Basal Ganglia Disfungsi Menyumbang kepada Ketidakaktifan Fizikal dalam Obesiti (2016)

Terdapat talian 29 Disember 2016

Papar semua

http://dx.doi.org/10.1016/j.cmet.2016.12.001

Info Terkini

• Obesiti dikaitkan dengan ketidakaktifan fizikal

• Tikus yang obes mempunyai pengikatan D2R yang lebih pendek, yang mungkin menjelaskan ketidakaktifan mereka

• Memulihkan G_i isyarat dalam iMSN menyelamatkan tahap aktiviti fizikal tikus obes

• Tidak aktif secara fizikal adalah lebih banyak akibat daripada sebab kenaikan berat badan

Ringkasan

Obesiti dikaitkan dengan ketidakaktifan fizikal, yang memburukkan lagi kesan kesihatan berat badan. Walau bagaimanapun, mekanisme yang menengahi persatuan ini tidak diketahui. Kami menegaskan bahawa defisit dalam isyarat dopamin menyumbang kepada ketidakaktifan fizikal dalam obesiti. Untuk menyiasat ini, kami mengukur pelbagai aspek isyarat dopamin dalam tikus tanpa lemak dan gemuk. Kami mendapati bahawa reseptor jenis D2 (D2R) mengikat di striatum, tetapi tidak mengikat reseptor jenis D1 atau tahap dopamin, dikurangkan dalam tikus gemuk. Mengeluarkan secara genetik D2Rs dari neuron berkilat sederhana striatal mencukupi untuk mengurangkan aktiviti motor dalam tikus tanpa lemak, sementara memulihkan G_i Isyarat dalam neuron ini meningkatkan aktiviti dalam tikus gemuk. Menghairankan, walaupun tikus dengan D2R yang rendah kurang aktif, mereka tidak lebih terdedah kepada berat badan yang disebabkan oleh diet daripada tikus kawalan. Kami menyimpulkan bahawa defisit dalam isyarat D2R striatal menyumbang kepada ketidakaktifan fizikal dalam obesiti, tetapi ketidakaktifan adalah lebih daripada akibat daripada obesiti.

Abstrak grafik

Pilihan Rajah

kata kunci

obesiti;
dopamin;
aktiviti fizikal;
senaman;
D2;
striatum;
obes;
penurunan berat badan

Pengenalan

Obesiti dikaitkan dengan ketidakaktifan fizikal (Brownson et al., 2005 and Ekkekakis et al., 2016), yang menimbulkan kesan kesihatan negatif diabetes jenis II dan penyakit kardiovaskular (de Rezende et al., 2014 and Sharma et al., 2015). Mekanisme yang mendasari hubungan ini tidak diketahui, fakta yang dicerminkan dalam kurangnya campur tangan yang berkesan untuk mengubah tahap aktiviti fizikal dalam populasi dengan obesiti (Ekkekakis et al., 2016). Menariknya, obesiti telah dikaitkan dengan perubahan dalam isyarat dopamin (DA), yang telah membawa kepada hipotesis disfungsi ganjaran dalam obesiti (Blum et al., 2011, Kenny, 2011 and Volkow dan Bijak, 2005). Walaupun DA striatal sangat dikaitkan dengan keluaran motor, beberapa kajian telah menyiasat bagaimana perubahan dopaminergik akibat diet boleh menyumbang kepada ketidakaktifan fizikal. Kami menghipnotiskan bahawa isyarat DA striatal terganggu dalam obesiti dan ini menyumbang kepada ketidakaktifan fizikal. Memahami punca biologi ketidakaktifan fizikal boleh menyebabkan intervensi berkesan untuk meningkatkan aktiviti, dan dengan itu meningkatkan kesihatan, pada individu yang mempunyai obesiti.

Striatal DA secara kritis terlibat dalam kawalan motor. Ini terbukti dalam gangguan motor seperti penyakit Parkinson, yang dicirikan oleh kematian neuron dopaminergik di bahagian tengah dan mengakibatkan kehilangan DA yang ketat (Hornykiewicz, 2010). Kedua-dua populasi neuron unjuran striatal yang dimodulasi oleh DA dikenali sebagai neuron berkilat sederhana dan tidak langsung (dMSNs dan iMSNs)Alexander dan Crutcher, 1990, DeLong, 1990 and Gerfen et al., 1990). dMSNs menyatakan G_sreseptor D1 (D1R) dan projek ke substantia nigra dan segmen dalaman globus pallidus, sedangkan iMSNs mengekspresikan G_iD2R-dikelilingi dan projek ke segmen luaran globus pallidus (GPe) (Gerfen et al., 1990, Le Moine dan Bloch, 1995 and Levey et al., 1993). Penghapusan genetik D2Rs dari iMSNs, atau rangsangan optogenetik iMSNs, mencukupi untuk mengurangkan pergerakan (Kravitz et al., 2010 and Lemos et al., 2016). Berdasarkan kaitan antara disfungsi D2R dan obesiti, kami mengandaikan bahawa obesiti haiwan telah mengubah output iMSN, menyebabkan ketidakaktifan fizikal.

Di sini, kita mengkaji pelbagai aspek DA yang memberi isyarat pada tikus obes dan diet yang disebabkan oleh diet. Pengikatan D2R dikurangkan dalam tikus gemuk, sedangkan D1R mengikat dan paras ekstraselular DA tidak berubah. Tikus obes juga memperlihatkan gangguan dalam tembakan striatal dan telah mengurangkan pergerakan. Mengeluarkan secara genetik D2Rs dari aktiviti pengurangan iMSN dalam tikus tanpa lemak, sementara memulihkan G_i Isyarat dalam IMSN meningkatkan aktiviti dalam tikus obes. Hasil ini menegaskan bahawa isyarat D2R dalam iMSNs boleh memodulasi aktiviti fizikal dengan sendirinya. Kami kemudian bertanya sama ada tikus dengan isyarat D2R yang rendah lebih terdedah kepada berat badan pada diet tinggi lemak, kerana aktiviti rendah mereka. Untuk melakukan ini, kami memeriksa berat badan yang berkaitan dengan variasi semula jadi dalam mengikat D2R di kalangan tikus, dan juga dalam tikus dengan penghapusan genetik D2R yang striatal. Walaupun tikus dengan tahap rendah D2Rs mempunyai tahap aktiviti fizikal yang rendah, mereka mendapat berat badan pada kadar yang sama seperti tikus dengan D2Rs utuh. Ini menentang hubungan kausal yang kuat antara aktiviti fizikal dan berat badan. Kami menyimpulkan bahawa kecacatan dalam isyarat D2R menyumbang kepada ketidakaktifan fizikal dalam obesiti tetapi ketidakaktifan tidak semestinya membawa kepada penambahan berat badan.

