Insulin mengaktifkan reseptor insulin (InsRs) dalam hipotalamus untuk menandakan kenyang selepas makan. Walau bagaimanapun, kejadian obesiti yang meningkat, yang mengakibatkan tahap insulin meningkat secara kronik, menunjukkan bahawa insulin juga boleh bertindak di pusat otak yang mengawal motivasi dan ganjaran. Kami melaporkan di sini bahawa insulin dapat menguatkan pelepasan dopamin (PG) yang berpotensi berpotensi berpotensi (action) dalam nukleus accumbens (NAc) dan caudate-putamen melalui mekanisme tidak langsung yang melibatkan interneuron cholinergic striatal yang menyatakan InsRs. Selain itu, dua manipulasi diet kronik yang berlainan dalam tikus, sekatan makanan (FR) dan diet obesogenik (OB), sebaliknya mengubah sensitiviti pembebasan DA striatal kepada insulin, dengan peningkatan respons dalam FR, tetapi kehilangan respons dalam OB. Kajian-kajian kelakuan menunjukkan bahawa tahap insulin utuh dalam cangkang NAc adalah perlu untuk memperoleh pilihan untuk rasa penyelesaian glukosa berpasangan. Bersama-sama, data ini menunjukkan bahawa isyarat insulin striatal meningkatkan pembebasan DA untuk mempengaruhi pilihan makanan.

Adalah mantap bahawa peningkatan insulin plasma yang berterusan semasa dan selepas makan mengaktifkan reseptor insulin (InsRs) dalam hypothalamus, yang memberikan maklum balas negatif kepada litar selera yang berkurangan terus memakan^{1, 2, 3}. Insulin otak berasal terutamanya dari sel-sel β pankreas, dengan pengangkutan aktif dari plasma ke otak di penghalang darah-otak^{4, 5, 6, 7, 8}, walaupun terdapat peningkatan bukti untuk sintesis insulin saraf dan pembebasan, juga^{1, 9}. Terutama, ungkapan InsRs tidak terhad kepada hipotalamus, walaupun fungsi InsRs ekstra hypothalamic masih tidak dapat diselesaikan^{1, 2, 3}. Memandangkan kejadian meningkatnya obesiti dan diabetes jenis II, di mana tahap insulin yang beredar sentiasa meningkat dan pengangkutan insulin otak dan kepekaan reseptor menurun^{3, 8, 10, 11}, adalah penting untuk memahami fungsi insulin di kawasan otak yang mengawal motivasi dan ganjaran. Kawasan otak yang menarik minatnya termasuk nukleus accumbens (NAc), yang mengantara pengaruh ganjaran makanan dan dadah^{12, 13}, dan caudate-putamen (CPu), yang memainkan peranan dalam tingkah laku berasaskan kebiasaan dan keinginan¹³. InsRs dinyatakan di seluruh kawasan ini, dengan ketumpatan tertinggi berlaku di NAc^{3, 14}; InsRs juga diungkapkan oleh neuron dopamin (DA) di kalangan orang tengah, termasuk di kawasan tegar ventral (VTA) dan substantia nigra pars compacta (SNc)¹⁵. Tahap insulin otak adalah berkadar dengan konsentrasi insulin plasma dan adipositi badan^{6, 7, 8}, yang membawa kepada hipotesis bahawa insulin mungkin bertindak di InsRs di kawasan otak ini untuk mempengaruhi ganjaran makanan^{3, 16, 17}.

Kajian terdahulu dalam synaptosomes striatal, sel heterologous, irisan otak dan dalam vivo telah menunjukkan bahawa pengaktifan Insulin InsRs membawa kepada kenaikan pengambilan DA oleh pengangkut DA (DAT)^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Proses ini melibatkan laluan isyarat PI3 kinase^{19, 20}, dan menyebabkan penyisipan DAT dalam membran plasma¹⁹. Beredar paras insulin secara dinamik memodulasi aktiviti DAT striatal, dengan penurunan pengambilan DA dan ekspresi permukaan DAT yang dilihat pada model kencing manis dan selepas larangan makanan (FR)^{20, 21}. Peningkatan ketergantungan insulin dalam aktiviti DAT telah terbukti mengurangkan kepekatan DA ekstraselular yang membangkitkan ([DA]_o) dalam VTA²³, mencerminkan perubahan dalam keseimbangan antara pembebasan DA dan pengambilan. Selaras dengan peranan insulin yang mantap dalam keadaan kenyang, penyerapan mikrosa akut dalam VTA dapat mengurangkan ganjaran makanan^{23, 24}, manakala tikus yang kurang InsRs dalam neuron VTA dan SNc menunjukkan peningkatan pengambilan makanan dan menjadi obes²⁵. Walaupun insulin boleh menyebabkan kemurungan jangka panjang dari input excitatory kepada neuron VTA DA²⁴, sekali lagi konsisten dengan peranan dalam keadaan kenyang, pendedahan insulin juga dapat meningkatkan kadar pembakaran neuron DA, mungkin dengan menurunkan pembebasan DA dan penghalang pengantara otoreptor²⁵. Oleh itu, kesan bersih insulin terhadap pembebasan DA striatal adalah sukar untuk diramal. Sesungguhnya, hasil daripada kajian mengenai pengaruh insulin terhadap pembebasan DA striatal di bekas vivo keping¹⁹ dan kesan mikrojeksi insulin tempatan di NAc pada ganjaran makanan²⁶ nampaknya bertentangan. Untuk menyelesaikannya, kami menilai pelepasan DA dan pengambilan aksonal dalam lingkungan mikro yang utuh daripada NAc dan CPu dalam bekas vivo keping striatal menggunakan voltmeter kitaran pantas (FCV), dan menentukan kesan isyarat insulin di NAc pada tingkah laku ganjaran dalam vivo.

Kajian kami menunjukkan bahawa kesan utama insulin di NAc dan CPu adalah untuk meningkatkan pembebasan DA, walaupun peningkatan serapan dalam pengambilan DA. Peraturan dinamik DA yang dilepaskan ini melibatkan peningkatan ketergantungan insulin dalam kegembiraan interneuron cholinergic striatal (ChIs), yang membawa kepada peningkatan pembebasan DA melalui pengaktifan reseptor nikotin asetilkolin (ACh) (nAChRs). Pengaruh insulin terhadap ChI dan pada pembebasan DA adalah pengantara oleh InsRs. Terutamanya, kesan insulin pada pembebasan DA diperkuatkan dalam kepingan dari tikus FR, tetapi tumpul pada tikus pada diet obesogenik (OB). Data ini menunjukkan penguatan pembebasan DA di bekas vivo Irisan oleh insulin membawa kepada ramalan bahawa insulin mungkin bertindak sebagai isyarat ganjaran dalam vivo. Malah, kajian tingkah laku selari menunjukkan peranan untuk insulin dalam shell NAc dalam penyesuaian rasa-rasa. Bersama-sama, penemuan ini menunjukkan peranan baru untuk insulin sebagai isyarat ganjaran yang boleh mempengaruhi pilihan makanan

Insulin yang bertindak di InsRs meningkatkan pembebasan DA striatal

Pemeriksaan awal tempatan ditimbulkan [DA]_o dipantau dengan FCV di bekas vivo irisan striatal dari tikus dengan iklan libitum (AL) akses kepada makanan dan air mendedahkan penemuan yang tidak dijangka bahawa penggunaan akut insulin merentasi pelbagai kepekatan fisiologi yang berkaitan^{1, 4} meningkat denyut tunggal-membangkitkan [DA]_o (Rajah 1a-c), dengan insulin EC₅₀ nilai (kepekatan di mana kesan adalah separuh maksimum) 2-12 nM (Rajah 1b). Peningkatan menimbulkan [DA]_o amat mengejutkan, memandangkan ini disertai oleh kenaikan ketara dalam kadar maksimum (V_maks) untuk pengambilan DAT-pengantara di setiap subregion (Jadual 1), yang akan membawa kepada penurunan pesaing dalam membangkitkan [DA]_o, seperti yang dilaporkan sebelum ini^{22, 23}. Sebaliknya, kami mendapati bahawa membangkitkan [DA]_o telah diperkuat secara maksimum 20-55% oleh insulin 30 nM; rantau ini dengan kesan berkadar paling besar adalah cengkerang NAc, yang merupakan subregion striatal dengan ekspresi InsR tertinggi^{1, 14}. Rempah-rempah yang terdedah kepada insulin 30 nM di bawah keadaan yang sama tidak menunjukkan perubahan pada kandungan DA yang keras (Tambahan 1a), menyiratkan bahawa insulin mengubah regulasi pelepasan dinamik, bukan sekadar menyusun sintesis DA. Terutama, kesan insulin pada membangkitkan [DA]_o telah hilang pada kepekatan suprafysiologi ≥100 nM (Rajah 1b). Ini bukan hasil peningkatan aktiviti DAT yang melepaskan pelepasan, sebagai kesan insulin V_maks juga hilang pada kepekatan ini (Jadual 1). Secara keseluruhannya, data ini menunjukkan bahawa dalam lingkungan mikroorganisma yang utuh, kesan utama insulin pada membangkitkan [DA]_o adalah untuk meningkatkan pembebasan, walaupun peningkatan serapan DA pengambilan.

  

  

(a) Purata nadi tunggal-dibangkitkan [DA]_o dalam cangkang NAc, teras NAC dan CPu sebelum dan selepas insulin (Ins) digambarkan untuk 30 nM; bar ralat diabaikan, tetapi lihat (b); anak panah menunjukkan masa rangsangan. Insulin meningkat ditimbulkan [DA]_o dalam shell (oleh 55 ± 10%), teras (oleh 37 ± 5%) dan CPu (oleh 20 ± 4%) (***P<0.001). (b) Kesan insulin adalah bergantung kepada tumpuan pelbagai fisiologi (1-30 nM) dalam shell (n= 22-24, F_5,133= 14.471, P<0.001), teras (n= 36-76, F_5,308= 16.318, P<0.001) dan CPu (n= 30-62, F_5,253= 13.763, P<0.001), tetapi hilang pada ≥100 nM. (c) Rakaman perwakilan puncak yang dibangkitkan [DA]_o berbanding masa di tapak tunggal di teras NAc jika tidak ada aplikasi ubat (Con), semasa penggunaan insulin (30 nM) atau apabila insulin digunakan di hadapan penghalang InsR HNMPA (5 μM). (d) Rata-rata puncak yang dibangkitkan [DA]_o data yang menunjukkan pencegahan kesan insulin (30 nM) oleh HNMPA, antagonis InsRS S961 (1 μM) dan inhibitor PI3K LY294002 (1 μM), tetapi bukan oleh inhibitor IGF-1R PPP (1 μM)n= 29-76; P> 0.9 berbanding insulin sahaja). Untuk Rajah 1a-d, n= bilangan tapak setiap subregion dari tikus 3-6 untuk setiap kepekatan dadah atau insulin; satu arah ANOVA, Ujian penting jujur ​​Tukey (HSD). Lihat Tambahan 1b, c untuk shell NAc dan data CPU.

• Imej saiz penuh (98 KB)

 

 

Kerana insulin juga boleh bertindak pada faktor pertumbuhan insulin seperti 1 reseptor (IGF-1Rs), walaupun pada kepekatan melebihi 100 nM (ref. 1), kami berusaha mengesahkan bahawa kesan peningkatan insulin pada membangkitkan [DA]_o adalah bergantung kepada InsR. Ini terbukti sebagai kesnya, kerana kesannya dihalang oleh inhibitor Inser intraselular, asid hidroksi-2-naftalenylmetilfosfonik (HNMPA), dan oleh antagonis InsR, S961, tetapi bukan oleh perencat terpilih IGF-1Rs, picropodofilin²⁴ (PPP; Rajah 1c, d and Tambahan 1b, c). Kami kemudian mengkaji penglibatan kinase PI3, yang memulakan laluan isyarat yang bertanggungjawab terhadap peraturan yang bergantung kepada insulin DAT¹⁹. Pada kepekatan 1 μM, inhibitor P13K LY249002 sahaja tidak mempunyai kesan pada puncak yang dibangkitkan [DA]_o or V_maks (n= Tapak 29-76 (inti NAc) setiap dadah, P> 0.05, analisis varians sehala (ANOVA); data tidak ditunjukkan), namun menghalang kesan insulin terhadap [DA] yang dibangkitkan_o di semua subregion yang menonjol (Rajah 1d and Tambahan 1b, c).

