Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502-1511.
Diterbitkan dalam talian 2017 Mei 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Abstrak
Tujuan / hipotesis
Berlebihan lemak diet menyebabkan obesiti pada manusia dan tikus. Kajian terbaru mengenai manusia dan tikus telah menunjukkan bahawa ketagihan terhadap lemak berkongsi mekanisme bersama dengan ketagihan terhadap alkohol, nikotin dan narkotik dari segi disfungsi sistem ganjaran otak. Ia telah diketengahkan bahawa diet berlebihan lemak (HFD) menyampaikan dopamin D2 reseptor (D2R) yang memberi isyarat di striatum, pengawal penting sistem ganjaran otak, yang menyebabkan hedonik makan berlebihan. Kami sebelum ini melaporkan bahawa konstituen bioaktif yang berasaskan coklat berasaskan γ-oryzanol melemahkan keutamaan untuk HFD melalui kawalan hipotalamus. Oleh itu, kami meneroka kemungkinan bahawa γ-oryzanol akan memodulasi fungsi sistem ganjaran otak pada tikus.
Kaedah
Tikus C57BL / 6J lelaki yang diberi HFD dirawat secara oral dengan γ-oryzanol, dan tahap molekul striatal yang terlibat dalam isyarat D2R dinilai. Kesan γ-oryzanol pada metilasi DNA D2R promoter dan perubahan seterusnya dalam pilihan untuk lemak diet diperiksa. Di samping itu, kesan 5-aza-2'-deoxycytidine, perencat kuat metiltransferases DNA (DNMTs), keutamaan makanan, isyarat D2R dan tahap DNMT di striatum disiasat. Kesan-kesan penghambatan γ-oryzanol terhadap aktiviti DNMTs dinilai secara enzim secara in vitro.
Hasil
Dalam striatum dari tikus yang diberi makan HFD, pengeluaran D2Rs telah berkurangan melalui peningkatan metilasi DNA kawasan promoter D2R. Pentadbiran mulut γ-oryzanol menurunkan ekspresi dan aktiviti DNMT, dengan itu memulihkan tahap D2Rs di striatum. Perencatan farmakologi DNMT oleh 5-aza-2'-deoxycytidine juga memperbaiki pilihan lemak diet. Selaras dengan penemuan ini, assay in vitro enzimatik menunjukkan bahawa γ-oryzanol menghalang aktiviti DNMTs.
Kesimpulan / tafsiran
Kami menunjukkan bahawa γ-oryzanol meningkatkan hiperetilasi DNA yang diakibatkan oleh HFD di kawasan promoter D2R di striatum tikus. Paradigma eksperimen kami menyoroti γ-oryzanol sebagai bahan antobesan yang menjanjikan dengan sifat tersendiri menjadi modulator epigenetik novel.
Bahan tambahan elektronik
Versi dalam artikel ini (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) mengandungi bahan tambahan yang dikaji semula tetapi tidak disunting, yang tersedia untuk pengguna yang diberi kuasa.
Pengenalan
Berlebihan di kalangan individu obes, sekurang-kurangnya sebahagiannya, mekanisme bersama dengan penagihan alkohol, nikotin dan narkotik [1]. Serta selera makan hipotalamik dan hormon, sistem ganjaran otak, khususnya isyarat penerima dopamin, berkait rapat dengan tingkah laku makan ketagihan atau hedonik [2]. Kajian terdahulu dalam tikus menunjukkan bahawa pengambilan reseptor D2 dopamine striatal (D2R) oleh rambut pendek berintensifkan lentivirus yang mengganggu RNA dengan pantas disebabkan kecacatan ganjaran seperti kecanduan dan pencarian makanan seperti paksaan [3]. Kerana ketumpatan D2R yang dikurangkan, striatum dorsal kurang responsif terhadap ganjaran makanan berbanding dengan kumpulan kawalan leher di kalangan manusia yang gemuk dan tikus [3-5]. Selaras dengan tanggapan ini, TaqAlel IA ANKK1 lokus gen (pengekodan DRD2 / ulangan ankyrin dan domain kinase yang mengandungi 1), yang mengurangkan pengeluaran D2R yang striatal, dikaitkan dengan fenotip obes pada manusia [6], manakala kesan penurunan berat badan selepas pembedahan bariatric dikaitkan dengan ketumpatan D2R striatal tinggi [7]. Data-data ini sangat mencadangkan pentingnya D2R striatal sebagai sasaran terapi baru untuk rawatan obesiti. Walau bagaimanapun, beberapa ubat yang dikembangkan yang bertindak ke atas sistem ganjaran otak menyebabkan kesan buruk yang besar, termasuk masalah psikiatri yang serius, mengakibatkan pengeluaran mereka dari klinik [8].