Hasil

Obesiti Diet yang Dihadiri Dihubungkan dengan Kegagalan Fizikal

Tikus jantan C57BL6 / J (3-4 bulan) diberi makan makanan biasa (kurus, n = 8) atau diet tinggi lemak (gemuk, n = 8) selama 18 minggu (Rajah S1A). Bermula pada minggu ke-2 dan berterusan hingga minggu ke-18, tikus gemuk mempunyai berat badan dan jisim lemak yang jauh lebih tinggi daripada tikus tanpa lemak (p <0.0001; Angka 1A dan S1B). Jisim rahang tidak diubah dengan ketara (Rajah S1C). Kami mengukur tahap aktiviti di lapangan terbuka setiap 2 minggu selama 18 minggu (Ethovision; Noldus Information Technologies). Tikus gemuk mempunyai aktiviti yang lebih rendah daripada tikus tanpa lemak bermula pada minggu ke-4 dan berterusan hingga minggu ke-18 (p <0.0001; Angka 1B dan 1C). Pada minggu ke-18, tikus gemuk menghabiskan lebih sedikit masa untuk bergerak (p = 0.005), lebih sedikit pergerakan (p = 0.0003), dan mempunyai kelajuan yang lebih perlahan ketika bergerak (p = 0.0002; Gambar 1D) berbanding tikus tanpa lemak. Penyembuhan dan dandanan tidak diubah dengan ketara (Gambar 1D). Tikus gemuk juga berlari lebih sedikit daripada tikus tanpa lemak ketika diberi akses ke roda kandang di rumah (p = 0.0005; Gambar 1E). Kami menguji sama ada defisit pergerakan dikaitkan dengan peningkatan berat badan dalam kumpulan gemuk. Walaupun berat badan berkait rapat dengan pengambilan kalori diet tinggi lemak (Gambar 1F), ia tidak dikaitkan dengan tahap pergerakan dalam medan terbuka atau dengan tenaga yang dibelanjakan semasa tempoh diet tinggi lemak (Angka 1G dan 1H). Menariknya, korelasi yang sama ini diadakan semasa kita mengkaji pengambilan makanan pada minggu pertama percubaan (Angka 1I-1K), yang menunjukkan tahap pengambilan makanan yang tinggi lemak (tetapi tidak pergerakan atau perbelanjaan tenaga) adalah ramalan kenaikan berat badan kemudian.

Rajah 1.

Diet Lemak Kronik Diet ke Tidak aktif Fizikal

(A) Tikus yang memberi makan diet tinggi lemak lebih daripada tikus diberi makan standard chow bermula pada minggu 2 dan terus ke minggu 18 (F_(18,252) = 62.43, p <0.0001).

(B dan C) (B) Contoh plot plot aktiviti terbuka yang menunjukkan bahawa (C) tikus obes telah mengurangkan aktiviti fizikal berbanding dengan tikus ramping bermula pada minggu 4 dan berterusan hingga minggu 18 (F_(10,140) = 4.83, p <0.0001).

(D) Setelah 18 minggu menjalani diet tinggi lemak, tikus gemuk mengalami penurunan masa yang dihabiskan untuk bergerak (t₍₁₄₎ = 3.32, p = 0.005), penurunan frekuensi pergerakan (t₍₁₄₎ = 4.74, p = 0.0003), dan penurunan kecepatan ketika bergerak (t₍₁₄₎ = 4.69, p = 0.0002) berbanding dengan kawalan ramping. Tikus gemuk juga menunjukkan kecenderungan penurunan pembiakan (p = 0.07).

(E) Apabila diberi akses kepada roda berjalan di kandang rumah, tikus obes mempunyai roda yang kurang berbanding dengan tikus lean (t₍₁₄₎ = 4.55, p = 0.0005).

(F – H) Peningkatan berat badan membentuk korelasi yang signifikan dengan (F) pengambilan tenaga sepanjang percubaan (r = 0.74, p = 0.04), tetapi tidak (G) perbelanjaan tenaga (r = 0.52, p = 0.19) juga (H) kelajuan medan terbuka (r = 0.19, p = 0.65).

(I – K) Peningkatan berat badan membentuk korelasi yang signifikan dengan (I) pengambilan tenaga purata pada minggu pertama (r = 0.88, p = 0.004), tetapi tidak (J) perbelanjaan tenaga (r = −0.19, p = 0.66) , atau (K) kelajuan medan terbuka (r = 0.36, p = 0.38).

Analisis statistik. (A dan C) ANOVA mengulangi langkah dua hala diikuti dengan ujian pasca hoc dengan kadar penemuan palsu Benjamini-Hochberg; (D dan E) ujian t Pelajar yang tidak berpasangan; (F-H) regresi linear; ^*p <0.05, ^**p <0.01, ^***p <0.0001 berbanding tanpa lemak. (I – K) regresi linear; ^***p <0.001 berbanding tikus tanpa lemak.

Pilihan Rajah

Obesiti Telah Dihubungkan dengan Pengurangan Dopamine D2R Binding

Untuk mengenal pasti mekanisme yang tidak aktif dalam fizikal, kami mengukur banyak aspek DA yang memberi isyarat pada tikus yang tidak bersandar dan gemuk. Selaras dengan laporan terdahulu dalam tikus, pengikat reseptor seperti D2R (melalui autoradiography dengan ³H-spiperone, yang selanjutnya disebut pengikatan D2R) lebih rendah pada tikus gemuk berbanding dengan tikus tanpa lemak (p <0.0001; Angka 2A dan 2B), penemuan yang signifikan dalam ketiga-tiga subbahagian striatal (dorsomedial: p = 0.004; dorsolateral: p <0.0001; ventral: p <0.001; Angka S2A dan S2B). Walau bagaimanapun, pengikatan D2R tidak berkaitan dengan lemak badan pada kumpulan kurus atau gemuk (p> 0.55 untuk kedua-duanya; Gambar 2C), mencadangkan bahawa, walaupun penyimpanan D2R dan penyimpanan lemak kedua-duanya diubah oleh diet tinggi lemak kronik, pembolehubah ini mungkin tidak berkaitan dengan satu sama lain.