Penyetempatan InsRs pada axons DA dan ChIs

Peningkatan yang diperhatikan dalam V_maks untuk DA pengambilan dengan tahap insulin fisiologi membayangkan kehadiran InsRs pada axons DA, seperti juga hasil sebelumnya dalam pelbagai persediaan striatal^{18, 19, 20, 21, 22}. Walaupun ungkapan ungkapan InsRs pada neuron DA tengah telah ditunjukkan^{15, 23, 24, 25}, Ungkapan InsR pada axons DA striatal belum dilaporkan. Kami menangani ini menggunakan imunohistokimia. Imunoreaktiviti InsR yang padat di seluruh kajian kuantitatif terhad striatum penyebaran InsR pada axons DA, yang dikenalpasti oleh immunoreactivity untuk enzim DA-sintesis, tyrosine hydroxylase (TH). Oleh itu, kami mengamalkan protokol yang dilaporkan sebelum ini²⁷, yang melibatkan mengira punca InsR yang bertindih dengan profil TH + dalam pandangan imej biasa dan mengira lagi selepas imej InsR hanya diputar oleh 90 °. Sekiranya pertindihan keterlaluan profil InsR dan TH + tidak spesifik, prosedur ini harus memberikan taksiran statistik yang sama sama ada fasa normal atau 90 daripada fasa. Walau bagaimanapun, analisis ini menunjukkan penurunan dalam tumpang tindih insR puncta dengan profil TH + 14 ± 9% (n= 42 bidang, P<0.01, berpasangan dua ekor t-test; data tidak ditunjukkan), mengesahkan kehadiran InsR pada axons DA. Walau bagaimanapun, lebih menarik lagi, InsR immunolabelling striatum menunjukkan ekspresi InsR berbeza pada badan sel yang besar yang dikenalpasti sebagai ChI striatal oleh co-imunolabelling untuk choline acetyltransferase (ChAT), enzim utama yang diperlukan untuk sintesis ACh. Menggunakan kriteria elektrofisiologi²⁸ untuk mengenal pasti ChI dalam kajian awal keseluruhan sel-rakaman, beberapa neuron dipenuhi dengan biocytin dan kemudian diproses untuk imunohistokimia; semua ini (4 / 4) adalah imunopositif untuk kedua InsR dan ChAT (Rajah 2a). Penilaian selanjutnya bagi InsR dan ChAT co-lokalisasi di NAc mengesahkan bahawa hampir semua neuron ChAT + menyatakan InsR (96%; n= Neuron 27 / 28 dalam empat bahagian dari dua tikus).

  

  

(a) ChI dipenuhi dengan biocytin, maka immunolabelled untuk ChAT, dan InsR (wakil ChI yang diisi biocytin 4 / 4); imej tergabung menunjukkan penyertaan bersama; bar skala, 10 μm. (b-e) Respon ChI striatal kepada satu siri depolarizing denyut arus (tempoh 3; 200, 300 dan 400 pA; selang 120-s) sebelum dan selepas insulin (30 nM). (bPenyesuaian kekerapan spike dalam ChI (atas) dilihat dalam kehilangan pelepasan potensi tindakan (AP) semasa suntikan semasa, manakala spiking berterusan sepanjang denyut semasa dalam insulin (lebih rendah); lengkapkan set data yang ditunjukkan dalam d. (c) Kursus masa perwakilan peningkatan insulin yang disebabkan oleh nombor AP dengan setiap langkah semasa untuk ChI di b. (d) Ringkasan nombor AP semasa denyut semasa dihantar sebelum dan pada kesan puncak pendedahan insulin (n= 21 rangsangan berpasangan, neuron 7, tikus 5) (e) Maklum balas yang menunjukkan kesan insulin (+ Ins) di bawah keadaan kawalan (Con; n= 21 rangsangan berpasangan, neuron 7, ***P<0.001, berpasangan dua ekor t-test), di hadapan HNMPA (5 μM) (n= 12 rangsangan berpasangan, neuron 4, tikus 4, P>0.05, berpasangan dua ekor t-test), dan dengan kehadiran PPP (1 μM) (n= 18 rangsangan berpasangan, neuron 6, tikus 6, **P<0.01, Wilcoxon sepadan dengan pasangan pangkat ujian yang ditandatangani). (f) Purata nadi tunggal-dibangkitkan [DA]_o dalam teras NAc sebelum dan selepas insulin (30 nM) dalam mecamylamine (Mec; 5 μM) atau DHβE (1 μM) dinormalkan kepada kawalan puncak 100%n= 20-40 tapak setiap subregion setiap keadaan dari tikus 3-4, P> 0.05 berbanding kawalan, tidak berpasangan t-test). (g) Purata nadi tunggal-dibangkitkan [DA]_o dalam kepingan forebrain dari kawalan heterozigot (Het) dan ChAT Tikus KO sebelum dan selepas insulin (30 nM), dinormalisasikan kepada kawalan puncak 100. Insulin meningkat ditimbulkan [DA]_o dalam heterozygous tikus oleh 190 ± 23% dalam shell NAc, 140 ± 8% dalam teras NAc dan 137 ± 12% dalam CPu (n= 15-25 tapak setiap subregion dari tikus 3-4 setiap genotype, **P<0.01, ***P<0.001 berbanding kawalan tidak berpasangan t-test), tetapi tidak memberi kesan kepada membangkitkan [DA]_o di mana-mana subregion striatal ChAT Tikus KO (P> 0.1).

• Imej saiz penuh (167 KB)

 

 

Insulin meningkatkan keceriaan ChI

Untuk menguji fungsi InsRs pada ChIs striatal, kami memeriksa kesan insulin pada kegembiraan ChI menggunakan rakaman semasa-clamp clamp keseluruhan. Keasyikan ChI dinilai dengan menggunakan satu siri denyut arus 3 yang sekarang ini dapat menimbulkan potensi keruntuhan aksi yang dapat mempamerkan penyesuaian kekerapan lonjakan (Rajah 2b), selalunya dengan kehilangan spiking pada akhir nadi semasa. Secara terperinci, insulin (30 nM) menyesuaikan penyesuaian kekerapan lonjakan, menyebabkan peningkatan progresif dalam bilangan potensi tindakan dari masa ke masa (Rajah 2c), dengan peningkatan maksimum (Rajah 2d, e) biasanya dilihat antara pendedahan insulin 20 dan 50. Dengan ketiadaan insulin, kawalan ChIs tidak menunjukkan perubahan dalam jumlah potensi tindakan yang ditimbulkan (P> 0.05, dipasangkan dua ekor t-test; data tidak ditunjukkan); apabila dibandingkan dengan neuron kawalan yang dipantau sepanjang selang masa yang sama, neuron yang terdedah kepada insulin menunjukkan perubahan ketara dalam bilangan potensi tindakan yang ditimbulkan (kawalan n= Pasangan rangsangan 12 dari empat neuron, insulin n= Pasangan rangsangan 21 dari tujuh neuron, F_1,25= 5.63, P<0.05, ANOVA dua hala bercampur; data tidak ditunjukkan). Kesan insulin terhadap peningkatan jumlah potensi tindakan dicegah oleh HNMPA tetapi tidak oleh PPP inhibitor selektif IGF-1R (Rajah 2e), menunjukkan bahawa peningkatan keterampilan ChI oleh insulin adalah diasingkan oleh InsR.

Peningkatan insulin membangkitkan [DA]_o memerlukan nAChRs dan ACh

Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa ChIs dan ACh secara perlahan mengawal pembebasan DA striatal melalui nAChRs pada axons DA^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Ekspresi InsR yang melimpah ke atas ChIs dan peningkatan dalam keceriaan ChI dilihat dengan pendedahan insulin akut mencadangkan bahawa neuron ini mungkin sasaran baru untuk insulin yang boleh membawa kepada pembebasan DA yang dipertingkatkan. Untuk menguji ini, kita mengkaji kesan insulin di hadapan mecamylamine, antagonis nAChR yang tidak selektif, atau dihydro-β-erythroidine (DHβE), antagonis selektif untuk β2 subunit yang mengandungi (β2 *) nAChRs yang diperkaya Axons DA³⁵. Menimbulkan [DA]_o telah mudah dikesan dengan kehadiran antagonis ini, walaupun kedua-dua ubat menurunkan amplitud denyut tunggal-membangkitkan [DA]_o (contohnya, oleh 13-26% dalam teras NAc), seperti yang dilaporkan sebelum ini^{29, 30, 31, 32}. Untuk menyokong peranan ACh dan nAChRs, kesan insulin pada membangkitkan [DA]_o telah dihalang oleh sama ada mecamylamine atau DHβE (Rajah 2f). Untuk mengesahkan penglibatan isyarat ACh striatal dalam pembebasan DA yang dipertingkatkan insulin, kami mengkaji kesan insulin dalam bekas vivo irisan striatal dari tikus di mana ungkapan CHAT secara genetik ablated dalam struktur forebrain (forebrain ChAT KO tikus), termasuk striatum³². Walaupun ChIs utuh dalam tikus ini, sintesis ACh dihapuskan, yang menyebabkan penurunan, tetapi masih mudah dikesan denyut tunggal-dibangkitkan [DA]_o, seperti yang dinyatakan sebelum ini³². Dalam kawalan heterozygous littermates, insulin (30 nM) meningkat membangkitkan [DA]_o dalam shell NAc dan inti dan dalam CPu oleh 37-90% (Rajah 2g), melebihi penguatan yang dilihat pada striatum tikus (contohnya, Rajah 1). Walau bagaimanapun, kesan insulin pada membangkitkan [DA]_o tidak hadir di seluruh kompleks striatal di forebrain ChAT Tikus KO, menunjukkan bahawa penambahan insulin-mediated DA releasing memerlukan ACh striatal, tetapi tidak melepaskan pemancar dari ChIs, seperti glutamat³⁶.

Pengaruh insulin pada membangkitkan [DA]_o adalah bergantung kepada diet

Kepekatan insulin plasma dan otak adalah berkadar dengan adipositi badan^{6, 7, 8}, dan boleh menyebabkan perubahan pampasan dalam kepekaan otak terhadap insulin. Oleh itu, kami menguji hipotesis bahawa diet mempengaruhi keupayaan insulin untuk mempromosikan pembebasan DA, menggunakan kepingan striatal dari tikus yang dipelihara sama ada diet FR atau OB versus kawalan AL. Seperti yang dijangkakan, tahap insulin plasma dikaitkan dengan berat badan, dengan insulin yang lebih rendah di FR berbanding tikus AL atau OB (Rajah 3a and Jadual 2). Walaupun terdapat perbezaan dalam insulin yang beredar, puncaknya ditimbulkan [DA]_o dalam cawangan NAc dan inti, dan CPu jauh lebih rendah dalam bekas vivo Kepingan striatal dari kedua-dua kumpulan diet berbanding dengan AL (Rajah 3b and Tambahan 2 a, b), menyiratkan bahawa faktor-faktor penambahan insulin mentadbir mutlak [DA]_o. Kandungan Striatal DA tidak berbeza di kalangan kumpulan diet, menunjukkan perubahan dalam peraturan pelepasan dan bukannya dalam sintesis DA (Tambahan 2c). Selaras dengan perubahan dalam peraturan dinamik, sensitiviti DA yang dilepaskan kepada insulin adalah bergantung kepada diet. Dalam tikus FR, kepekatan insulin ≤1 nM, yang tidak mempunyai kesan dalam AL (Rajah 1b), meningkat membangkitkan [DA]_o (Rajah 3c), mencerminkan kepekaan insulin yang meningkat, dengan EC₅₀ nilai-nilai dalam striatum FR (0.4-0.6 nM) yang kira-kira suatu urutan magnitud yang lebih rendah bahawa dalam AL (bandingkan Figs 1b and 3c). Sebaliknya, kesan insulin telah hilang di stesen OB; walaupun insulin 30 nM, yang mempunyai kesan maksimum dalam striatum AL (Rajah 1b), tidak mempunyai kesan di OB (Rajah 3c).

