Psikiatri Hadapan. 2018; 9: 81.
Diterbitkan dalam talian 2018 Mar 12. doi: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun Park,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* and Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Abstrak
Latar Belakang
Penggunaan Internet dan permainan dalam talian secara ketagihan ialah gangguan psikiatri yang berpotensi yang dinamakan gangguan permainan Internet (IGD). Profil ekspresi mikroRNA (miRNA) yang diubah telah dilaporkan dalam darah dan tisu otak pesakit yang mengalami gangguan psikiatri tertentu dan dicadangkan sebagai biomarker. Walau bagaimanapun, tiada laporan mengenai profil miRNA darah dalam IGD.
Kaedah
Untuk menemui miRNA yang berkaitan dengan IGD, kami menganalisis profil ekspresi miRNA daripada 51 sampel (25 IGD dan 26 kawalan) menggunakan TaqMan Low Density miRNA Array. Untuk pengesahan, kami melakukan PCR transkripsi terbalik kuantitatif dengan 36 sampel bebas (20 IGD dan 16 kawalan).
Hasil
Melalui penemuan dan pengesahan bebas, kami mengenal pasti tiga miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p) yang dikurangkan dengan ketara dalam kumpulan IGD. Individu yang mempunyai ketiga-tiga perubahan miRNA mempunyai risiko IGD yang lebih tinggi daripada mereka yang tidak mengalami perubahan [nisbah odds (OR) 22, 95% CI 2.29-211.11], dan OR meningkatkan dos bergantung dengan bilangan miRNA yang diubah. Gen sasaran yang diramalkan bagi tiga miRNA dikaitkan dengan laluan saraf. Kami meneroka ekspresi protein tiga gen sasaran hiliran oleh western blot dan mengesahkan bahawa ekspresi GABRB2 dan DPYSL2 jauh lebih tinggi dalam kumpulan IGD.
Kesimpulan
Kami melihat bahawa ungkapan hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, dan hsa-miR-652-3p telah dikurangkan dalam pesakit IGD. Keputusan kami akan membantu untuk memahami patofisiologi IGD.
Pengenalan
Penggunaan Internet dan permainan berasaskan Internet secara ketagihan bukan sekadar fenomena sosial di negara yang mempunyai infrastruktur capaian Internet yang luas, tetapi potensi gangguan psikiatri yang disebut gangguan permainan Internet (IGD) (1-3). Menurut laporan epidemiologi, kadar prevalens IGD pada remaja berbeza-beza di seluruh negara, antara 0.8 hingga 26.7% (4). Khususnya, kajian menunjukkan kadar prevalens melebihi 10% dalam kalangan remaja di banyak negara Asia seperti Korea Selatan, China, Taiwan, Hong Kong, dan Singapura (4). IGD dikaitkan dengan kemerosotan dalam kognisi, hubungan psiko-sosial, dan kehidupan seharian; contohnya, kemerosotan prestasi akademik atau pekerjaan (4-7). IGD kini dimasukkan dalam Bahagian III (Syarat untuk Kajian Lanjut) semakan kelima Manual Diagnostik dan Statistik Gangguan Mental (DSM-V) (8). Walau bagaimanapun, di sebalik kepentingan klinik-sosialnya, sedikit yang diketahui tentang mekanisme genetik molekul di sebalik IGD.
Kajian berkembar berskala besar baru-baru ini telah mencadangkan latar belakang genetik kepada IGD (9, 10). Vink et al. menyiasat perbezaan individu dalam penggunaan Internet kompulsif dengan 5,247 kembar remaja monozigotik dan dizygotik dalam Daftar Berkembar Belanda dan melaporkan bahawa 48% daripada perbezaan itu dijelaskan oleh faktor genetik (9). Li et al. memerhatikan 825 pasangan kembar remaja Cina dan melaporkan bahawa faktor genetik menjelaskan 58–66% daripada perbezaan (10). Sehubungan itu, polimorfisme gen yang terlibat dalam penghantaran neuro, kognisi, dan perhatian seperti gen D2 reseptor dopamin (DRD2), gen katekolamin-O-metiltransferase (COMT), gen pengangkut serotonin (5HTTLPR), dan reseptor kolinergik nikotinik alpha 4 gen (CHRNA4) telah dilaporkan secara signifikan dikaitkan dengan ketagihan Internet (11-13). Baru-baru ini, Kim et al. menapis varian lebih daripada 100 gen calon yang berkaitan dengan pengeluaran, tindakan dan metabolisme neurotransmitter oleh analisis penjujukan generasi akan datang dan melaporkan bahawa rs2229910 daripada NTRK3 gen dikaitkan dengan IGD (14).
