Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor dan Attenuates Signal Hilir (2013)

Petikan: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor dan Attenuates Signal Hilir. PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, University of North Dakota, Amerika Syarikat

Menerima: Boleh 20, 2013; Diterima: November 14, 2013; Published: Disember 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Ini adalah artikel akses terbuka yang diedarkan di bawah terma Lesen Pengiktirafan Creative Commons, yang membenarkan penggunaan, pengedaran, dan pembiakan tidak terhad dalam mana-mana medium, dengan syarat pengarang dan sumber asal dikreditkan.

Pembiayaan: Kerja-kerja ini disokong oleh geran (NRF-2012R1A2A2A01012923 dan NRF-2012R1A4A1028200) dari kerajaan Korea (MSIP) dan juga disokong di bawah rangka program kerjasama antarabangsa yang diuruskan oleh NRF Korea (2012K2A1A2033117) dan Institut Penyelidikan Otak Korea (KBRI) Program Penyelidikan Asas MSIP (2031-415). SKP adalah penerima Perikatan Kebangsaan 2004 dan 2006 untuk Anugerah Penyelidik Muda Penyelidikan Schizophrenia dan Kemurungan (NARSAD). Para pendanaan tidak mempunyai peranan dalam reka bentuk kajian, pengumpulan data dan analisis, keputusan untuk menerbitkan, atau penyediaan manuskrip.

Minat bersaing: Para pengarang telah menyatakan bahawa tidak ada kepentingan bersaing.

Pengenalan

Isyarat dopamine terlibat dalam pelbagai fungsi otak termasuk koordinasi motor, kawalan mood dan mekanisme ganjaran [1]. Komponen utama isyarat dopamine dalam vertebrata ditekankan oleh neuron berduri sederhana (MSNs) yang secara selektif meluahkan subset reseptor dopamin dan menerima input dopaminergik terutamanya dari kawasan tegar ventral (VTA) dan substantia nigra (SN) [2]. Reseptor dopamine adalah penerima reseptor protein G (GPCR) dengan tujuh domain transmembran dan terdiri daripada dua subtipe, D1 seperti dan reseptor seperti D2, yang memeterai tindakan timbal balik dalam isyarat dopamin [1]. Contohnya, reseptor seperti D1 (D1, D5) mengaktifkan adenylisl siklase melalui G_αs dan meningkatkan tahap intraselular kAMP, tetapi reseptor seperti dopamine D2 (D2, D3, D4) menghalang adenylisl siklase melalui G_αi dan mengurangkan tahap intrapelular cAMP [1], [3].

Di antara penerima reseptor dopamin, reseptor D2 (DRD2) terlibat dalam patofisiologi pelbagai gangguan psikiatri utama termasuk skizofrenia dan ketagihan dadah [4], seperti banyak ubat antipsikotik sekurang-kurangnya mensasarkan DRD2. Ia juga diketahui bahawa aktiviti DRD2 berkorelasi baik dengan akibat tingkah laku dadah penyalahgunaan dalam model haiwan [5]. Antidepresan dan keberkesanan penstabil mood juga telah dikaitkan dengan perubahan dalam ekspresi permukaan sel DRD2 atau isyarat intrasel hilir yang diantara PKA, ERK dan GSK3 [1], [4], [6]. Walaupun peranan kritikal ini untuk DRD2 di dalam otak, mekanisme pengawalseliaan terperinci yang memberikan kepelbagaian dan kerumitan kepada sifat-sifat DRD2 tidak difahami sepenuhnya.

Barisan bukti konvergen menunjukkan bahawa beberapa modifikasi posttranslational terlibat dalam penalaan halus aktiviti DRD2. Glycosylation yang meluas DRD2 didedahkan pada kajian pelabelan afiniti awal [7], dan pembentukan ikatan disulfida dalam DRD2 juga dikenalpasti sebagai pengubahsuaian penting untuk mengikat ligand [8]. Selain itu, tapak fosforilasi DRD2 pada mulanya dikenal pasti oleh vitro pengujian dengan radioisotop, menyediakan laluan untuk pelbagai laluan pengawalseliaan yang diantarkan oleh pelbagai kinase [9]. Sesungguhnya protein kinase C (PKC) mengawal mobilisasi DRD2-penggabungan kalsium intraselular dan memodulasi interaksi DRD2 dengan protein sitoskeletal [10]. Fosforilasi oleh GPCR kinase 2 (GRK2) mengawal corak resensitisasi yang disebabkan oleh agonis DRD2 [11].