Rajah 2.

Diet Lemak Tinggi Kerosakan Striatal Dopamine D2R Mengikat

(A) Imej pengikatan D2R striatal seperti diukur melalui ³Autoradiografi H-spiperon.

(B) Pengikatan D2R Striatal telah menurun di obes berbanding tikus lean (t₍₂₅₎ = 5.02, p <0.0001).

(C) Pengikatan Striatal D2R tidak berkorelasi dengan peratusan lemak badan pada kurus (p = 0.95) atau tikus gemuk (p = 0.56).

(D-F) (D) Striatal D1R mengikat (t₍₂₄₎ = 1.31, p = 0.20), (E) jumlah kandungan dopamin (DA; t₍₁₃₎ = 0.85, p = 0.41), dan (F) ketumpatan tirosin hidroksilase (TH) (t₍₁₄₎ = 0.48, p = 0.64) tidak berbeza antara kumpulan diet.

Analisis statistik. Maksud dengan tikus individu; n = 8–19 tikus / kumpulan; Ujian t pelajar (B dan D – F) atau regresi linear (C); ^*p <0.01.

Pilihan Rajah

Kami cuba mengenal pasti mekanisme asas pengurangan obesiti-pengurangan dalam mengikat D2R. Untuk melakukan ini, kami mencari perbezaan dalam Drd2 mRNA (melalui hibridisasi in situ) dan mendapati ia tidak berubah pada ketiga subdivisi striatal (dorsomedial: p = 0.92; dorsolateral: p = 0.90; ventral: p = 0.34; Rajah S2C). Kami melakukan western blot untuk mengukur tahap protein D2R total dan menyatakan tidak ada perubahan pada band 50- atau 70-kDa, yang dianggap mewakili keadaan glikosilasi D2R yang berbeza (kedua-duanya> 0.95, Angka S2D dan S2E) (Johnson dan Kenny, 2010). Akhir sekali, kami menilai penanda disfungsi metabolik pada tikus yang bersisik dan gemuk untuk melihat sama ada mereka mungkin berkaitan dengan pengurangan D2R seperti yang dilaporkan sebelum ini (Dunn et al., 2012). Tikus gemuk mempunyai kolesterol puasa yang lebih tinggi (p <0.0001), leptin (p <0.0001), glukosa (p = 0.0002), insulin (p = 0.001), dan penilaian model homeostatik berasaskan rintangan (HOMA-IR) (p <0.001) , tetapi bukan trigliserida atau asid lemak bebas (Angka S1D-S1J). Walau bagaimanapun, tidak ada faktor yang berkaitan dengan D2R yang mengikat tikus obes (data tidak ditunjukkan).

Mengikat seperti D1R (melalui autoradiography dengan ³H-SCH23390, yang selanjutnya disebut pengikatan D1R) tidak berbeza antara tikus gemuk dan kurus (p = 0.20; Gambar 2D). Tidak ada juga perbezaan dalam kandungan DA striatal, diukur melalui kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) pukulan tisu striatal (p = 0.41; Gambar 2E), atau pelabelan imuno tirosin hidroksilase (p = 0.64; Gambar 2F). Memandangkan pelbagai laporan mengenai perbezaan DA asas dalam tikus obes (Carlin et al., 2013, Davis et al., 2008, Vucetic et al., 2012 and Wang et al., 2014), kami seterusnya meneroka titik ini dengan menggunakan microdialysis fluks tanpa jaring (tikus baru, n = 6 setiap kumpulan). Kami sekali lagi tidak melihat perbezaan DA ekstraselular (p = 0.99) atau salah satu daripada dua metabolitnya, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) (p = 0.85) dan homovanillic acid (HVA) (p = 0.68, Rajah S3), dengan kaedah ini, menunjukkan bahawa obesiti tidak dikaitkan dengan penurunan dalam DA ekstraselular dalam eksperimen ini.

Gerakan Striatal yang Berkaitan Pergerakan Terjejas dalam Tikus Obes

Kami melakukan elektrofisiologi in vivo untuk memeriksa bagaimana pengurangan pengikatan D2R striatal dapat mengubah output neuronal striatal, dan dengan itu menyumbang kepada pengurangan pergerakan. Kami mencatat dari striatum dorsomedial tikus kurus dan gemuk (n = 3 tikus setiap kumpulan, histologi di Gambar 3F). Walaupun tikus gemuk bergerak kurang keseluruhannya, kecepatan pergerakan yang dilakukan tidak berbeza antara kumpulan ini (p = 0.55; Gambar 3A), membolehkan kita membandingkan pergerakan yang berkaitan dengan pergerakan antara tikus kurus dan gemuk. Kadar lonjakan berbilang unit basal tidak berbeza antara tikus kurus dan gemuk (kurus, 2.1 ± 0.4 Hz; gemuk, 2.0 ± 0.7 Hz; p = 0.93). Walau bagaimanapun, kelaziman unit yang diaktifkan pergerakan (Gambar 3B) jauh lebih rendah pada tikus gemuk (p <0.0001; Gambar 3C). Ini tidak bergantung pada definisi statistik kami mengenai unit "diaktifkan pergerakan", kerana kami juga memerhatikan penurunan pergerakan di sekitar tindak balas rata-rata semua unit yang direkodkan pada tikus gemuk berbanding kurus (interaksi oleh ANOVA, p <0.0002; Angka 3D dan 3E). Kami menyimpulkan bahawa jumlah kadar spiking di striatum tidak berbeza, tetapi organisasi pancang di sekitar gerakan terganggu dalam tikus gemuk.

Rajah 3.

Pergerakan Berkaitan Pergerakan di Striatum terganggu dalam Tikus Obes

(A) Pergerakan mempunyai halaju yang sama pada tikus tanpa lemak dan gemuk.

(B) Contoh pergerakan yang diaktifkan dan tidak responsif dalam neuron striatal.

(D) Tembakan berkaitan pergerakan purata semua neuron direkodkan.

(E) Tembakan berkaitan pergerakan adalah jauh lebih rendah berikutan pendedahan diet (diet × interaksi gerakan, F_(1,171) = 14.77, p <0.0002).

(F) Skematik (disesuaikan daripada Franklin dan Paxinos, 1997) menggambarkan penempatan array elektrod pada tikus rakaman kurus dan gemuk (masing-masing n = 3).