  

  

(a) Kepekatan insulin plasma positif berkorelasi dengan berat badan di seluruh kumpulan makan (R= 0.76). (b) Purata nadi tunggal-dibangkitkan [DA]_o dalam teras NAc (lihat Tambahan 2a, b untuk cengkerang NAc dan CPu) adalah lebih rendah dalam FR (38 ± 4%) dan OB (25 ± 4%) berbanding AL (n= Laman web 50-60 dari tikus 5-6 setiap kelompok diet, F_2,156= 23.337, satu arah ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB berbanding FR (P<0.08). (c) Sensitiviti membangkitkan [DA]_o untuk insulin dipertingkatkan dalam FR, tetapi hilang dalam OB (n= 21-49 tapak setiap subregion setiap konsentrasi dari tikus 2-4 untuk kumpulan diet, ANOVA sehala, Tukey HSD), dengan kepekaan yang lebih tinggi di FR berbanding tikus AL di semua subregionP<0.001 untuk setiap wilayah; ANOVA dua hala; CPU: F_{(conc x diet; 3,286)}= 10.253; teras: F_{(conc x diet; 3,353)}= 6.166; cangkang: F_{(conc x diet; 3,195)}= 10.735).

• Imej saiz penuh (124 KB)

 

 

Data ini menyiratkan hubungan songsang antara sensitiviti InsR striatal dan adipositi badan. Walaubagaimanapun, perbezaan yang bergantung kepada diet mungkin mencerminkan sensitiviti nAChR yang diubah. Oleh itu, kami menentukan tindak balas tumpuan kepada nikotin dalam teras NAc dari setiap kumpulan diet. Nikotin menyebabkan desensitisasi nAChR, yang boleh dikira dengan membandingkan nisbah [DA]_o dibangkitkan oleh sebuah kereta singkat lima pulsa di 100 Hz hingga satu-pulse-evoked [DA]_o (5 p: 1 p ratio) sebagai indeks pengaktifan / desensitisasi nAChR^{30, 31}. Dengan menggunakan pendekatan ini, kami mendapati tiada perbezaan di kalangan kumpulan diet dalam sensitiviti nAChR dalam inti NA (Tambahan 3a-c). Tambahan pula, nisbah kawalan 5 p: 1 tidak berbeza di kalangan kumpulan diet di inti NAc (Gambar Tambahan 3d) atau CPu (tidak digambarkan), menyiratkan bahawa diet tidak mengubah Peraturan keluaran DA yang bergantung kepada nAChR. Oleh itu, kepekaan InsR yang striatal nampaknya dipertingkatkan dalam FR berbanding tikus AL, tetapi tidak terdapat dalam tikus OB, dengan kehilangan peraturan pembebasan DA yang hebat pada kepekatan insulin fisiologi.

Insulin shell NAC memodulasi keutamaan rasa dingin

Keutamaan makanan dihasilkan oleh kedua-dua faktor sebelum dan selepas pengingesan; mekanisme untuk masing-masing tidak dapat diselesaikan sepenuhnya, tetapi bukti semasa membabitkan NAc DA memberi isyarat kepada kedua-duanya^{37, 38}. Memandangkan paras insulin plasma dan serebrospinal (CSF) meningkat dengan pesat selepas ketinggian glukosa periferal⁶, dan bahawa peningkatan insulin dalam striatum dapat dikesan dalam min 5 ketinggian insulin plasma⁷, adalah logik untuk hipotesis bahawa pelepasan insulin periferi semasa makan boleh meningkatkan pembebasan NAc DA dan menyumbang kepada mekanisme ganjaran selepas pengingesan. Kami menyesuaikan protokol preferensi rasa yang digambarkan sebelum ini³⁷ dengan penyelesaian glukosa saccharin yang manis pada tikus untuk menguji hipotesis yang menyekat kesan insulin endogen melalui aplikasi tempatan antibodi insulin (InsAb) dalam NAc akan mengurangkan keutamaan untuk rasa yang dipasangkan. Keberkesanan InsAb dalam menghalang kesan insulin diuji dalam vitro assay DA pengambilan ke synaptosomes striatal. Insulin (30 nM) menyebabkan peningkatan ketara dalam V_maks dalam synaptosomes dari NAc atau CPu (Tambahan 4), selaras dengan kami V_maks data dari kepingan striatal (Jadual 1) dan dengan kajian terdahulu^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Dengan ketiadaan insulin, InsAb atau imunoglobulin antibodi kawalan G (IgG) telah mengubah V_maks untuk pengambilan DA berbanding kawalan. Di hadapan IgG, insulin masih menyebabkan peningkatan ketara dalam V_maks; Walau bagaimanapun, kesan insulin pada V_maks telah hilang dengan kehadiran InsAb (Tambahan 4).

Untuk meminimumkan kerosakan tisu dan memelihara kepekaan sasaran tisu, dua kumpulan subjek diuji di mana kita menggantikan mikroinjeki intra-NAc dengan prosedur microinjection palsu, daripada menggunakan satu kumpulan subjek dan memasangkan satu penyelesaian berperisa dengan InsAb dan yang lain dengan kenderaan. Oleh itu, semasa sesi satu botol botol, kumpulan percubaan menerima microinjections InsAb yang dipasangkan dengan salah satu daripada dua perisa, dan pada sesi silih berganti, microinjections mengejek yang dipasangkan dengan rasa lain (Rajah 4a, ditinggalkan). Kumpulan kawalan menerima microinjections mengejek dengan alternating microinjections sama ada saline buffer fosfat (PBS) atau IgG. Kedua-dua penyelesaian berperisa mengandungi glukosa semasa pengkondisian. Tiada keistimewaan perbezaan di antara perisa dijangkakan dalam kumpulan kawalan mikroinjek, sedangkan keutamaan dijangka beralih ke arah peranan microinjection-dipasangkan dalam kumpulan InsAb-microinjected.

  

  

(a) Rajah menggambarkan satu botol botol (kiri) dan ujian dua botol (kanan). (b) Jumlah yang digunakan (ml) semasa sesi satu botol botol. Terdapat interaksi yang signifikan antara sesi pemanasan infusi dan rawatan microinjection (n= Tikus 19-20 setiap kumpulan, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 ANOVA bercampur dengan langkah berulang pada sesi penyusunan infusi). Injeksi mikro InsAb menurunkan penggunaan secara ketara berbanding dengan kawalan semasa ketiga (t(40) = 3.026, **P<0.01) dan keempat (t(40) = 3.052, **P<0.01, dilindungi satu-ekor t-tests) infus. Suntikan mock tidak memberi kesan ke atas penggunaan dalam kedua-dua kumpulan (F_3,111= 1.110, 2 × 4 ANOVA bercampur dengan langkah-langkah berulang pada sesi penghawa keranda). (c) Kelantangan yang digunakan semasa ujian rasa-dua rasa. Terdapat interaksi yang signifikan antara rasa dan rawatan microinjection semasa penyaman (F_1,37= 5.36, P<0.05, ANOVA campuran dua hala dengan pengukuran rasa yang berulang). Kumpulan InsAb menggunakan rasa Insar berpasangan jauh lebih sedikit berbanding dengan rasa pasangan berpasangan (t(18) = 2.82, ** P<0.01, dilindungi satu-ekor t-test); kumpulan kawalan tidak menunjukkan keutamaan rasa (t(19) = 0.803, P> 0.05, dilindungi t-test). Membandingkan kumpulan, Tikus InsAb meminum lebih kurang rasa yang dipasangkan dengan infusi (t(40) = 1.96, *P<0.05) dan lebih banyak lagi rasa berpasangan tiruan (t(40) = 1.77, *P<0.05, dilindungi satu-ekor t-test) daripada kawalan.

• Imej saiz penuh (161 KB)

 

 

Semasa sesi penyaman satu botol, mikroinjection InsAb berkurangan dengan ketara berbanding dengan kenderaan semasa infusi ketiga dan keempatRajah 4b). Sebaliknya, kedua-dua kumpulan menggunakan jumlah penyelesaian yang sama semasa keempat sesi suntikan mock (F_3,111= 0.127, P>0.05, campuran ANOVA dua hala) (Rajah 4b). Selepas sejumlah lapan sesi penyaman, pilihan rasa telah dinilai dalam ujian dua botol di mana tikus mempunyai akses kepada kedua-dua penyelesaian berperisa pada masa yang sama (Rajah 4a). Analisis statistik mendedahkan interaksi yang signifikan antara rasa dan rawatan mikroinjeksi yang diterima semasa penyaman (Rajah 4c). Kumpulan InsAb menggunakan kurang daripada rasa yang dipasangkan InsAb berbanding dengan rasa yang dipasangkan bersama (Rajah 4c), manakala kumpulan kenderaan tidak menunjukkan keutamaan rasa (Rajah 4c), menyiratkan bahawa isyarat insulin utuh menyumbang kepada pemilihan penyelesaian kalori manis. Berbanding dengan kenderaan, tikus InsAb-microinjected menanam jauh lebih sedikit daripada rasa penyerapan yang dipasangkan dan lebih banyak rasa perasa yang disuntik dengan mock (Rajah 4c). Mikrojeksi IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, dilindungi t-tests) atau PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, dilindungi t-tests) tidak mempunyai kesan terhadap keutamaan rasa (data tidak ditunjukkan), dengan alasan kemungkinan bahawa kesan tidak spesifik dari microinjection InsAb mengurangkan penggunaan atau rasa rasa. Perlu juga diingatkan bahawa keutamaan kumpulan InsAb pada ujian bukan pilihan untuk rasa kurang baru, kerana tidak ada interaksi antara sesi dan jenis sesi (infusi sebenar berbanding infusi penyerapan) untuk kumpulan InsAb (F_3,54= 1.584, P> 0.05, ANOVA dua hala). Artinya, kumpulan InsAb tidak menggunakan lebih banyak rasa berpasangan mock-infusion berbanding dengan rasa berpasangan infus; sebaliknya, perbezaan antara kumpulan rawatan hanya muncul semasa sesi penyuntikan infus. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahawa insulin dalam NAc berperanan dalam pengukuhan preferensi terhadap rasa yang menandakan beban glisemik.

Kami melaporkan di sini bahawa insulin menguatkan pembebasan DA striatal dalam cara yang bergantung kepada nAChR dengan memodulasi keceriaan ChI melalui InsRs. Keputusan kami menyiratkan bahawa insulin boleh berfungsi sebagai isyarat imbalan, sebagai tambahan kepada peranannya yang mantap dalam memberi isyarat. Terutama, kesan insulin terhadap pelepasan DA dimodulasi oleh diet, dengan peningkatan kepekaan terhadap insulin selepas FR, tetapi kehilangan sepenuhnya peraturan yang dipertingkatkan insulin pada diet OB. Perubahan-perubahan ini kelihatan mencerminkan perubahan sensitiviti InsR yang berkait rapat dengan tahap insulin yang beredar, memandangkan tahap insulin plasma didapati bergantung kepada diet, tetapi kepekaan nAChR tidak. Akhirnya, kajian keutamaan kami dalam memerangkap haiwan menyiratkan bahawa isyarat insulin di cangkang NAc mempengaruhi keutamaan makanan, yang bukan sahaja membabitkan insulin dalam pembelajaran berkaitan makanan tetapi juga mengesahkan peranannya sebagai isyarat ganjaran.