Kinase 5 yang bergantung kepada Cyclin (Cdk5) adalah serine / threonine kinase yang diarahkan proline yang mempunyai aktiviti keutamaan kerana ekspresi khusus otak pemikat pentingnya, p35 dan p39 [12]. Cdk5 terlibat dalam pelbagai proses neuron termasuk penghijrahan saraf dan bimbingan akson, dan Cdk5 dan p35 nipis menunjukkan kecacatan pada lapisan kortikal [13]. Baru-baru ini, menunjukkan bahawa fosforilasi WAVE1 dan ephexin oleh Cdk5 mengawal morphogenesis tulang belakang dendritik [14]. Tambahan pula, Cdk5 juga mengawal paras ekspresi permukaan reseptor NMDA, NR2B, dan NMDA arus yang diurus oleh NR2A [15], [16]. Perlu diperhatikan bahawa beberapa keping bukti mencadangkan hubungan intim antara Cdk5 dan sistem dopamine. Phosphorylates Cdk5 tyrosine hydroxylase (TH), mengawal kestabilannya, dan dengan itu mengekalkan homeostasis dopaminergik [17]. Dalam neuron postsynaptic, apabila T75 residu dopamine dan siklik-AMP yang dikawal fosfoprotein-32kD (DARPP-32) adalah fosforilasi oleh Cdk5, ia boleh menghalang aktiviti PKA dan dengan itu menimbulkan dendam dopamine DRD1-mediated PKA signaling [18]. Menariknya, apabila kokain, agonis tidak langsung reseptor dopamin, dikendalikan secara kronik dalam tikus, mRNA dan tahap protein peningkatan Cdk5 dalam neurons berduri sederhana [19]. Secara kolektif, Cdk5 nampaknya terlibat dalam penyesuaian sinaptik yang disebabkan oleh dadah. Dalam kajian ini, kami menunjukkan interaksi fungsional DRD2 dan Cdk5 yang memanjangkan peranan Cdk5 dalam isyarat dopamin.

Bahan dan Kaedah

Antibodi

Serum anti arnab telah dibangkitkan terhadap peptida yang mengandungi phospho-serine 321 (pS321) daripada gelung intraselular ketiga DRD2 (D2i3). Phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), digunakan untuk membuat lajur konjugasi peptida untuk pembersihan afiniti (20401, PIERCE). Antibodi anti-pS321 diperkaya dengan sistem pembersihan afiniti berikutan arahan pengeluar. Fosfo-antibodi dipulihkan disimpan di PBS dengan 0.1% natrium azide dan 0.1% gelatin. Anti-tikus antibodi antibodi antibodi (sc-5) dan antibodi anti-p249 anti-p35 (sc-820) telah digunakan untuk pemotongan dan immunocytochemistry Barat Cdk5 / p35. Antibodi anti-tikus anti-GFP (sc-9996) digunakan untuk imunoprecipitation dan pemusnahan Barat DRD2-GFP. Antibodi antibodi antibodi (sc-807), antibodi antibodi anti-arnab (sc-805), anti-tikus antibodi anti-GST (sc-138) dan anti-tikus antibodi anti-GAPDH (sc- 32293) telah dibeli dari Bioteknologi Santa Cruz.

haiwan

Tikus knockout p35 adalah hadiah yang baik dari Dr. Katsuhiko Mikoshiba di RIKEN Brain Science Institute di Jepun dan digunakan untuk budaya neuron utama. Set primer untuk genotip adalah 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC dan 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT seperti yang digambarkan sebelum ini [20]. Tikus ICR dan tikus Sprague Dawley digunakan untuk penyediaan lateks otak. Semua prosedur haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institut Universiti Sains dan Teknologi Pohang.

Membina Plasmid

Manusia isoform DRD2 panjang dalam vektor plasmid EGFP-N1 dan gelung intraselular ketiga DRD2 (212-373 residu asid amino termasuk residu asid amino tambahan 29 yang unik kepada isoform panjang DRD2) dalam vektor plasmid pFLAG-CMV-2 digunakan. Manusia Cdk5 dimasukkan dalam vektor plasmid pCMV-HA dan manusia p35 dimasukkan dalam vektor pcDNA 3.1 plasmid. Manusia Cdk5 dimasukkan di bawah penganalisis sitomegalovirus (CMV) bersama p35 manusia dalam vektor PCDNA 3.1 untuk membuat ungkapan dua bentuk (Cdk5 / p35) untuk imunokytokimia, pengambilan internalisasi reseptor, [³⁵S] -GTP_γS mengikat assay, radioligand mengikat assay dan cAMP enzyme immunoassay.

Dalam Vitro Kinase Assay

Berkaitan dengan IP vitro kinase assay dilakukan seperti berikut. Satu otak tetikus keseluruhan diletakkan di dalam 3 mL erythrocytes lysis buffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) oleh 20 sebatan homogenizer Dounce untuk mendapatkan lysates otak homogen . The lysates diinkubasi pada ais untuk 30 min, sonicated, dan centrifuged pada 16,000 × g untuk min 10. Supernatan telah diimunisasi dengan antibodi anti-arnab anti-p35 untuk mendapatkan kompleks Cdk5 / p35 yang aktif. Cdk5 / p35 protein gabungan GST kompleks dan disucikan dicampur dengan adenosin 5'-triposfat, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) dan diinkubakan dalam penampan kinase (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) untuk 1 h pada suhu bilik [18], [21]. Kompleks Cdk5 / p25 yang dibersihkan (14-516, Millipore) juga digunakan untuk vitro kinase assay seperti yang dinyatakan di atas. Penampan pemuatan sampel 2 × ditambahkan pada campuran reaksi dan direbus pada 100 ° C. Sampel kemudiannya tertakluk kepada SDS-PAGE dan gel kering ditaksir oleh autoradiography.