Analisis statistik. (C) Ujian tepat Fisher. (D dan E) Dua langkah ANOVA berulang.

Pilihan Rajah

Perencatan Tahap Aktiviti Dipulihkan Output IMSN dalam Tikus Obes

Untuk menguji sama ada mengurangkan output dari iMSNs boleh meningkatkan pergerakan dalam tikus gemuk, kami menggunakan strategi dependen Cre-recombinase (Cre) untuk mengekspresikan perencat G_ireseptor reseptor reseptor kappa opioid diubahsuai secara eksklusif diaktifkan oleh ubat berjenama (KOR-DREADD) dalam iMSNs tikus gemuk (Gambar 4A). Walaupun adenosin 2A-reseptor Cre (A2A-Cre) tetikus telah disahkan sebelum ini dengan imunostaining untuk menunjukkan bahawa ekspresi Cre khusus untuk iMSN striatal (Cui et al., 2013 and Lemos et al., 2016), kami melakukan pengesahan tambahan garis ini dengan hibridisasi in situ pendarfluor berganda. Hampir semua neuron (98.7% ± 0.6% dari 1,301 dikira neuron) menyatakan kedua-duanya Cre and Drd2 mRNA, sedangkan sangat sedikit (1.3% ± 0.6%) menyatakan sama ada Cre or Drd2 mRNA, tetapi tidak kedua-duanya, mengesahkan bahawa garis A2A-Cre dengan setia mensasarkan iMSNs ( Rajah S4).

Rajah 4.

Perencatan-mediated DREADD aktiviti-aktiviti fizikal yang dipulihkan iMSN dalam Tikus Obesiti

(A) Gambar ekspresi KOR-DREADD, dan skema (disesuaikan daripada Franklin dan Paxinos, 1997yang menggambarkan laman suntikan virus semua KOR-DREADD dalam tikus A2A-Cre; kelegapan menunjukkan bilangan tikus yang menyatakan virus di lokasi tertentu.

(B) Tikus obes lebih banyak apabila disuntik dengan SalB berbanding dengan DMSO (t₍₇₎ = 3.056, p = 0.02).

(C-G) Selepas pentadbiran SalB, tikus obes menunjukkan perubahan yang tidak ketara dalam kekerapan pergerakan (C), (D) tempoh pergerakan purata, dan (E) kelajuan pergerakan, berbanding dengan bila ditadbir DMSO. (F) Pentadbiran Sal-B meningkatkan kekerapan pemeliharaan (t₍₇₎ = 3.116, p = 0.02), tetapi (G) tidak banyak mengubah frekuensi dandanan.

(H) Tikus lean bergerak lebih banyak apabila disuntik dengan SalB berbanding DMSO (t₍₉₎ = 3.3, p = 0.01).

(I) SalB tidak mempengaruhi pergerakan pada tikus jenis liar yang tidak menyatakan KOR-DREADD (p = 0.77).

Analisis statistik. (B – I) Ujian t Pelajar Berpasangan; bermaksud dengan tikus individu; n = 6-10 tikus / kumpulan.

Pilihan Rajah

Suntikan agonis KOR-DREADD salvinorin-B (SalB) meningkatkan jarak yang dilalui tikus gemuk yang menyatakan KOR-DREADD (p = 0.02; Gambar 4B). SalB juga meningkatkan kekerapan pemeliharaan (p = 0.02; Gambar 4F) dan menyebabkan trend ke arah peningkatan frekuensi (t₍₇₎ = 1.64, p = 0.12), tetapi bukan tempoh atau kelajuan, pergerakan (Angka 4C – 4E). Suntikan SalB juga meningkatkan pergerakan pada tikus tanpa lemak (p = 0.01; Gambar 4H), tetapi tidak pada tikus jenis liar yang tidak menyatakan KOR-DREADD (p = 0.73; Gambar 4Saya). Kami menyimpulkan bahawa mengurangkan pengeluaran iMSN cukup untuk meningkatkan tahap pergerakan kedua-dua leher dan obesiti haiwan.

Tahap D2R yang rendah Jangan Bawa Haiwan Ke Masa Berat Keuntungan

Akhir sekali, kami meneliti sama ada terdapat perbezaan yang sedia ada dalam isyarat D2R mungkin menimbulkan tikus individu kepada obesiti yang disebabkan oleh diet. Untuk menangani soalan ini, kami melakukan tomografi emisi mikro-positron (mikro-PET) dengan ¹⁸F-fallypride untuk menentukan ketersediaan D2R asas sebelum pendedahan diet tinggi lemak (Gambar 5A). Kami mendapati tahap variasi yang tinggi dalam potensi mengikat D2R di kalangan tikus, seperti yang ditunjukkan oleh orang lain (Constantinescu et al., 2011). Perbezaan individu dalam ketersediaan D2R berkorelasi positif dengan pergerakan di lapangan terbuka (p = 0.045; Gambar 5B), selaras dengan peranan D2R dalam pergerakan. Setelah melakukan imbasan mikro-PET, haiwan menjalani diet tinggi lemak selama 18 minggu, untuk menguji apakah tikus dengan D2R rendah akan lebih rentan terhadap kenaikan berat badan yang disebabkan oleh diet. Anehnya, kami menjumpai arah ke arah a positif hubungan antara ketersediaan D2R awal dan kenaikan berat badan sepanjang eksperimen ini (p = 0.10; Gambar 5C). Walaupun korelasi ini tidak signifikan, ia berhujah terhadap hipotesis bahawa ketersediaan D2R yang rendah atau ketidakaktifan fizikal yang rendah menjadikan haiwan lebih terdedah kepada kenaikan berat badan. Ini juga konsisten dengan penemuan kami yang bukan aktiviti terbuka bidang basal, atau aktiviti terbuka di seluruh eksperimen, dikaitkan dengan kenaikan berat badan (Angka 1F-1K).

Rajah 5.

Pengikatan Basikal D2R Tidak Memprediksi Keuntungan Berat Masa Depan

(A) Contoh lengkung ketersediaan mikro-PET D2R di striatum dan cerebellum menggunakan ¹⁸F-fallypride.

(B dan C) (B) Potensi pengikatan berkorelasi dengan pergerakan lapangan terbuka basal (r = 0.56, p = 0.045), dan (C) cenderung ke arah hubungan positif dengan kenaikan berat badan yang disebabkan oleh diet tinggi lemak (r = 0.50, p = 0.10, n = 12–14 tikus).