Sebagai tambahan kepada faktor genetik, ia juga diketahui bahawa fenotip neurobehavioral dikawal secara epigenetik oleh RNA bukan pengekodan termasuk mikroRNA (miRNA) (15, 16). miRNA ialah molekul RNA untai tunggal bukan pengekodan kecil (kira-kira 20-23 nukleotida panjangnya), yang secara negatif mengawal ekspresi gen pengekodan protein dengan merendahkan mRNA dan memainkan peranan penting dalam proses patofisiologi pelbagai penyakit (17). Barisan bukti telah menunjukkan bahawa miRNA banyak terdapat dalam sistem saraf pusat manusia (CNS) dan bertindak untuk menyesuaikan tahap ekspresi gen sasaran mereka, yang terlibat dalam pembangunan dan pematangan sistem CNS (15). Malah, kajian baru-baru ini telah mendedahkan bahawa profil ekspresi miRNA diubah dalam tisu otak pesakit yang mengalami gangguan psikiatri, menunjukkan bahawa profil ekspresi mereka boleh menjadi biomarker untuk gangguan psikiatri (15, 16, 18). Sebagai contoh, melalui analisis postmortem, Lopez et al. melaporkan bahawa ekspresi miR-1202, yang mengawal ekspresi gen reseptor-4 glutamat metabotropik dan meramalkan tindak balas terhadap antidepresan, telah dikurangkan dalam tisu korteks prefrontal pesakit gangguan kemurungan utama (19). Dari segi pemeriksaan biomarker, pendekatan ini mempunyai had yang jelas kerana melakukan biopsi tisu CNS untuk pemeriksaan adalah mustahil. Memandangkan miRNA boleh dikesan dalam darah (plasma atau serum), miRNA yang beredar mempunyai kelebihan yang pasti sebagai biomarker bukan invasif dalam gangguan neuropsikiatri. Walau bagaimanapun, sehingga kini, tidak ada kajian tentang mengedarkan profil miRNA dalam IGD. Pemahaman yang lebih baik tentang profil ekspresi miRNA yang beredar boleh membantu untuk menjelaskan mekanisme pembangunan IGD dan memudahkan terjemahan klinikal.
Dalam kajian ini, kami bertujuan untuk mengenal pasti penanda miRNA yang berkaitan dengan IGD dengan memerhatikan miRNA plasma yang dinyatakan secara berbeza antara IGD dan kumpulan kawalan dan meneroka implikasi biologi mereka.
Bahan dan Kaedah
Subjek Kajian
Kami meninjau 3,166 remaja (berumur 12–18 tahun) menggunakan pemarkahan IGD DSM-V. Antaranya, 251 (168 lelaki dan 83 perempuan) telah didiagnosis sebagai IGD mengikut kriteria DSM-V (8). Sebanyak 91 individu (49 IGD dan 42 kawalan) memberikan persetujuan termaklum untuk kajian ini. Antaranya, empat individu telah dikecualikan mengikut kriteria pengecualian. Akhirnya, 87 individu (45 subjek IGD dan 42 individu kawalan sihat) telah didaftarkan untuk kajian ini. Antaranya, 51 peserta (25 pesakit IGD dan 26 kawalan) telah diambil sebagai set penemuan dari 2014 hingga 2016. 36 peserta lain (20 pesakit IGD dan 16 kawalan) telah direkrut sebagai set pengesahan bebas dari 2016. Semua peserta adalah warga Korea individu, mendaftar dari Hospital St. Mary Seoul (Seoul, Korea Selatan) dan Hospital Boramae Universiti Nasional Seoul (Seoul, Korea Selatan). Semua peserta telah menjalani temu bual berstruktur oleh pakar psikiatri berdasarkan Jadual Kiddie Korea untuk Gangguan Afektif dan Skizofrenia (K-SADS-PL) (20). Semua peserta melengkapkan ujian kecil Reka Bentuk Blok dan Perbendaharaan Kata bagi Skala Kecerdasan Korea-Wechsler untuk Kanak-kanak, edisi ke-4 (K-WISC-IV) (21). Impulsiveness dinilai oleh Barratt Impulsiveness Scale (BIS) (22). Skala Sistem Perencatan Tingkah Laku (BInS) dan Sistem Pengaktifan Tingkah Laku (BAS) diukur untuk menilai dimensi personaliti (23). Kriteria pengecualian termasuk gangguan perubatan utama masa lalu atau semasa (mis., diabetes mellitus), gangguan neurologi (cth., gangguan sawan, kecederaan kepala), gangguan psikiatri (cth., gangguan kemurungan utama, gangguan kebimbangan), terencat akal, atau sebarang penyalahgunaan bahan (cth. , tembakau, ganja, alkohol). Ciri-ciri umum subjek kajian diringkaskan dalam Jadual Table1.1. Kajian ini telah diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi Kolej Perubatan Universiti Katolik Korea (MC16SISI0120). Semua peserta dan ibu bapa mereka memberikan kebenaran bertulis secara bertulis.