Analisis kromatografi cecair (LC) -Mass Spectrometry (MS) / MS

GST-D2i3 protein rekombinan dianalisis oleh LC-MS / MS berikut berkaitan IP vitro kinase assay. Kami melakukan pengenalan peptida data LC-MS / MS menggunakan X !! Tandem (versi Dec-01-2008). Setiap fail data RAW mula-mula ditukarkan kepada mzXML menggunakan saluran paip trans-proteomik (TPP; versi 4.3). Imbasan MS / MS dalam mzXML yang ditukar kemudiannya tertakluk kepada pencarian terhadap pangkalan data urutan protein UniProt (melepaskan 2010_07) termasuk urutan GST-D2i3 menggunakan X !! Tandem. Toleransi telah ditetapkan kepada 3 Da untuk ion prekursor dan 2 Da untuk ion-ion serpihan. Kekhususan enzim untuk trypsin digunakan. Pilihan pengubahsuaian yang berubah-ubah digunakan untuk karbamidomethylation cysteine ​​(57.021 Da), pengoksidaan methionine (15.995 Da), hidrolisis asparagine (0.987 Da) dan fosforilasi serine (79.966 Da).

Immunoprecipitation

Imunopresumatik dilakukan pada lysates sel dalam penyangga lisis ELB. Antibodi anti-GFP telah ditambah kepada lysates dan diinkubasi untuk 3 h pada 4 ° C. Immunocomplexes disucikan menggunakan protein-A agarose. Presipitat diinkubasikan dengan buffer pemuatan sampel SDS untuk min 30 pada 37 ° C, dan tertakluk kepada SDS-PAGE dan Blots Barat.

GST Pull-down Assay

10 μg GST yang disucikan dan GST-D2i3 diinkubasi dengan lysate otak tikus untuk 1.5 h pada 4 ° C. 30 μL glutathione (GSH) yang disambungkan manik Sepharose 4B (17-0756-01, GE Healthcare) diseimbangkan dengan penyangga lisis ditambah dan diinkubasi untuk tambahan 1 h. Manik dikumpulkan dengan sentrifugasi di 2,000 ×g dan dibilas dengan penampan lisis 4 kali [22], [23]. Precipitates dianalisis oleh pemusnah Barat menggunakan antibodi anti-Cdk5 dan anti-p35.

Immunocytochemistry

Transfected HEK 293 sel dan neuron striatal yang dibiakkan pada coverlips dibasuh sekali dengan saline buffered fosfat (PBS) dan tetap dengan rendaman dalam 4% paraformaldehyde / PBS untuk min 30. Antibodi utama dicairkan dalam penyelesaian menyekat (2% kuda serum dan 1% Triton X-100 dalam PBS). Antibodi antibodi anti-tikus Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) dan antibodi antibodi anti-arak Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen) digunakan sebagai antibodi sekunder. Hoechst digunakan untuk pewarnaan nukleus. Imej diperolehi oleh mikroskop confocal (Olympus, FluoView-1000).

Assept Internalization Receptor

24 h selepas pemindahan, sel telah dirawat dengan 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) untuk 30 min dan min 90 pada 37 ° C. Sel telah digantung semula dalam 2 mL sejuk PBS dan 200 μL aliquots digunakan untuk setiap reaksi. Rawatan ubat dilakukan pada suhu bilik untuk 3 h pada kepekatan berikut; 3 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpiride (895, TOCRIS), 10 μM haloperidol (H1512, Sigma). Hidrofobik [³H] -spiperone digunakan untuk melabelkan jumlah reseptor yang dinyatakan dan sulpiride hidrofilik digunakan untuk menggantikan penerima reseptor berbran [³H] - isyarat spionone. Isyarat reseptor yang berkaitan dengan membran dikira dengan menolak nilai reseptor intraselular daripada nilai reseptor yang dinyatakan. Sel-sel telah ditapis pada penapis GF / B (Millipore) dan mencuci 3 kali dengan penampan basuh (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Penapis telah dikeringkan dan radioaktiviti sisa diukur menggunakan kaunter cair penipisan [24].

Penyediaan Membran Sel

Sel-sel confluent dalam hidangan budaya 100 mm selepas transfusi dibasuh dengan PBS ais sejuk dan dituai di 1 mL HME buffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Lysates homogenized telah sentrifuged dengan 500 × g untuk min 15 dan supernatan kemudian disentrifugasi dengan 36,000 × g untuk min 30. Pelet yang digantung semula dalam penampan HME digunakan untuk ujian.

[³⁵S] -GTP_γS Binding Assay

Fraksi membran sel telah diinkubasi terlebih dahulu dengan 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) dalam penyangga assay (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA dan 0.01 mM KDN) untuk min 10. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) telah ditambahkan ke kepekatan akhir 3 nM dalam 30 μL dan selanjutnya diinkubasi untuk min 90. 170 μL buffer ais sejuk (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, dan 0.1 mM GTP) ditambah untuk menghentikan reaksi. Membran ditapis pada penapis GF / B (Millipore) dan dibasuh kali 3 dengan penampan basuh (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Penapis telah dikeringkan dan radioaktiviti diukur menggunakan kaunter kerinting [25], [26].

