Reseptor Dopamine D2 dalam disfungsi ganjaran seperti ketagihan dan makan kompulsif dalam tikus gemuk (2010)

Ulasan: Kajian ini menunjukkan bahawa apabila seekor haiwan diberi akses tanpa had, penguat semula jadi yang kuat (makanan yang sangat merangsang) dapat menyebabkan penurunan reseptor D2. Penurunan ini dapat dilihat pada hampir semua tikus, dan berlaku dengan cepat. Ketika makanan “sangat enak” dikeluarkan, tikus tersebut menolak makan makanan yang normal. Tikus-tikus itu terus bergegas (ketika mereka bisa) walaupun memasangkan kejutan elektrik dengan penggunaan makanan yang "sangat enak".

• Kajian Penuh

Nat Neurosci. 2010 Mei; 13(5): 635-641. Diterbitkan dalam talian 2010 Mac 28. doi:  10.1038 / nn.2519

Abstrak

Kami mendapati bahawa perkembangan obesiti disertai dengan kemunculan defisit yang semakin memburuk dalam respon ganjaran saraf. Perubahan yang sama dalam ganjaran homeostasis yang diakibatkan oleh kokain atau heroin dianggap sangat penting dalam memicu peralihan dari pengambilan dadah yang biasa dan biasa. Oleh yang demikian, kami mengesan tingkah laku makan yang kompulsif seperti obesiti tetapi bukan tikus tanpa lemak, diukur sebagai penggunaan makanan yang sihat yang tahan terhadap gangguan oleh rangsangan udara yang rancak. Penyakit dopamin D2 striatal (D2Rs) telah dikurangkan dalam tikus gemuk, seperti yang telah dilaporkan kepada manusia yang kecanduan dadah. Lebih-lebih lagi, pengetatan D2R yang dikawal oleh lentivirus dengan cepat mempercepatkan perkembangan defisit ganjaran seperti ketagihan dan permulaan makanan seperti yang kompulsif yang mencari tikus dengan akses yang diperluaskan kepada makanan tinggi lemak yang enak. Data-data ini menunjukkan bahawa pengambilan makanan yang lebih lazat mencetuskan tindak balas neuroadaptif seperti kecanduan di dalam litar ganjaran otak dan memacu perkembangan makanan kompulsif. Oleh itu, mekanisme hedonik yang biasa mungkin mendasari ketagihan obesiti dan dadah.

Pengenalan

Memberi makan dipengaruhi oleh keseronokan dan ganjaran, dan memperoleh ganjaran makanan dapat mendorong penggunaan secara kuat1, 2. Namun demikian, mekanisme hedonik yang menyumbang kepada kegemukan tetap kurang difahami. Pada manusia hiperfagik dengan kekurangan leptin kongenital, aktiviti di striatum punggung dan ventral, yang merupakan komponen teras litar ganjaran otak meningkat dengan ketara sebagai tindak balas kepada gambar makanan3, dan terapi penggantian leptin mengurangkan aktiviti striatal dan 'suka' makanan yang dilaporkan sendiri3 . Ini menunjukkan bahawa striatum penting dalam aspek hedonik dari tingkah laku makan. Baru-baru ini ditunjukkan bahawa pengaktifan striatum sebagai tindak balas terhadap makanan yang sangat enak adalah tumpul pada individu yang gemuk jika dibandingkan dengan kawalan tanpa lemak4. Lebih-lebih lagi, hipofungsi striatum dorsal dan kenaikan berat badan jangka panjang paling ketara pada individu yang mempunyai alel TaqIA dari lokus gen DRD2-ANKK1, yang mengakibatkan penurunan ekspresi D2R striatal dan terbukti dapat mempengaruhi individu terhadap gangguan ketergantungan bahan4, 5 Ini dan pemerhatian yang serupa telah menyebabkan cadangan bahawa kekurangan dalam pemprosesan ganjaran mungkin merupakan faktor risiko penting untuk perkembangan obesiti, dan bahawa individu yang gemuk boleh secara konsumsi mengambil makanan yang sedap untuk mengimbangi hiposensitiviti ganjaran6. Terutama, tidak jelas apakah defisit dalam pemprosesan ganjaran bersifat konstitutif dan mendahului kegemukan, atau apakah pengambilan makanan yang sedap boleh menyebabkan disfungsi ganjaran dan dengan itu menyumbang kepada kegemukan yang disebabkan oleh diet.

Ciri khas individu berlebihan berat badan dan gemuk adalah bahawa mereka terus makan berlebihan walaupun kesihatan negatif dan akibat sosial yang diketahui. Sesungguhnya, ramai orang yang berlebihan berat badan menyatakan hasrat untuk mengehadkan penggunaan makanan mereka, namun berjuang untuk mengawal pengambilan mereka dan berulang kali mengambil alih keperluan tenaga mereka7, 8. Perkembangan tingkah laku makan yang tidak sensitif kepada hasil negatif adalah sama dengan tingkah laku pengambilan dadah kompulsif yang dilihat dalam penagih dadah manusia, yang juga tidak menimbulkan kesan negatif9. Di sini kita menyelidiki kesan akses yang diperluaskan kepada pemakanan lemak tinggi pada sensitiviti sistem ganjaran otak dalam tikus. Kami juga mengkaji hubungan antara disregulasi hedonik yang disebabkan diet dan kemunculan pencarian makanan yang kompulsif. Akhir sekali, kami menyiasat peranan untuk D2R yang tegas dalam tindak balas tindak balas seperti ketagihan.

Defisit ganjaran seperti ketagihan dalam tikus gemuk

Untuk menguji kesan akses terhad atau dilanjutkan ke diet tinggi lemak yang enak, kami menyiapkan tikus Wistar jantan (300−350 g) dengan elektrod rangsangan bipolar pada hipotalamus lateral dan melatihnya selama 10-14 hari dalam percubaan diskrit Prosedur ganjaran otak semasa-ambang (BSR) sehingga tahap ganjaran stabil ditetapkan4. Dalam prosedur BSR, tikus bertindak balas dengan kuat untuk mendapatkan rangsangan diri elektrik yang memuaskan melalui elektrod rangsangan yang tinggal, dengan intensiti rangsangan minimum yang mengekalkan tingkah laku rangsangan diri yang disebut ambang ganjaran10. Kerana ambang ganjaran tetap stabil dan tidak berubah dalam jangka masa yang panjang dalam keadaan asas, prosedur ini memberikan ukuran sensitif terhadap respons sistem ganjaran otak. Setelah menetapkan ambang BSR yang stabil (ditakrifkan sebagai <10% variasi ambang pada tiga sesi berturut-turut), kami mengalihkan tikus kepada tiga kumpulan yang tidak menunjukkan perbezaan dalam berat badan rata-rata atau ambang ganjaran antara kumpulan. Ketiga-tiga kumpulan diberi akses berbeza ke diet 'gaya kafetaria' yang terdiri daripada makanan padat tenaga yang mudah didapati untuk penggunaan manusia (lihat Kaedah Dalam Talian). Tikus mempunyai 0 jam (tikus chow sahaja; n = 9), 1 jam (tikus akses terhad; n = 11), atau 18-23 jam (tikus akses diperpanjang; n = 11) akses ke diet setiap hari untuk 40 hari berturut-turut. Diet kafeteria diketahui menyebabkan kegemukan yang disebabkan oleh diet pada tikus11. Semua tikus juga mempunyai akses bebas ke makmal standard, dengan had ganjaran, kenaikan berat badan dan pengambilan kalori sepanjang masa.