Jadual 1
Ciri-ciri umum subjek kajian.
| Discovery | Pengesahan | Gabungan | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Mengawal | IGD | P- nilai | Mengawal | IGD | P- nilai | Mengawal | IGD | P- nilai | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Umur (tahun) | |||||||||
| Median (min–maks) | 13 (12-17) | 13 (12-15) | 0.759 | 15 (13-18) | 14.5 (12-18) | 0.628 | 14 (12-18) | 14 (12-18) | 0.509 |
| Waktu permainan Internet mingguan (j) | |||||||||
| Median (min–maks) | 5.25 (2-17) | 18 (6-46) | 1.27E−6a | 5.5 (2-23) | 8 (1-112) | 0.374 | 5.5 (2-23) | 14 (1-112) | 1.63E−5a |
| Pendapatan isi rumah bulanan (juta KRW) | |||||||||
| Median (min–maks) | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.588 | 4 (4-4) | 2 (2-2) | 1.000 | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.460 |
| Pendidikan (tahun) | |||||||||
| Median (min–maks) | 8 (7-9) | 8 (7-9) | 0.584 | 12 (12-12) | 6 (6-13) | 0.305 | 8 (7-12) | 8 (6-13) | 0.269 |
| K-WISC: reka bentuk blok | |||||||||
| Median (min–maks) | 10.5 (4-17) | 10 (4-16) | 0.544 | 10 (3-16) | 12.5 (4-15) | 0.125 | 10 (3-17) | 11 (4-16) | 0.598 |
| K-WISC: perbendaharaan kata | |||||||||
| Median (min–maks) | 9 (5-17) | 7 (5-13) | 0.174 | 9.5 (8-15) | 11.5 (5-15) | 0.595 | 9 (5-17) | 9 (5-15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Median (min–maks) | 24 (17-36) | 37 (22-51) | 3.81E−6a | 29 (17-34) | 59 (22-108) | 1.2E−5a | 25 (17-36) | 40 (22-108) | 2.05E−10a |
| BIS | |||||||||
| Median (min–maks) | 63 (35-75) | 67.5 (45-81) | 0.080 | 61 (45-79) | 63 (32-82) | 0.835 | 62 (35-79) | 65 (32-82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Median (min–maks) | 31 (15-40) | 31 (13-51) | 0.558 | 36.5 (22-48) | 34 (27-52) | 1.000 | 32 (15-48) | 34 (13-52) | 0.637 |
| BInS | |||||||||
| Median (min–maks) | 18 (10-26) | 17.5 (13-27) | 0.642 | 18.5 (12-25) | 20 (13-21) | 0.138 | 18 (10-26) | 19 (13-27) | 0.302 |
IGD, pesakit gangguan permainan Internet; KS, Skala Ketagihan Internet Korea; BIS, Skala Impulsif Barratt; BAS, Sistem Pengaktifan Tingkah Laku; BInS, Sistem Perencatan Tingkah Laku; KRW, Won Korea.
aP < 0.05 (Ujian Mann–Whitney–Wilcoxon).
Eksperimen TaqMan Low Density miRNA Array (TLDA).
Darah periferal dikumpul daripada setiap peserta dan dipindahkan ke makmal dalam masa 4 j untuk meminimumkan lisis sel darah. Spesimen telah disentrifugasi pada 3,000 rpm selama 10 min pada suhu bilik. Kemudian, supernatan (lapisan plasma) dikumpulkan tanpa mencemarkan sel darah. MiRNA yang beredar diekstrak menggunakan Kit Pemurnian ABC miRNA TaqMan (Panel Manusia A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mengikut arahan pengilang. Secara ringkasnya, 50 μL sampel plasma dan 100 μL penimbal ABC telah dicampur. Selepas penghibridan dengan manik magnet anti-miRNA khusus sasaran, miRNA beredar terikat telah dielusi daripada manik dengan 100 μL penimbal elusi. Dalam fasa penemuan, 381 miRNA diperiksa daripada 51 sampel plasma (25 IGD dan 26 kawalan) menggunakan Kit Pemurnian ABC miRNA TaqMan (Panel Manusia A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mengikut arahan pengeluar. Transkripsi terbalik Megaplex dan tindak balas pra-penguatan dilakukan untuk meningkatkan kuantiti cDNA untuk analisis ekspresi miRNA menggunakan MegaplexPreAmp Primers Human Pool A dan TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Panel TLDA A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) dijalankan pada sistem PCR masa nyata ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) untuk menilai ekspresi miRNA. Data mentah diproses menggunakan Perisian ExpressionSuite v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) untuk menentukan nilai Ct bagi setiap miRNA.