Radioligand Binding Assay

Membran sel yang disediakan telah diinkubasi dengan 0.01 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer) dan peningkatan kepekatan quinpirole (Q102, Sigma) untuk min 30 dalam buffer assay (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membran ditapis pada penapis GF / B (Millipore) dan dibasuh kali 3 dengan penampan basuh (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reaksi itu ditamatkan dengan penapisan cepat melalui penapis GF / C. Radioaktiviti sisa diukur menggunakan kaunter cair penipisan [27]-[29].

cAMP Enzyme Immunoassay

Sel-sel HEK 293 yang ditransmisikan telah dirawat dengan rolipram 10 μM (R6520, Sigma) untuk 1 h, dan kemudian dirawat dengan 0.1 μM forskolin (F6886, Sigma) dan meningkatkan kepekatan quinpirole (Q102, Sigma) untuk min 30. Neuron striatal berbudaya utama dirawat dengan rolipram 10 μM untuk 1 h, dan kemudian 1 μM dopamin untuk 1 h [22]. Lysates sel telah disediakan dengan tahap 0.1 M HCl dan cAMP dikesan oleh kit enzyme immunoassay cAMP (Sapphire Bioscience) berikutan arahan pengeluar.

Neuron Striatal Kultur Utama

Kawasan Striatal diasingkan daripada otak embrio tikus (E15). Tisu yang disisihkan dipisahkan dalam medium penting (MEM) (11095, Invitrogen) yang mengandungi 0.25% trypsin (T4549-100, Sigma) dan 0.1% DNase I untuk 6 min pada 37 ° C. Sel-sel telah digantung semula dalam media penyaduran (MEM dengan serum kuda 0.01-7.4, GIBCO) dengan 10 M HEPES (pH 16050) dan 122% (vol / vol). Neuron dipupuk untuk hari-hari 7 vitro (DIV 7) dalam MEM dengan tambahan B27 (17504-044, Invitrogen) sebelum digunakan untuk immunoassays enzim cAMP.

Hasil

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 dalam Loop Intracellular Ketiga DRD2 vitro

Untuk mengenal pasti substrat Cdk5 novel, kami melakukan carian yang sistematik menggunakan (S / T) PX (K / H / R) sebagai urutan konsensus Cdk5 pengiktirafan [30] dan dikenalpasti DRD2 sebagai substrat calon. Susunan konsensus, termasuk serum 321, terletak di gelung intraselular ketiga DRD2 (D2i3) di mana pelbagai mekanisme pengawalseliaan telah terbabit [3], [10], [11]. Urutan ini secara konservatif dilestarikan dalam DRD2 dalam vertebrata, yang menunjukkan pentingnya fungsi residu (Rajah 1A).

Download:   

• PPT

  Slaid PowerPoint

• PNG

  imej yang lebih besar (2.08MB)

• TIFF

  imej asal (4.36MB)

Rajah 1. Cdk5 phosphorylates serine 321 dalam gelung intrasel ketiga dari DRD2 dalam vitro.

(A) penjajaran urutan asid amino yang menunjukkan kawasan konservatif DRD2 dari pelbagai spesies (diwarnakan). Potensi tapak fosforilasi Cdk5 ditunjukkan oleh asterisk. (B) berkaitan IP vitro kinase assay dengan protein GST-D2i3 rekombinan dan GST-D2i3 mutant protein. Kompleks Cdk5 / p35 diperkaya dari ekstrak otak tikus oleh immunoprecipitation anti-p35 digunakan untuk tindak balas kinase. Autoradiograph protein fosforilasi ditunjukkan bersama dengan Coomassie pewarnaan biru cemerlang gel yang sama. Arrowhead menunjukkan isyarat radioaktif sepadan dengan GST-D2i3s dan anak panah terbuka menandakan isyarat radioaktif dari p35. (C) MS / MS spektrum fragmen peptida fosforilasi D2i3. Corak pemecahan teori ditunjukkan di bawah spektrum. Di antara semua ion serpihan, ion-ion dan ion-ion yang dikesan dinyatakan dalam spektrum. Y₆ dan y₇ ion yang kuat menunjukkan phosphorylation serum 321. (D) In vitro kinase assay dengan kompleks Cdk5 / GST-p25 yang disucikan menggunakan GST-D2i3 dan GST-D2i3 protein mutan. Protein fosforilasi ditunjukkan dalam autoradiograph, bersama dengan Coomassie berwarna biru yang cemerlang. Arrowhead menunjukkan isyarat radioaktif sepadan GST-D2i3 dan anak panah terbuka menunjukkan isyarat radioaktif dari GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Untuk menilai kapasiti Cdk5 untuk memfosforasikan D2i3, kami melakukan hubungan IP vitro pemeriksaan kinase menggunakan kompleks Cdk5 / p35 yang aktif diperkaya dari lysate otak tikus dengan imunoprecipitation p35 dengan protein GST-D2i3 (residu asid amino 212-373) yang dimurnikan sebagai substrat. Kami mengamati isyarat fosforilasi dalam protein GST-D2i3 dan GST-D2i3 S297A yang disucikan, tetapi isyaratnya berkurangan dengan menggunakan GST-D2i3 S321A (Rajah 1B). Untuk mengesahkan lagi fosforilasi serine 321 dalam GST-D2i3, kami melakukan analisis LC-MS / MS sampel dari hubungan IP vitro pengujian kinase menggunakan spektrometri massa LTQ XL. Secara konsisten, phospho-peptides sepadan dengan jisim peptida X-PHO-serine telah pulih (Rajah 1C). Memandangkan pemerolehan yang bergantung kepada data semasa analisis LC-MS / MS cenderung untuk mengesan protein yang banyak dalam sampel [31], data ini menunjukkan bahawa serum 321 residu adalah tapak fosforilasi dominan Cdk5 di rantau D2i3. Untuk membuktikan fosforilasi langsung serum 321 dalam GST-D2i3 oleh Cdk5, vitro kinase assay menggunakan kompleks Cdk5 / GST-p25 yang dibersihkan dengan protein GST-D2i3 yang dipadamkan semula dilakukan. Kami mengenal pasti isyarat fosforilasi penting dalam GST-D2i3 yang tidak hadir dalam GST-D2i3 S321A (Rajah 1D). Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa residu D2i3 S321 adalah sasaran istimewa untuk phosphorylation-mediated Cdk5.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 dalam Loop Intracellular Ketiga DRD2 dalam Sel