Pengubahsuaian epigenetik adalah kritikal bukan sahaja untuk pembangunan dan pembezaan, tetapi juga kerana mereka timbul akibat perubahan persekitaran, termasuk dalam diet dan gaya hidup [9]. Metilasi DNA adalah peristiwa epigenetik ketua bagi kestabilan ungkapan gen [9]. Dalam tikus, pendedahan ibu kepada diet tinggi lemak (HFD) secara intergenerationally mengubah metilasi DNA dalam sistem ganjaran pusat dalam keturunan, yang membawa kepada pengambilan lebihan HFD oleh pups [10]. Khususnya, methyltransferases DNA (DNMTs) memainkan peranan kritikal dalam peraturan kedua-dua tingkah laku makan dan aktiviti fizikal [10, 11], mencadangkan bahawa DNMTs boleh menjanjikan sasaran terapeutik untuk terapi sindrom obesiti-diabetes. Yang penting, beberapa bahan yang berasal dari makanan semulajadi, termasuk asid kafein dan epigallocatechin, diketahui bertindak sebagai perencat DNMT [12, 13].
Baru-baru ini, kami menunjukkan bahawa komponen berasaskan biookular, coklat beras γ-oryzanol, campuran ester asid ferum dan beberapa phytosterols, mengatasi keutamaan lemak diet melalui penurunan tekanan retikulum endoplasma (ER) hypothalamic [14]. Dalam tikus dan arnab, secara lisan diberikan γ-oryzanol cepat diserap dari usus dan diedarkan terutama ke otak [15, 16]. Mengambil keputusan ini bersama-sama, produk hasil semula jadi yang bertindak ke atas sistem saraf pusat boleh menjadi alternatif untuk selamat memperbaiki tingkah laku makan terjejas dengan obesiti. Dalam konteks ini, kami menguji hipotesis bahawa γ-oryzanol akan mengubah status metilasi DNA dalam sistem ganjaran otak, yang mengakibatkan pengecilan pilihan untuk HFD pada tikus.
Kaedah
haiwan
Tikus C57BL / 6J lelaki berusia tujuh minggu yang diperoleh dari Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Jepun) ditempatkan (3-4 per kandang) dalam keadaan bebas patogen pada suhu 24 ° C di bawah cahaya 12 jam / 12 jam / kitaran gelap. Setelah seminggu menyesuaikan diri, tikus berusia 8 minggu dipadankan dengan berat dan dibahagikan kepada dua atau tiga kumpulan untuk menjalani setiap eksperimen. Tikus-tikus itu dibenarkan masuk percuma ke makanan dan air. Semua eksperimen haiwan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Eksperimen Haiwan Universiti Ryukyus (No. 5352, 5718 dan 5943).
Pentadbiran γ-oryzanol dan 5-aza-2'-deoxycytidine
Untuk menilai keutamaan untuk HFD, γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Jepun) telah diberikan kepada tikus 8-minggu yang lama dengan gavage semasa ujian pilihan makanan seperti yang dijelaskan sebelum ini [14, 17]. Untuk eksperimen lain, HFD (D12079B; Diet Penyelidikan, New Brunswick, NJ, Amerika Syarikat) yang mengandungi 0.4% γ-oryzanol dihasilkan sebagai pelet. Komponen diet ditunjukkan dalam Jadual Tambahan Bahan Elektronik (ESM) 1. Selepas 12 minggu penyusuan, tisu dikumpulkan dari striatum dan hipotalamus. Pengambilan harian γ-oryzanol, yang dianggarkan dari pengambilan makanan tikus rata-rata, adalah kira-kira 320 μg / g berat badan. Dosis γ-oryzanol ditentukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [14]. 5-aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) disuntik secara intraperitoneal (0.25 μg / g berat badan) tiga kali seminggu selama 12 minggu [18].
Anggaran keutamaan untuk lemak diet
Untuk menilai keutamaan untuk lemak diet, ujian makanan menyediakan pilihan antara chow dan HFD (D12450B dan D12451; Diet Penyelidikan) seperti yang dijelaskan sebelum ini [14]. Komponen diet ditunjukkan dalam Jadual ESM 1. Secara ringkas, tikus diizinkan masuk percuma ke chow dan HFD. Pengambilan chow dan HFD diukur setiap minggu dan dianalisis untuk perubahan pilihan lemak diet. Keutamaan HFD dikira mengikut formula: Keutamaan HFD = [(pengambilan HFD / jumlah pengambilan makanan) × 100].