Berat meningkat dengan ketara pada tikus dengan akses yang diperluaskan ke diet kafeteria berbanding dengan kumpulan chow-only atau terhad-akses (Rajah 1a). Berat juga cenderung meningkat dalam tikus akses terhad berbanding dengan tikus chow-only sahaja, tetapi kesan ini tidak mencapai maksud statistik. Perkembangan obesiti dalam tikus akses diperluas dikaitkan rapat dengan defisit yang semakin buruk dalam fungsi ganjaran otak, yang ditunjukkan dalam ambang BSR yang semakin tinggi (Rajah 1b). Kerana tiada perbezaan dalam latensi tindak balas untuk BSR diperhatikan di antara ketiga-tiga kumpulan (Supplementary Fig 1), defisit dalam prestasi tingkah laku tidak dapat menjelaskan pemerhatian ini. Defisit yang sama dalam fungsi ganjaran otak telah dilaporkan dalam tikus dengan akses yang terhad tetapi tidak terhad kepada kokain intravena atau pentadbiran sendiri heroin12, 13, 14. Oleh itu, akses yang diperluaskan kepada makanan berkhasiat tinggi boleh menyebabkan defisit seperti ketagihan dalam fungsi ganjaran otak, dianggap sebagai sumber motivasi yang penting yang boleh mendorong makan berlebihan dan menyumbang kepada pembangunan obesiti1, 6.

Rajah 1: Berat badan dan disfungsi ganjaran dalam tikus dengan akses yang diperluaskan ke diet kafeteria.

(a) Berat (± sem) kenaikan berat badan pada tikus chow-only, akses terhad dan akses diperpanjang (interaksi akses × hari: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 berbanding dengan kumpulan chow-only, ujian pos hoc). (b) Perubahan peratusan min (± sem) dari ambang ganjaran awal (akses × masa interaksi: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 berbanding dengan kumpulan chow-only, ujian post hoc).

Apabila kita mengkaji tingkah laku makan secara terperinci (Rajah 2), kami mendapati bahawa jumlah pengambilan kalori setiap hari adalah serupa antara tikus chow-hanya dan tikar akses terhad (Gambarajah 2a, d). Sebaliknya, jumlah pengambilan kalori dalam tikus dengan akses lanjutan hampir dua kali ganda dari tikus akses dan hanya tikus chow-larangan (Rajah 2a, d). Walaupun tikus akses terhad dan hanya chow mengekalkan kira-kira pengambilan kalori harian yang sama (Rajah 2a, d), tikus akses terhad yang hanya diperoleh ~ 33% daripada kalori harian mereka dari chow (Rajah 2b, d), yang menunjukkan bahawa mereka telah membangunkan tingkah laku makan yang gila dan menggunakan ~ 66% daripada pengambilan kalori harian mereka semasa sesi akses 1 mereka ke diet kafeteria15 (Rajah 2d). Tikus akses diperkembangkan hanya mendapat sedikit pecahan (~ 5%) daripada jumlah pengambilan kalori mereka daripada chow (Rajah 2b); mereka menggunakan makanan kafeteria hampir secara eksklusif (Gambarajah 2d). Peralihan keutamaan pemakanan dalam kumpulan terhad dan diperluas juga dicerminkan dengan peningkatan ketara dalam pengambilan lemak berbanding dengan tikus chow sahaja (Gambarajah 2c dan Tambahan 2). Selaras dengan laporan sebelumnya16, terdapat kecenderungan untuk penggunaan diet kafeteria untuk mengurangkan masa dalam tikus akses diperpanjang. Ini mungkin mencerminkan perkembangan toleransi terhadap kesenangan makanan yang disediakan sebagai sebahagian daripada diet kafeteria dari masa ke masa. Walau bagaimanapun, keutamaan untuk diet kafeteria berbanding chow standard kekal tinggi secara konsisten dalam tikus ini (Supplementary Fig 3). Data-data ini menunjukkan bahawa akses yang diperluaskan tetapi tidak terhad kepada diet tinggi lemak yang mantap menyebabkan defisit ganjaran seperti ketagihan, berlebihan dan kehilangan keseimbangan tenaga homeostatik. Sebaliknya, akses terhad kepada makanan yang enak menimbulkan pola penggunaan seperti pesta, tetapi tidak mengganggu keseimbangan tenaga keseimbangan atau fungsi ganjaran otak. Walau bagaimanapun, adalah mungkin bahawa akses terhad kepada diet kafeteria selama lebih dari 40 hari berturut-turut akan mendorong kenaikan berat badan yang signifikan dan gangguan fungsi ganjaran otak.

Rajah 2: Corak penggunaan dalam tikus dengan akses yang diperluaskan ke diet kafeteria.

(a) Purata (± sem) pengambilan kalori harian pada tikus chow-only, akses terhad dan akses diperpanjang (akses: F1,324 = 100.6, P <0.0001; masa: F18,324 = 7.8, P <0.0001; akses × interaksi masa: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 berbanding dengan kumpulan chow-only, ujian post hoc). (b) Minimum pengambilan kalori harian (± sem) dari chow (akses: F2,504 = 349.1, P <0.0001; masa: F18,504 = 5.9, P <0.0001; akses × interaksi masa: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 berbanding dengan kumpulan chow-only, post hoc test). (c) Minimum pengambilan kalori harian (± sem) dari lemak (akses: F2,486 = 118.7, P <0.0001; masa: F18,486 = 8.8, P <0.0001; akses × interaksi masa: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 berbanding dengan kumpulan chow-only, post hoc test). (d) Perbandingan min (± sem) jumlah pengambilan kalori, dan kalori yang dimakan secara eksklusif dari chow, sepanjang tempoh 40 hari akses (akses: F2,54 = 25.0, P <0.0001; sumber kalori: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; akses × interaksi sumber kalori: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 berbanding dengan jumlah kalori dalam kumpulan chow-only, ### P <0.001 berbanding dengan jumlah kalori di kumpulan tikus yang sama, ujian post hoc).

Selepas 40 hari, tikus tidak lagi dibenarkan mengakses makanan yang sedap, tetapi terus mendapat akses secara bebas ke makmal standard chow. Kami menilai ambang ganjaran dan penggunaan chow setiap hari dalam tempoh 'pantang' yang dikuatkuasakan ini. Peningkatan ambang ganjaran berterusan selama sekurang-kurangnya 2 minggu pada tikus akses diperpanjang ketika mereka tidak lagi dapat mengakses makanan yang enak (Gambar 3a). Ini berbeza dengan kekurangan fungsi ganjaran yang agak sementara (~ 48 jam) yang dilaporkan pada tikus yang menjalani pantang dari kokain yang diberikan sendiri13. Terdapat juga penurunan ketara dalam pengambilan kalori (Gambar 3b) dan penurunan secara beransur-ansur dalam berat badan (Gambar 3c) pada tikus akses diperpanjang, dan pada tahap yang lebih rendah pada tikus akses terhad, dalam tempoh pantang ini, selaras dengan laporan terdahulu11, 15. Selepas 14 hari pantang, tikus dibunuh dan penempatan elektrod ditentukan oleh pewarnaan vesel kresil (Gamb. 3d).

Rajah 3: Disfungsi ganjaran berterusan dan hipofagia semasa pantang dalam tikus dengan akses yang diperluaskan ke diet kafeteria.

(a) Perubahan peratusan min dari ambang ganjaran awal (± sem) semasa pantang dari diet tinggi lemak yang sedap (akses: F2,112 = 3.7, P <0.05; masa: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 berbanding dengan kumpulan chow-only, post hoc test). (b) Pengambilan kalori rata-rata (± sem) pada hari terakhir akses ke diet tinggi lemak (asas) dan semasa 14 hari berpantang ketika hanya tersedia makanan biasa (akses: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; masa: F6,168 = 65.6, P <0.0001; akses × interaksi masa: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 berbanding dengan kumpulan chow-only, ujian post hoc). (c) Perubahan berat badan rata-rata (± sem) berbanding dengan berat badan pada hari terakhir akses ke diet tinggi lemak (garis dasar) dan selama 14 hari berpantang ketika hanya tersedia chow standard (akses: F1,126 = 37.2, P <0.0001; masa: F7,126 = 3.1, P <0.01; akses × interaksi masa: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 berbanding dengan kumpulan chow-only, ujian post hoc). (d) Rekonstruksi histologi lokasi elektrod rangsangan BSR di hipotalamus lateral tikus chow-only (segitiga), akses terhad (kotak) dan akses berpanjangan (bulatan).