Bersih [DA]_o mencerminkan keseimbangan antara pembebasan DA dan pengambilan DA melalui DAT. Bukti terdahulu menunjukkan insulin dapat mengawal aktiviti DAT^{18, 19, 20, 21, 22, 23} membawa kepada ramalan bahawa peningkatan dalam insulin akan menyebabkan penurunan bersih membangkitkan [DA]_o melalui peningkatan pengambilan DA. Walau bagaimanapun, kami mendapati bahawa di striatum, kesan insulin lebih kompleks daripada ini. Walaupun pendedahan insulin meningkat V_maks untuk DAT, kesan utama insulin adalah pada pembebasan DA, bukan pada pengambilan DA, dengan peningkatan yang konsisten dalam membangkitkan [DA]_o merentasi pelbagai fisiologi kepekatan insulin dalam shell NAc dan inti dan dalam CPu. Walaupun peningkatan membangkitkan [DA]_o telah kembali ke tahap kawalan pada kepekatan suprafysiological 100 nM, V_maks juga tidak berubah dari kawalan, menghapuskan kesan utama pada DAT sebagai penjelasan. Sebaliknya, kehilangan kesan ke atas pengambilan serta pelepasan membebankan desensitisasi InsRs atau downregulation jalur isyarat hiliran pada kepekatan insulin yang tinggi. Sesungguhnya, InsRs menjalani endositosis dan degradasi pesat selepas mengikat insulin dalam tisu periferi¹, dengan bukti baru muncul untuk kehilangan sensitiviti InsR neuron selepas pendedahan jangka pendek ke tahap tinggi insulin atau diet tinggi kalori^{10, 11, 39}.

Kesan dominan insulin untuk meningkatkan pelepasan DA striatal yang dilaporkan di sini berbeza dengan keputusan dua yang baru-baru ini bekas vivo kajian keping. Pada mulanya, insulin menyebabkan penurunan dalam lekuk elektrik menimbulkan limpahan [³H] DA dari kepingan striatal, walaupun meningkat [³H] Limpahan DA dikesan apabila DAT dihalang²². Memandangkan dibebaskan [³H] DA mesti melepaskan pengambilan DAT-pengantara di seluruh tisu untuk dikesan dalam penyelesaian superfusing, protokol ini amat sensitif kepada peraturan DAT. Keputusan kami menunjukkan bahawa insulin meningkatkan pembebasan DA melalui ChIs dan aktivasi nAChR, selain meningkatkan pengambilan DAT-pengantara, akan menjelaskan peningkatan yang seolah-olah paradoks dalam peningkatan insulin [³H] Limpasan DA dilihat apabila kesan bersaing pada DAT disekat²². Kajian kedua menggunakan FCV untuk pengesanan secara langsung pembebasan DA somatodendritik dalam VTA, tetapi juga mendapati kesan utama insulin terhadap pengambilan DA, yang tercermin dalam penurunan menurun [DA]_o (ref. 23). Perbezaan dalam beberapa faktor, dari microcircuitry tempatan untuk somatodendritic versus axonal DA mekanisme pelepasan⁴⁰, boleh menyumbang kepada perbezaan serantau ini. Walau bagaimanapun, seperti yang dibincangkan di bawah, peranan insulin yang bergantung kepada serantau mungkin menjadi pelengkap, dan bukannya bercanggah.

Sebelum ini, apa-apa peranan peraturan yang bergantung kepada insulin DA signaling telah diandaikan untuk dimediasi oleh pengaktifan langsung InsRs pada neuron DA. Kami menunjukkan di sini bahawa InsRs juga dinyatakan pada ChIs striatal, dan insulin itu memodulasi kebolehan ChI untuk meningkatkan pembebasan DA striatal, yang mungkin memainkan peranan penting dalam pengaruh insulin terhadap diet. Chri Striatal menerima unjuran dari neuron nukleus intralaminar thalamus, yang mempamerkan tembakan pecah sebagai tindak balas kepada rangsangan deria yang penting dan membantu memacu corak spek tersendiri dalam ChI yang penting dalam mengarahkan perhatian, pengukuhan dan pembelajaran bersekutu⁴¹. Oleh itu, tindakan insulin di InsRs pada ChIs striatal dapat meningkatkan kesan isyarat makanan deria pada respons respons striatal kepada penembakan thalamic, menyumbang kepada peningkatan persepsi nilai ganjaran hidangan makan. Promosi langsung pembebasan DA striatal oleh aktivasi ChI telah membawa kepada cadangan bahawa faktor-faktor yang merangsang ChI akan mempunyai peranan istimewa sebagai pencetus pembebasan DA³³. Data kami memberikan bukti sokongan pertama untuk ini, dengan keceriaan ChI yang dipertingkatkan insulin dan isyarat ACh memacu peningkatan dinamik dalam pembebasan DA.

Peningkatan DA yang meningkat dengan kehadiran insulin juga berpendapat terhadap peningkatan dalam isyarat ACh sehingga tahap yang menyebabkan pengaktifan nAChR atau reseptor ACh muscarinic (mAChR), salah satu daripadanya boleh menekan denyut tunggal yang ditimbulkan [DA]_o (ref 29, 30, 31, 42). Oleh itu, mekanisme yang dilaporkan di sini berbeza daripada pengaktifan AChRs, yang telah dikaitkan dengan keengganan dan ketenangan⁴³.

Single-pulse-evoked [DA]_o adalah lebih rendah dalam tikus FR dan OB daripada tikus AL; walaupun keputusan ini selaras dengan laporan terdahulu^{44, 45, 46}, kajian kami menyediakan perbandingan sistematik pertama dari tiga subrionan yang terperinci dalam kedua-dua kumpulan diet sepanjang jangka masa yang tetap. Mekanisme yang mendasari perubahan yang bergantung kepada diet dalam pembebasan DA tidak dapat dijelaskan, dan berada di luar skop kajian sekarang. Bagaimanapun, memandangkan tahap insulin plasma tidak berubah oleh diet FR dan OB, tidak mungkin penurunan menurun [DA]_o dalam kedua-dua kumpulan adalah akibat daripada tahap insulin yang bergantung kepada diet.

Sebaliknya, perubahan sensitiviti InsR dengan diet dan tahap insulin plasma yang bergantung kepada pemakanan menyebabkan penjelasan yang paling mungkin untuk meningkatkan kepekaan terhadap insulin di FR dan kehilangan respons terhadap insulin dalam OB. Tidak ada keterangan untuk penjelasan alternatif mengenai kepekaan nAChR yang diubah dalam tikus FR atau OB berbanding AL. Walaupun penemuan kami adalah antara yang pertama untuk menunjukkan sensitiviti InsR yang lebih tinggi dengan FR¹⁸, penurunan berat badan boleh disertai oleh penurunan kadar insulin dalam CSF⁷, yang akan menyumbang kepada peningkatan sensitiviti pengeluaran DA untuk insulin di FR. Sebaliknya, kehilangan tindak balas insulin dalam tikus OB adalah konsisten dengan bukti terdahulu untuk mengurangkan kepekaan InsR otak yang disebabkan oleh peningkatan berat badan atau OB.^{3, 10, 11}.

Kami bekas vivo data slice menyokong hipotesis bahawa insulin boleh memberi ganjaran serta ketenangan. Kami menguji hipotesis ini dengan menghalang kesan insulin endogenus dengan microinjection InsAb dua hala dalam shell NAc semasa penyesuaian rasa-rasa. Selaras dengan peranan ganjaran, menghalang kesan insulin menurunkan keutamaan untuk rasa yang mengandungi penyelesaian glukosa yang dipadankan berbanding rasa yang berkaitan dengan isyarat insulin utuh. Menyekat insulin dalam cengkerang NAc juga mengurangkan penggunaan penyelesaian berpasangan semasa pengkondisian satu botol, sedangkan mikrojeksi kawalan atau kawalan tidak memberi kesan kepada penggunaan. Data-data ini menunjukkan bahawa insulin dalam shell NAc memainkan peranan dalam keutamaan makanan. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa intakan DA utuh dalam NAc adalah perlu untuk memperolehi penyaman rasa^{37, 38}, mengesahkan peranan DA NA dalam mengantarkan kesan pengukuhan penyelesaian pemakanan. Dalam cahaya ini, keutamaan untuk penyelesaian glukosa dipasangkan dengan ketersediaan insulin utuh berpendapat terhadap kesan utama insulin terhadap pengambilan DAT-pengantara DA dalam cangkang NAc, kerana ini dijangka berkurang [DA]_o dan oleh itu mengurangkan penggunaan rasa yang disambungkan dengan kawalan. Keputusan kami juga konsisten dengan kajian-kajian terdahulu di mana microinjection insulin dalam cangkang NAc meningkatkan masa haiwan terlibat dalam sukrosa diri pentadbiran mulut, dengan peningkatan sempadan dalam penggunaan sukrosa²⁶, yang bertentangan dengan akibat jangkaan peningkatan pengambilan DA. Keseluruhannya, data tingkah laku ini konsisten dengan pengaruh insulin yang diramalkan terhadap ChIs striatal dan pembebasan DA yang dipertingkatkan. Walau bagaimanapun, keputusan ini tidak mengecualikan penglibatan elemen-elemen microcircuitry yang lain dalam tingkah laku yang dipantau, memandangkan ungkapan InsR yang tersebar di seluruh striatum^{1, 14}.

Kajian-kajian yang dilaporkan di sini memberikan bukti pertama bahawa insulin memainkan peranan dalam menyampaikan nilai kalori, dan oleh itu kesan ganjaran makanan, yang mempunyai implikasi penting untuk pengaruh insulin dalam subjek yang kurang berat badan dan gemuk. Beberapa kajian menunjukkan bahawa kesan pemakanan selepas makan, tidak kira sama ada laluan transduksi rasa utuh⁴⁷, meningkatkan pelepasan NAc DA dan pengukuhan tingkah laku positif^{37, 47}. Oleh itu, tindak balas insulin pasca penyerapan dapat mengekalkan hasil glikemik makan dan menyumbang kepada penguatan keutamaan dan kelakuan makanan yang membolehkan penggunaan. Walau bagaimanapun, perubahan paras insulin yang berlebihan dan kepekaan InsR pusat boleh memainkan peranan dalam kelakuan yang tidak normal dan juga penyesuaian. Sebagai contoh, hypoinsulinaemia dan upregulation kompensasi kepekaan InsR dalam subjek FR boleh menjadi faktor dalam pelupusan mereka untuk pesta⁴⁸. Sebaliknya, ketegangan insulin pusat dalam diabetes jenis II atau obesiti, yang dicerminkan di dalam tikus OB, boleh menyumbang kepada rasa ganjaran yang berkurangan setelah pengingesan, memandu pengambilan makanan dengan indeks glisemik tinggi sebagai pampasan^{49, 50}. Oleh itu, sama ada peningkatan atau penurunan sensitiviti insulin striatal boleh menyumbang kepada pemakanan patologi, mengakibatkan pesta makan dan / atau obesiti.

Secara keseluruhan, penemuan kami mendedahkan peranan baru untuk insulin sebagai isyarat imbalan. Peranan seperti ini berbeza dengan fungsi yang dikenali sebagai isyarat kenyang, termasuk penemuan baru-baru ini bahawa insulin microinjected ke dalam VTA dapat mengurangkan makan hedonik dan keutamaan untuk isyarat yang berkaitan dengan ganjaran makanan^{23, 24}. Ini menimbulkan persoalan tentang bagaimana peranan yang seolah-olah menentang insulin dalam fungsi-fungsi DA yang bergantung kepada ini boleh didamaikan. Jawapannya adalah bahawa kesan-kesan ini adalah pelengkap, bukannya bercanggah. Keputusan sekarang menunjukkan bahawa insulin di striatum menyampaikan nilai ganjaran makanan yang tertelan. Peranan dobel dalam memberi isyarat senyuman hanya boleh membenarkan insulin berfungsi dengan tujuan penting untuk mengakhiri makan, pada masa yang sama mewujudkan ingatan nutrisi dan kualiti yang bermanfaat, dengan itu menguatkan pengulangan tingkah laku pengingesan.