Penjujukan bisulphite untuk metilasi DNA
DNA disucikan menggunakan DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokyo, Jepun). Larutan DNA dicampurkan dengan NaOH 3 mol / l yang baru disiapkan, diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 15 minit dan ditambahkan ke 5.3 mol / l urea, 1.7 mol / l natrium bisulfit dan 4.9 mmol / l hidrokuinon. Penyelesaiannya dikenakan 15 kitaran denaturasi pada 95 ° C selama 30 s dan inkubasi pada 50 ° C selama 15 minit [19]. DNA yang dirawat bisulphite telah dibersihkan dengan menggunakan Kit Pemurnian PCR MinElute (QIAGEN) dan diperkuat oleh PCR menggunakan KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, Amerika Syarikat) dan primer di sekitar tapak CpG di wilayah promoter D2R . Urutan primer adalah seperti berikut: primer, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; primer terbalik, 5'-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 '. Seterusnya, urutan penyesuai telah ditambah dan dibersihkan menggunakan Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, Amerika Syarikat). Sampel kemudian dikumpulkan dan dimuatkan ke GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Jepun) untuk menyusun mengikut protokol pengeluar. Tahap metilasi dinyatakan sebagai peratusan sitosin metilasi dalam semua residu sitosin.
Pengujian aktiviti DNMT
Pengujian aktiviti enzimatik DNMT dilakukan menggunakan kit Kumpulan Kitaran Kegiatan / Inhibitor Methyltransferase (Epigentek Group, Brooklyn, NY, Amerika Syarikat) dan EPIgeneous Methyltransferase Assay kit (Cisbio Japan, Chiba, Jepun) mengikut protokol pengeluar.
Untuk menilai aktiviti penghambaan setiap sebatian pada metilasi DNA, pembentukan S-adenosyl-l-homocysteine (SAH) diukur dengan adanya setiap sebatian (20 μmol / l untuk pemeriksaan saringan), S-adenosil metionin (SAM; 10 μmol / l) dan substrat DNMT (4 ng / μl) pada suhu 37 ° C selama 90 minit. Untuk menilai kinetik Michaelis-Menten, DNMT1 (20 μmol / l) diinkubasi dengan γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) dan kepekatan poli dI-dC yang ditunjukkan pada suhu 37 ° C selama 90 minit. DNMT3a (100 μmol / l) dan DNMT3b (100 μmol / l) diinkubasi dengan γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) dan kepekatan poli dG · dC yang ditunjukkan pada suhu 37 ° C selama 120 minit. Pengujian dilakukan secara rangkap empat. Protein yang diekstrak (0.75 mg / ml) diinkubasi dengan SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml), dan poli dG · dC (5 μg / ml) pada 40 ° C selama 120 minit, dan Pembentukan SAH diukur.
Reseptor yang berkaitan dengan estrogen-³ aktiviti pengujian
Potensi aktiviti antagonis γ-oryzanol pada reseptor-γ yang berkaitan dengan estrogen (ERRγ) dinilai menggunakan Sistem Analisis Gamma Reporter Reseptor Berkaitan Estrogen Manusia (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) mengikut protokol pengeluar. Secara ringkas, sel-sel pelapor mamalia bukan manusia yang secara eksklusif menyatakan ERRγ aktif terdedah kepada kepekatan yang ditunjukkan dari setiap sebatian selama 24 jam dalam rangkap tiga.
Blotting Barat
Ini dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [20] dengan antibodi terhadap D2R (1: 500, arnab), pengangkut dopamin (DAT; 1: 500, arnab), tirosin hidroksilase (TH; 1: 1000, arnab) (AB5084P, AB1591P dan AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), transduser isyarat dan pengaktif transkripsi 3α (STAT3α; 1: 1000, arnab), DNMT1 (1: 1000, arnab), DNMT3a (1: 1000, arnab) (nombor 8768, 5032 dan 3598; Teknologi Isyarat Sel, Tokyo, Jepun), DNMT3b (1 μg / ml, arnab), ERRγ (1: 1000, arnab) dan β-aktin (1: 10,000, tetikus) (ab16049, ab128930 dan ab6276; Abcam, Cambridge, MA, USA).
PCR masa nyata kuantitatif
Ekspresi gen diperiksa seperti yang dinyatakan sebelum ini [14]. Tahap mRNA telah dinormalisasikan kepada Rn18s (RRNA 18S). Set primer yang digunakan untuk analisis PCR masa nyata kuantitatif diringkaskan dalam Jadual ESM 2.
Analisis statistik
Data dinyatakan sebagai min ± SEM. ANOVA sehala dan ANOVA pengukuran berulang diikuti dengan ujian perbandingan berganda (kaedah Bonferroni – Dunn) digunakan di mana berkenaan. Pelajar t Ujian telah digunakan untuk menganalisis perbezaan antara dua kumpulan. Perbezaan dianggap penting pada p <0.05.