(D) Perwakilan D2R autoradiography pada tikus dengan D2Rs utuh (atas) dan iMSN-Drd2-KO tikus (bawah).

(E dan F) (E) iMSN-Drd2-KO tikus telah menurunkan aktiviti fizikal dalam medan terbuka (t₍₈₎ = 2.99, p = 0.02) dan (F) pada roda lari kandang rumah (p = 0.01, n = 5-19 tikus / kumpulan).

(G) iMSN-Drd2-KO tikus dan Drd2- Kawalan sampah yang dikelilingi mendapat jumlah berat badan yang sama pada diet tinggi lemak (F_(5,70) = 1.417, p = 0.23; n = 6-10 tikus / kumpulan).

(H – J) (H) Tidak ada perbezaan yang signifikan dalam pengambilan tenaga yang dinormalisasi (p = 0.60), (I) perbelanjaan tenaga (p = 0.47), atau (J) RER (p = 0.17) antara iMSN-D2R-KO kawalan tikus dan littermate.

Analisis statistik. (B dan C) Regresi linear; (E, F, dan H-J) ujian t Pelajar yang tidak berpasangan; (G) langkah berulang dua langkah ANOVA, ^*p <0.05.

Pilihan Rajah

Untuk meneroka hubungan antara perbezaan yang sedia ada dalam tahap aktiviti dan penambahan berat badan, kami mengambil kesempatan daripada model tetikus genetik dengan pemadaman yang disasarkan Drd2 gen dari iMSNs (iMSN-Drd2-KO) tetapi mengekalkan ungkapan dalam jenis sel lain ( Dobbs et al., 2016 and Lemos et al., 2016). Seperti yang dilaporkan sebelum ini, iMSN-Drd2-KO tikus bergerak kurang daripada kawalan littermate di medan terbuka (p = 0.02; Gambar 5E) dan pada roda sangkar rumah yang berjalan (p = 0.01; Gambar 5F). Selaras dengan eksperimen di atas, iMSN-Drd2-KO tikus tidak mendapat berat badan lebih banyak daripada kawalan littermate mereka ketika menjalani diet tinggi lemak (p = 0.23; Gambar 5G). Untuk mengkaji penggunaan tenaga mereka dengan lebih teliti, kami melakukan eksperimen kalorimetri tidak langsung untuk membandingkan iMSN-Drd2-KO tikus untuk mengawal sampah. Kami tidak mengesan perbezaan ketara dalam pengambilan tenaga (p = 0.60), perbelanjaan tenaga (p = 0.47), atau nisbah pertukaran pernafasan (RER) (nisbah CO₂ pengeluaran kepada O₂ penggunaan [VCO₂/ VO₂], p = 0.17) antara tikus iMSN-Drd2-KO dan kawalan littermate mereka, menunjukkan bahawa pengurangan pergerakan tikus IMSN-Drd2-KO tidak diterjemahkan ke dalam perubahan penggunaan tenaga (Angka 5H-5J). Akhir sekali, kami meneroka sejauh mana pengurangan yang lebih kecil dalam stroke D2R (seperti yang diperhatikan dalam tikus obesiti kita) boleh mengawal pergerakan dan kenaikan berat badan. Untuk melakukan ini, kami menggunakan garis tetikus yang menyebabkan penurunan 30% -40 dalam striatal Drd2 mRNA (iMSN-Drd2-Het) ( Lemos et al., 2016). Tikus-tikus ini juga memperlihatkan pergerakan yang berkurang, menunjukkan bahawa pengurangan sebahagian D2R cukup untuk menghasilkan kekurangan motor (p = 0.04; Rajah S5A). Sama seperti tikus iMSN-Drd2-KO, tikus iMSN-Drd2-het tidak lebih rentan terhadap kenaikan berat badan yang disebabkan oleh diet tinggi lemak (p = 0.89; Rajah S5B). Kami menyimpulkan bahawa perubahan dalam D2R striatal cukup untuk mengubah pergerakan, tetapi tidak seimbang keseimbangan atau berat badan pada tikus.

Perbincangan

Obesiti dikaitkan dengan ketidakaktifan fizikal, yang sering dipercayai menyumbang kepada peningkatan berat badan. Di samping itu, peningkatan adipositas adalah hipotesis untuk menyumbang kepada tahap aktiviti rendah pada orang yang mempunyai obesiti (Ekkekakis dan Lind, 2006 and Westerterp, 1999), walaupun idea ini sukar untuk diuji secara langsung. Menariknya, orang yang menurunkan berat badan sama ada melalui diet (de Boer et al., 1986, de Groot et al., 1989, Martin et al., 2007 and Redman et al., 2009) atau pembedahan bariatric (Berglind et al., 2015, Berglind et al., 2016, Bond et al., 2010 and Ramirez-Marrero et al., 2014) tidak meningkatkan tahap aktiviti mereka, dengan menentang berat adipositas yang menyebabkan ketidakaktifan mereka. Di sini, kita menyiasat hipotesis bahawa obesiti yang disebabkan oleh diet menyebabkan ketidakaktifan fizikal melalui defisit dalam transmisi DA striatal. Selaras dengan kerja terdahulu, kami mendapati bahawa diet tinggi lemak kronik menurunkan pengikatan D2R yang striatal (Hajnal et al., 2008, Huang et al., 2006, Narayanaswami et al., 2013, van de Giessen et al., 2012 and van de Giessen et al., 2013). Kami juga memerhatikan defisit dalam penembakan yang berkaitan dengan motor neuron striatal di tikus gemuk. Menghalang iMSNs dengan G_i- DREADD dikendalikan aktiviti diselamatkan di tikus gemuk, menunjukkan bahawa tikus dengan adipositas yang berlebihan dapat bergerak normal apabila output ganglia basal dipulihkan. Walau bagaimanapun, menghairankan, tiada ukuran pengukuran D2R atau aktiviti fizikal yang dikaitkan dengan kenaikan berat badan, satu titik yang kita perhatikan dalam pelbagai eksperimen. Ini adalah berbeza dengan kajian pada tikus, yang mungkin mencerminkan spesies atau perbezaan percobaan (Michaelides et al., 2012). Kami menyimpulkan bahawa pengurangan D2Rs dan ketidakaktifan fizikal seterusnya adalah akibat obesiti, tetapi tidak semestinya dikaitkan dengan peningkatan berat badan pada tikus.