Pengendalian haiwan

Prosedur haiwan sesuai dengan garis panduan NIH dan diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan NYU School of Medicine. Semua haiwan berada di 12 h light: siklus gelap, dengan lampu dari 06: 00 ke 18: 00; bekas vivo irisan disediakan di antara 08: 00 dan 12: 00. Kajian mekanistik di tikus dan tikus AL dijalankan di Malaysia bekas vivo kepingan dari haiwan ditempatkan berpasangan, sedangkan tikus hanya ditempatkan untuk semua perbandingan kelompok diet dan untuk kajian tingkah laku.

Rat diet diet

Tikus Sprague-Dawley lelaki dewasa (Taconic) adalah berumur 8-10 berumur pada permulaan rejimen diet yang menampung hari 21-30. Tikus secara separuh rawak ditugaskan kepada kumpulan diet: subjek diberi peringkat oleh berat awal, maka setiap trio berturut-turut tikus diedarkan secara rawak di kalangan kumpulan diet. Tikus AL mempunyai akses percuma ke chow tikus untuk tempoh yang sama seperti tikus dipasangkan pada diet FR atau OB. Semua tikus mempunyai akses percuma ke air. Pembatasan makanan telah dilaksanakan seperti sebelum ini⁵¹; sebentar lagi, tikus menerima 40-50% pengambilan AL yang standard tikus chow setiap hari sehinggalah berat badan dikurangkan sebanyak 20%, selepas itu makanan dititrisi untuk mengekalkan berat badan ini. Tikus OB mempunyai akses percuma ke chow tikus dan coklat Pastikan, cecair yang sangat enak dengan lemak dan gula yang agak tinggi⁵².

Forebrain ChAT tikus kalah mati

Tikus dengan alel bersyarat bersyarat ChAT (ChAT^flox) diseberang dengan a Nkx2.1^Cre garis transgenik untuk menghasilkan tikus di mana ablasi sintesis ACh dihadkan kepada forebrain³². Kawalan transgenik bukan mutan adalah kawalan; genotip mereka Cre⁺;ChAT^{flox / +} dan Cre^-;ChAT^{flox / flox} dirujuk sebagai 'heterozygotes'. Tikus jantan dewasa digunakan untuk kajian kepingan iklan libitum akses kepada chow dan air.

Ex vivo penyediaan slice dan penyelesaian fisiologi

Tikus atau tikus telah sangat membesar dengan berat 50 mg^-1 pentobarbital (intraperitoneal (ip)) dan dipenggal. Untuk voltammetry, kepingan forebrain coronal (ketebalan 300-400-μm) dipotong pada microtome Bilah Leica VT1200S yang bergetar (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) dalam buffered buffered CSF (aCSF) (120); NaHCO₃ (20); glukosa (10); HEPES asid (6.7); KCl (5); HEPES garam natrium (3.3); CaCl₂ (2); dan MgSO₄ (2), disesuaikan dengan 95% O₂/ 5% CO₂. Irisan kemudian dikekalkan dalam larutan ini pada suhu bilik untuk 1 h sebelum eksperimen^{30, 32, 53}. Untuk elektrofisiologi, selepas pembiusan, tikus telah direbus transcardially dengan larutan ais sejuk yang mengandungi (dalam mM): sukrosa (225); KCl (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); NaH₂PO₄ (1.25); glukosa (7); askorbat (1); dan piruvat (3), dan disesuaikan dengan 95% O₂/ 5% CO₂. Irisan dipotong dalam larutan ini, kemudian dipindahkan ke ruang pemulihan dalam aCSF yang diubah suai (dalam mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); glukosa (25); askorbat (1); piruvat (3); dan myo-inositol (4), disesuaikan dengan 95% O₂/ 5% CO₂; penyelesaian ini pada mulanya di 34 ° C, kemudian dibenarkan untuk menyejukkan secara beransur-ansur ke suhu bilik⁵⁴. Semua eksperimen voltammetri dan fisiologi telah dijalankan di dalam ruang rakaman penyerapan di 32 ° C yang superfused pada 1.5 ml min^-1 dengan aCSF yang mengandungi (dalam mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); dan glukosa (10), dan albumin serum lembu (BSA, 0.05-0.1 mg ml^-1diselaraskan dengan 95% O₂/ 5% CO₂; hirisan dibenarkan untuk menyesuaikan diri dengan persekitaran ini untuk min 30 sebelum eksperimen.

Voltan cepat kitaran imbasan

Kajian keluaran DA yang dibangkitkan telah dijalankan menggunakan FCV dalam kepingan otak^{32, 53} disediakan dari tikus jantan atau ChAT tikus knockout forebrain dan kawalan heterozygote (minggu 5-8). Kajian di Malaysia ChAT tikus kalah mati telah dibutakan, tetapi kumpulan diet tikus mempunyai fenotip yang jelas yang menghalang pembilaan. Pengukuran voltammetrik dibuat dengan Voltammeter Millar (tersedia dengan permintaan khas kepada Dr Julian Miller di St Bartholomew dan Royal London School of Medicine dan Pergigian, University of London). Gelombang segitiga konvensional digunakan untuk FCV, dengan julat imbasan -0.7 hingga + 1.3 V (berbanding Ag / AgCl), kadar imbasan 800 V s^-1, dan jarak persampelan ms 100^{30, 32, 53}. Data telah diperoleh menggunakan papan DigiData 1200B A / D yang dikawal oleh perisian Clampex 7.0 (Peranti Molekul). Pembebasan DA ditimbulkan menggunakan elektrod merangsang konsentrik; amplitud nadi rangsangan adalah 0.4-0.6 mA dan durasi adalah 100 μs^{30, 32, 53}. Rangsangan pulsa tunggal tempatan digunakan dalam teras NAC dan CPu; Walau bagaimanapun, tren nadi frekuensi tinggi ringkas (lima denyutan pada 100 Hz) digunakan untuk menguatkan membangkitkan [DA]_o dalam cengkerang NAc. Kedua-dua paradigma rangsangan membangkitkan pengeluaran DA yang merupakan potensi tindakan dan Ca²⁺ bergantung, tidak terjejas oleh glutamat dan GABA yang dikeluarkan secara serentak^{42, 55}, dan difasilitasi secara serentak dikeluarkan ACh^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Untuk mengukur membangkitkan [DA]_o, elektrod telah dikalibrasi dengan kepekatan DA yang diketahui pada 32 ° C selepas setiap eksperimen di aCSF dan di hadapan setiap ubat yang digunakan semasa eksperimen yang diberikan⁵³.

Eksperimen Voltammetry untuk menilai kesan insulin pada membangkitkan [DA]_o telah diperoleh menggunakan dua protokol. Eksperimen awal untuk menentukan jangka masa untuk kesan insulin (Sigma, I5523) dilakukan dengan pemantauan menimbulkan [DA]_o setiap min 5 di satu tapak sahaja. Insulin digunakan selepas konsisten [DA]_o telah diperolehi (biasanya pengukuran 4-5); kesan insulin adalah maksimum selepas 50-60 min, dan kemudian menimbulkan [DA]_o kekal pada tahap ini untuk tempoh percubaan (biasanya jumlah pendedahan insulin min min 90; Rajah 1c). Selepas itu, kesan insulin telah dinilai dengan merekodkan membangkitkan [DA]_o di 4-5 diskret pada irisan (+ 1.5 mm dari bregma) di setiap tiga subregion di bawah keadaan kawalan (aCSF atau aCSF ditambah ubat) dan sekali lagi pada masa kesan insulin maksimal (sampling lebih min 60-80), maka sampel-sampel ini adalah purata bagi setiap subregion. Kesan insulin berkurang dengan masa selepas penyediaan slice; untuk meminimumkan masa bekas vivo dan untuk mengoptimumkan penggunaan haiwan, biasanya, dua keping dari haiwan tertentu telah diuji di ruang rakaman pada masa yang sama. Dadah yang digunakan untuk mencabar kesan insulin digunakan min 15 sebelum insulin melalui superfusing aCSF, termasuk HNMPA trisacetoxymethyl ester (HNMPA-AM_3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodophyllotoxin (PPP; Tocris), mecamylamine (Tocris) dan DHβE (Tocris). Seperti yang dijelaskan dalam Keputusan, sensitiviti yang mungkin diubah dari reseptor ACIC nikotinik di kalangan kumpulan diet diuji dengan membandingkan nisbah puncak [DA]_o dibangkitkan oleh 5 p (100 Hz) dengan yang dibangkitkan oleh 1 p membangkitkan (nisbah 5 p: 1 p)^{30, 31} dalam teras NAc di hadapan 0-500 nM nikotin (Sigma).

Penentuan V _maks dari membangkitkan [DA]_o transients dalam kepingan striatal

Untuk menilai perubahan yang disebabkan oleh insulin dalam pengambilan DA yang dikawal oleh DAT, bahagian awal fasa jatuh yang dibangkitkan [DA]_o lengkung dipasang pada persamaan Michaelis-Menten untuk diambil V_maks (kadar pengambilan maksimum pengambilan)⁵⁶. K_m (yang terbalik dengan kaitannya dengan DAT untuk DA) telah ditetapkan pada 0.2 μM dan diketahui sama di seluruh subregional striatal⁵⁷ dan tidak terjejas oleh insulin (lihat Tambahan 4 kapsyen).

Rakaman sel utuh

Irisan otak disediakan dari tikus-tikus 29-ke-35-hari tua; keadaan rakaman adalah sama dengan yang digunakan dalam kajian pelepasan DA. Rakaman semasa-clamp semasa menggunakan kaedah konvensional⁵⁴. Chri Striatal telah divisualisasikan menggunakan mikroskop Olympus BX51WI (Olympus America, Pusat Lembah, PA) dengan optik kontras inframerah-perbezaan inframerah dan matriks 40-perencangan air. Larutan pipet yang terkandung (dalam mM): K-gluconate (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl₂ (2); EGTA (1); Na₂-ATP (2); Na₃-GTP (0.3); dan diselaraskan kepada pH 7.2-7.3 dengan KOH. Bagi neuron yang direkodkan untuk dinilai untuk immunoreactivity ChAT, biocytin 0.3% dimasukkan dalam penyelesaian pipet dan neuron direkod secara ringkas (~ 5 min) untuk meminimumkan pencairan kandungan intrasel. Rintangan paip adalah ~ 3-5 MΩ. Rakaman diperolehi menggunakan penguat Axopatch 200B (Peranti Molekul, Sunnyvale CA) dan pasir rendah yang ditapis pada 2 kHz. ChIs telah dikenalpasti oleh kriteria elektrofisiologi yang telah ditetapkan²⁸; kebanyakannya aktif secara tonik pada mulanya, tetapi aktiviti berkurangan dengan berlainan selepas menampal. Walau bagaimanapun, tindak balas terhadap suntikan semasa secara amnya teguh dan konsisten dari masa ke masa, dan oleh itu digunakan untuk menyiasat kesan insulin terhadap keceriaan ChI (lihat Keputusan). Dalam eksperimen untuk memeriksa peranan InsRs dan IGF-1Rs dalam respon ini, sama ada HNMPA atau PPP telah dipohon sekurang-kurangnya 20 min sebelum ChI ditetap. Kesan maksimum insulin sahaja biasanya diperhatikan selepas ~ 16 min pendedahan, walaupun dalam sesetengah sel, peningkatan tidak maksimal hingga 50 min atau lebih lama. Lebih-lebih lagi, dalam empat daripada enam neuron yang direkodkan dalam PPP, insulin menyebabkan pengurangan awal bilangan spike sebelum pulih ke dan melebihi jumlah spek mula. Oleh itu, dalam semua eksperimen, kesan insulin diukur dengan membandingkan kesan maksimum ke atas bilangan spikel dengan jumlah pancang yang timbul segera sebelum aplikasi insulin. Perbezaan yang jelas dalam masa untuk mencapai kesan puncak dapat mencerminkan beberapa faktor, termasuk kedalaman sel yang direkam dalam kepingan. Potensi tindakan yang timbul juga direkodkan dalam ChIs dengan ketiadaan insulin pada titik masa yang setanding.