Hasil
Perencatan farmakologi DNMT oleh 5-aza-dC melemahkan keutamaan lemak diet pada tikus
Dalam tikus yang diberi makan HFD, metilasi DNA di kawasan promoter D2R di striatum diperkuat dengan ketara berbanding dengan tikus yang diberi makanan chow (Gamb. â € <(Fig.1a) .1a). Sebaliknya, metilasi DNA hypothalamic di kawasan promoter D2R nampaknya lebih tinggi daripada itu di striatum di bawah diet chow (p <0.01) (Gamb. â € <(Fig. 1a, 1a, f) dan tidak diubah oleh HFD (Gamb. â € <(Fig. 1f) .1f). Dalam tikus yang diberi makan HFD, metilasi DNA bertambah di rantau promoter D2R di striatum dinormalisasi dengan rawatan dengan 5-aza-dC, perencat DNMT yang kuat (Gamb. â € <(Fig.1a) .1a). Sebaliknya, metilasi DNA di kawasan promoter D2R dalam hipotalamus tidak banyak berubah dengan rawatan dengan 5-aza-dC (Gamb. â € <(Fig. 1f) .1f). Dalam striatum tikus jantan berusia 20 minggu yang diberi makan HFD selama 12 minggu, tahap mRNA dan protein D2R menurun dengan ketara (Gambar. â € <(Fig. 1b, 1b, k, l). Sebaliknya, tahap penerima D1 dopamin (D1Rs, dikodkan oleh Drd1), yang bertindak secara bertentangan dengan D2Rs pada isyarat adenylisl dan sinaran intraselular yang dikendalikan oleh CAMP, tidak berubah (Gamb. â € <(Fig. 1c) .1c). Selain itu, tidak ada perubahan pada tahap molekul lain yang berkaitan dengan isyarat D2R, seperti TH dan DAT pada mRNA dan / atau tahap protein (Gamb. â € <(Fig. 1d, 1d, e, k, m). Di sisi lain, tiada perubahan nyata dalam hipotalamus, termasuk untuk D2R (Gamb. â € <(Fig. 1gâ € "m) .1gâ € "m). Ketara, paras protein D2R dan TH dalam hipotalamus jauh lebih rendah daripada yang di striatum (Gamb. â € <(Fig. 1l, 1l, m), mungkin mencerminkan kepentingan relatif penerima isyarat dopamin dalam sistem ganjaran otak berbanding dengan hipotalamus.
Untuk mengkaji sama ada DNA metilation di kawasan promoter D2R akan mengubah keutamaan lemak diet, perilaku makan tikus 5-aza-dC dianalisis. Seperti yang dijangkakan, 5-aza-dC meningkatkan kadar mRNA dan protein untuk D2R dalam striatum tikus yang diberi makan HFD (Gamb. â € <(Fig. 1b, 1b, k, l). Sebaliknya, tiada kesan pada tahap Drd1, Th and Slc6a3 (pengekodan DAT) di striatum, atau di peringkat Drd2, Drd1, Th and Slc6a3 dalam hipotalamus (Gamb. â € <(Fig. 1câ € "e, 1câ € "e, gâ €" m). Sedangkan tikus yang dilayan kenderaan lebih memilih HFD, keutamaan untuk HFD telah berkurang secara signifikan dalam tikus 5-aza-dC (88% daripada nilai untuk tikus yang dirawat kenderaan) (Gamb. â € <(Fig. 1n) .1n). Oleh itu, rawatan dengan 5-aza-dC mengurangkan keuntungan dalam berat badan (Gamb. â € <(Gamb. 11o).
γ-oryzanol menurunkan kadar DNMT dalam striatum tikus yang diberi makan HFD
Seperti yang dilaporkan sebelum ini [14], pentadbiran oral γ-oryzanol kepada tikus lelaki dengan gavage dengan ketara melemahkan keutamaan untuk HFD (93% daripada nilai untuk tikus yang dirawat kenderaan) (Gamb. (Gambarajah 2a), 2a), mengakibatkan pengurangan berat badan yang jelas (Gamb. (Gambarajah 2b) .2b). Oleh itu, kami meneroka potensi kesan γ-oryzanol pada modulasi epigenetik D2Rs di striatum.