Untuk mengenal pasti fosforilasi serine 321, kami membangkitkan antibodi khusus untuk phospho-serine 321 (pS321). Sampel dari pautan IP vitro kinase assay dianalisis oleh blotting Barat menggunakan anti-pS321 antibodi. Blots menunjukkan kumpulan yang berbeza dalam reaksi kinase yang bergantung kepada GST-D2i3 (Rajah 2A). Untuk mengesahkan potensi phosphorylation serum 321 dalam DRD2 oleh Cdk5 dalam sel, immunoprecipitates anti-GFP dari sel HEK 293 yang menyatakan DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP dengan atau tanpa HA-Cdk5 dan p35 dianalisis oleh pemadatan Barat menggunakan anti-GFP dan anti-pS321 antibodi. Isyarat band yang dicirikan oleh antibodi anti-GFP yang diketahui disebabkan oleh glycosylation yang berlebihan DRD2 diperhatikan hanya dengan kehadiran DRD2-GFP, dan anti-pS321 antibodi mengesan isyarat DRD2 yang serupa hanya dengan ekspresi bersama Cdk5 / p35 (Rajah 2B) [7]. Untuk mengesahkan lagi fosforilasi serine 321 oleh Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) dan bentuk mutan D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) dihasilkan. FLAG-D2i3 dan FLAG-D2i3 S321A dinyatakan dengan atau tanpa HA-Cdk5 dan p35 dalam sel HEK 293 dianalisis oleh assay shift mobiliti SDS-gel. Peralihan mobiliti yang bergantung kepada Cdk5 diperhatikan untuk FLAG-D2i3, tetapi bukan untuk FLAG-D2i3 S321A (Rajah 2C). Kami juga menilai tahap fosforilasi DRD2 di Ser321 apabila rangsangan agonis. Sel HEK 293 yang menyatakan kompleks DRD2-GFP dan Cdk5 / p35 dirangsang oleh quinpirole, dan anti-GFP immunoprecipitates dari lysates sel dianalisis oleh pemusnah Barat menggunakan antibodi anti-GFP dan anti-pS321. Kami mendapati bahawa fosforilasi Cdk5 yang diimultasikan oleh DRD2 pada Ser321 tidak terjejas oleh rangsangan agonis, yang kelihatan berbeza daripada fosforilasi GRK- dan PKCRajah 2D) [32], [33]. Bersama-sama, keputusan ini menunjukkan bahawa Cdk5 dapat memfilmkan sisa serum 321 DRD2 dalam persekitaran selular.

Download:   

• PPT

  Slaid PowerPoint

• PNG

  imej yang lebih besar (1.92MB)

• TIFF

  imej asal (3.5MB)

Rajah 2. Phosphorylate Cdk5 serina 321 dalam gelung intraselular ketiga DRD2 dalam sel.

Phosphorylation-mediated Cdk5 serine 321 dianalisis dengan menggunakan anti-pS321 antibodi. (A) Sampel daripada berkaitan IP vitro kinase assay menggunakan protein GST-D2i3 dianalisa oleh Western blotting (WB) dengan antibodi yang ditunjukkan. Arrowheads menunjukkan GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP dinyatakan dengan atau tanpa HA-Cdk5 dan p35 dalam sel HEK 293. Immunoprecipitates Anti-GFP dianalisis oleh pemusnah Barat menggunakan antibodi anti-GFP dan anti-pS321. Kurungan menunjukkan isyarat DRD2 dan anak panah terbuka menunjukkan isyarat tidak spesifik dari immunoprecipitates anti-GFP. 'Input%' adalah jilid% total lysate untuk reaksi IP. Isyarat endokrin Cdk5 yang lemah ditunjukkan oleh asteris. (C) Pergeseran gel mobiliti ujian. Sel HEK 293 yang ditransfeksi seperti yang ditunjukkan dianalisis oleh pemusnahan Barat. (D) Sel HEK 293 yang ditransportasi telah dirawat dengan imunoprecipitates quinpirole dan anti-GFP dianalisis oleh pembengkakan Barat dengan antibodi anti-GFP dan anti-pS321. Anak panah terbuka menandakan isyarat tidak spesifik daripada imunoprecipitates anti-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Kompleks Cdk5 / p35 dan DRD2 bersekutu secara fizikal