Analisis Data untuk TLDA
Kami mula-mula mengukur kitaran ambang (nilai Ct) setiap miRNA. miRNA dengan nilai Ct> 35 dianggap sebagai tidak dapat dikesan dan dikecualikan daripada analisis seterusnya. Semua nilai Ct telah dinormalisasikan kepada nilai Ct miR-374b (nilai ΔCt), salah satu miRNA yang paling stabil dinyatakan yang beredar dalam plasma manusia (24). Nisbah perubahan lipatan log2 (nilai ΔΔCt) ungkapan dikira menggunakan nilai min sampel kawalan sebagai penentukur dalam pakej HTqPCR dalam Bioconductor (25). Kuantifikasi relatif (RQ) setiap sasaran miRNA ditakrifkan sebagai 2-ΔΔCt. Untuk ujian hipotesis tentang perbezaan ekspresi antara dua kumpulan, kami menggunakan analisis pembolehubah pengganti (SVA) untuk menangkap heterogeniti seperti kesan kelompok dalam eksperimen menggunakan sva pakej dalam Biokonduktor (26). miRNA dengan a P-nilai <0.05 dianggap berbeza secara signifikan antara dua kumpulan.
Analisis Pengayaan Set Gen
Untuk analisis pengayaan set gen, kami menggunakan ToppFun dalam ToppGene Suite (27) untuk menyimpulkan Ontologi Gen (GO) yang diperkaya dengan ketara (28) istilah, laluan, dan istilah penyakit. Sebagai input untuk pendekatan ini, kami menggunakan 1,230, XNUMX gen sasaran yang diramalkan bagi calon miRNA. Analisis laluan digunakan untuk mencari laluan penting gen sasaran yang diramalkan mengikut KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP, dan MSigDBin laluan ToppGene. Kepentingan istilah pengayaan berfungsi ditentukan berdasarkan Bonferroni-dilaraskan P- nilai.
Pengesahan dan Replikasi PCR Transkripsi Songsang Kuantitatif (qRT-PCR).
Untuk mengesahkan 10 miRNA yang dinyatakan secara berbeza dalam peringkat penemuan, qRT-PCR dilakukan menggunakan TaqMan MicroRNA Assay (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p, # 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423-5p, #002340; -483p, #5; dan miR-002338-652p, #3) dan sistem ViiA002352 (Life Technologies) mengikut protokol pengeluar. Sepuluh nanogram jumlah RNA telah ditukar kepada cDNA untaian pertama dengan primer khusus miRNA menggunakan Kit Transkripsi Terbalik TaqMan MicroRNA (#7, Life Technologies), diikuti oleh PCR masa nyata dengan TaqMan Probes. RQ setiap miRNA ditakrifkan sebagai 4366596−ΔCt, dengan ΔCt ialah perbezaan dalam kitaran ambang untuk sampel yang dipersoalkan, dinormalkan terhadap miRNA endogen (miR-374b-5p, #001319). Semua tindak balas PCR dilakukan dalam tiga kali ganda, dan nilai Ct mereka dipuratakan. Kami mengira nisbah perubahan lipatan log2 (ΔΔCt) setiap miRNA dengan cara yang sama seperti dalam analisis berasaskan tatasusunan. Ujian Mann-Whitney-Wilcoxon bukan parametrik telah dilakukan untuk menguji perbezaan dalam tahap ekspresi miRNA dalam dua kumpulan dengan ambang P-nilai 0.05.
Analisis Blot Barat
Setiap sampel serum pertama kali habis daripada 14 protein kelimpahan tinggi teratas (albumin, immunoglobulin G, immunoglobulin A, serotransferrin, haptoglobin, alpha-1 antitrypsin, fibrinogen, alpha-2 macroglobulin, alpha-1 acid glycoprotein, immunoglobulin M, apolipoprotein A-I , apolipoprotein A-II, melengkapkan C3, dan transthyretin) menggunakan lajur MARS-14 (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) sebelum analisis western blot. Pecahan tidak terikat yang diperoleh daripada lajur MARS-14 telah ditumpukan menggunakan penapis emparan Amicon Ultracel-3 (potongan 3 kDa), dan kemudian kepekatan protein ditentukan menggunakan kaedah asid bicinchoninic. Jumlah yang sama (dari 10 hingga 30 μg) kawalan dan sampel serum IGD diasingkan pada gel pratuang Mini-PROTEAN TGX 4-20% (Bio-Rad, CA, USA) dan dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida. Seterusnya, membran telah disekat dalam TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris–HCl, pH 7.5, dan 0.05% Tween 20) dengan 5% susu kering tanpa lemak pada suhu bilik selama 30 min. Membran kemudian diinkubasi dengan antibodi utama terhadap DPYSL2 (1:500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2 (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), dan CNR1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology , Inc., Santa Cruz, CA, USA), DUSP4 (1:500, MybioSource, San Diego, CA, USA) dan PI15 (1:500, MybioSource, San Diego, CA, USA) dalam TBS-T dengan 5 % susu kering tanpa lemak pada suhu 4°C semalaman, dan kemudian dengan antibodi sekunder yang sesuai sama ada anti-tikus lembu (1:1,000, Santa Cruz Biotechnology) atau anti-arnab kambing (1:1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA ) terkonjugasi kepada lobak pedas peroksidase pada suhu bilik selama 1 j. Pengesanan isyarat dilakukan menggunakan chemiluminescence dengan reagen ECL (GE healthcare, Piscataway, NJ, USA). Kami mengukur keputusan western blot menggunakan perisian analisis TotalLab 1D (Dinamik Bukan Linear, Newcastle upon Tyne, UK). Kemudian, nilai nisbah densitometri dikira dengan membahagikan nilai densitometri setiap sampel seperti yang diterangkan di tempat lain (29). Sebagai kawalan untuk normalisasi, sampel serum dikumpulkan daripada 46 IGD dan sampel kawalan digunakan untuk setiap eksperimen. Kepentingan statistik ditentukan menggunakan ujian Mann–Whitney–Wilcoxon bukan parametrik dengan ambang P-nilai 0.05.