Kromatografi cecair berprestasi tinggi

Kandungan DA dari tikus striatal tikus (ketebalan 400-μm) ditentukan dengan menggunakan kromatografi cair prestasi tinggi dengan pengesanan elektrokimia⁵⁸. Pasangan slice telah disesuaikan untuk 30 min pada 32 ° C dalam aCSF, dan kemudian satu keping bagi setiap pasangan diinkubakan untuk tambahan 60 min pada 32 ° C dalam aCSF manakala yang lain diinkub dalam aCSF dengan 10 atau 30 nM insulin. Bagi perbandingan kumpulan diet, tisu striatal dikumpul antara 30-60 min selepas pemulihan. Berikutan inkubasi, aCSF yang berlebihan dikeluarkan dengan teliti dari kepingan, sampel tisu striatal (7-10 mg) ditimbang, beku pada ais kering dan kemudian disimpan di kemudian disimpan di -80 ° C. Pada hari analisis, sampel telah diawasi dalam ais sejuk, larut, deoxygenated dengan argon⁵⁸, berputar di microcentrifuge untuk min 2, dan supernatan yang disuntik terus ke ruang HPLC (BAS, West Lafayette, IN); pengesan adalah elektrod karbon berkelas di 0.7 V versus Ag / AgCl.

Imunohistokimia

Untuk pelabelan imunohistokimia, tikus telah dibius dengan natrium pentobarbital (50 mg kg^-1, ip), kemudian dilaraskan secara transcardially dengan PBS (154 mM NaCl dalam buffer 10 mM fosfat, pH 7.2) diikuti oleh paraformaldehyde 4% dalam PBS ini; otak dikeluarkan dan bahagian koronal (20 μm) dipotong dan diproses secara konvensional^{27, 59}. Imej immunofluorescence diperoleh dengan mikroskop confocal Nikon PM 800 dilengkapi dengan kamera digital yang dikawal oleh perisian Spot (Diagnostic Instruments Inc.) dan menggunakan objektif × 100 (aperture berangka = 1.4) atau dengan mikroskop konfigurasi Zeiss LSM 510 menggunakan × 63 objektif (aperture berangka = 1.2). Laser adalah Argon (488 nm), He / Ne (543 nm) dan He / Ne (633 nm). Penapis yang sesuai untuk setiap laser dipilih oleh perisian mikroskop confocal. Saiz pinhole bervariasi dengan objektif yang digunakan dan ketebalan seksyen dipilih dalam z-stack generation; kami memilih nilai pinhole optimum yang ditunjukkan oleh perisian (biasanya 30 μm). Fail digital dianalisis dengan perisian deconvolution (AutoQuant Imaging), dengan imej akhir yang diproses menggunakan Adobe Photoshop 7.0. Semua imej disesuaikan untuk kecerahan dan kontras; pelarasan sedemikian dibuat seragam ke semua bahagian imej. Aki striatal telah dikenal pasti dengan menggunakan dua antibodi TH: antibodi kelinci AB152 anti-TH (1: 800) dan tikus MAB318 monoclonal (1: 500) (kedua-duanya dari Chemicon). Tiga antibodi Inser digunakan: sc-57342 dan sc-09 (1: 100; Santa Cruz), dan PP5 (hadiah dari Pfizer). Keistimewaan masing-masing telah ditunjukkan sebelumnya^{60, 61}, dan telah disahkan dalam kajian-kajian ini dengan ketiadaan immunolabelling dengan antibodi sc-57342 atau PP5 di hadapan peptida menyekat yang sepadan. Antibodi ChAT adalah AB144 (1: 200; Millipore), dan biotin adalah dari Vektor (1: 200). Anti-kelenjar sekunder yang digunakan adalah anti-kelinci Alexa 488 (Invitrogen), atau kelinci anti kelinci Cy2 (Makmal Jackson, Bar Harbor, ME), keldai anti-kambing Cy3 (Jackson) dan keldai anti-tikus Cy5 (Jackson).

Untuk menilai penyetempatan bersama InsRs di aksons TH +, kami menggunakan kaedah yang diterangkan sebelum ini untuk mengenal pasti kehadiran Kir6.2, subunit pembentuk liang KP sensitif ATP⁺ saluran dalam axons DA²⁷. Puncta yang mewakili InsR telah diedarkan ke seluruh imej laras, menunjukkan bahawa superimpos dengan TH immunoreactivity mungkin berlaku sedikit sebanyak secara kebetulan. Untuk menguji andaian ini, kami mengira superimposisi InsR / TH dalam bidang bebas 42 dalam tiga bahagian immunolabelled NAC dari dua tikus. Fail digital InsR kemudian diputar 90 ° mengikut arah jam dan mengira bilangan yang diulang; putaran menurun jumlah punca InsR yang diselaraskan dengan TH dalam kebanyakan bidang (lihat Hasil). Pengurangan jumlah superimposisi dengan putaran²⁷ menunjukkan kadar punca insR di setiap bidang yang berkaitan dengan axons DA.

Glukosa darah dan insulin ELISA

Darah batang dikumpulkan pada masa pemusnahan untuk kajian keping. Glukosa darah ditentukan segera dengan monitor glukosa darah standard. Untuk insulin, darah tambahan dikumpulkan dalam tiub yang mengandungi EDTA dan disentrifugasi di 1,500g untuk min 15; supernatan (plasma) dikumpulkan dan disimpan pada -80 ° C sehingga diproses dengan ALPCO Rat Insulin ELISA kit.

Penempatan Cannula dan pengesahan histologi

Empat puluh satu tikus Sprague-Dawley lelaki dewasa (Taconic dan Charles River) pada mulanya menimbang 350-425 g anaesthetized dengan ketamin (100 mg kg^-1, ip) dan xylazine (10 mg kg^-1, ip) dan stereotaxically diimplan dengan dua cannulae panduan dalaman kronik (tolok 26) diletakkan bilateral 2.0 mm punggung ke tapak infusi di shell medial NAc⁶² (1.6 mm anterior ke bregma; 2.1 mm lateral ke jahitan sagittal, petua 8 ° arah ke garis tengah, 5.8 mm ventral ke permukaan tengkorak). Tikus diberi banamine (kg 2.0 mg^-1, subkutaneus) sebagai analgesik selepas pembedahan berikutan pemulihan daripada anestesia dan selepas pagi. Satu minggu selepas pembedahan, tikus diletakkan di FR (diterangkan di atas) dan dikekalkan pada 80% berat pemulihan selepas pembedahan mereka untuk selebihnya kajian. Penempatan Cannula ditentukan secara histologi selepas selesai ujian tingkah laku. Setiap tikus telah dibunuh dengan CO₂, dipenggal dan otak dikeluarkan dan dibetulkan dalam 10% formalin buffered selama> 48 jam. Bahagian korona beku (ketebalan 40-μm) dipotong pada Reichert-Jung Cryostat, dicairkan pada slaid kaca bersalut gelatin, dan diwarnai dengan kresil violet. Data dari tikus yang diberikan hanya digunakan jika kedua-dua kanula berada di dalam cangkang NAc medial⁶² (termasuk sempadan shell / teras atau shell / pencium tabung)Tambahan 5); berdasarkan kriteria ini, dua tikus dikecualikan daripada analisis akhir.

Pre-exposure pendedahan rasa-suka

Tikus menerima satu malam (di kandang rumah) dan enam sesi 30-min-per hari pendedahan terdahulu (dalam bilik ujian) ke 0.2% natrium sakarin (Sigma) dalam air dengan selang 48-h antara sesi. Tikus kemudian menerima dua sesi 5-min-per hari pendedahan kepada 0.2% natrium sakarin pada 0.05% anggur tanpa gula atau Kool-Aid ceri (Kraft Foods) di dalam air. Untuk sesi pra-pendedahan Kool-Aid yang pertama, separuh daripada tikus menerima penyelesaian merasakan ceri, dan separuh lagi menerima penyelesaian berperisa anggur. Perisa telah dibalikkan pada sesi pra pendedahan Kool-Aid kedua untuk memastikan bahawa semua tikus mengambil sampel setiap rasa. Pengambilan diukur untuk semua sesi pra pendedahan. Bilik ujian adalah sangkar plastik yang jelas dengan tempat tidur yang segar. Untuk semua sesi pra pendedahan, tikus mempunyai akses kepada penyelesaian yang sama di kedua-dua belah ruang. Kecuali sesi pra pendedahan semalaman, semua sesi dijalankan di bilik prosedur tingkah laku, dengan tempoh pembiakan 30-min sebelum sebarang latihan atau ujian.

Pengeringan satu botol

Kajian terdahulu menunjukkan bahawa microinjection InsAb ke hypothalamus ventrenedial dapat menghalang kesan insulin terhadap tingkah laku makan dan rembesan glucagon^{63, 64}. Di sini kami menggunakan pendekatan ini untuk menilai kemungkinan peranan insulin dalam penguatkan pilihan makanan. Tikus secara semi-rawak ditugaskan berdasarkan purata jumlah pengambilan pra-pendedahan kepada dua kumpulan, kawalan atau percubaan (InsAb). Dalam kumpulan kawalan, tikus menerima kenderaan (microinjection PBS; 137 mM NaCl dan 2.7 mM KCl dalam buffer 10 mM phosphate) atau IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl^-1 di PBS, seperti yang diterima) microinjection dalam cangkang NAc sebelum memakan salah satu daripada dua larutan berperisa, dan microinjection mock sebelum memakan penyelesaian berperisa yang lain. Dalam kumpulan eksperimen, tikus menerima microinjection shell NAc InsAb (Abcam ab46707; 0.5 μl 1 μg μl^-1 di PBS, seperti yang diterima) sebelum terdedah kepada satu penyelesaian berperisa, dan pendedahan microinjection terdedah kepada yang lain. Dua set subjek dengan penggantian antara microinjection cecair dan mikrojek penyuntik telah digunakan, sehingga jumlah penyuntik mikro telah terhad kepada empat, dengan itu mengurangkan kemungkinan kerosakan tisu dan hilangnya kepekaan di tapak mikrojeksi⁶⁵. Untuk suntikan mikro cecair, penyelesaian kawalan atau InsAb telah dimuatkan ke dalam dua panjang 30-cm PE-50 tiub melekat pada satu hujung untuk picagari 5 ul Hamilton dipenuhi dengan air suling dan pada hujung yang lain untuk 31-gauge penyuntik Kanula, yang dilanjutkan 2.0 mm di luar panduan yang ditanamkan. Jumlah infusi μl 0.5 dihantar melalui 90 s pada kadar 0.005 μl s^-1; penyuntik telah ditinggalkan untuk ~ 60 s untuk membolehkan masa untuk penyebaran, maka penyuntik telah digantikan dengan stylet.

Tikus telah dipindahkan terus ke bilik-bilik perilaku dalam 2 min penyempurnaan microinjection atau mikrojeksi penyesalan. Penyelesaian penyaman mengandungi 0.2% natrium sakarin, 0.05% buah anggur tanpa gula atau Kool-Aid ceri, dan glukosa 0.8%. Akses penyelesaian terhad kepada min 30 setiap sesi. Perasa yang disandingkan dan sisi bilik dengan akses minum telah ditugaskan separa rawak dan diimbangi dalam setiap kumpulan. Jeda antara microinjections adalah sekurang-kurangnya 72 h, bergantian antara sesi infusi dan mock untuk sejumlah lapan sesi penyaman.

Ujian keutamaan dua botol

Empat puluh lapan jam selepas sesi penyaman terakhir, tikus diletakkan di dalam bilik ujian dengan akses serentak kepada kedua-dua permaidani; penyelesaiannya ialah 0.2% natrium sakarin dalam anggur 0.05 atau ceri Kool-Aid, tanpa glukosa. Ujian berlaku sepanjang hari 2 (min 60 sehari). Posisi tabung minum yang mengandungi larutan yang dipadankan atau dipasangkan dengan penyusutan atau penyerapan telah diganti untuk memastikan setiap tikus diuji untuk penggunaan setiap larutan di kedua sisi sangkar. Pengambilan setiap penyelesaian berperisa adalah purata untuk dua hari ujian untuk menentukan keutamaan.