Striatal D2Rs dalam tikus gemuk: peranan dalam defisit ganjaran

Kami seterusnya menguji hipotesis bahawa pengambilan makanan kafeteria yang berlebihan boleh mengurangkan kepadatan D2R yang menyerang, menyumbang kepada perkembangan hiposensitiviti ganjaran seperti ketagihan. Sekumpulan baru tikus chow-only, akses terhad dan akses diperpanjang dibenarkan masuk ke diet kafetaria sehingga terdapat peningkatan berat badan yang signifikan secara statistik pada tikus akses diperpanjang berbanding dengan kumpulan chow-only (P <0.05 ; Rajah 4a). Ekspresi striatal dari bentuk D70R yang terikat membran glikosilasi (~ 2 kDa) dilaporkan lebih rendah pada tikus akses diperpanjang daripada tikus akses terhad atau chow-only (Gamb. 4b; lihat Kaedah Dalam Talian). Apabila kami membahagi tikus dalam setiap kumpulan akses menjadi dua subkumpulan berdasarkan pembahagian berat badan yang rata-rata (ringan atau berat), kami menjumpai hubungan terbalik yang jelas antara berat badan dan ekspresi D2R striatal (Gamb. 4a, c). Kami tidak mengesan penurunan yang signifikan secara statistik dalam ungkapan tidak matang glikosilasi (~ 39 kDa) dan bentuk sitoplasma glikosilasi antara (~ 51 kDa) bentuk D2R (Gambar Tambahan 4) 17, yang menunjukkan bahawa ekspresi D2R striatal pada tikus akses diperpanjang mungkin dikawal selia melalui mekanisme pasca transkrip.

Rajah 4: Penambahan berat badan berkait rapat dengan tahap D2R striatal.

(a) Tikus Chow-only, akses terhad dan akses diperpanjang dibahagikan kepada dua kumpulan setiap keadaan akses berdasarkan pembahagian berat badan yang rata-rata: ringan (L) atau berat (H). (b) Seluruh kompleks striatal dikumpulkan dari semua tikus dan tahap D2R dalam setiap kumpulan yang diukur dengan western blotting. Jalur D2R yang berkaitan dengan membran diselesaikan pada 70 kDa, dan kawalan pemuatan protein ditunjukkan di bawah (β-aktin, 43 kDa). Imunoblot panjang penuh ditunjukkan dalam Gambar Tambahan 12. (c) Jumlah relatif D2R dalam striatum tikus chow-only, akses terhad dan akses diperpanjang dihitung dengan densitometri (F2,6 = 5.2, P <0.05, utama kesan akses; * P <0.05 dan ** P <0.01 berbanding dengan kumpulan chow-only-L).

Seterusnya, untuk menguji kaitan fungsi pengurangan diet yang disebabkan oleh D2R striatal kepada fungsi ganjaran otak, kami merangka dan mengesahkan vektor lentiviral untuk menyampaikan rambut pendek yang mengganggu RNA (shRNA) untuk menghancurkan D2R (Lenti-D2Rsh; 5 dan Tambahan 5). Ambang ganjaran mula meningkat pada tikus yang dirawat dengan Lenti-D2Rsh hampir serta-merta apabila diberi akses diperluaskan ke diet kafeteria, sedangkan ambang ganjaran tetap tidak berubah dalam tikus akses diperpanjang yang dirawat dengan vektor lentivirus kosong (Lenti-control) dalam tempoh yang relatif singkat akses kepada diet kafeteria (14 d; Rajah 6a). Latensi tindak balas tidak berubah dalam kedua-dua kumpulan tikus, menunjukkan bahawa kesan ini tidak sekunder terhadap defisit dalam prestasi tugas (Tambahan Gambar 6). Ambang ganjaran juga tidak berubah dalam tikus yang dirawat dengan Lenti-D2Rsh atau kawalan Lenti yang mempunyai akses kepada chow hanya dalam tempoh yang sama (Rajah 6b).

Ambang terus kekal tinggi semasa pantang larangan 15 tambahan apabila semua tikus hanya mempunyai akses kepada standard chow (Supplementary Fig 7). Oleh itu, ketegangan D2R yang striatal meningkatkan kerentanan terhadap hiperaktif ganjaran yang disebabkan oleh diet tetapi tidak mengubah aktiviti asas sistem ganjaran otak.

Rajah 5: Pengetatan Lentivirus yang dikuasai oleh Lentivirus ekspresi D2R yang tegang.

(a) Perwakilan grafik kawasan striatal di mana Lenti-D2Rsh diekspresikan secara berlebihan. Lingkaran hijau di hemisfera striatal kiri mewakili lokasi di mana infus virus menjadi sasaran. Pewarnaan hijau di hemisfera striatal kanan adalah pewarnaan imunokimia representatif untuk protein pendarfluor hijau (GFP) dari otak tikus Lenti-D2Rsh. (b) Imunoblot perwakilan penurunan ekspresi D2R dalam striatum tikus Lenti-D2Rsh. Imunoblot panjang penuh ditunjukkan dalam Gambar Tambahan 13. (c) Jumlah relatif D2R dalam striatum tikus Lenti-kontrol dan Lenti-D2Rsh, dikuantifikasi dengan densitometri (* P <0.05 berbanding dengan kumpulan kawalan Lenti, ujian post hoc ). (d) Jangkitan sel glial di striatum oleh vektor Lenti-D2Rsh tidak dikesan. Pewarnaan hijau adalah GFP dari virus; merah adalah protein asid glial fibrillary marker astrocyte (GFAP); inti sel diserlahkan oleh pewarnaan DAPI dengan warna biru. Anak panah putih menunjukkan kawasan gliosis yang terdapat hanya di tempat suntikan virus di striatum dan bukan di tisu-tisu di sekitarnya di mana virus telah menyebar. Walaupun di kawasan ini, tidak ada astrosit yang positif GFP. Anak panah kuning dalam gambar yang diperbesar menyerlahkan astrosit negatif GFP khas yang dikesan. (e) Tahap tinggi jangkitan neuron pada striatum oleh vektor Lenti-D2Rsh. Pewarnaan hijau adalah GFP dari virus; merah adalah penanda nuklear neuron NeuN; inti sel diserlahkan oleh pewarnaan DAPI dengan warna biru. Anak panah kuning pada gambar yang diperbesar menyerlahkan neuron positif GFP dan NeuN-positif di striatum. (f) Gambaran pembesaran yang lebih tinggi dari neuron yang dijangkiti virus (positif GFP) pada striatum tikus Lenti-D2Rsh yang menunjukkan ciri khas morfologi neuron berduri sederhana.

Rajah 6: Pengetuk D2R yang ketat meningkatkan kerentanan untuk menggugurkan disfungsi pada tikus dengan akses yang diperluaskan ke diet kafetaria.

(a) Perubahan peratusan min (± sem) dari ambang ganjaran awal pada tikus Lenti-control dan Lenti-D2Rsh yang telah meluaskan akses ke diet kafeteria selama 14 hari berturut-turut (virus: F1,156 = 5.9, P <0.05; masa: F13,156 = 2.2, P <0.05; interaksi virus × masa: F13,156 = 2.2, P <0.05; #P <0.05, kesan interaksi). (b) Perubahan peratusan min (± sem) dari ambang ganjaran awal pada tikus Lenti-control dan Lenti-D2Rsh yang mempunyai akses chow-only. (c) Purata (± sem) pengambilan kalori tikus selama 14 d chow sahaja atau akses lanjutan (akses: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Berat (± sem) kenaikan berat badan selama 14 d chow sahaja atau akses lanjutan (akses: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, kesan utama akses).