Hasil
Ciri-ciri Subjek Kajian
Ciri demografi dan klinikal subjek kajian ditunjukkan dalam Jadual Table1.1. Apabila kami membandingkan IGD dan kumpulan kawalan mengikut Skala Kecenderungan Ketagihan Internet Korea (K-Skala) seperti yang diterangkan di tempat lain (20, 30), kumpulan IGD menunjukkan nilai Skala K median yang jauh lebih tinggi daripada kumpulan kawalan (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Jadual (Table1) .1). Masa mingguan median yang dihabiskan untuk permainan Internet dalam kumpulan IGD adalah jauh lebih lama daripada kawalan (18 berbanding 5.25 j, P = 1.27 × 10-6). Manakala tidak terdapat perbezaan yang signifikan antara dua kumpulan umur, pendapatan isi rumah bulanan, tempoh pendidikan, reka bentuk blok, dan keputusan ujian kecil perbendaharaan kata K-WISC, BIS, BInS, dan BAS.
MiRNA yang Diungkapkan Secara Berbeza Antara IGD dan Kawalan
Untuk menemui miRNA yang berkaitan dengan IGD, kami menggunakan pendekatan dua langkah (penemuan dan pengesahan bebas). Reka bentuk kajian dan strategi keseluruhan digambarkan dalam Rajah S1 dalam Bahan Tambahan. Dalam peringkat penemuan, kami menganalisis profil ekspresi miRNA daripada 51 sampel (25 IGD dan 26 kawalan) menggunakan susunan miRNA yang mengandungi 384 miRNA. Tahap ekspresi 10 miRNA didapati berbeza dengan ketara antara IGD dan kumpulan kawalan (Jadual (Table2) .2). Tahap ekspresi relatif 10 miRNA ini ditunjukkan dalam Rajah Rajah1.1. Antaranya, dua (hsa-miR-423-5p dan hsa-miR-483-5p) dikawal selia dan lapan (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411-5p, dan hsa-miR-652-3p) telah dikurangkan dalam kumpulan IGD.
Jadual 2
MikroRNA yang dinyatakan secara berbeza (miRNA) dan perubahan lipatan.
| miRNA | Discovery | Pengesahan | Gabungan | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P- nilai | Lipat perubahan | P- nilai | Lipat perubahan | P- nilai | Lipat perubahan | |
| hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNAs berubah dengan ketara dalam kedua-dua set penemuan dan pengesahan dengan cara yang konsisten.
Pengesahan qRT-PCR miRNA Calon
Untuk mengesahkan 10 calon miRNA, kami melakukan qRT-PCR dengan set pengesahan bebas (20 IGD dan 16 kawalan) (Jadual S1 dalam Bahan Tambahan). Tiga daripada miRNA ini (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, dan hsa-miR-652-3p) telah dikurangkan dengan ketara dalam kumpulan IGD set pengesahan (Jadual (Table2) .2). Tiga miRNA lain (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b, dan hsa-miR-423-5p) juga dikurangkan dalam kumpulan IGD tetapi tidak ketara. Baki empat miRNA (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p, dan hsa-miR-423-5p) dinyatakan secara bertentangan dalam set pengesahan. Apabila kami menggabungkan set penemuan dan pengesahan (sejumlah 45 subjek IGD dan 42 kawalan), ketiga-tiga miRNA yang disahkan adalah secara konsisten penting (Jadual (Table2) .2). Maklumat terperinci, lokasi kromosom, urutan matang, dan tahap ekspresi dalam CNS ketiga-tiga miRNA ini tersedia dalam Jadual S2 dalam Bahan Tambahan.