Hubungan antara isyarat D2R dan obesiti yang diubahsuai pertama kali dikenal pasti pada manusia dan pada mulanya direplikasi oleh orang lain (de Weijer et al., 2011, Kessler et al., 2014, Volkow et al., 2008 and Wang et al., 2001). Bagaimanapun, kerja yang lebih baru telah menimbulkan persoalan ini (Caravaggio et al., 2015, Cosgrove et al., 2015, Dunn et al., 2012, Guo et al., 2014, Karlsson et al., 2015, Karlsson et al., 2016, Steele et al., 2010 and Tuominen et al., 2015). Walaupun penyelidikan tambahan diperlukan untuk memahami percanggahan yang diperhatikan di kalangan kajian klinikal, mereka mungkin mencerminkan kompleksiti yang wujud dalam kajian klinikal dan pengimejan PET. Sebagai contoh, raclopride, ligan radio yang digunakan dalam banyak kajian, boleh digantikan oleh DA endogen, dan oleh itu mengikat boleh dipengaruhi oleh perbezaan dalam nada DA basal (Horstmann et al., 2015). Di samping itu, hubungan antara tahap D2R dan obesiti mungkin tidak linear, oleh itu perubahan D2Rs boleh berlaku secara berbeza pada pesakit dengan tahap obesiti yang berlainanHorstmann et al., 2015). Akhir sekali, faktor-faktor seperti tempoh tidur (Wiers et al., 2016) dan pengambilan kafein (Volkow et al., 2015) juga boleh menjejaskan D2R mengikat, dan tidak dilaporkan atau dikawal dalam kebanyakan kajian klinikal. Sumber-sumber varians ini boleh dikurangkan dalam kajian haiwan, yang cat gambar yang konsisten pengurangan dalam mRNA D2R (Mathes et al., 2010 and Zhang et al., 2015), protein (Adams et al., 2015 and Johnson dan Kenny, 2010), dan reseptor mengikat (Hajnal et al., 2008, Huang et al., 2006, Narayanaswami et al., 2013, van de Giessen et al., 2012 and van de Giessen et al., 2013) dalam tikus gemuk. Kerja kami membentangkan kesusasteraan tubuh ini dengan melaporkan bahawa aspek lain dari isyarat DA tetap tidak berubah dalam tikus gemuk, bahkan mereka yang mengalami pengurangan D2Rs. Di samping itu, dengan pengurangan D2R pengurangan kami ³H-spiperone, tetapi tiada perubahan dalam jumlah protein D2R atau Drd2 mRNA, kami percaya bahawa perubahan kepada D2R mungkin melibatkan perubahan selepas translasi seperti internalisasi reseptor. Walaupun data kami menunjukkan bahawa mengikat pengurangan D2R cukup untuk mengurangkan aktiviti fizikal dalam obesiti, aktiviti fizikal dipengaruhi oleh banyak faktor termasuk genetik dan persekitaran ( Bauman et al., 2012). Kami percaya bahawa D2Rs adalah satu-satunya perubahan neurologi yang berkaitan dengan ketidakaktifan fizikal dalam obesiti. Sebagai contoh, perubahan hormon yang beredar seperti ghrelin, leptin, dan insulin bertindak pada neuron dopaminergik dan mungkin mempengaruhi aktiviti (Murray et al., 2014). Akhir sekali, walaupun kita tidak melihat perubahan dalam D1Rs, kita tidak boleh menolak perubahan dalam neuron menembak neuron laluan langsung yang mungkin juga mempengaruhi aktiviti fizikal.

Tidak jelas sama ada variasi dalam ketersediaan D2R menjejaskan individu untuk mendapatkan berat badan. Manusia dengan Drd2 Alel Taq1A telah mengurangkan ketersediaan D2R dan peningkatan risiko obesiti ( Blum et al., 1996, Carpenter et al., 2013, Noble et al., 1991, Stice et al., 2008 and Thompson et al., 1997). Di samping itu, tikus dengan pemadaman global D2R lebih mudah mendapat berat badan pada diet tinggi lemak, yang disebabkan oleh ketidakaktifan fizikal (Beeler et al., 2015). Sebaliknya, variasi individu (secara semula jadi atau genetik yang diinduksi) dalam D2R striatal dikaitkan dengan tahap aktiviti dalam kajian kami, tetapi tidak dikaitkan dengan kenaikan berat badan. Satu perbezaan penting dalam kajian kami ialah model genetik kami mengeluarkan D2Rs semata-mata dari iMSNs. Di samping itu, pengukuran pengambilan makanan dan perbelanjaan tenaga yang teliti menunjukkan bahawa manipulasi D2R pada neuron ini tidak mengubah keseimbangan tenaga. Oleh itu, kajian yang menunjukkan hubungan antara fungsi D2R global dan keseimbangan tenaga mungkin memerhatikan kesan D2Rs pada jenis sel lain. Eksperimen kami menyokong kesimpulan bahawa ketidakaktifan fizikal adalah akibat obesiti tetapi dengan sendirinya tidak mencukupi untuk menyebabkan perubahan dalam berat badan.

Walaupun bukti yang semakin meningkat bahawa aktiviti fizikal dikaitkan dengan peningkatan dalam kesihatan kardiovaskular dan menurunkan risiko untuk beberapa penyakit kronik yang lain, aktiviti fizikal masih rendah pada individu dengan obesiti (Ekkekakis et al., 2016). Kekurangan intervensi yang berkesan untuk meningkatkan tahap aktiviti fizikal ditunjukkan dalam kekurangan pemahaman tentang mekanisme selular dan molekul yang mendasari ketidakaktifan fizikal pada individu yang mempunyai obesiti. Di sini, kita mengaitkan ketidakaktifan fizikal kepada perubahan dalam fungsi ganglia basal, memberikan penjelasan biologi untuk kekurangan aktiviti fizikal pada individu yang mempunyai obesiti.