Dalam mamalia, terdapat tiga utama DNMTs-DNMT1, 3a dan 3b. Fungsi DNMT1 untuk mengekalkan metilasi DNA, manakala DNMT3a dan 3b memainkan peranan dalam memudahkan metilasi DNA novo [21]. Untuk meneroka potensi kesan γ-oryzanol pada DNMTs dalam vivo, kami menilai tahap DNMT dalam otak tikus HFD yang diberi makan. Walaupun HFD per se tidak memberi kesan pada mRNA dan tahap protein DNMT dalam striatum atau hypothalamus, suplemen dengan γ-oryzanol menurun secara signifikan tahap DNMT dalam striatum tetapi tidak di hipotalamus (Gamb. â € <(Fig. 2câ € "e, 2c-e, g-i, k-n). Data-data ini menimbulkan kemungkinan bahawa γ-oryzanol mungkin mengawal tahap DNMT dalam cara yang spesifik. Dalam cara yang sama, 5-aza-dC menurunkan tahap mRNA DNMT3a dan 3b secara sengaja di striatum (ESM Fig. 1a-d).
Berdasarkan kajian sebelumnya yang menunjukkan bahawa tahap mRNA DNMT1 dikawal secara positif, sekurang-kurangnya sebahagiannya, oleh ERRγ penerima reseptor nuklear [22], kami mengkaji kesan potensi γ-oryzanol pada aktiviti ERRγ. Dalam sel-sel mamalia bukan manusia secara konkrit mengekspresikan ERRγ aktif, 4-hydroxy tamoxifen, agonist terbalik yang kuat ERRγ, aktiviti ERRγ menurun secara nyata. Daripada nota, γ-oryzanol sebahagiannya menurunkan aktiviti ERRγ (kira-kira pengurangan 40% daripada nilai semula jadi) (Gamb. â € <(Fig.3a) .3a). Yang penting, ERRγ sangat dinyatakan dalam striatum tetapi tidak dalam hipotalamus (Gamb. (Gambarajah 3b-d) .3b-d). Berbeza dengan keadaan striatum, γ-oryzanol meningkatkan kadar protein DNMT1 hanya dalam hipotalamus (Gamb. (Gambarajah 2k, 2k, l). Keputusan ini boleh dijelaskan, sekurang-kurangnya sebahagiannya, dengan penemuan kami bahawa STAT3α, pengatur positif tahap DNMT1 [23], telah banyak dinyatakan dalam hipotalamus tetapi tidak di striatum (Gamb. â € <(Gamb. 33e-g).
Untuk menilai lagi kesan γ-oryzanol mengenai aktiviti DNMT dalam vivo, pembentukan SAH, produk sampingan daripada metilasi DNA dan juga penceroboh kuat DNMTs, telah dinilai dalam tikus yang dirawat γ-oryzanol yang diberi makan HFD. Tiada perubahan ketara dalam pembentukan SAH sama ada striatum atau hipotalamus antara tikus HFD dan diberi makan (Rajah. (Gambarajah 2f, 2f, j). Ketahuilah, γ-oryzanol dengan ketara menurunkan pembentukan SAH di striatum (Gamb. (Gambarajah 2f) 2f) tetapi tidak dalam hipotalamus (Gamb. (Gambarajah 2j), 2j), menunjukkan bahawa γ-oryzanol boleh menekan aktiviti DNMT dalam cara spesifik striatum dalam tikus HFD yang diberi makan.
Analisis enzimatik terhadap sifat-sifat penghambatan γ-oryzanol untuk DNMTs in vitro
Kami seterusnya menilai kesan γ-oryzanol mengenai aktiviti DNMTs in vitro. Potensi yang merintangi γ-oryzanol, asid ferulik, 5-aza-dC, haloperidol (antagonis D2R wakil), quinpirole (seorang agonis D2R wakil) dan SAH terhadap DNMTs dinilai. Sebagai kawalan positif, SAH dengan kuat melemahkan aktiviti DNMT dalam cara yang bergantung kepada dos (Gamb. (Gambarajah 4a-f) .4a-f). Seperti yang dijangkakan, haloperidol dan quinpirole tidak memberi kesan ke atas aktiviti-aktiviti DNMTs (ESM Fig. 2). Ketahui, γ-oryzanol dengan ketara menghalang aktiviti DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) dan 3b (penghambatan maksimum 57%) (Gamb. (Gambarajah 4d-f) .4d-f). Sebaliknya, aktiviti penghambatan asid ferul, metabolit γ-oryzanol, jauh lebih rendah daripada γ-oryzanol (Gamb. â € <(Gamb. 44d-f).