Kami mendapati bahawa pengambilan kalori (Gambarajah 6c) dan berat badan (Rajah 6d) adalah sama dalam kumpulan Lenti-D2Rsh dan kumpulan kawalan yang sepadan dengan syarat-syarat sahaja (Tambahan Figs 8 dan 9). Oleh itu, knockdown D2R striatal tidak mengubah keutamaan untuk diet kafeteria atau jumlah pengambilan kalori apabila makanan enak disediakan secara bebas untuk digunakan.

Makan yang kompulsif dalam tikus obes: peranan untuk D2R yang striatal

Kami seterusnya menguji hipotesis bahawa makan seperti kompulsif mungkin muncul pada tikus dengan akses yang meluas ke diet kafeteria dan bahawa kekurangan dalam isyarat D2R yang menyerang mungkin menyumbang kepada kesan ini. Sekumpulan baru tikus chow-only, akses terhad dan akses diperpanjang dibenarkan masuk ke diet kafeteria selama> 40 hari sehingga kenaikan berat badan yang signifikan secara statistik berlaku pada tikus yang diperpanjang (P <0.05 berbanding tikus chow-only; data tidak ditunjukkan). Ketiga-tiga kumpulan tikus kemudian diizinkan hanya 30 minit setiap hari ke diet kantin selama 5-7 hari di ruang operasi sehingga pengambilan yang stabil dicapai (ditakrifkan sebagai variasi <10% dalam pengambilan harian). Separuh tikus dalam setiap keadaan akses kemudian terkena cahaya (rangsangan terkondisi) yang dipasangkan dengan penyampaian kejutan kaki (kumpulan dihukum), sedangkan tikus yang tersisa di setiap kumpulan terkena cahaya isyarat sekiranya tidak ada kejutan kaki (kumpulan yang tidak dihukum ). Pada hari ujian, kami memeriksa kesan pendedahan cahaya isyarat sahaja terhadap penggunaan makanan yang enak (Gambar 7; lihat Kaedah Dalam Talian). Kami mendapati bahawa pengambilan kalori rata-rata selama sesi basikal 30 minit lebih tinggi pada tikus chow-only dan akses terhad daripada pada tikus akses lanjutan (Gamb. 7a, b). Ini menunjukkan bahawa tikus chow-only dan akses terhad bergantung pada makanan yang enak selama sesi akses selama 30 minit, yang tercermin dalam kenyataan bahawa tikus ini memakan ~ 40-50% daripada pengambilan kalori harian mereka, biasanya ~ 100 kCal, semasa sesi ini (Gamb. 7a, b). Sebaliknya, tikus berkepanjangan nampaknya tahan untuk mengembangkan tingkah laku makan seperti pesta ini, mungkin kerana sejarah mereka tentang akses tanpa had ke makanan yang sedap selama> 40 hari berturut-turut membentuk corak makan yang relatif tidak fleksibel untuk berubah. Pada hari ujian, kami memerhatikan tidak ada kesan statistik yang signifikan terhadap pemutaran cahaya isyarat pada penggunaan makanan pada tikus yang tidak dihukum dari kumpulan akses chow-only, akses terhad atau akses diperpanjang jika dibandingkan dengan pengambilan semasa tempoh awal (Gamb. 7a). Oleh itu, cahaya isyarat sahaja tidak mempunyai kesan motivasi. Pada tikus yang dihukum, cahaya isyarat berpasangan kejutan mengurangkan pengambilan makanan yang enak pada tikus chow-only dan akses terhad. Walau bagaimanapun, lampu isyarat tidak berpengaruh pada pengambilan makanan yang enak pada tikus akses diperpanjang, menunjukkan bahawa penggunaannya tidak sensitif terhadap petunjuk persekitaran yang menjangkakan kesukaran. Pengambilan tenaga asas pada tikus akses diperpanjang lebih rendah daripada kumpulan lain. Walau bagaimanapun, kerana pengambilan chow dalam jangka masa yang sama jauh lebih rendah (Gambar 7d), tidak mungkin ini menunjukkan 'kesan lantai' yang membingungkan penemuan kami. Bersama-sama, data kami menyokong idea bahawa tingkah laku makan seperti kompulsif dapat muncul pada tikus yang dilanjutkan dengan cara yang serupa dengan pengambilan kokain kompulsif yang dilihat pada tikus dengan sejarah akses yang lebih lama ke ubat18.

Rajah 7: Seperti kompulsif merespon makanan yang enak.

(a) Rata-rata (± sem) pengambilan makanan yang sedap di tikus yang belum dijalani selama sesi awal 30 minit dan pada hari ujian ketika tikus terdedah kepada rangsangan berkondisi neutral yang sebelumnya tidak dipasangkan dengan kejutan kaki yang berbahaya (akses: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 berbanding dengan tikus chow-only). (b) Rata-rata (± sem) pengambilan makanan yang enak pada tikus yang dihukum semasa sesi awal 30 minit dan pada hari ujian ketika tikus terdedah kepada rangsangan terkondisi yang sebelumnya dipasangkan dengan kejutan kaki yang berbahaya (akses: F2,21 = 3.9 , P <0.05; petunjuk: F1,21 = 8.6, P <0.01; interaksi akses × petunjuk: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 dibandingkan dengan pengambilan semasa sesi awal, #P <0.05 dibandingkan dengan tikus chow-only). (c) Rata-rata (± sem) pengambilan makanan yang enak selama sesi awal 30 minit dan pada hari ujian pada tikus Lenti-control dan Lenti-D2Rsh yang sebelumnya mempunyai akses chow-only atau diperpanjang ke diet kafetaria (isyarat: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 berbanding dengan pengambilan semasa sesi awal, ujian post hoc). (d) Rata-rata (± sem) penggunaan chow selama sesi baseline 2 minit dan pada hari ujian pada tikus Lenti-control dan Lenti-D1,26Rsh yang sebelumnya hanya mendapat makan atau meluaskan akses ke diet kafeteria (isyarat: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX berbanding dengan pengambilan semasa sesi awal, ujian post hoc).

Akhirnya, kami meneliti kesan rangsangan berpasangan hukuman pada pengambilan makanan pada tikus Lenti-kontrol dan Lenti-D2Rsh yang sebelumnya mempunyai akses hanya untuk makan atau meluaskan akses ke diet kafeteria (tikus dari Gambar 6). Kami mendapati bahawa pengambilan makanan yang enak selama 30 minit sesi asas adalah sama tinggi (~ 40 kCal) di keempat-empat kumpulan (Gamb. 7c). Di samping itu, jumlah penggunaan chow harian (di kandang rumah) adalah serupa antara keempat-empat kumpulan tikus semasa sesi penyaman dan pada hari ujian (Gambar Tambahan 10). Oleh itu, 14 hari sebelum akses ke diet kafetaria tidak mencukupi untuk menyekat tingkah laku makan seperti pesta dengan cara yang serupa dengan yang dilihat pada tikus yang mempunyai akses> 40 hari ke diet kafeteria (Gbr. 7a, b). Rangsangan cahaya petunjuk menghindari gangguan pengambilan makanan yang sedap di tikus Lenti-control dan Lenti-D2Rsh yang sebelumnya hanya mempunyai akses chow (Gamb. 7c). Begitu juga, rangsangan yang dikendalikan secara aversif mengganggu pengambilan makanan yang enak pada tikus kawalan Lenti yang sebelumnya mempunyai akses masuk ke kafeteria selama 14 hari. Sebaliknya, rangsangan terkondisi yang tidak berpengaruh tidak mempengaruhi penggunaan makanan yang enak pada tikus Lenti-D2Rsh yang sebelumnya mempunyai akses masuk ke kafeteria selama 14 hari (Gambar. 7c). Ambang BSR kekal tinggi pada tikus ini apabila dicatatkan 48 jam selepas sesi ujian, sementara ambang batas tetap stabil dan tidak berubah pada tiga kumpulan tikus yang lain