Prosedur Eksperimen

Subjek dan Diet

Dalam semua kajian, tikus ditempatkan secara individu dalam keadaan standard (kitaran cahaya / gelap 12 jam, 21–22 ° C), dengan akses bebas makanan dan air. Tikus diberi diet chow standard (5001 Rodent Diet; 3.00 kcal / g dengan 29% tenaga yang berasal dari protein, 13% dari lemak, dan 56% dari karbohidrat; LabDiet) atau diet tinggi lemak (D12492; 5.24 kcal / g dengan 20% tenaga berasal dari protein, 60% dari lemak, dan 20% dari karbohidrat; Penyelidikan Diet). Semua prosedur dilakukan sesuai dengan pedoman dari Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institut Nasional tentang Diabetes dan Pencernaan dan Penyakit Ginjal.

Pertempuran bersyarat transgenik iMSN-Drd2-Tikus KO dihasilkan oleh tikus melintang yang menyatakan Cre didorong oleh unsur-unsur pengawalseliaan gen reseptor adenosin 2A (Adora2a) (B6.FVB (Cg) -Tg (Adora2a-Cre) KG139Gsat / Mmucd; GENSAT; 036158-UCD) dengan tikus yang membawa bersyarat Drd2 null alleles B6.129S4 (FVB) -Drd2^{tm1.1Mrub / J}, JAX020631 (Bello et al., 2011).

Komposisi Badan dan Pengiraan Perbelanjaan Tenaga

Komposisi badan diukur setiap minggu menggunakan ¹Spektroskopi H-NMR (EchoMRI-100H; Sistem Perubatan Echo). Perbelanjaan tenaga ditentukan menggunakan pengiraan keseimbangan tenagaGuo et al., 2009 and Ravussin et al., 2013):

Energyexpenditure = Metabolizableenergyintake- (Δfatmass + Δfat-freemass).

Hidupkan MathJax

Aktiviti Terbuka Medan

Ujian lapangan terbuka dilakukan di kandang PhenoTyper (30 × 30 cm; Noldus IT), dan perisian analisis video EthoVision (Versi 11; Noldus IT) digunakan untuk mengesan tikus sepanjang ujian.

Home Cage Wheel Running

Lari roda diukur dengan meletakkan roda berjalan tanpa wayar berprofil rendah (Med Associates) ke dalam kandang tikus selama 72 jam setiap 3 minggu (eksperimen obesiti disebabkan diet) atau berterusan (iMSN-Drd2-KO eksperimen).

Langkah-langkah Darah

Darah darah vena daripada haiwan yang dikorbankan digunakan untuk analisis metabolit dan hormon serum selepas puasa 4-hr.

Dopamine Receptor Autoradiography

Hemiseksi kanan dikuroseksi pada tahap striata (−0.22, 0.14, 0.62, dan 1.18 mm dari bregma, meliputi keseluruhan striatum) menjadi bahagian 12 mm. Slaid dicairkan dan diinkubasi dalam buffer assay (20 mM HEPES, 154 mM NaCl, dan 0.1% albumin serum sapi [BSA]; pH 7.4) selama 20 minit pada suhu 37 ° C. Pengikatan D1R dinilai dengan memasukkan slaid dalam buffer assay yang mengandungi 1.5 nM tritium berlabel SCH-23390 (Perkin-Elmer) dan ketanserin 100 nM selama 60 min pada suhu 37 ° C. Pengikatan D2R dinilai dengan menginkubkan slaid dengan spiperone berlabel tritium 600 pM (Perkin-Elmer) dan ketanserin 100 nM selama 100 minit pada suhu 37 ° C. Setelah diinkubasi dengan radioligand yang sesuai, slaid dicuci dua kali selama 10 min pada suhu 4 ° C dalam buffer basuh (10 mM Tris-HCl, 154 mM NaCl), dan kemudian dicelupkan ke dalam air (0 ° C) dan dibiarkan kering semalaman. Slaid kemudiannya terdedah kepada plat pencitraan fosfor selama 7 (pengikatan D1R) atau 11 hari (pengikatan D2R) dan dikembangkan menggunakan fosfimimager (Cyclone; Perkin-Elmer). Untuk analisis, bidang minat digariskan dan dianalisis menggunakan perisian analisis imej Optiquant (Perkin-Elmer).

Blotting Barat

Blots Barat diinkubkan dengan antibodi anti-D2DR tetikus (1: 500; Santa Cruz; sc-5303) atau antibodi anti-GAPDH tetikus (1: 1,000; Santa Cruz; sc-32233) HRP (1: 1,000; Santa Cruz; sc-2005). Isyarat chemiluminescence dihasilkan dengan menggunakan kemiluminescence ditingkatkan reagen pengesan barat (Bio-Rad) dan visualisasi dengan Chemidoc Imaging System (Bio-Rad).

Dalam Situ Hibridisasi

Kit ujian pendarfluor multiplex RNAscope digunakan untuk hibridisasi in situ (Advanced Cell Diagnostics). Secara ringkas, bahagian tetap formalin dikeringkan dalam etanol diikuti dengan pendedahan protease. Bahagian kemudian dihibridisasi dengan probe oligonukleotida RNAscope terhadap Drd2. Mengikut hibridisasi probe, slaid diinkubkan dengan penguat isyarat mengikut protokol RNAscope. Slaid kemudian dibasuh dengan penampan basuh RNAscope. Akhirnya, slaid telah dipasang dengan counterstain DAPI.

Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi dengan Pengesanan Elektrokimia

Hemiseksi kiri diproses untuk mengesan DA menggunakan kromatografi cecair prestasi tinggi terbalik fasa dengan pengesanan elektrokimia (HPLC-EC), seperti yang dinyatakan sebelumnya (Kilpatrick et al., 1986).

Tyrosine Hydroxylase Immunohistochemistry

Bahagian yang dipasang pada slaid diperbaiki dalam formalin buffer neutral 10%, dibilas dalam 0.1 M TBS (pH 7.5) dan diinkubasi dalam larutan antibodi primer yang mengandungi 3% serum keldai normal, 0.3% Triton X-100, dan antibodi hidroksilase anti-tirosin arnab (1: 1,000; Millipore; MAB152) semalam pada suhu 23 ° C. Keesokan harinya, bahagian tisu dibilas dalam TBS dan diinkubasi dalam larutan antibodi sekunder yang mengandungi 3% serum keldai normal, 0.3% Triton X-100, dan kambing anti-arnab yang disambungkan ke Alexa Fluor 555 (Millipore; AQ132F). Untuk setiap tetikus, dua bahagian striatal dianalisis, kecuali empat tikus (dua HFD, dua Chow) di mana hanya satu bahagian yang dianalisis kerana kualiti tisu atau gambar yang buruk.