Kesan Sinergis Pengubahan Serentak Tiga miRNA pada Risiko IGD
Untuk menilai kesan gabungan tiga miRNA, kami memerhatikan nisbah odds (OR) daripada empat subkumpulan (dengan 0, 1, 2, atau 3 perubahan miRNA). pengubahan miRNA ditakrifkan oleh nilai RQ seperti yang diterangkan dalam Bahagian "Bahan dan Kaedah.” Oleh kerana ketiga-tiga penanda miRNA telah dikurangkan dalam kumpulan IGD, miRNA yang nilai RQnya di bawah satu telah disangkal sebagai yang diubah. Maklumat terperinci bagi setiap nilai RQ subjek kajian untuk tiga miRNA tersedia dalam Jadual S3 dalam Bahan Tambahan. Bagi setiap subkumpulan, kemungkinan dikira sebagai nisbah bilangan kawalan kepada IGD, kemudian setiap OR dikira dengan membahagikan kemungkinan setiap subkumpulan dengan kemungkinan subkumpulan tanpa sebarang perubahan miRNA. Individu yang mempunyai tiga perubahan miRNA menunjukkan risiko 22 kali lebih tinggi daripada mereka yang tidak mempunyai sebarang perubahan miRNA (ATAU 22, 95% CI 2.29-211.11). OR menunjukkan trend yang semakin meningkat dengan bilangan miRNA yang diubah daripada 0 hingga 3 (r2 = 0.996) (Rajah (Rajah22).
Analisis GO dan Laluan Gen Sasaran miRNA Calon
Untuk mendapatkan gambaran tentang fungsi tiga penanda miRNA yang dikurangkan dengan ketara dalam kumpulan IGD, gen sasaran mereka diramalkan menggunakan pangkalan data miRWalk 2.0 (31). Sebanyak 1,230 gen secara konsisten diramalkan sebagai sasaran hiliran oleh empat algoritma (miRWalk, miRanda, RNA22, dan Targetscan) menggunakan pangkalan data miRWalk (32-34) (Jadual S4 dalam Bahan Tambahan). Analisis pengayaan set gen menggunakan ToppFun dalam ToppGene Suite menunjukkan bahawa gen sasaran miRNA tersebut secara signifikan dikaitkan dengan laluan pembangunan saraf seperti "panduan Akson" dan istilah GO seperti "neurogenesis" (Jadual S5 dalam Bahan Tambahan).
Ungkapan Gen Sasaran yang Diramalkan
Antara gen sasaran hiliran tiga miRNA, 140 diramalkan secara serentak untuk dua atau lebih miRNA (Jadual S4 dalam Bahan Tambahan). Untuk meneroka sama ada tahap ekspresi protein mereka bagi gen sasaran hiliran berbeza antara IGD dan kumpulan kawalan, kami memilih 2 gen (DUSP4 and PI15), yang diramalkan sebagai sasaran hiliran semua 3 miRNA dan 3 gen tambahan (GABRB2, DPYSL2, dan CNR1) daripada yang diramalkan untuk 2 miRNA dan melakukan analisis western blot dengan sampel plasma daripada 28 IGD dan 28 kawalan yang tersedia untuk eksperimen. Kami membandingkan ungkapan lima sasaran antara IGD dan kumpulan kawalan dengan mengukur intensiti dan kawasan jalur seperti yang diterangkan di tempat lain (29). Antaranya, tahap ekspresi DPYSL2 (28 IGD dan 28 kawalan, P = 0.0037) dan GABBR2 (27 IGD dan 28 kawalan, P = 0.0052) adalah jauh lebih tinggi dalam kumpulan IGD (Rajah (Rajah3) .3). Walau bagaimanapun, kami tidak dapat melihat ungkapan pembezaan CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443), dan PI15 (P = 0.6346).
Perbincangan
Telah dilaporkan bahawa miRNA terlibat dalam pembangunan neuron (35, 36), dan ekspresi pembezaan miRNA otak diperhatikan dalam penyakit psikiatri seperti skizofrenia (37). Oleh itu, adalah munasabah bahawa profil miRNA yang beredar boleh menjadi biomarker berguna untuk IGD. MiRNA yang beredar telah dicadangkan sebagai biomarker untuk pelbagai gangguan neuropsikiatri (38-40); walau bagaimanapun, mekanisme molekul di sebalik pembangunan IGD masih tidak diketahui walaupun mempunyai kepentingan klinikal dan sosial. Khususnya, tidak ada kajian mengenai miRNA yang berkaitan dengan IGD. Matlamat kajian ini adalah dua kali ganda. Pertama, kami cuba menemui miRNA plasma yang dikaitkan dengan IGD. Kedua, kami menilai implikasi biologi calon miRNA dengan meneroka ekspresi protein dan GO gen sasaran hiliran. Melalui penyaringan genom profil ekspresi miRNA dan pengesahan hiliran calon, kami mendapati bahawa ekspresi tiga miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, dan hsa-miR-652-3p) adalah jauh lebih rendah pada pesakit IGD daripada kawalan. Walaupun corak ekspresi tujuh calon miRNA yang lain tidak direplikasi dalam pengesahan, ia boleh menjadi negatif palsu kerana saiz sampel yang kecil dalam kajian ini. Untuk pengetahuan kami, ini adalah laporan pertama tentang kemungkinan profil ekspresi miRNA darah boleh menjadi biomarker berguna untuk IGD. Gabungan tiga penanda miRNA boleh berfungsi sebagai alat invasif minimum untuk mengenal pasti awal orang yang berisiko IGD.
