsi oleh degradasi protein. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Peningkatan aktiviti jenis sitoplasmik casein kinase II mengiringi pertumbuhan neurit selepas perencatan sintesis DNA dalam sel-sel neuroblastoma NIA-103. J Neurochem 58:1820-1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Protein kinase CK2 phosphorylates dan toregregate Akt / PKB. Kematian Sel Berbeza 12:668-677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Kedua-dua produk gen fosB, FosB dan bentuk pendeknya, FosB / SF, adalah pengaktif transkrip dalam fibroblas. Mol Cell Biol 11:5470-5478.
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Penentu struktur yang bertanggungjawab untuk degradasi proteasomal protein c-Fos berbeza mengikut syarat-syarat ungkapan. onkogen 22:1461-1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Penyasaran fosforilasi yang bergantung kepada c-Jun ubiquitination oleh Jun N-kinase. onkogen 13:1531-1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) kinetik terminal NH2 c-Jun mensasarkan kekeliruan faktor transkripsi yang berkaitan. J Biol Chem 272:32163-32168.
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Kestabilan faktor transkripsi ATF2 dikawal oleh phosphorylation dan dephosphorylation. J Biol Chem 275:12560-12564.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Phosphorylation of DARPP-32, fosfoprotein dopamine-and-regulated, oleh casein kinase II. J Biol Chem 264:21748-21759.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Pencirian pada otak mamalia dari DARPP-32 serine kinase sama dengan casein kinase II. J Neurochem 55:1772-1783.
Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicin, agen antitumor baru yang berasal dari mikrob. J Antibiot (Tokyo) 45:1746-1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Protein yang dikodkan oleh manusia c-myc oncogene: ungkapan berbeza dalam sel-sel neoplastik. Mol Cell Biol 4:2486-2497.
Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, phosphoprotein AMP yang dikawal selia AMP (Mr = 21,000) diperkaya di kawasan otak dopamine-innervated. Urutan asid amino dari tapak yang difosforilasi oleh AMP kitaran dalam sel-sel utuh dan kajian kinetik fosforilasi dalam in vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Farmakologi inhibitor protein kinase. Toksikol Annu Rev Pharmacol 32:377-397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Ketidakstabilan protein Hes7 adalah penting untuk jam segmentasi sesuatu. Nat Genet 36:750-754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Rawatan neuroleptik yang tipikal dan tipikal menyebabkan program ekspresi faktor transkripsi di striatum. J Comp Neurol 374:70-83.
Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Peraturan ekspresi gen awal segera dan AP-1 mengikat dalam nukleus tikus akrab dengan kokain kronik. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Hasil rawatan elektroconvulsive kronik (ECS) dalam ekspresi kompleks AP-1 yang berpanjangan di otak dengan komposisi dan ciri-ciri yang berubah. J Neurosci 14:4318-4328.
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Induksi kompleks AP-1 yang berpanjangan terdiri daripada protein seperti Fos yang diubah dalam otak oleh kokain kronik dan rawatan kronik yang lain. Sel-sel otak 13:1235-1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Penstabilan protein kinase II bergantung kepada calmodulin melalui domain autoinhibitory. J Biol Chem 270:2163-2170.
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Mekanisme kompleks untuk c-fos dan c-jun degradasi. Mol Biol Rep 24:51-56.
Jones S, Yakel JL (2003) Casein kinase ii (protein kinase ck2) mengawal fungsi saluran reseptor serotonin 5-ht (3) dalam sel 108-15. Neurosains 119:629-634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 adalah kinase C-terminal IkappaB yang bertanggungjawab untuk pengaktifan NF-kappaB semasa tindak balas UV. Mol Cell 12:829-839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Ekspresi faktor transkripsi deltaFosB di otak mengawal kepekaan terhadap kokain. Alam 401:272-276.
Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Perencatan protein oleh produk epoxomycin semula jadi dan dihydroeponemycin: pemahaman terhadap kekhususan dan potensi. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), sebatian mikrob baru, adalah perencat protein kinase C. yang sangat kuat dan khusus. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.
Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Casein kinase II adalah enzim yang kebanyakannya nuklear. J Cell Biol 116:43-55.
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Fosforat kinase CK2 protein kinase protein domain kelompok mobiliti tinggi SSRP1, mendorong pengiktirafan DNA yang rosak UV. J Biol Chem 278:12710-12715.
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, DW Self, Nestler EJ (2005) Pengubahsuaian Chromatin adalah mekanisme utama yang mendasari kepekaan cocaine-induced in striatum. Sel-sel otak 48:303-314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Casein kinase-II mengawal fungsi saluran NMDA dalam neuron hippocampal. Nat neurosci 2:125-132.
Litchfield DW (2003) Protein kinase CK2: struktur, peraturan dan peranan dalam keputusan sel hidup dan kematian sel. Biochem J 369:1-15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Degradasi protein c-Fos yang dinyatakan oleh N-methyl-dAspek asparat dalam pecahan nukleus hippocampus murine. Otak Res 905:34-43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Ketidakhadiran antigen yang berkaitan dengan 37 kDa yang berterusan dan aktiviti pengikatan DNA seperti AP-1 di otak tikus nadi fosB yang dirawat berasid kainic. J Neurosci 17:5407-5415.
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Kekhususan tapak kasein kinase-2 (TS) daripada sitosol hati tikus. Satu kajian dengan substrat peptida model. Eur J Biochem 160:239-244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Peraturan ekspresi gen dan ganjaran kokain oleh CREB dan DeltaFosB. Nat neurosci 6:1208-1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: suis molekular untuk penyesuaian jangka panjang di dalam otak. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Satu-ribu-dan-satu substrat protein kinase CK2? FASEB J 17:349-368.
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforilasi pecahan kasein oleh hati tikus 'phosvitin kinase.' FEBS Lett 75:192-196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosphorylation of 2 casein kinase TS pada kedua alpha- dan beta-subunitnya. Pengaruh pelaksana yang berbeza. FEBS Lett 160:203-208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Derivatif Ribofuranosil-benzimidazol sebagai perencat kasein kinase-2 dan kasein kinase-1. Eur J Biochem 187:89-94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Spesifikasi substrat protein kinase CK2. Cell Mol Biol Res 40:401-409.
Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Induksi transkrip gen cyclooxygenase-2 oleh asid okadaik menghalang aktiviti phosphatase dalam chondrocytes manusia: rangsangan bersama protein AP-1 dan CRE. J Cell Biochem 69:392-413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Perubahan peringkat rangkaian dalam ekspresi protein Fos-Jun yang terinduksi dalam striatum semasa rawatan dan pengeluaran kokain kronik. Sel-sel otak 17:147-156.
Morgan JI, Curran T (1995) Gen-gen awal: sepuluh tahun pada. Trend Neurosci 18:66-67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Bentuk FosB yang dipenggal secara semulajadi yang menghalang aktiviti transkripsi Fos / Jun. Cell 64:751-759.
Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: suis molekul yang berterusan untuk ketagihan. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Pengenalan subunit reseptor glutamat 1 ke neuron motor in vitro dan vivo menggunakan virus herpes simplex rekombinan. Neurosains 79:435-447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Fosforilasi serine 239 daripada Groucho / TLE1 oleh protein kinase CK2 adalah penting untuk menghalang pembezaan neuron. Mol Cell Biol 24:8395-8407.
Okazaki K, Sagata N (1995) Laluan kinase Mos / MAP menstabilkan c-Fos oleh fosforilasi dan menambah aktiviti perubahnya dalam sel NIH 3T3. EMBO J 14:5048-5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Jalur ubiquitin-proteasome diperlukan untuk memproses protein prekursor NF-kappa B1 dan pengaktifan NF-kappa B. Cell 78:773-785.
Papavassiliou AG, Trey M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Degradasi sasaran c-Fos, tetapi bukan v-Fos, oleh isyarat yang bergantung kepada fosforilasi pada c-Jun. Sains/Ilmu 258:1941-1944.