(Tambahan Gambar 11). Untuk mengesahkan bahawa penentangan terhadap penindasan yang disebabkan oleh rangsangan yang berpanjangan terhadap pengambilan makanan yang enak dalam tikus akses Lenti-D2Rsh diperluas tidak sekunder terhadap masalah dalam proses penyesuaian klasik, kami menguji kesan rangsangan udara yang rancak terhadap pengambilan chow standard yang kurang memuaskan dalam semua empat kumpulan tikus. Berbeza dengan penggunaan makanan yang enak seperti pesta, kami mendapati bahawa keempat-empat kumpulan tikus menggunakan sedikit chow (~ 2 kCal) semasa sesi asas min 30 (Rajah 7d) dan pengambilan chow terganggu dalam semua empat kumpulan oleh magnitud yang sama apabila terdedah kepada rangsangan udara yang rawan (Gambar 7d). Data-data ini menunjukkan bahawa kejatuhan D2R yang tegas mempercepat kemunculan makanan seperti makanan yang kompulsif, tetapi hanya dengan tikus dengan sejarah akses yang diperluaskan. Lebih-lebih lagi, kerana makan secara kompulsif hanya dikesan dalam tikus Lenti-D2Rsh yang mempunyai ambang BSR yang tinggi, hypofunction ganjaran yang disebabkan oleh diet mungkin merupakan antecedent yang perlu bagi kemunculan pencarian makanan kompulsif.

Perbincangan

Kemudahan akses kepada makanan berkhasiat tinggi dianggap sebagai faktor risiko alam sekitar yang penting untuk obesiti19. Kami mendapati bahawa akses yang diperluaskan ke diet gaya kafetia yang sangat enak menghasilkan makan berlebihan dan berat badan ditambah dengan peningkatan ambang BSR pada tikus. Kesan ini pada ambang BSR boleh dijelaskan dengan secara beransur-ansur mengurangkan tanggapan litar ganjaran otak, tafsiran selaras dengan hakikat bahawa sekatan makanan dan penurunan berat badan dapat meningkatkan 20, sedangkan overfeeding yang akut dapat menurun secara langsung21, menanggapi BSR dalam tikus. Tinjauan ini menunjukkan lanjutan kerja menunjukkan bahawa terlalu banyak makan tikus melalui tiub makan intragastricXXUM, dan penyusutan gastrik atau infusi glukagon intravena yang meniru kesegaran postprandial21, 22, 23, menurunkan tindak balas untuk menggalakkan BSR hipotalamik lateral dan meningkatkan tindak balas seperti keengganan rangsangan24. Kerja terdahulu juga menunjukkan bahawa tikus memaksa berulang kali melalui tiub intragastrik sehingga berat badan mereka telah meningkat sebanyak ~ 25 juga menurunkan kadar tindak balas untuk BSR, kesan yang berterusan sehingga berat badan telah normalized200. Seperti yang ditunjukkan dalam tikus ini, respons dalam kucing untuk BSR hipotalamik lateral dihalang oleh penyusuan sebelumnya kepada satiation23, menunjukkan bahawa interaksi antara fungsi ganjaran otak dan keadaan metabolik dipelihara dan oleh itu mungkin berlaku pada manusia juga. Kemudahan akses dan akibat makan berlebihan diet gaya kafeteria pada manusia dianggap penyumbang alam sekitar penting kepada wabak obesiti semasa di masyarakat Barat26. Data kami menunjukkan bahawa hipofili ganjaran timbul pada tikus yang secara sukarela makan terlalu banyak makanan kafetaria yang sama seperti yang dimakan oleh manusia dan kesan ini menjadi semakin teruk kerana mereka mendapat lebih banyak berat badan. Terutama, semua tikus yang mempunyai tahap ambang ganjaran ≥19% mempunyai elektrod BSR yang terletak dalam ~ 20 μm fornix dorsolaterally. Kepekaan neuron yang berkaitan dengan ganjaran di kawasan ini meningkat dengan sekatan makanan dalam cara yang sensitif terhadap leptin hormon yang ditemui lemak, dan rantau otak ini dianggap sebagai substrat yang penting untuk ganjaran makanan500. Litar otak yang mengawal hedonik makanan oleh itu adalah terhalang oleh isyarat postestive yang meramalkan ketegangan, selaras dengan kajian pencitraan manusia baru-baru ini yang menunjukkan bahawa 27 pencernaan gastrik dan peptida faktor postprandial yang diperolehi YY28-3 (PYY) 36 memodulasi aktiviti kawasan otak terlibat dalam pemprosesan ganjaran. Di samping itu, sistem ganjaran juga dihalang oleh peningkatan berat badan yang berlebihan. Laporan baru-baru ini menunjukkan bahawa leptin yang beredar, pengawal selia tenaga seimbang, boleh menembusi ke dalam tisu otak dan menghalang aktiviti litar ganjaran29, 3, 27, 30.

Kekurangan ganjaran pada tikus yang berlebihan berat badan dapat mencerminkan penurunan balas pada sensitiviti awal rangkaian ganjaran otak untuk menentang rangsangan berlebihan mereka oleh makanan yang enak. Hipofungsi ganjaran yang disebabkan oleh diet seperti ini dapat menyumbang kepada perkembangan kegemukan dengan meningkatkan motivasi untuk makan diet 'obesogenik' dengan pahala tinggi untuk mengelakkan atau mengurangkan keadaan ganjaran negatif ini, 6, 32. Ini mungkin menyumbang kepada hipofagia yang kita amati dalam akses yang dilanjutkan tikus dan pada tahap yang lebih rendah pada tikus akses terhad ketika makanan yang enak ditarik dan hanya chow yang kurang enak yang ada. Senario seperti itu juga selaras dengan data dari kajian pencitraan otak manusia di mana pengaktifan striatum yang tumpul sebagai tindak balas terhadap makanan yang sangat sedap, terutama pada individu dengan polimorfisme genetik yang dianggap dapat menurunkan ekspresi D2R, dikaitkan dengan kenaikan berat badan jangka panjang4. Tidak jelas sama ada hiposensitiviti ganjaran pada individu gemuk dinyatakan sebelum perkembangan obesiti dan hanya berkaitan dengan faktor genetik ('sindrom kekurangan ganjaran') atau sama ada makan berlebihan boleh menyebabkan gangguan dalam proses ganjaran. Data kami menunjukkan bahawa akses yang meluas ke makanan bertenaga tinggi yang sedap dan pemakanan berlebihan yang berlebihan memberi kepekaan dan oleh itu mungkin merupakan mekanisme hedonik penting yang mendorong perkembangan kegemukan. Disfungsi ganjaran yang serupa dengan yang dilaporkan di sini pada tikus gemuk juga dikesan pada tikus dengan riwayat akses berpanjangan kepada kokain intravena atau pemberian diri heroin, tetapi tidak pada mereka yang mempunyai sejarah akses terhad 12, 13, 14. Selain itu, peralihan dari pencarian ubat-ubatan secara kasual hingga kompulsif telah dicadangkan hasil daripada usaha untuk mengurangkan keadaan pahala berkurang yang berterusan yang disebabkan oleh disfungsi ganjaran yang disebabkan oleh ubat ini12, 32, 33. Oleh itu, data kami menunjukkan bahawa kegemukan dan ketagihan dadah mungkin mempunyai mekanisme hedonik yang mendasari.