Kami menyelidiki potensi interaksi fizikal antara kompleks Cdk5 / p35 dan DRD2 kerana banyak substrat Cdk5 diketahui secara fizikal dikaitkan dengan kompleks Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. Pertama, eksperimen pull-down GST telah dilakukan. Protein GST-D2i3 yang dipulihkan semula diinkubasi dengan lysate otak tikus dan GST pull-down precipitates dianalisis untuk pembongkaran Barat. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3A, endogenous Cdk5 dan p35 telah dikenalpasti dalam precipitates pull-down, menunjukkan interaksi fizikal antara kompleks DRD2 dan Cdk5 / p35 (Rajah 3A). Selain itu, HA-Cdk5 dan p35 dikesan dalam immunoprecipitates anti-GFP dari lysates sel HEK 293 yang menyatakan DRD2-GFP dan Cdk5 / p35 (Rajah 3B). Di samping itu, kami melakukan analisis immunocytochemical dan mendapati bahawa DRD2-GFP, HA-Cdk5 dan p35 menunjukkan isyarat bersama penyetempatan yang signifikan di kawasan membran sel HEK 293 (Rajah 3C, panel atas). Kami juga menyiasat penyetempatan bersama DRD2 dan Cdk5 / p35 dalam konteks neuron. Secara konsisten, DRD2-GFP juga menunjukkan penyertaan bersama dengan endogen Cdk5 dan p35 dalam neuron striatal yang berbudaya (DIV7), menghubungkan lagi pautan fungsi antara DRD2 dan Cdk5 / p35 (Rajah 3C, panel bawah). Hasilnya menunjukkan bahawa DRD2 dan Cdk5 / p35 boleh membentuk kompleks dan dengan itu, menyokong tanggapan bahawa DRD2 adalah substrat fisiologi Cdk5.

Download:   

• PPT

  Slaid PowerPoint

• PNG

  imej yang lebih besar (3.91MB)

• TIFF

  imej asal (5.35MB)

Rajah 3. Cdk5 / p35 boleh membentuk kompleks dengan DRD2.

(A) GST pull-down assay menggunakan protein GST-D2i3 rekombinan yang dimurnikan dengan ekstrak otak tikus. GST tarik turun turun tertakluk kepada analisis blotting Barat. 'Manik' menunjukkan mendakan tarik turun tanpa protein GST. (B) Immunoprecipitation of kompleks DRD2 dan Cdk5 / p35. IP Anti-GFP dari lysates dari sel-sel yang ditranspel ke bawah tertakluk kepada analisis blotting Barat. Kurungan menunjukkan isyarat DRD2 dan anak panah terbuka menunjukkan isyarat tidak spesifik dari immunoprecipitates anti-GFP. Blot yang terlalu banyak untuk input juga ditunjukkan di sebelah kanan. (C) Analisis immunocytochemical DRD2 dan Cdk5 / p35. Sel-sel HEK 293 yang meluahkan DRD2-GFP dan Cdk5 / p35 diwarnai dengan antibodi anti-Cdk5 dan anti-p35 (Panel atas). DRD2-GFP diisytiharkan sendirian dalam neuron-neuron yang berbudaya dan berwarna dengan anti-Cdk5 dan anti-p35 antibodi (Panel bawah). Hoechst digunakan untuk pewarnaan nukleus. Bar skala adalah 5 μm. Semua imej diperoleh menggunakan mikroskop confocal (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Phosphorylation-mediated Cdk5 dari DRD2 Attenuates Activity Receptor

Telah melaporkan bahawa fosforilasi memodulasi ciri-ciri kritikal GPCR seperti G protein gandingan, internalisasi reseptor, penyetempatan intraselular, dan hubungan dengan protein modulator [9], [11], [24]. APenerokumentasi penerima reseptif gonis adalah proses pengawalseliaan kritikal transduksi isyarat. Kami menyiasat modulasi Cdk5 yang dimediasi pengantarawinan DRD2. Sel HEK 293 yang mengekspresikan DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP dengan atau tanpa Cdk5 / p35 diinkubasi dengan quinpirole 1 untuk mendorong pengantarabangsaan DRD2 yang dirangsang agonis (Rajah 4A). [³H] -spioner dari sel ekspres DRD2-GFP dikurangkan dengan ketara pada rawatan min quinpirole 30 dan pulih pada min 90. Menariknya, [³Isyarat -spiperone dari sel-sel ekspresi DRD2-GFP dan Cdk5 / p35 juga dikurangkan pada rawatan min quinpirole 30 tetapi tidak pulih pada min 90 (Rajah 4A, seksyen kedua). Selain itu, [³Isyarat -spiperone dari sel-sel yang mengekspresikan DRD2 S321A-GFP dikurangkan pada min 30 dan pulih pada min 90, tidak kira sama dengan ekspresi bersama dengan Cdk5 / p35. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa DRD2 yang diawali semula mengulang kembali ke membran plasma apabila rangsangan agonis yang berpanjangan [11]. TBagaimanapun, fosforilasi Cdk5 yang disederhanakan oleh DRD2 terlibat dalam proses resensitisasi berikutan pengikatan DRD2 yang disebabkan agonis.

Download:   

• PPT

  Slaid PowerPoint

• PNG

  imej yang lebih besar (387KB)

• TIFF

  imej asal (1.31MB)

Rajah 4. Fosforilasi yang disederhanakan Cdk5 melancarkan ekspresi permukaan DRD2 dan isyarat hiliran.