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, , Schaeffer E (2003) Ekspresi khusus rantau otak yang boleh dipamerkan, mutan negatif dominan c-Jun dalam tikus transgenik mengurangkan kepekaan terhadap kokain. Otak Res 970:73-86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Induksi DeltaFosB dalam struktur otak berkaitan ganjaran selepas tekanan kronik. J Neurosci 24:10594-10602.
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Ekspresi faktor transkripsi otak: kesan amfetamin akut dan kronik dan tekanan suntikan. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Pengubahsuaian selepas translasi: fosforilasi dan fosfatase. In: Protokol semasa dalam sains protein (Dunn BM, ed.) Ms. 13.01-13.02. New York: Wiley and Sons.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Ciri-ciri katalitik dan molekul phosvitin / kasein kinase jenis II yang sangat dimurnikan dari sel epitelium manusia dalam budaya (HeLa) dan hubungan dengan ecto protein kinase. Biol Chem Hopey Seyler 368:215-227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Status sistem "kinase protein CK2-HMG14" dalam amnesia yang berkaitan dengan usia dalam tikus. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Degradasi reseptor domain homix helix-loop-helix / Per-ARNT-Sim asas melalui laluan ubiquitin / proteaseome. J Biol Chem 274:36351-36356.
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Pelayan PredictProtein. Asid Nukleat Res 32:W321-W326.
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Targets Ap-1 di dalam otak. Biosci depan 9:8-23.
Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Pencirian molekul adenosina kinase rekombinan dan tetikus sebagai sasaran untuk fosforilasi protein. Eur J Biochem 271:3547-3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Adakah terdapat pelbagai saluran proteolitik yang menyumbang kepada penurunan protein c-Fos, c-Jun dan p53 dalam vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Autoksidasi ester phorbol di bawah keadaan penyimpanan biasa. Rawatan Kanser 35:1375-1377.
Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Fosforilasi konstitutif IkappaBalpha oleh casein kinase II berlaku secara serentak di serine 293: keperluan untuk kemerosotan IkappaBalpha percuma. Mol Cell Biol 16:3554-3559.
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras meningkatkan kestabilan protein Myc. Mol Cell 3:169-179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Fosforilasi nukleotida bebas kitaran dari vitellin oleh kasein kinase II disucikan daripada Rhodnius prolixus oosit. Biokim Mol Biol serangga 32:847-857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Wisdom R (1997) Pengaktifan transkrip dan transformasi oleh protein FosB memerlukan fosforilasi domain pengaktifan terminal karboksil. Mol Cell Biol 17:2372-2380.
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Protein kinase CK2 secara fosforikular berbeza dengan kumpulan mobiliti tinggi kromosom B (HMGB) protein modulasi kestabilan dan interaksi DNA. J Biol Chem 277:1092-1098.
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Pengenalpastian cyk, kinase B2 siklik, sebagai kinase II protein kalsium / calmodulin yang bergantung kepada peranannya semasa pematangan oocyte Xenopus laevis. Exp Res Cell 252:303-318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Peraturan c-fos dan c-jun ekspresi gen oleh lipopolysaccharide dan sitokin dalam astrocytes berbudaya utama: kesan laluan PKA dan PKC. Arch Pharm Res 27:396-401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Fosforilasi pembezaan protein asid ribosom daripada sel yis oleh dua kinase protein endogen: kasein kinase-2 dan kinase 60S. Acta Biochim Pol 42:357-362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) dan sebatian yang berkaitan dengan calphostin, kelas baru perencat spesifik dan kuat protein kinase C. Adv Kedua Rasul Phosphoprotein Res 24:497-501.
Torres J, Pulido R (2001) Penekan tumor PTEN di fosforilasi oleh kinase protein CK2 pada terminal Cnya. Implikasi untuk kestabilan PTEN terhadap degradasi mediasi proteasome. J Biol Chem 276:993-998.
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Perencatan membezakan aktiviti calpain dan proteasome oleh peptidyl aldehydes di-leucine dan tri-leucine. J Biochem (Tokyo) 119:572-576.