The downregulation ekspresi D2R striatal adalah tindak balas neuroadaptive yang ketara untuk penggunaan lebih banyak makanan enak. Sesungguhnya pengurangan ketumpatan D2R yang tinggi dilihat dalam individu berat badan4, 34 dan rodents35, 36. Sebaliknya, individu dengan anoreksia nervosa telah meningkatkan D2R37 striatal, dan penurunan berat badan pada individu obes selepas pembedahan bariatric (bypass gastrik) dikaitkan dengan ketumpatan D2R striatal tinggi28. Polimorfisme gen yang dirujuk sebagai alel TaqIA A1 mengakibatkan ketumpatan D2R yang menurun, dan individu yang melindungi alel ini melebihi perwakilan dalam populasi obes4. Alel Taqia juga meningkatkan kerentanan kepada kecanduan alkohol, opioid dan ketagihan perangsang psikomotor38. Pengurangan ketumpatan D2R striatal yang berlaku sama ada melalui faktor genetik konstitutif atau sebagai akibat daripada makan berlebihan boleh menyumbang kepada mekanisme neurobiologi obesiti. Kami mendapati bahawa tahap striatal isoform 70 kDa D2R, yang dianggap mencerminkan D2R yang berkaitan dengan membran, adalah terbalik secara berkait dengan berat badan dalam tikus dari kumpulan-kumpulan sahaja, akses terhad dan kumpulan akses yang diperluas (Rajah 4). Pengetatan ekspresi D2R yang teguh, yang paling menonjol dalam striatum dorsolateral (Rajah 5), menyebabkan ambang BSR meningkat hampir sebaik sahaja pendedahan kepada diet kafeteria. Pengurangan dalam ekspresi D2R yang tegas oleh itu dengan pantas mempercepatkan kemunculan hipofeksi ganjaran pada tikus dengan akses yang diperluaskan kepada makanan yang sangat enak, penemuan yang konsisten dengan data pengimejan otak manusia yang menunjukkan bahawa defisit dalam ketumpatan D2R yang tinggi menyumbang kepada hiperpaun ganjaran pada individu yang gemuk4.

Tiga ciri tikus Lenti-D2Rsh juga perlu diperhatikan. Pertama, walaupun tekanan darah tinggi D2R yang dikombinasikan dengan akses yang diperluaskan kepada diet yang enak menghasilkan peningkatan ambang BSR, tidak ada perbezaan dalam pengambilan kalori atau peningkatan berat badan dalam tikus ini berbanding dengan tikus kawalan. Ini mungkin mencerminkan fakta bahawa tikus hanya mempunyai akses 14 untuk diet kafeteria; tempoh akses yang lebih lama mungkin mengakibatkan kenaikan berat badan yang lebih tinggi dari masa ke masa, sama dengan kecenderungan yang lebih tinggi terhadap peningkatan berat badan yang dilihat pada manusia dengan defisit dalam isyarat D2R striatal4. Walau bagaimanapun, kelebihan mengehadkan akses ke diet kafeteria hanya untuk 14 d adalah bahawa tikus knockdown dengan akses yang diperluaskan adalah satu-satunya kumpulan untuk menunjukkan ambang BSR yang tinggi, dan ini membenarkan kami untuk menilai potensi peranan hipofili ganjaran dalam pembangunan kompulsif makan (lihat di bawah). Kedua, ambang BSR kekal stabil dan tidak berubah dalam tikus tikus yang mempunyai akses kepada chow sahaja. Ini menunjukkan bahawa ekspresi D2R yang berkurangan sahaja tidak mencukupi untuk mendorong hiposensitiviti ganjaran; Sebaliknya, ia seolah-olah berinteraksi dengan pengambilan makanan yang enak untuk mempercepat kemunculan keadaan kepekaan ganjaran yang kurang. Tanggapan penyesuaian lain dalam litar ganjaran otak mungkin akan menyebabkan hiposensitiviti ganjaran pada tikus dengan akses yang diperluaskan ke diet kafetaria. Dengan ini, kita perhatikan bahawa bromocriptine agonist D2R mengurangkan tahap sirkulasi leptin39, dan leptin menghalang makan sekurang-kurangnya sebahagiannya dengan menghalang kawasan-kawasan yang striatal yang mengawal tindak balas hedonik terhadap makanan3, 30, 31. Oleh itu, adalah mungkin bahawa downregulation D2R striatal sebagai tindak balas kepada peningkatan berat badan meningkatkan leptin isyarat dan dengan itu meningkatkan kesan menghalang adipokine ini pada sistem ganjaran otak. Akhirnya, kami perhatikan bahawa kami menyasarkan vektor lentivirus kami ke arah stesen dorsolateral. Hal ini terutama untuk sebab-sebab teknikal, sebagai penempatan lateral kannula untuk penyebaran virus ke striatum membolehkan kita juga menampung elektroda merangsang hipotalamik dalam penentuan ambang BSR. Oleh itu, kemungkinan penargetan D2Rs untuk kejatuhan di kawasan lain di striatum, terutamanya kawasan dorsomedial dan ventral (nukleus accumbens teras dan shell), mungkin mempunyai ambang BSR yang tinggi walaupun tanpa diet yang enak.

Striatum dorsolateral sangat terlibat dalam pembelajaran jenis kebiasaan rangsangan-tindak balas, seperti yang tercermin dalam perkembangan tingkah laku yang tidak sensitif terhadap penurunan dengan memberi makan sebelum kenyang atau berpasangan dengan rangsangan berbahaya40. Dengan menyasarkan terutama striatum dorsolateral, kita mungkin telah merobohkan populasi D2R yang mengatur kerentanan tikus terhadap perkembangan makan seperti kompulsif. Sesuai dengan peranan untuk D2R striatal dalam tingkah laku kompulsif, alel TaqIA dari gen gen DRD2-ANKK1 manusia-yang menghasilkan kepadatan D2R striatal rendah5, mengaktifkan aktivasi striatal sebagai tindak balas terhadap makanan yang enak4 dan meningkatkan kerentanan terhadap kegemukan4-juga dikaitkan dengan defisit dalam pembelajaran untuk mengelakkan tindakan dengan akibat negatif41. Kehilangan kawalan perencatan terhadap tingkah laku yang dapat memberikan hasil negatif adalah ciri khas dari kegemukan dan ketagihan dadah, di mana tingkah laku konsekuen berterusan walaupun terdapat akibat sosial, kesihatan atau kewangan yang negatif. Tingkah laku pengambilan kokain pada tikus dengan riwayat pengambilan ubat yang meluas dapat menjadi tidak fleksibel dan tahan terhadap gangguan oleh rangsangan yang tidak disukai yang meramalkan hasil negatif (kejutan kaki) 18. Begitu juga, tikus yang sebelumnya memiliki akses ke diet tinggi lemak yang enak akan menghabiskan lebih banyak waktu di persekitaran yang tidak menyenangkan (cahaya terang) untuk mendapatkan makanan yang enak daripada tikus yang tidak mempunyai pengalaman dengan diet42. Kami mendapati bahawa pengambilan makanan yang enak pada tikus dengan akses yang berpanjangan ke diet kafetaria juga tidak sensitif terhadap rangsangan yang tidak disukai. Selaras dengan peranan untuk D2R striatal dalam keadaan ini, makan seperti kompulsif dijumpai pada tikus knockdown D2R yang sebelumnya mempunyai akses masuk ke kafeteria selama 14 hari tetapi tidak dalam kumpulan kawalan. Dari perspektif neurocircuitry, akses yang meluas ke makanan yang enak dapat memicu keplastikan pada jalur kortikostriatal, sehingga menjadikan haiwan lebih rentan terhadap perkembangan tingkah laku seperti kompulsif, dengan defisit pada isyarat D2R striatal yang meningkatkan proses ini. Sesungguhnya, ketumpatan D2R striatal yang berkurang pada individu yang gemuk berkorelasi dengan penurunan metabolisme di kawasan kortikal prefrontal dan orbitofrontal43 yang memberikan kawalan perilaku terhadap perilaku44.