[³H] DA pengambilan dalam synaptosomes striatal untuk menilai keberkesanan InsAb

Synaptosomes Striatal^{21, 66} disediakan dari tikus AL (lelaki, 350-400 g), dengan NAc (shell dan inti) dan CPu dibedah dan disediakan secara berasingan. Tisu dari setiap rantau dihomogenkan dalam jumlah 15 daripada larutan 0.32 M sucrose yang sejuk-dingin dalam homogenizer gelas dengan pungle Teflon yang didorong oleh motor; selepas membilas dan sentrifugasi, pelet terakhir digantung semula dalam ais sejuk 0.32 M sucrose^{21, 66}. Sebelum memulakan [³H] DA pengambilan ujian⁶⁶, Aliquots synaptosomal dalam jumlah dagangan sebanyak 180 ul penimbal pengambilan dieram dalam shaker untuk 15 min pada 30 ° C dengan kehadiran atau ketiadaan 30 nM insulin, di dalam kenderaan (PBS) atau dalam InsAb (akhir pencairan 1: 500) , dalam IgG (pencairan akhir 1: 500) atau dalam kenderaan. Penampan penyerapan yang terkandung (dalam mM): NaCl (122); Na₂HPO₄ (3); NaH₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); glukosa (10), CaCl₂ (1); nialamide (0.01); tropon (0.1); dan asid askorbik (0.001), pH 7.4. Pengambilan [³H] DA dimulakan dengan cepat mengeluarkan 20 μl setiap penggantian sinaptosomal ke dalam pinggan 96 dengan kepekatan yang berbeza-beza DA (0.003-1.0 μM) dan [³H] DA (5 nM); selepas 5 min dalam pengapit plat di 25 ° C, pengambilan ditamatkan oleh penyaringan vakum yang sejuk dan cepat⁶⁶. Jumlah per telur ditukar kepada pmoles, kemudian diperbetulkan kepada mg jumlah protein per minit. Kesemua ujian dilakukan dalam tiga kali ganda dan berulang sekurang-kurangnya empat kali; V_maks and K_m telah dikira menggunakan perisian Biosoft Kell Radlig (Cambridge, UK).

Analisis statistik

Data diberikan secara beransur-ansur; kepentingan dinilai menggunakan pelajar yang berpasangan atau tidak berpasangan t-tests atau ANOVA, melainkan dinyatakan sebaliknya. Untuk data voltammetry, n adalah bilangan laman rakaman, memandangkan variabilitas tapak-ke-tapak dalam subregion striatal adalah lebih besar daripada kepelbagaian antara haiwan atau antara kepingan^{30, 32, 55, 56}; nombor haiwan dicatatkan bagi setiap set data. The EC₅₀ untuk kesan insulin dan nikotin pada puncak yang ditimbulkan [DA]_o telah dikira menggunakan Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Untuk data elektrofisiologi, kepentingan statistik dinilai menggunakan pasangan t- Ujian atau ujian Wilcoxon dalam Prism 6.0, atau ANOVA dua hala campur dalam SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Untuk penilaian penglibatan insulin dalam penyesuaian rasa-pilihan, dua kajian penuh telah selesai menggunakan protokol yang sama dengan pengecualian rawatan kenderaan yang digunakan. Dalam kajian pertama, tikus 10 menerima infus kenderaan PBS dan 9 menerima suntikan InsAB. Dalam kajian kedua, tikus 10 menerima infus kenderaan IgG dan 10 yang menerima infus InsAb. Tidak terdapat perbezaan yang signifikan antara kedua-dua kumpulan kenderaan (PBS atau IgG) semasa sesi penyusunan infusi (F₁₉= 0.619, campuran ANOVA dua hala) dengan langkah berulang pada sesi pemanasan infusi) atau pada ujian (F₁₉= 0.012, ANOVA bercampur dua hala dengan langkah berulang pada rasa). Oleh itu, kedua-dua eksperimen digabungkan untuk analisis. Untuk analisis ini, ANOVA bercampur 2 × 4 (dengan langkah berulang pada hari penghawa infusi) digunakan untuk menentukan kesan rawatan mikroinjek semasa pengkondisian, diikuti oleh perlindungan t-tests (satu ekor untuk menentukan di mana rawatan penyejatan microinjection menurun jumlah pengambilan). Analisis yang sama telah disiapkan untuk sesi penyaman udara. Untuk menentukan kesan rawatan penghawa dingin semasa ujian kecenderungan rasa dua botol, data dianalisis menggunakan ANOVA campuran dua hala (dengan langkah berulang pada rasa), diikuti oleh perlindungan t-test (satu ekor untuk menguji hipotesis InsAb akan menurunkan keutamaan).