Kami selanjutnya menyiasat sifat-sifat penghambatan γ-oryzanol pada DNMTs. Pembentukan SAH diukur untuk menilai aktiviti penghambatan γ-oryzanol pada DNMTs in vitro. Data mengenai pembentukan SAH semasa metilasi DNA yang disandarkan oleh DNMT menunjukkan corak kinetik Michaelis-Menten untuk kedua-dua kehadiran dan ketiadaan γ-oryzanol (Gamb. (Gambarajah 4g-i) .4g-i). Dalam methylation DNA yang diselaraskan DNMT1, analisis Eadie-Hofstee menunjukkan bahawa γ-oryzanol tidak menunjukkan kesan ke atas V maks pembentukan SAH (kenderaan, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), sementara γ-oryzanol nampaknya meningkatkan K m (kenderaan, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Gbr. (Gambarajah 4j) .4j). Keputusan ini menunjukkan bahawa γ-oryzanol menghalang DNMT1 sekurang-kurangnya sebahagiannya dengan cara yang kompetitif. Sebaliknya, untuk DNA metilasi DNMT3- dan 3b, γ-oryzanol berkurangan V maks pembentukan SAH (DNMT3a: kenderaan, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: kenderaan, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) dan, sama, K m untuk tindak balas ini (DNMT3a: kenderaan, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: kenderaan, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Gbr. (Gambarajah 4k, 4k, l). Keputusan ini menunjukkan bahawa γ-oryzanol menghalang DNMT3a dan 3b sekurang-kurangnya sebahagiannya dalam cara yang tidak kompetitif.
γ-oryzanol meningkatkan tahap D2R dalam striatum tikus yang diberi makan HFD
Kami seterusnya menguji kemungkinan bahawa γ-oryzanol akan meningkatkan kandungan D2R yang teguh melalui perencatan DNMTs. Dalam tikus yang diberi makan HFD, pentadbiran oral γ-oryzanol ketara menurunkan metilasi DNA striatal di kawasan promoter D2Rs (Gamb. (Gambarajah 5a), 5a), sedangkan ia tidak melakukan ini dalam hipotalamus (Gamb. â € <(Fig. 5f) .5f). Selaras dengan penemuan ini, kadar mRNA dan protein D2R meningkat secara berturut-turut (Gamb. â € <(Fig. 5b, 5b, g, k, l). Serupa dengan data rawatan dengan 5-aza-dC (Gamb. (Gambarajah 1), 1), tiada kesan jelas pada tahap RNA dan protein Drd1, Th and Slc6a3 (DAT) di striatum, dan tiada kesan pada tahap Drd1, Th and Slc6a3 dalam hipotalamus (Gamb. â € <(Fig. 5câ € "e, 5c-e, h-k, m).
Kajian terdahulu menunjukkan bahawa tahap D2R dan DNMT1 dikawal oleh tekanan ER dan keradangan sekurang-kurangnya sebahagiannya melalui NF-κB [17, 24, 25]. Oleh itu, kita meneliti tahap gen yang berkaitan dengan tekanan dan keradangan ER. Seperti yang ditunjukkan sebelum ini [26], HFD meningkatkan ekspresi gen pengekodan TNF-α (Tnfa), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) (Ccl2), Protein homologus C / EBP (Chop), ER-setempat DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) dan bentuk bersambung X-box mengikat protein 1 (Xbp1s) dalam hipotalamus tetapi tidak di striatum (Gamb. (Gambarajah 6) .6). Terutama, suplemen HFD dengan γ-oryzanol ketara menurunkan ekspresi bertambah Ccl2, Chop, Dnajb9 and Xbp1s secara eksklusif dalam hipotalamus tetapi tidak di striatum (Gamb. â € <(Gamb. 66).
Perbincangan
Temuan utama dalam kajian ini adalah bahawa γ-oryzanol bertindak sebagai perencat DNMT yang kuat di striatum tikus, dengan itu melemahkan, sekurang-kurangnya sebahagiannya, preferensi untuk HFD melalui modulasi epigenetik D2R striatal. Dalam striatum tikus HFD, tahap D2R berkurangan dengan ketara, sedangkan D1R, TH dan DAT tidak berubah (Gamb. (Gambarajah 1b-e, 1b-e, k-m). Data-data ini konsisten dengan tanggapan bahawa disyskulasi D2R striatal memainkan peranan kritikal dalam persepsi ganjaran makanan apabila pada HFD, yang menyebabkan hedonik penggunaan HFD pada hewan gemuk [3]. Dalam kajian ini, rawatan tikus yang diberi makan HFD dengan 5-aza-dC meningkatkan kadar D2R yang tinggi (Gamb. â € <(Fig. 1b, 1b, k, l) mungkin melalui pengurangan tahap metilasi DNA di kawasan promoter D2R (Gamb. (Gambarajah 1a), 1a), dan seterusnya melemahkan keutamaan lemak diet (Gamb. â € <(Fig. 1n) .1n). Dapatan ini juga menyokong peranan penting D2R dalam persepsi ganjaran makanan apabila HFD.