Micro-PET

Tikus disuntik dengan ¹⁸F-fallypride dengan aktiviti tertentu 2.5 ± 0.34 mCi / nmol dalam isipadu 130 μL melalui urat ekor semasa berada di bawah anestesia isofluran. Imbasan mikro-PET dilakukan selama 2 jam, di mana 25 bingkai diperoleh untuk dianalisis. Keluk aktiviti masa untuk ¹⁸F-figurpride di kawasan minat (ROI) telah diekstrak menggunakan perisian AFNI (https://afni.nimh.nih.gov/afni) dan parameter kinetik sesuai dengan model empat petak menggunakan skrip MATLAB tersuai (dengan cerebellum yang digunakan sebagai tisu rujukan) untuk menentukan potensi mengikat D2RLammertsma dan Hume, 1996).

Dalam Elektrofisiologi Vivo

Rakaman dibuat dari susunan elektrod yang mengandungi 32 wayar mikro tungsten bersalut Teflon (diameter 35 mm) yang ditanam secara sepihak dalam striatum dorsomedial (anterior / posterior [A / P]: +0.8; medial / lateral [M / L]: +1.5 ; dorsal / ventral [D / V]: −2.6 mm per bregma), dan diproses dengan perisian komersial (Offline Sorter and Neuroexplorer; Plexon).

Suntikan Vektor Vein Stereotoksik

Tikus diberi bius secara ringkas melalui pendedahan isofluran. Setelah dibius secara mendalam, satu sayatan dibuat di sepanjang garis tengah, tengkorak terdedah, dan kraniotomi dua hala dibuat (A / P: +0.5; M / L: ± 1.5 mm per bregma). Vektor virus yang mengandungi KOR-DREADD penghambat (Syn-DIO-hKORD-IRES-mCit-WPRE; 0.5 μL) disuntikkan secara dua hala ke dalam striatum dorsomedial (D / V, −2.8 mm dari bahagian atas tengkorak) dan dibiarkan mengekspresikan untuk 9 minggu sebelum percubaan.

Analisis Mikrodialisis dan Dopamine Fluks Tidak Bersih

Pengukuran DA ekstraselular basal, DOPAC, dan HVA pada striatum dorsal tikus dilakukan dengan pendekatan mikrodialisis fluks tanpa jaring. Probe 2-mm unilateral (potongan membran 18-kDa) ditanam secara stereotaksis 1 minggu selepas implantasi kanula dengan penyerapan berterusan cecair serebrospinal buatan (aCSF) pada 1 μL / min selama 4 jam sebelum pengumpulan sampel (lihat Prosedur Eksperimen Tambahan). Percubaan fluks tanpa jaring untuk mengukur tahap DA ekstraselular dilakukan dengan secara rawak menyempurnakan enam kepekatan DA yang berbeza (0, 2.5, 5, 10, 20, dan 40 nM) dalam aCSF melalui probe dialisis. Setiap kepekatan DA disempurnakan selama 30 minit, dan kemudian 2 × 10-minit sampel dikumpulkan dalam 2.5 μL HCl 100 mM ditambah 1 mM EDTA untuk mencegah degradasi catecholamine dan dibekukan pada suhu −80 ° C. Untuk analisis neurochemical, digunakan sistem HPLC isokratik yang digabungkan dengan pengesanan amperometrik (HPLC-EC; BASi LC-4C). Hanya tikus dengan penempatan probe yang betul dimasukkan dalam analisis (Rajah S3E).

Statistik

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan GraphPad Prism (Versi 6.07; Perisian GraphPad). Kecuali dinyatakan, ujian t Pelajar dua ekor digunakan. Jika tidak, ujian t berpasangan dua ekor, ANOVA pengukuran berulang satu arah atau ANOVA pengulangan dua arah digunakan apabila sesuai dan seperti yang dinyatakan. ANOVA diikuti dengan ujian t untuk perbandingan post hoc. Hasil dianggap penting pada alpha p <0.05, atau dengan alpha ditentukan oleh pembetulan kadar penemuan palsu (FDR) Bejamini-Hochberg, jika sesuai.

Sumbangan Pengarang

DMF, KD, TJO, MS, AK, IPSGRVAA, MR, KDH dan AVK, merancang eksperimen tersebut. DMF, KD, TJO, MS, dan AVK, melakukan dan menganalisis eksperimen tingkah laku. IP melakukan eksperimen western blotting. DMF, dan AVK melakukan dan menganalisis data elektrofisiologi in vivo. DMF, J.-SL, JG, dan AVK melakukan dan menganalisis eksperimen mikro-PET. DMF, KD, TJO, dan AVK menulis naskah tersebut. Semua pengarang membincangkan hasil dan memberi komen mengenai manuskrip tersebut.

Penghargaan

Kerja ini disokong oleh Program Penyelidikan Intramural NIH, Institut Kebangsaan Diabetes dan Pencernaan dan Penyakit Ginjal (NIDDK). Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Core Metabolism Mouse di NIDDK untuk menilai metabolit dan hormon serum, Andres Buonanno dengan bantuannya dalam merancang eksperimen microdialysis dopamin, dan Dr. Judith Walters, Dr. Kristin Dupre, dan Dr. Claire Delaville untuk bantuan HPLC analisis kandungan tisu dopamin. Kami juga ingin mengucapkan terima kasih kepada Dr. Scott Young untuk menggunakan peralatan makmal dan bantuannya dengan kajian mengikat. Terima kasih juga kepada ahli-ahli makmal AVK, Marc Reitman, dan Nick Ryba untuk input pada reka bentuk eksperimen dan membaca dengan teliti manuskrip.

Maklumat Tambahan

Dokumen S1. Prosedur Eksperimen dan Angka Tambahan S1-S5.

Bantu dengan fail PDF

Pilihan

Dokumen S2. Artikel ditambah dengan Maklumat Tambahan.

Bantu dengan fail PDF

Pilihan

Rujukan

Adams et al., 2015
WK Adams, JL Sussman, S. Kaur, AM D'souza, TJ Kieffer, CA Winstanley
Pengambilan kalori jangka panjang, diet tinggi lemak dalam tikus mengurangkan kawalan impuls dan reseptor D2 striatal ventral signaling-dua penanda kelemahan kecanduan
Eur. J. Neurosci., 42 (2015), ms 3095-3104
CrossRef

Pautan Pantas