MiRNA yang dikenal pasti dalam kajian ini telah dilaporkan terlibat dalam pelbagai gangguan neuropsikiatri. Ekspresi hsa-miR-200c dalam darah telah dilaporkan dikurangkan dalam beberapa gangguan psikiatri seperti skizofrenia (41) dan episod kemurungan utama (42). miR-200c dilaporkan lebih tinggi dinyatakan dalam pecahan sinaptik daripada jumlah otak depan (43) dan juga dikaitkan dengan kematian sel neuron (44). Berdasarkan laporan terdahulu ini, miR-200c terlibat dalam pembangunan saraf dan boleh dikaitkan dengan gangguan neuropsikiatri jika ekspresinya terganggu. Beberapa kajian telah mencadangkan perkaitan antara miR-652 dan risiko gangguan neuropsikiatri. Sama seperti pendekatan kami, untuk mengenal pasti biomarker darah untuk skizofrenia, Lai et al. menjalankan analisis TLDA dengan pesakit skizofrenia dan kawalan normal, dan mendapati tujuh miRNA termasuk hsa-miR-652 dinyatakan secara berbeza dalam pesakit skizofrenia (45). Dalam kajian seterusnya, mereka mereka bentuk model ramalan menggunakan data ekspresi miRNA dan berjaya membezakan skizofrenia daripada kawalan biasa (46). Ekspresi hsa-miR-652 yang diubah juga diperhatikan dalam peminum alkohol (47). Hsa-miR-26b didapati diaktifkan semasa pembezaan sel neuron (48). Perkins et al. melaporkan bahawa hsa-miR-26b telah dikurangkan dalam korteks prefrontal pesakit skizofrenia (49).
Walaupun tidak ada bukti langsung untuk menyokong hubungan antara ekspresi terganggu miRNA ini dan patofisiologi IGD, kita boleh membuat kesimpulan bahawa disregulasi miRNA ini mungkin dikaitkan dengan patofisiologi IGD berdasarkan pelbagai laporan sebelumnya mengenai gen hiliran yang kami ramalkan. . Beberapa gen hiliran tiga miRNA seperti GABRB2, CNR1, NRXN1, dan DPYSL2 dilaporkan dikaitkan dengan gangguan neuropsikiatri. Asid gamma-aminobutyric (GABA) adalah neurotransmitter perencatan utama dalam CNS. Disregulasi reseptor GABA, terlibat dalam gangguan neuropsikiatri termasuk ketagihan, kebimbangan, dan kemurungan (50), yang juga merupakan ciri utama IGD (8). Polimorfisme genetik dalam gen reseptor GABA dilaporkan dikaitkan dengan ketagihan alkohol dan skizofrenia (51, 52). Dihydropyrimidinase-like 2 (DPYSL2) ialah ahli keluarga protein mediator tindak balas collapsin, yang memainkan peranan dalam pemasangan microtubule, isyarat sinaptik, dan pengawalan pertumbuhan akson. Akibatnya, molekul ini telah dicadangkan sebagai biomarker untuk gangguan psikiatri (53, 54). Polimorfisme dalam DPYSL2 gen juga dilaporkan dikaitkan dengan gangguan penggunaan alkohol (55). Laporan terdahulu dan data kami mencadangkan bahawa overexpression GABRB2 dan DPYSL2, sasaran hiliran miRNA yang dikurangkan, mempunyai implikasi untuk patogenesis gangguan neuropsikiatri termasuk IGD. Reseptor Cannabinoid jenis 1 (CNR1) ialah heteroreseptor presinaptik yang memodulasi pelepasan neurotransmitter dan gangguan dalam isyarat cannabinoid dikaitkan dengan pelbagai gangguan neuropsikiatri (56). Polimorfisme genetik bagi CNR1 gen diketahui dikaitkan dengan kebergantungan bahan di Kaukasia (57). Dalam model tikus, pengaktifan hippocampus ventral CNR1 mengganggu tingkah laku sosial dan kognisi normal (58). Perubahan genetik dalam keluarga NRXN diketahui terlibat dalam pelbagai gangguan neuropsikiatri termasuk ketagihan (59).