Ujian in vitro kami menunjukkan bahawa aktiviti penghambatan γ-oryzanol terhadap DNMTs nampaknya lebih kuat daripada asid ferulik metabolitnya (Gamb. (Gambarajah 4d-f), 4d-f), mencadangkan kepentingan struktur lengkap γ-oryzanol untuk tindakan menghalangnya terhadap DNMTs. Dalam tikus yang diberi makan HFD, kajian kami menunjukkan bahawa, selepas pentadbiran lisan, γ-oryzanol mencapai otak sebagai struktur lengkap dan menurunkan tahap dan aktiviti DNMT secara sengaja di striatum, dengan pengurangan penurunan metilasi DNA di kawasan promoter D2R di striatum. Selain itu, kajian in vitro kami telah menunjukkan bahawa γ-oryzanol bertindak sebagai antagonis separa terhadap ERRγ, yang terutamanya berfungsi sebagai pengatur positif untuk pengeluaran DNMT1 [22], dan seterusnya menurunkan aktiviti DNMT1 (Gamb. â € <(Fig.3a) .3a). Daripada nota, ERRγ sangat dinyatakan dalam striatum tetapi tidak dalam hipotalamus pada tikus (Gamb. (Gambarajah 3b) .3b). Data-data ini menunjukkan bahawa γ-oryzanol mempunyai potensi untuk mengurangkan tahap mRNA DNMT1, sekurang-kurangnya sebahagiannya melalui perencatan ERRγ. Berbeza dengan striatum, γ-oryzanol tidak memberi kesan pada tahap D2R dalam hipotalamus daripada tikus HFD-fed (Gamb. (Gambarajah 5g, 5g, k, l).
Sebaliknya, kami menunjukkan bahawa γ-oryzanol meningkatkan tahap DNMT1 dalam hipotalamus tetapi tidak di striatum (Gamb. (Gambarajah 2k, 2k, l). Telah ditunjukkan bahawa STAT3 meningkatkan kandungan DNMT1 dalam sel T-limfoma malignan [23]. Terutama, sebelum ini kami menunjukkan bahawa γ-oryzanol meningkat dengan ketara fosforilasi STAT3 yang disebabkan oleh leptin dalam hipotalamus daripada tikus yang diberi makan HFD [14]. Ia juga harus diperhatikan bahawa STAT3α telah dinyatakan secara besar-besaran dalam hipotalamus tetapi tidak di striatum dalam tikus (Gamb. (Gambarajah 3e-g) .3e-g). Data-data ini menggalakkan kita untuk membuat spekulasi bahawa perbezaan yang jelas dalam kesan γ-oryzanol pada tahap DNMT1 antara hipotalamus dan striatum boleh dikaitkan, sekurang-kurangnya sebahagiannya kepada kandungan khusus STAT3α dan ERRγ di otak tikus ( Rajah. (Gambarajah 3b-g) .3b-g). Secara kolektif, nampaknya terdapat corak kebalikan dari ekspresi ERRγ dan STAT3α antara striatum dan hipotalamus pada tikus. Atas dasar keputusan kami, maka adalah wajar untuk membuat spekulasi bahawa di striatum, di mana pengeluaran ERRγ banyak, γ-oryzanol dapat menurunkan tahap mRNA dan aktiviti enzim DNMT1 sebagai pengatur negatif ERRγ. Sebaliknya, dalam hipotalamus, di mana pengeluaran STAT3α adalah dominan, γ-oryzanol mungkin lebih suka meningkatkan tahap DNMT1.
Satu kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa pengurangan isyarat D2R yang disebabkan oleh HFD menyahaktifkan tingkah laku makan [3], mencadangkan pentingnya perencatan DNMT yang striatal untuk rawatan obesiti. Sebaliknya, kajian terdahulu menunjukkan kemungkinan status metilasi DNA gen reseptor 4 melanocortin yang dinyatakan dalam nukleus hypothalamic tertentu boleh memodulasi bentuk transgenerational obesiti dalam tikus kuning agouti yang berdaya maju [27]. Walaupun kajian lanjut diperlukan untuk menjelaskan mekanisme yang mendasari, kajian-kajian ini mencadangkan pentingnya methylation DNA-gen, dan genetik-spesifik dalam patofisiologi obesiti yang disebabkan oleh HFD.