Bagaimana untuk memetik artikel ini: Stouffer, MA et al. Insulin meningkatkan pembebasan dopamin stigat dengan mengaktifkan interneuron cholinergik dan dengan itu menandakan ganjaran. Nat. Komun. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, reseptor Insulin RB dan tindakan insulin di otak: tinjauan dan implikasi klinikal. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 855-872 (2000).
   • CAS
   • ISI
   • PubMed
   • Artikel
   • Tunjukkan konteks
2. Gerozissis, K. Insulin otak, homeostasis tenaga dan glukosa; gen, persekitaran dan patologi metabolik. Eur. J. Pharmacol. 585, 38-49 (2008).
3. CAS
4. PubMed
5. Artikel
6. Tunjukkan konteks
7. CAS
8. PubMed
9. Artikel
10. Tunjukkan konteks
11. CAS
12. PubMed
13. Artikel
14. Tunjukkan konteks
15. CAS
16. PubMed
17. Artikel
18. Tunjukkan konteks
19. CAS
20. ISI
21. PubMed
22. Artikel
23. Tunjukkan konteks
24. ISI
25. PubMed
26. Artikel
27. Tunjukkan konteks
28. CAS
29. PubMed
30. Artikel
31. Tunjukkan konteks
32. Tunjukkan konteks
33. CAS
34. ISI
35. PubMed
36. Artikel
37. Tunjukkan konteks
38. CAS
39. ISI
40. PubMed
41. Artikel
42. Tunjukkan konteks
43. CAS
44. ISI
45. PubMed
46. Tunjukkan konteks
47. ISI
48. PubMed
49. Artikel
50. Tunjukkan konteks
51. CAS
52. ISI
53. PubMed
54. Artikel
55. Tunjukkan konteks
56. CAS
57. ISI
58. PubMed
59. Artikel
60. Tunjukkan konteks
61. Tunjukkan konteks
62. CAS
63. ISI
64. PubMed
65. Artikel
66. Tunjukkan konteks
67. CAS
68. ISI
69. PubMed
70. Artikel
71. Tunjukkan konteks
72. CAS
73. ISI
74. PubMed
75. Artikel
76. Tunjukkan konteks
77. PubMed
78. Artikel
79. Tunjukkan konteks
80. Tunjukkan konteks
81. CAS
82. PubMed
83. Artikel
84. Tunjukkan konteks
85. ISI
86. PubMed
87. Artikel
88. Tunjukkan konteks
89. CAS
90. ISI
91. PubMed
92. Artikel
93. Tunjukkan konteks
94. CAS
95. ISI
96. PubMed
97. Artikel
98. Tunjukkan konteks
99. CAS
100. PubMed
101. Artikel
102. Tunjukkan konteks
103. Tunjukkan konteks
104. CAS
105. ISI
106. PubMed
107. Artikel
108. Tunjukkan konteks
109. CAS
110. ISI
111. PubMed
112. Artikel
113. Tunjukkan konteks
114. CAS
115. ISI
116. PubMed
117. Artikel
118. Tunjukkan konteks
119. CAS
120. ISI
121. PubMed
122. Artikel
123. Tunjukkan konteks
124. PubMed
125. Artikel
126. Tunjukkan konteks
127. CAS
128. ISI
129. PubMed
130. Artikel
131. Tunjukkan konteks
132. CAS
133. PubMed
134. Artikel
135. Tunjukkan konteks
136. CAS
137. ISI
138. PubMed
139. Artikel
140. Tunjukkan konteks
141. CAS
142. PubMed
143. Artikel
144. Tunjukkan konteks
145. ISI
146. PubMed
147. Artikel
148. Tunjukkan konteks
149. Tunjukkan konteks
150. Tunjukkan konteks
151. CAS
152. ISI
153. PubMed
154. Artikel
155. Tunjukkan konteks
156. CAS
157. ISI
158. PubMed
159. Artikel
160. Tunjukkan konteks
161. CAS
162. ISI
163. PubMed
164. Artikel
165. Tunjukkan konteks
166. CAS
167. ISI
168. PubMed
169. Artikel
170. Tunjukkan konteks
171. CAS
172. ISI
173. PubMed
174. Tunjukkan konteks
175. CAS
176. ISI
177. PubMed
178. Artikel
179. Tunjukkan konteks
180. PubMed
181. Artikel
182. Tunjukkan konteks
183. CAS
184. ISI
185. PubMed
186. Artikel
187. Tunjukkan konteks
188. CAS
189. ISI
190. PubMed
191. Artikel
192. Tunjukkan konteks
193. CAS
194. ISI
195. PubMed
196. Artikel
197. Tunjukkan konteks
198. CAS
199. ISI
200. PubMed
201. Artikel
202. Tunjukkan konteks
203. Tunjukkan konteks
204. CAS
205. ISI
206. PubMed
207. Tunjukkan konteks
208. Tunjukkan konteks
209. Tunjukkan konteks
210. Tunjukkan konteks
211. CAS
212. ISI
213. PubMed
214. Artikel
215. Tunjukkan konteks
216. CAS
217. PubMed
218. Artikel
219. Tunjukkan konteks
220. CAS
221. ISI
222. PubMed
223. Tunjukkan konteks
224. Tunjukkan konteks
225. CAS
226. PubMed
227. Artikel
228. Tunjukkan konteks
229. ISI
230. PubMed
231. Artikel
232. Tunjukkan konteks
233. Tunjukkan konteks
234. ISI
235. PubMed
236. Artikel
237. Tunjukkan konteks
238. Tunjukkan konteks
239. CAS
240. ISI
241. PubMed
242. Artikel
243. Tunjukkan konteks
244. Tunjukkan konteks
245. Isyarat insulin Vogt, MC & Bruning, JC CNS dalam kawalan homeostasis tenaga dan metabolisme glukosa - dari embrio hingga usia tua. Tren Endokrinol. Metab. 24, 76–84 (2013).
246. Havrankova, J., Schmechel, D., Roth, J. & Brownstein, M. Pengenalpastian insulin pada otak tikus. Pro. Natl Acad. Sains. USA 75, 5737–5741 (1978).
247. King, GL & Johnson, S. Pengangkut insulin yang dimediasi oleh reseptor ke sel endotel. Sains 227, 1583–1586 (1985).
248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC Insulin respons dan tahap glukosa dalam plasma dan cecair serebrospinal semasa berpuasa dan memberi makan pada tikus. Fisiol. Behav. 44, 205–208 (1988).
249. Banks, WA & Kastin, AJ Kebolehtelapan perbezaan penghalang darah-otak terhadap dua peptida pankreas: insulin dan amilin. Peptida 19, 883–889 (1998).
250. Bank, WA Sumber insulin serebrum. Eur. J. Pharmacol. 490, 5-12 (2004).
251. Nemoto, T. et al. Penemuan baru mengenai sintesis insulin dan rembesannya pada hippocampus dan korteks serebrum: pengurangan amiloid-β1-42 yang disebabkan oleh tahap proinsulin melalui glikogen sintase kinase-3β. Isyarat Sel. 26, 253-259 (2014).
252. De Souza, CT et al. Penggunaan diet yang kaya lemak mengaktifkan tindak balas proinflamasi dan mendorong ketahanan insulin dalam hipotalamus. Endokrinologi 146, 4192-4199 (2005).
253. Anthony, K. et al. Penolakan respon insulin yang ditimbulkan dalam rangkaian otak mengawal selera dan ganjaran dalam rintangan insulin: asas otak untuk mengawal pengurangan pengambilan makanan dalam sindrom metabolik? Diabetes 55, 2986-2992 (2006).
254. Kelley, AE & Berridge, KC Ilmu saraf mengenai ganjaran semula jadi: perkaitan dengan ubat ketagihan. J. Neurosci. 22, 3306–3311 (2002).
255. Koob, GF & Volkow, ND Neurocircuitry ketagihan. Neuropsikofarmakologi 35, 217–238 (2010).
256. Werther, GA et al. Penyetempatan dan pencirian reseptor insulin pada otak tikus dan kelenjar pituitari menggunakan vitro autoradiography dan densitometry berkomputer. Endokrinologi 121, 1562-1570 (1987).
257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. & Baskin, DG Ekspresi reseptor untuk insulin dan leptin di kawasan tegmental ventral / substantia nigra (VTA / SN) tikus. Otak Res. 964, 107–115 (2003).
258. Daws, LC et al. Isyarat dan ketagihan insulin. Neuropharmacology 61, 1123-1128 (2011).
259. Figlewicz, DP & Sipols, isyarat peraturan AJ Energy dan ganjaran makanan. Farmakol. Biokimia. Behav. 97, 15–24 (2010).
260. Patterson, TA et al. Kekurangan makanan mengurangkan mRNA dan aktiviti pengangkut tikus dopamin. Neuroendokrinologi 68, 11-20 (1998).
261. Carvelli, L. et al. Peraturan PI 3-kinase pengambilan dopamin. J. Neurochem. 81, 859-869 (2002).
262. Williams, JM et al. Hypoinsulinemia mengawal pengangkutan dopamine yang terbalik akibat amphetamine. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Sekatan makanan kronik dan fungsi pengangkut dopamin dalam striatum tikus. Otak Res. 1082, 98–101 (2006).
264. Schoffelmeer, AN et al. Insulin memodulasi fungsi pengangkut monoamin sensitif cocaine dan tingkah laku impulsif. J. Neurosci. 31, 1284-1291 (2011).
265. Insulin Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL di kawasan tegmental ventral mengurangkan pemberian hedonik dan menekan kepekatan dopamin melalui peningkatan pengambilan semula. Eur. J. Neurosci. 36, 2336–2346 (2012).
266. Labouebe, G. et al. Insulin menggalakkan kemurungan jangka panjang neuron dopamine kawasan tegar ventralan melalui endokannabinoid. Nat. Neurosci. 16, 300-308 (2013).
267. Konner, AC et al. Peranan untuk isyarat insulin dalam neuron katekolaminergik dalam mengawal homeostasis tenaga. Metab Sel. 13, 720-728 (2011).
268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Insulin bertindak di laman CNS yang berbeza untuk mengurangkan pengambilan sukrosa akut dan pemberian sendiri sukrosa pada tikus. Am. J. Physiol. Peraturan. Bersepadu. Komp. Fisiol. 295, R388 – R394 (2008).
269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Peraturan kedua dari pelepasan dopamin striatal oleh pra-sinaptik K_ATP saluran. J. Neurochem. 118, 721-736 (2011).
270. Tepper, JM & Bolam, JP Kepelbagaian fungsi dan kekhususan interneuron neostriatal. Curr. Pendapat. Neurobiol. 14, 685-692 (2004).
271. Zhou, FM, Liang, Y. & Dani, JA Aktiviti kolinergik nikotinik endogen mengatur pelepasan dopamin dalam striatum. Nat. Neurosci. 4, 1224–1229 (2001).
272. Rice, ME & Cragg, SJ Nicotine menguatkan isyarat dopamin yang berkaitan dengan ganjaran dalam striatum. Nat. Neurosci. 7, 583–584 (2004).
273. Zhang, H. & Sulzer, D. Modulasi bergantung kepada frekuensi pembebasan dopamin oleh nikotin. Nat. Neurosci. 7, 581–582 (2004).
274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME & Machold, RP Menentang peraturan pelepasan dopamin striatal dan tingkah laku motor eksplorasi oleh input kolinergik otak depan dan otak. Nat. Komuniti. 3, 1172 (2012).
275. Threlfell, S. et al. Pembebasan dopamin striatal dicetuskan oleh aktiviti segerak dalam interneuron cholinergik. Neuron 75, 58-64 (2012).
276. Cachope, R. et al. Pengaktifan selektif interneuron cholinergik meningkatkan pelepasan dopamine phumbic accumbal: menetapkan nada untuk pemprosesan ganjaran. Rep Sel 2, 1-9 (2012).
277. Jones, IW, Bolam, JP & Wonnacott, S. Penyetempatan presynaptik dari reseptor nikotinik asetilkolin beta2 subunit imunoreaktiviti pada neuron dopaminergik nigrostriatal tikus. J. Komp. Neurol. 439, 235–247 (2001).
278. Higley, MJ et al. Internuron Cholinergik memeterai penghantaran glutamaterg yang bergantung kepada VGluT3 yang cepat di striatum. PLOS ONE 6, e19155 (2011).
279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. Pengaktifan reseptor menyerupai dopamin D1 dalam nukleus accumbens sangat penting untuk pemerolehan, tetapi bukan ungkapan, keutamaan rasa yang dikekalkan nutrien pada tikus. Eur. J. Neurosci. 27, 1525–1533 (2008).
280. Sclafani, A., Touzani, K. & Bodnar, RJ Dopamine dan mempelajari pilihan makanan. Fisiol. Behav. 104, 64–68 (2011).
281. Pemberian isyarat insulin Mayer, CM & Belsham, DD Central dikurangkan dengan pendedahan insulin jangka panjang melalui fosforilasi serine substrat-1 reseptor insulin, degradasi proteasomal, dan degradasi reseptor insulin lisosom. Endokrinologi 151, 75–84 (2010).
282. Pelepasan Rice, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Dopamine di ganglia basal. Neurosains 198, 112–137 (2011).
283. Sumbangan Smith, Y., Surmeier, DJ, Redgrave, P. & Kimura, M. Thalamic terhadap peralihan dan pengukuhan tingkah laku yang berkaitan dengan ganglia basal. J. Neurosci. 31, 16102–16106 (2011).
284. Threlfell, S. et al. Reseptor muscarinik striatal menggalakkan ketergantungan aktiviti penghantaran dopamine melalui subtip penerima reseptor yang berbeza pada interneuron cholinergik dalam ventral berbanding striatum dorsal. J. Neurosci. 30, 3398-3408 (2010).
285. Hoebel, BG, Avena, NM & Rada, P. Mengumpulkan keseimbangan dopamin-asetilkolin dalam pendekatan dan penghindaran. Curr. Pendapat. Farmakol. 7, 617–627 (2007).
286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG Makan yang terhad dengan penurunan berat badan secara selektif mengurangkan dopamin ekstraselular dalam nukleus yang sesuai dan mengubah tindak balas dopamin terhadap amfetamin, morfin, dan pengambilan makanan. J. Neurosci. 15, 6640–6650 (1995).
287. Geiger, BM et al. Defisit mesoprak dopamin neurotransmission dalam obesiti diet tikus. Neurosains 159, 1193-1199 (2009).
288. Morris, JK et al. Rintangan insulin merosakkan fungsi dopamin nigrostriat. Exp. Neurol. 231, 171-180 (2011).
289. De Araujo, IE et al. Ganjaran makanan dengan ketiadaan isyarat reseptor rasa. Neuron 57, 930-941 (2008).
290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM Hubungan antara obesiti dan tindak balas striatal tumpul terhadap makanan disederhanakan oleh alel TaqIA A1. Sains 322, 449-452 (2008).
291. Wang, GJ et al. Dopamine otak dan obesiti. Lancet 357, 354-357 (2001).
292. Reseptor Johnson, PM & Kenny, PJ Dopamine D2 dalam disfungsi ganjaran seperti ketagihan dan makan kompulsif pada tikus gemuk. Nat. Neurosci. 13, 635–641 (2010).
293. Carr, KD, Kim, G.-Y. & Cabeza de Vaca, S. Kesan ganjaran dan pengaktifan lokomotor dari agonis reseptor dopamin langsung ditambah dengan sekatan makanan kronik pada tikus. Psikofarmakologi (Berl.) 154, 420–428 (2001).
294. Levin, BE & Keesey, RE Pertahanan mengenai perbezaan berat badan yang berbeza pada tikus obes dan tahan yang disebabkan oleh diet. Am. J. Physiol. 274, R412 – R419 (1998).
295. Patel, JC & Rice, ME Memantau pelepasan dopamin aksonal dan somatodendritik menggunakan voltammetri siklik imbasan pantas dalam kepingan otak. Kaedah Mol. Biol. 96, 243–273 (2013).
296. Lee, CR, Witkovsky, P. & Rice, ME Peraturan substansia nigra pars reticulata GABAergik neuron aktiviti oleh H₂O₂ melalui saluran sensitif asid flufenamik dan K_ATP saluran. Depan. Syst. Neurosci. 5, 14 (2011).
297. Chen, BT, Moran, KA, Avshalumov, MV & Rice, ME Peraturan terhad pelepasan dopamin somatodendritik oleh Ca sensitif voltan²⁺ saluran berbanding dengan peraturan pembebasan dopamin akson yang kuat. J. Neurochem. 96, 645-655 (2006).
298. Li, X. et al. Peningkatan penghantaran dopamine dan prestasi motor dengan jangkitan LRRK2 pada tikus disingkirkan oleh G2019S mutasi penyakit Parkinson keluarga. J. Neurosci. 30, 1788-1797 (2010).
299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Penentuan parameter pelepasan dan pengambilan dari dinamika dopamin yang digerakkan secara elektrik yang diukur oleh voltametri masa nyata. J. Neurosci. Kaedah 112, 119–133 (2001).
300. Chen, BT, Avshalumov, MV & Rice, ME H₂O₂ adalah novel, modulator endogen pelepasan dopamine sinaptik. J. Neurophysiol. 85, 2468-2476 (2001).
301. Witkovsky, P., Patel, JC, Lee, CR & Rice, ME Pengenalpastian imunoktokimia protein yang terlibat dalam pembebasan dopamin dari petak somatodendritik neuron dopaminergik nigral. Neurosains 164, 488–496 (2009).
302. Sugimoto, K. et al. Reseptor insulin dalam saraf periferi tikus: lokasinya dan alternatifnya sformed isoforms. Metab Diabetes. Res. Wahyu 16, 354-363 (2000).
303. Sanchez-Alavez, M. et al. Insulin menyebabkan hyperthermia oleh perencatan langsung neuron sensitif panas. Diabetes 59, 43-50 (2010).
304. Paxinos, G. & Watson, C. Otak Tikus dalam Stereotaxic Coordinates 6th edn Academic (2007).
305. Strubbe, JH & Mein, CG Peningkatan makan sebagai tindak balas terhadap suntikan antibodi insulin dua hala di VMH. Physiol Behav. 19, 309–313 (1977).
306. Paranjape, SA et al. Pengaruh insulin pada hypothalamus ventromedial pada rembesan glukagon pankreas dalam vivo. Diabetes 59, 1521-1527 (2010).
307. Wise, RA & Hoffman, DC Penyetempatan mekanisme ganjaran ubat dengan suntikan intrakranial. Sinaps 10, 247–263 (1992).
308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK & Reith, MEA Interaksi antara analog hidroksipiperidin bagi 4- (2-benzhydryloxy-ethyl) -1- (4-fluorobenzyl) piperidine and aspartate 68 in pengangkut dopamin manusia. Eur. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Muat turun rujukan

Kajian-kajian ini disokong oleh geran NIH DA033811 (MER, KDC dan MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) dan NARSAD Independent Investigator Award (KDC). S961 adalah hadiah murah hati dari Dr Lauge Schaffer, Novo Nordisk. Antibodi PP5 adalah hadiah yang murah hati dari Pfizer. Kami berterima kasih kepada Dr Charles Nicholson, Sekolah Perubatan NYU untuk mendapatkan perisian V_maks nilai dari data FCV.