Untuk mengkaji implikasi biologi tiga calon miRNA dengan cara yang lebih langsung, kami meneroka ekspresi protein gen sasaran hiliran mereka. Disebabkan ketersediaan sampel plasma yang terhad, daripada 140 calon biasa (diramalkan sebagai hiliran 2 atau lebih miRNA), kami memeriksa 5 sasaran (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4, dan PI15) oleh western blot dan mengesahkan bahawa ungkapan GABRB2 dan DPYSL2 jauh lebih tinggi dalam kumpulan IGD. Laporan terdahulu dan data kami mencadangkan bahawa overexpression GABRB2 dan DPYSL2, sasaran hiliran miRNA yang dikurangkan, mungkin mempunyai implikasi untuk patogenesis gangguan neuropsikiatri termasuk IGD. Keputusan GO dan analisis laluan laluan pembangunan saraf juga menyokong implikasi neurobiologi penanda miRNA. Satu lagi penemuan menarik ialah kesan sinergistik perubahan serentak miRNA. Individu yang mempunyai downregulation semua 3 miRNA menunjukkan risiko 22 kali lebih tinggi daripada mereka yang tidak mempunyai downregulation, dan OR meningkat dalam cara yang bergantung kepada dos. Walaupun CI untuk ketiga-tiga perubahan ini adalah luas kerana saiz sampel yang terhad, korelasi positif yang jelas (r2 = 0.996) menyokong kesan sinergistik tiga miRNA.
Walaupun kami telah menemui penanda miRNA yang berkaitan dengan IGD dan individu dengan ketiga-tiga perubahan miRNA mempunyai risiko 22 kali lebih tinggi daripada mereka yang tidak mempunyai sebarang perubahan miRNA, terdapat beberapa batasan dalam kajian ini. Pertama, saiz sampel yang kecil meningkatkan kemungkinan kehilangan penanda miRNA penting yang lain. Kedua, kerana data kami tidak mencukupi untuk menjelaskan sama ada profil miRNA plasma sama ada sebab atau akibat, kami tidak dapat mengesahkan peranan biologi penanda bukan invasif ini dalam keadaan klinikal. Pemprofilan miRNA selanjutnya dan analisis gen hiliran mereka menggunakan tisu otak manusia dari bank tisu otak boleh memberikan jawapan yang lebih langsung. Analisis tisu otak dengan model haiwan gangguan permainan juga akan membantu. Ketiga, disebabkan ketersediaan sampel plasma yang terhad, kami hanya memeriksa lima molekul calon hiliran. Meneroka lebih banyak sasaran hiliran dengan set sampel yang lebih besar akan membantu untuk memahami lebih lanjut mekanisme molekul IGD.
Ringkasnya, melalui penyaringan genom profil ekspresi miRNA dan pengesahan bebas, kami menemui tiga miRNA yang berkaitan dengan IGD (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, dan hsa-miR-652-3p). Banyak gen hiliran mereka dilaporkan terlibat dalam pelbagai gangguan neuropsikiatri, dan pengesahan eksperimen bagi ekspresi diubah gen hiliran ini menyokong implikasi miRNA yang dikenal pasti dalam kajian ini. Kami mendapati bahawa individu dengan downregulation ketiga-tiga miRNA berisiko tinggi untuk IGD. Bersama-sama dengan faktor risiko klinikal atau persekitaran yang diketahui dan kriteria diagnostik, penemuan kami boleh memudahkan campur tangan awal untuk membantu orang yang berisiko tinggi menghidapi IGD.
Kenyataan Etika
Kajian ini telah diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi Kolej Perubatan Universiti Katolik Korea (MC16SISI0120). Semua peserta dan ibu bapa mereka memberikan kebenaran bertulis secara bertulis.
Sumbangan Pengarang
ML dan HC menyumbang sama kepada kertas ini. ML, D-JK dan Y-JC mereka bentuk kajian. SJ, S-MC, YP, DC dan JL melakukan eksperimen dan penjanaan data. J-WC, S-HP, J-SC, dan D-JK mengumpul sampel darah dan maklumat klinikal. Data dianalisis ML, HC, S-HY dan Y-JC. ML, HC, S-HY, dan Y-JC menerangkan manuskrip. Y-JC menyelia projek itu.
Penyata Percanggahan Kepentingan
Penulis mengisytiharkan bahawa penyelidikan itu dijalankan tanpa adanya sebarang hubungan komersial atau kewangan yang boleh ditafsirkan sebagai potensi konflik kepentingan.
Nota kaki
Pembiayaan. Kerja ini disokong oleh geran daripada Program Penyelidikan Otak melalui Yayasan Penyelidikan Kebangsaan Korea (NRF), yang dibiayai oleh Kementerian Sains dan ICT dan Perancangan Masa Depan (NRF-2015M3C7A1064778).
Bahan Tambahan
Bahan Tambahan untuk artikel ini boleh didapati di talian di http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Rujukan
;