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Degradasi c-Fos oleh proteasome 26S dipercepatkan oleh c-Jun dan kinase protein berganda. Mol Cell Biol 15:5682-5687.
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Protein kinase CK2 sebagai pengatur survival sel: implikasi untuk terapi kanser. Sasaran Dadah Kanker Curr 4:77-84.
Vial E, Marshall CJ (2003) Aktiviti kinase ERK-MAP yang lebih tinggi melindungi anggota keluarga FOS FRA-1 terhadap degradasi proteasomal dalam sel karsinoma kolon. J Cell Sci 116:4957-4963.
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB mengawal roda berjalan. J Neurosci 22:8133-8138.
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Peraturan fungsi transkripsi oleh fosforilasi. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.
Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Dua tapak fosforilasi kinase protein CK2 adalah penting untuk aktiviti Myf-5. Biol Chem 378:1445-1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Fosforilasi konstitutif ekor berasid kumpulan pergerakan tinggi 1 protein oleh casein kinase II mengubah kesesuaian, kestabilan, dan spesifikasi mengikat DNA. J Biol Chem 274:20116-20122.
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Casein kinase II berinteraksi dengan domain bZIP beberapa faktor transkripsi. Asid Nukleat Res 26:3854-3861.
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforilasi protein tekanan A170 oleh aktiviti seperti kasein kinase II dalam makrofaj. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Inhibitor pemanjangan transkrip 5,6-dichloro-1-beta-d-ribofuranosilbenzimidazole menghalang faktor transkripsi IIH yang berkaitan dengan protein kinase. J Biol Chem 270:23922-23925.
Yen J, Kebijaksanaan RM, Tratner I, Verma IM (1991) Satu bentuk alternatif FosB adalah pengatur negatif pengaktifan dan transformasi transkripsi oleh protein Fos. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Casein kinase II phosphorylates lens connexin 45.6 dan terlibat dalam degradasi. J Biol Chem 275:6850-6856.
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Induksi komponen transkripsi AP-1 semasa pengaktifan sel T oleh interleukin 1 dan ester phorbol. Pertumbuhan sel berbeza 3:677-684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Akibat CK2 memberi isyarat kepada matriks nuklear. Mol Cell Biochem 227:67-71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Penargetan berbeza protein kinase CK2 ke matriks nuklear apabila overexpression sementara subunitnya. J Cell Biochem 74:127-134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, MP Cassidy, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: peranan penting untuk ΔFosB dalam nukleus akrab dalam tindakan morfin. Nat neurosci 9:205-211.
Artikel yang memetik artikel ini
- Tindak Balas Tingkah Laku dan Struktur untuk Cocaine Kronik Memerlukan Loop Feedforward Melibatkan {Delta} Protein Kinos II FosB dan Calcium / Calmodulin-Dependen di Shell Nucleus Accumbens Jurnal Neurosains, 6 March 2013, 33(10):4295-4307
- Overexpression Striatal {Delta} FosB Memperbaiki Pergerakan Tidak Bertentangan Levodopa-Induced Kronik Jurnal Neurosains, 26 Mei 2010, 30(21):7335-7343
- Abstrak
- Teks penuh
- Teks Penuh (PDF)
- Abstrak
- Teks penuh
- Teks Penuh (PDF)
- Abstrak
- Teks penuh
- Teks Penuh (PDF)
- Abstrak
- Teks penuh
- Teks Penuh (PDF)
- Mekanisme penagihan ketagihan: peranan {Delta} FosB Transaksi filosofis Royal Society B: Sains Biologi, 12 Oktober 2008, 363(1507):3245-3255
- Mengekalkan kerentanan untuk mengembalikan semula tingkah laku mencari methamphetamine dalam sel-sel neurotrofik faktor glial sel yang diperolehi tikus mutan Jurnal FASEB, 1 Julai 2007, 21(9):1994-2004
- Faktor Transkripsi Protein-1 dalam Karsinogenesis Epitelium Pernafasan Penyelidikan Kanser Molekul, 1 Februari 2007, 5(2):109-120
;