(A) ungkapan permukaan DRD2 diukur oleh [³H] -spiperone mengikat assay. Transfected HEK293 sel telah dirangsang dengan 1 μM quinpirole untuk masa yang ditunjukkan dan dituai, diikuti oleh 3 nM [³H] -rawatan spiperone selama 3 jam. Radioaktiviti diukur dan isyarat permukaan dikira. Bar ralat mewakili min ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA sehala dengan ujian post hoc Dunnett: bandingkan semua lajur berbanding lajur kawalan). (B) [³⁵S] -GTP_γUjian pengikat. Membran sel telah disediakan dari sel-sel yang dipindahkan seperti yang ditunjukkan. Persiapan membran diinkubasi dengan quinpirole 1 μM diikuti oleh 3 nM [³⁵S] -GTP_γS selama 90 min. Bar ralat mewakili min ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA sehala dengan ujian post hoc Bonferroni: bandingkan semua pasangan lajur). (C) Quinpirole-bersaing [³H] -spiperone mengikat assay. Persediaan membran dari sel-sel transpens telah diinkubasi dengan 0.01 nM [³H] -spiperone dan peningkatan kepekatan quinpirole selama 30 min. Regresi tidak linear diperoleh oleh GraphPad. Bar ralat menunjukkan min ± SE (n = 3). (D) Uji imunisasi enzim cAMP dalam sel HEK 293 yang ditransfeksi. Sel-sel yang ditransfeksi telah diawetkan dengan 10 µM rolipram selama 1 jam, dan kemudiannya dirawat bersama dengan forkolin 0.1 µM dan peningkatan kepekatan quinpirole selama 30 minit. Regresi tidak linear diperoleh oleh GraphPad. Palang ralat mewakili min ± SE (n = 4; ** p <0.01; dua sisi t-teri). (E) Neuron striatal yang dibiakkan dari jenis liar dan embrio knockout p35 (DIV 7) telah dirawat dengan rolipram 10 μM untuk 1 h diikuti dengan 1 μM dopamin untuk 1 h. Bar ralat merangkumi min ± SE (n = 4; **p<0.01; dua ekor t-teri).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Kami selanjutnya menilai kemungkinan perubahan penggantian protein G dirangsang agonis kepada DRD2 yang dikaitkan dengan fosforilasi yang dikendalikan Cdk5 menggunakan [³⁵S] -GTP_γUjian pengikat [25], [26]. DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP dengan atau tanpa Cdk5 / p35 dinyatakan dalam sel HEK 293. Membran telah disediakan dan dirangsang dengan quinpirole 1 μM dan seterusnya dibenarkan [³⁵S] -GTP_γPenggabungan S. DRD2-GFP dan Cdk5 / p35 mengekspresikan membran sel menunjukkan secara signifikan terjejas [³⁵S] -GTP_γS mengikat berbanding semua membran sel lain (Rajah 4B). Keputusan ini menunjukkan bahawa phosphorylation-mediated Cdk5 turun mengawal protein G dirangsang agonis di DRD2.

Tambahan pula, quinpirole-competing [³H] -spiperone mengikat assay dilakukan untuk menyiasat sebarang perubahan potensial dalam pertalian agonis di DRD2 oleh phosphorylation-mediated Cdk5. Mengikat kompetitif [³H] -spiperon apabila rawatan peningkatan kepekatan quinpirole ke persediaan membran dari transfected diukur. Bersaing mengikat quinpirole dan [³H] -spiperone di DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP dibuat logK serupa_i nilai (-9.789 untuk DRD2-GFP; -9.691 untuk DRD2 S321A-GFP), yang menunjukkan bahawa pertalian ligan ke DRD2 tidak terjejas dengan ketara oleh fosforilasi Cdk5-mediated at DRD2 (Rajah 4C).

Phosphorylation-mediated Cdk5 Down-mengawal Laluan Signal DRD2-camp

Seterusnya, kami menyiasat sama ada pengubahsuaian DRD2 oleh Cdk5 menjejaskan laluan isyarat hiliran. Kami memantau perencatan DRD2 yang diperintahkan oleh pengeluaran CAMP yang dirangsang oleh pesakit oleh adenylisl cyclase dalam sel-sel yang menyatakan DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP menggunakan immunoassay enzyme cAMP. Sel-sel ekspres DRD2 menunjukkan penurunan paras CAMP sebagai tindak balas kepada quinpirole dalam cara yang bergantung kepada dos. Hebatnya, ekspresi bersama Cdk5 / p35 dapat mengurangkan pengurangan maksimal pembentukan cAMP (Rajah 4D, panel kiri). Sebaliknya, dalam sel-sel yang mengekspresikan DRD2 S321A-GFP, pembentukan cAMP secara berkesan dihalang sebagai tindak balas kepada rawatan quinpirole tanpa menghiraukan ungkapan Cdk5 / p35 (Rajah 4D, panel kanan). Keputusan ini menunjukkan bahawa phosphorylation-mediated Cdk5 dari DRD2 melengkapkan aktiviti penghambatan DRD2 pada laluan isyarat hiliran cAMP. Untuk mengesahkan lagi fenomena dalam tetapan yang lebih fisiologi yang relevan, kami menggunakan neuron-neuron berbudaya primer daripada kekurangan embrio dalam kumpulan p35, pengaktif Cdk5 yang penting. Neuron striatal berbudaya utama telah dirawat dengan dopamine 1 μM dan dianalisis oleh immunoassay enzim cAMP. Neurons dari tikus knockout p35 yang dipamerkan mengurangkan tahap cAMP berbanding neuron jenis liar apabila dirangsang dengan dopamin (Rajah 4E). TKami bersama-sama, kami menyimpulkan bahawa fosforilasi Cdk5-mediated DRD2 menghasilkan penurunan dalam nada perencatan pada laluan cAMP yang digunakan oleh DRD2.