Terutama, penggunaan makanan sedap yang kompulsif dikesan hanya pada tikus luka yang sebelum ini telah memanjangkan akses ke diet kafeteria, bukan pada tikus kawalan yang telah memanjangkan akses ke diet kafeteria untuk tempoh masa yang sama, atau pada tikus knockdown yang telah akses sahaja. Perbezaan utama antara tikus tikus dengan akses lanjutan terdahulu dan kepada kumpulan lain adalah ambang BSR yang berterusan. Ini mungkin mencerminkan asal-usul neurobiologi yang lazim dari hiperpaun ganjaran dan kemunculan makan seperti yang kompulsif, yang fenomena secara sementara bersempadan namun bebas. Secara alternatif, hypofunction ganjaran diet mungkin berfungsi sebagai substrat untuk tetulang negatif yang memudahkan perkembangan makan seperti kompulsif14, 32, 33. Walau apa pun mekanisme yang mendasari, penemuan kami menunjukkan bahawa ketagihan seperti yang bertindak balas terhadap makanan yang enak dapat muncul dalam tikus gemuk, dan menunjukkan bahawa defisit dalam penekanan D2R striatal meningkatkan kelemahan terhadap perkembangan tingkah laku ini.

Ringkasnya, kami mendapati bahawa terlalu banyak rangsangan sistem ganjaran otak melalui penggunaan makanan yang padat dan enak yang berlebihan menyebabkan keadaan hiposensitiviti ganjaran dan perkembangan makan seperti yang kompulsif. Tindak balas tingkah laku maladaptive dalam tikus gemuk mungkin timbul daripada defisit yang disebabkan oleh makanan dalam isyarat D2R yang tegas. Pengambilan ubat penyalahgunaan lebih banyak juga menurunkan ketumpatan D2R yang ketat, mendorong keadaan hipofili ganjaran dan mencetuskan kemunculan perilaku pengambilan dadah seperti kompulsif. Oleh itu, penemuan kami menyokong kerja-kerja sebelumnya4, 19, 42, 45, 46, 47 dalam menunjukkan bahawa ketagihan obesiti dan ketagihan dadah mungkin timbul daripada tindak balas neuroadaptive yang serupa dalam litar ganjaran otak.

Kaedah

Tikus.

Tikus Wistar lelaki dengan berat 300-350 g pada permulaan eksperimen diperoleh dari Charles River. Apabila ketibaan, tikus ditempatkan secara berasingan pada suhu malar pada kitaran cahaya 12-h (cahaya pada 2200 h). Tikus telah dibenarkan akses libitum iklan ke chow laboratorium standard dan air untuk tempoh eksperimen. Semua prosedur telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Scripps Florida, dan tikus telah dirawat mengikut garis panduan yang ditetapkan oleh Institut Kesihatan Nasional mengenai prinsip penjagaan haiwan.

Prosedur pembedahan.

Tikus yang disiapkan dengan elektrod yang merangsang BSR mula-mula dibiakkan melalui penyedutan 1-3% isoflurane dalam oksigen dan diposisikan dalam kerangka stereotaxic (Kopf). Elektrods Bipolar BSR (11 mm panjang) ditanamkan ke dalam hipothalamus lateral (anteroposterior), -0.5 mm dari bregma, mediolateral, ± 1.7 mm dari garis tengah; dorsoventral, 8.3 mm dari dura; bar incisor diselaraskan ke 5 mm di atas garis interaural ) 47. Tikus yang menerima suntikan virus juga disediakan dengan panduan dua hala cannulae (tolok 23, 14 mm panjang) diletakkan di atas striatum (anteroposterior, 2.8 mm dari bregma; mediolateral, ± 3.1 mm dari garis tengah; dorsoventral, -2.4 mm dari dura) 48 dan diisi dengan stoket 14-mm. Empat skru skull keluli tahan karat dan akrilik pergigian memegang elektrod dan cannula di tempatnya. Luka pembedahan telah dirawat dengan antibiotik topikal sekali setiap 12 h untuk 5 d selepas pembedahan. Tikus dibenarkan 7-10 d untuk pulih dari pembedahan dan kemudian dilatih dalam prosedur ambang BSR.

Prosedur BSR.

Tikus telah dilatih untuk bertindak balas terhadap rangsangan BSR mengikut prosedur pembendungan arus-diskrit yang sama seperti yang diterangkan di tempat lain10, 14. Secara ringkasnya, aras BSR semasa berubah-ubah dalam siri menurun dan menaik dalam langkah-langkah 5-μA. Dalam setiap sesi ujian, empat siri menurun / naik menaik telah dibentangkan. Ambang bagi setiap siri ditakrifkan sebagai titik tengah antara dua intensiti semasa berturut-turut di mana tikus bertindak balas dalam sekurang-kurangnya tiga daripada lima percubaan, dan dua intensiti semasa yang berturut-turut di mana tikus tidak bertindak balas dalam tiga atau lebih daripada lima percubaan. Ambang keseluruhan sesi itu ditakrifkan sebagai min ambang untuk empat siri individu. Setiap sesi ujian adalah lebih kurang 30 min dalam tempoh. Ambang BSR yang stabil ditentukan sebagai ≤10% variasi dalam ambang selama 5 berturut-turut hari, biasanya ditubuhkan selepas latihan 10-14 d. Latensi tindak balas untuk setiap sesi ujian ditakrifkan sebagai latensi tindak balas min bagi semua percubaan di mana tindak balas positif berlaku.

Pembungkusan dan penghantaran virus.

RNA jepit rambut pendek disampaikan dan dinyatakan secara konstitutif menggunakan sistem vektor pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). Zarah virus disusun mengikut protokol pengeluar. Secara ringkas, sel HEK 293FT dipindahkan dengan vektor yang mengandungi sisipan shRNA (5′-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-3 ′) atau vektor kosong, ditambah medium ViraPower selepas campuran (h) Supernatan kemudian dikumpulkan dan dipusatkan dengan ultrasentrifugasi (72g, Beckman Coulter SW 24 TI rotor., 76,755 min, 32 ° C) dan titer virus ditentukan oleh penyortiran sel yang diaktifkan pendarfluor mengikut arahan pengeluar. Virus diasingkan dan disimpan dalam kotak yang dilindungi cahaya pada suhu −90 ° C sehingga digunakan.

Tikus dengan ambang BSR yang stabil menerima suntikan virus dua hala di tiga tapak di striatum setiap hemisfera otak (2 μl per suntikan, 1 μl min-1, 1 min antara suntikan, sebanyak enam suntikan setiap tikus). Tikus dibenarkan sekurang-kurangnya pemulihan 2-3 dari suntikan intrastriatal sebelum penilaian ambang BSR diteruskan. Pemeriksaan ambang BSR harian berterusan untuk 33 d selepas suntikan virus untuk memastikan tahap ketinggian D2R yang paling hebat dicapai sebelum membenarkan akses tikus ke diet kafeteria. Tiada perbezaan dalam ambang BSR antara tikus kawalan Lenti dan Lenti-D2Rsh semasa 33 d (data tidak ditunjukkan).

Immunoblotting.