Kami baru-baru ini melaporkan bahawa HFD meningkatkan tahap D2R di pulau pankreas tikus [17, 24]. Ia mungkin bahawa pembesaran semacam itu diantarkan, sekurang-kurangnya sebahagiannya, dengan tekanan ER dan keradangan melalui NF-κB, kerana terdapat beberapa elemen respons NF-κB di kawasan promoter D2R [17, 24]. Tambahan pula, satu kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa TNF-α dan IL-1β meningkatkan tahap dan aktiviti DNMT1 dalam tisu adiposa dari tikus HFD-fed [25]. Yang penting, kajian ini menunjukkan bahawa HFD menginduksi tekanan ER dan keradangan yang lebih disukai dalam hipotalamus tetapi tidak di striatum (Gamb. (Gambarajah 6) .6). Mekanisme mendalam tisu, rantau, dan spesifik tapak metilasi DNA dan demethylation dalam paradigma eksperimen kita mesti menunggu siasatan lanjut.
Bersama dengan laporan sebelumnya yang menunjukkan bahwa γ-oryzanol menyempurnakan preferensi untuk HFD melalui peraturan hipotalamik tekanan ER pada tikus [14], γ-oryzanol juga mewakili harta yang unik untuk mengimbangi kedua-dua disregulasi hedonik dan metabolik tingkah laku makan. Kerana beberapa ubat antobesan yang telah dibangunkan diketahui menyebabkan kesan buruk kritikal [8], pendekatan berasaskan makanan semulajadi ke arah sistem ganjaran otak dijangkakan untuk merawat sindrom obesiti-diabetes dengan selamat [16]. Dalam paradigma ini, γ-oryzanol adalah calon anti-kemesraan yang menjanjikan dengan sifat tersendiri menjadi modulator epigenetik.
Penghargaan
Kami berterima kasih kepada S. Okamoto (University of the Ryukyus, Jepun) untuk mengkaji manuskrip. Kami mengucapkan terima kasih kepada M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato dan C. Noguchi (University of the Ryukyus, Japan) untuk bantuan kesetiaan.
Singkatan
| 5-aza-dC | 5-aza-2'-deoxycytidine |
| D1R | Dopamine D1 reseptor |
| D2R | Dopamine D2 reseptor |
| DAT | Pengangkut dopamin |
| DNMT | Methyltransferase DNA |
| ER | Retikulum endoplasmic |
| ERR | Reseptor yang berkaitan dengan estrogen |
| HFD | Diet tinggi lemak |
| SAH | S-Adenosyl-l-homocysteine |
| SAM | S-Adenosil methionine |
| STAT3α | Transduser isyarat dan pengaktifan transkripsi 3α |
| TH | Tyrosine hydroxylase |
Nota
Ketersediaan data
Dataset yang dihasilkan dan / atau dianalisis semasa kajian semasa boleh didapati daripada penulis yang berkaitan dengan permintaan yang munasabah.
pembiayaan
Kerja-kerja ini disokong sebahagiannya oleh Grants-in-Aid daripada Persatuan Sains Sosial untuk Promosi Sains (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 dan 24591338), Majlis Sains, Teknologi dan Inovasi (CSTI), Program Promosi Inovasi Strategik Cross-Kariah (SIP) 'Teknologi untuk mewujudkan pertanian, kehutanan dan perikanan generasi akan datang', Yayasan Lotte, Yayasan Jepun untuk Enzimologi Gunaan, Pertubuhan Baru Teknologi Pembangunan Tenaga dan Industri (NEDO), Projek Pembentukan Rangkaian Sains Hidup (Bidang Farmaseutikal ) (Prefektur Okinawa, Jepun) dan Projek Promosi Pengumpulan Perubatan di Prefektur Okinawa, Jepun, bersama dengan pemberian dari Prefektur Okinawa untuk promosi ubat canggih (Prefektur Okinawa, Jepun).
Dualiti minat
Penulis mengisytiharkan bahawa tidak ada dualitas minat yang berkaitan dengan manuskrip ini.
Penyata sumbangan
CK dan HM merancang penyelidikan. CK dan TK melakukan eksperimen dan dianalisis data. TK, CS-O, CT, MT, MM dan KA menyumbang kepada penafsiran data. CK dan HM menulis manuskrip itu. Semua penulis menyumbang kepada tafsiran data. Semua penulis menyertai dalam menyemak semula manuskrip dan meluluskan versi terakhirnya. HM adalah penjamin kerja ini, mempunyai akses penuh kepada semua data dan bertanggungjawab sepenuhnya terhadap integriti data dan ketepatan analisis data.
Nota kaki
Bahan tambahan elektronik
Versi dalam artikel ini (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) mengandungi bahan tambahan yang dikaji semula tetapi tidak disunting, yang tersedia untuk pengguna yang diberi kuasa.
Rujukan
;