Perbincangan

Kami mengenal pasti DRD2 sebagai substrat baru Cdk5. Fosforilasi kelihatan turun mengawal ekspresi permukaan DRD2 dengan menjejaskan nasib DRD2 berikutan pengaktifan reseptor dengan itu mengurangkan DRD2 G_i- laluan cAMP dan hiliran cAMP. Oleh kerana residu fosforilasi S321 wujud dalam DRD2 isoforms panjang dan pendek, mekanisme yang dicadangkan dalam kajian ini boleh menjadi mod peraturan umum dalam isyarat DRD2-mediated.

DRD2 dalam neuron berkilat sederhana bukan sahaja dianggap sebagai subtipe penerima reseptor utama tetapi juga telah diiktiraf kerana kerentanan terhadap perubahan dalam ketersediaan sebagai tindak balas kepada rangsangan alam sekitar. Desensitisasi yang disebabkan oleh agonis dan resensitisasi DRD2 telah dikaji secara meluas [11], [24]. Khususnya, beberapa kajian telah menunjukkan bahawa kesan pendedahan psychostimulant kronik, seperti kokain dan amphetamine, yang meningkatkan tahap dopamine ekstraselular dalam sinaps striatal, disertai dengan perubahan dinamik DRD2 selepas berstatus [36]. Sesungguhnya, pengguna kokain kronik diketahui telah menurunkan tahap DRD2 di kawasan striatal, dan ketersediaan DRD2 dalam nukleus accumbens (NAcc) menunjukkan korelasi negatif dengan mencari dan tingkah laku penguat dadah pada tikus dan primata [37]-[39]. Penemuan ini menunjukkan bahawa fungsi DRD2 sangat mudah terdedah kepada peraturan penyesuaian atau pampasan sebagai tindak balas kepada pelbagai rangsangan termasuk pendedahan dadah kronik. Keputusan kami menunjukkan bahawa residu S321 dalam gelung intraselular ketiga DRD2 boleh di fosforilasi oleh Cdk5, yang mengakibatkan penurunan pengaruh perencatan DRD2 pada laluan cAMP. Interaksi ini mencadangkan mekanisme pengawalseliaan baru yang berkaitan dengan Cdk5 dalam neopsi dopaminoceptif yang mungkin dikaitkan dengan sifat dinamik ketersediaan permukaan DRD2.

Perlu diingatkan bahawa Cdk5 dikenali sebagai komponen utama dalam mengantarkan perubahan adaptif persekitaran neuron. Sebagai contoh, perubahan struktur dan fungsian dendritik duri pada neuron litar limbik adalah salah satu akibat daripada pendedahan psikostimulan berulang [40]. Perubahan ini disertai oleh pelbagai perubahan molekul termasuk induksi protein tindak balas unsur-unsur tindak balas CAMP (CREB) dan ΔFosB, faktor transkripsi yang memperlihatkan pengawalseliaan yang berterusan sebagai tindak balas terhadap pentadbiran kokain kronik [41], [42]. Yang penting, Cdk5 adalah sasaran ΔFosB [19], dan banyak komponen kritikal yang terlibat dalam dinamika tulang dendritik, seperti PSD-95, p21-activated kinase (PAK), β-catenin, dan spinophilin, dilaporkan sebagai substrat Cdk5 [43]-[46]. Secara manipulasi, manipulasi genetik atau farmakologi aktiviti Cdk5 menimbulkan perubahan morfologi tulang belakang dendrit dan tindak balas tingkah laku terhadap kokain, yang menunjukkan peranan kritikal bagi Cdk5 dalam perubahan molekul dan morfologi litar dopamin mesolimbi [47], [48]. Keputusan kami menunjukkan bahawa DRD2 adalah sasaran baru Cdk5 memberikan maklumat tambahan mengenai perubahan penyesuaian sistem dopamine sebagai tindak balas terhadap pendedahan dadah kronik kerana pengawalseliaan Cdk5 seterusnya yang diuruskan oleh ΔFosB dapat mendorong peningkatan tonik dalam fosforilasi DRD2 . Selain itu, DRD2 diketahui menjejaskan banyak proses selular, termasuk peraturan laluan camp dan MAP kinase dan peristiwa transkrip hiliran [42], [49]. Oleh itu, penemuan dalam kajian ini mungkin bukan hanya menggambarkan peraturan langsung DRD2 oleh Cdk5 tetapi juga memberikan wawasan baru mengenai respon adaptif sistem dopamine kepada pendedahan dadah kronik.

Sumbangan Pengarang

Menyedari dan merancang eksperimen: JJ YUP DH SKP. Menjalankan eksperimen: JJ YUP DKK YK. Menganalisis data: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Alat reagen / bahan / analisis yang disumbangkan: YHS. Tulis kertas: JJ SKP.