Tikus telah dibunuh kira-kira 1 h selepas akses mereka yang kerap dijadwalkan ke diet kafeteria, dan otak telah dikeluarkan dengan cepat. Ketebalan 1-2 mm disediakan dengan menggunakan matriks otak koronal (selang slit 1-mm; Plastics One) pada blok ais, dan pukulan tisu striatum dorsal (bregma: ~ 2.2 hingga -0.26 mm) telah diambil. Pukulan tisu striatal dikumpulkan dengan cepat, snap beku dan disimpan pada -80 ° C sehingga digunakan. Sampel individu dicairkan pada ais dan jumlah yang sama tisu striatal dikumpulkan atas dasar pemisahan median bergantung kepada kelompok akses (tikus 7-10 per kolam). Tisu telah disegarkan semula di buffer RIPA selang 500 μl (Thermo Scientific) yang mengandungi natrium ortovanadate, penghambat koktel fosfatase 1 dan 2 (Sigma-Aldrich), leupeptin dan pepstatin sebelum homogenisasi. Lysates tisu digoreng untuk min 10 dalam penampan sampel dan dimuatkan ke gel SDS 4% -20% atau 10% Tris-glycine (Invitrogen). Protein dipindahkan ke membran nitroselulosa, disekat untuk 1 h pada ~ 23-25 ° C (susu kering bukan lemak 5% dan 0.2% Tween-20 dalam PBS, pH 7.4), dan diinkubasi dalam antibodi utama semalaman di 4 ° C. Antibodi utama berikut telah dicairkan dalam larutan blok: monoklonal tikus D2R (Santa Cruz, 1: 100) atau monoklonal tetikus β-actin (Santa Cruz, 1: 200). Reagent Chemiluminescent ECL telah ditambahkan selepas pengeraman dengan antibodi menengah peroxidase-conjugated (Amersham, 1: 2,000). D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 yang telah dikaitkan dengan membran yang matang telah dinormalisasikan kepada kawalan pemuatan protein (β-actin; 43 kDa) dan dinitifikasi oleh densitometry menggunakan perisian NIH Image J.

Analisis imunokimia.

Tikus telah dibiakkan dan transcardially diperam dengan 4% paraformaldehyde dalam PBS (pH 7.6). Otak telah dikeluarkan, selepas semalaman diikat dan disimpan dalam sukrosa (penyelesaian 30% dalam PBS, pH 7.4) sekurang-kurangnya 72 h. Bahagian-bahagian tisu beku (ketebalan 30 μm) dikumpulkan dari mikrotome dan disekat (3% BSA, 5% normal serum kambing dan 0.3% Triton X-100 dalam PBS) untuk 1 h pada ~ 23-25 ° C. Antibodi utama berikut telah ditambahkan kepada penyelesaian blok dan diinkub dalam sekelip mata di 4 ° C: poliklonal ayam ke GFP (Abcam, 1: 1,000); kelinci monoklonal kepada GFAP (Millipore, 1: 1,000); tetikus monoklonal kepada NeuN (Millipore, 1: 1,000). Bahagian-bahagian yang diinkubasi dengan antibodi menengah fluorescent-dye-conjugated di ~ 23-25 ° C: pewarna anti-ayam-488-nm (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), pewarna anti-arnab- 594-nm (Invitrogen, 1: 1,000 ), dan anti-tikus-594-nm pewarna (Invitrogen, 1: 1000). Seksyen dipasang dengan media pemasangan Vectashield yang mengandungi DAPI (Vektor Labs) dan coverlipped. Imej diambil menggunakan mikroskop pendarfluor Olympus BX61 (Objektif 2 ×) atau mikroskop confocal Olympus (× 10 dan × 100 objektif).

Prosedur pemakanan.

Tikus ditempatkan secara berasingan di atas katil kertas (alfa pad; Kertas Khas Gembala) untuk menghalang produk makanan daripada menjadi kotor dengan bahan katil yang longgar. Diet kantin terdiri daripada bacon, sosej, kek keju, kek pon, frosting dan coklat, yang secara individual ditimbang sebelum disediakan untuk tikus. Makanan makanan kafetaria disampaikan dalam bekas logam kecil. Semua item makanan, termasuk chow makmal standard, ditimbang semula setelah selesai sesi makan. Pengambilan kalori dari pelbagai makronutrien dikira menggunakan maklumat pemakanan yang disediakan oleh pengilang.

Penindasan berasaskan tangkapan tingkah laku makan.

Prosedur pemberian makanan dilakukan di ruang operasi yang dilemahkan bunyi yang sama dimensi dengan yang digunakan dalam eksperimen BSR. Tikus dimasukkan ke dalam ruang operasi dan mempunyai akses ke diet kafeteria atau makan selama 30 minit. Produk makanan dihantar dalam bekas logam kecil. Semua barang makanan ditimbang sebelum dan sesudah sesi makan, yang dilakukan dalam tempoh makan normal tikus. Penggunaan Chow dinilai dengan penggunaan pelet chow 45 mg yang sama komposisi dengan chow yang disediakan di kandang tikus. Tikus kemudian diizinkan akses 30 min sehari ke diet kafeteria sehingga pengambilan yang stabil dicapai (ditakrifkan sebagai variasi <10% dalam pengambilan harian), memerlukan 5-7 hari. Setelah menstabilkan pengambilan makanan yang enak selama tempoh awal ini, tikus dalam setiap keadaan akses diperuntukkan kepada dua kumpulan: dihukum (mereka yang menerima kejutan kaki) dan tidak dihukum (tidak menerima kejutan kaki). Tikus kemudian menjalani empat sesi penyaman pada hari berturut-turut di ruang operasi yang sama di mana mereka sebelumnya mempunyai akses ke makanan yang enak. Semasa sesi penyaman 30 minit, lampu isyarat (rangsangan terkondisi) diaktifkan selama 10 minit, dimatikan selama 10 minit, dan kemudian dihidupkan semula selama 10 minit. Tikus yang dihukum hanya mengalami kejutan pada kaki semasa persembahan cahaya isyarat (0.5 mA selama 1.0 s; 10 rangsangan dengan selang ~ 1-minit). Tikus yang tidak dihukum diberikan cahaya isyarat dengan cara yang sama, tetapi tanpa kejutan pada kaki. Pada hari ujian, sehari selepas sesi pengkondisian terakhir, tikus dalam kumpulan yang dihukum mendapat kejutan kaki sekejap (lima rangsangan secara keseluruhan) dipasangkan dengan pengaktifan lampu isyarat selama 5 minit. Tikus-tikus yang tidak dihukum itu kembali terkena lampu isyarat sekiranya tidak mengalami kejutan pada kaki. Selepas tempoh hukuman 5 minit, semua tikus dibenarkan masuk ke makanan yang enak selama 30 minit dengan rangsangan terkondisi diaktifkan sebentar-sebentar (lampu isyarat 10 minit menyala, lampu isyarat 10 minit mati, lampu isyarat 10 minit menyala).

Analisis statistik.

Amaun ganjaran asas ditakrifkan sebagai nilai ambang purata untuk 5 sebelum akses kepada diet kafeteria untuk setiap subjek. Amaun ganjaran dinyatakan sebagai peratusan perubahan dari nilai ambang asas. Data mengenai peratusan nilai ambang ganjaran asas, berat badan, penggunaan kalori, dan penggunaan kalori dari lemak dianalisis oleh dua faktor, analisa berulang analisis varians, dengan akses (chow sahaja, akses terhad atau akses lanjutan), sumber kalori standard chow atau diet kafeteria), virus (Lenti-control atau Lenti-D2Rsh) dan isyarat (berpasangan atau tidak berpasangan dengan hukuman) sebagai faktor antara subjek dan masa sebagai faktor subjek. Apabila sesuai, kesan utama dalam analisis varians dianalisis dengan lebih lanjut oleh ujian Bonferroni post hoc. Semua analisis statistik telah dilakukan menggunakan perisian GraphPad Prism.

Rujukan

Rujukan

Surat-menyurat kepada:

· Paul J Kenny ([e-mel dilindungi])