FACS ระบุการควบคุมยีนที่เกิดจากโคเคนที่ไม่ซ้ำกันในเซลล์ประสาท striatal สำหรับผู้ใหญ่ที่เลือกใช้งาน (2011) ซึ่งเป็นเซลล์ประสาท striatal เพียงเล็กน้อย

J Neurosci ต้นฉบับผู้เขียน; พร้อมใช้งานใน PMC Sep 16, 2011
เผยแพร่ในแบบฟอร์มการแก้ไขขั้นสุดท้ายเป็น:
PMCID: PMC3073079
NIHMSID: NIHMS279955

 

บทความนี้ฉบับแก้ไขสุดท้ายของผู้จัดพิมพ์มีให้บริการฟรีที่ Neurosci J
ดูบทความอื่น ๆ ใน PMC ที่ กล่าวถึง บทความที่ตีพิมพ์

นามธรรม

การศึกษาจำนวนมากที่มีเครื่องหมายของระบบประสาทฟอสบ่งชี้ว่าโคเคนเปิดใช้งานเพียงสัดส่วนเล็ก ๆ ของเซลล์ประสาทตาเกิดการกระจายอย่างกระจัดกระจาย จนถึงขณะนี้ยังไม่มีวิธีการที่มีประสิทธิภาพในการประเมิน neuroadaptations ที่เกิดขึ้นเฉพาะภายในเซลล์ประสาทที่เปิดใช้งานเหล่านี้ เราใช้การเรียงลำดับเซลล์ที่เปิดใช้งานการเรืองแสง (FACS) เพื่อชำระเซลล์ประสาท striatal ที่เปิดใช้งานในระหว่างการเคลื่อนที่โคเคนที่เกิดจากโคเคนในnaïveและโคเคนไวต่อ cFos-lacZ หนูดัดแปรพันธุกรรม เซลล์ประสาทที่ถูกกระตุ้นจะถูกติดป้ายด้วยแอนติบอดี้ต่อต้านβ-galactosidase ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์โปรตีนของยีน lacZ Cocaine เหนี่ยวนำให้เกิดโปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่ไม่ซ้ำกันโดยการคัดเลือกในสัดส่วนที่น้อยของเซลล์ประสาทที่ถูกกระตุ้นซึ่งไม่ได้สังเกตเห็นในเซลล์ประสาทส่วนใหญ่ที่ไม่ได้ถูกกระตุ้น ยีนเหล่านี้รวมถึงระดับที่เปลี่ยนแปลงของยีนเริ่มต้นทันที ส่วนโค้ง fosBและ nr4a3รวมถึงยีนที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณ p38 MAPK และความจำเพาะของเซลล์ เราเสนอว่าวิธีการ FACS นี้สามารถใช้ในการศึกษาการปรับระบบประสาทในระดับโมเลกุลในเซลล์ประสาทที่เฉพาะเจาะจงซึ่งเข้ารหัสผลของพฤติกรรมของยาที่ถูกทารุณกรรมและพฤติกรรมที่เรียนรู้อื่น ๆ

คำสำคัญ: อาการแพ้โคเคน, accumbens นิวเคลียส, วงประสาทเซลล์ประสาท, การจัดเรียงของเซลล์เรืองแสงเปิดใช้งาน

บทนำ

สมมติฐานสำคัญของการวิจัย neurobiological ปัจจุบันเกี่ยวกับการติดโคเคนคือการสัมผัสโคเคนเรื้อรังทำให้เกิด neuroadaptations ยาวนานภายใน striatum และส่วนประกอบอื่น ๆ ของวงจรรางวัลโดปามีน mesolimbic นำไปสู่การใช้ยาเสพติดและช่องโหว่กำเริบในระยะยาว (Nestler, 2001; Shaham และ Hope 2005; Kalivas, 2009; Bowers และคณะ 2010; Wolf และ Ferrario, 2010) อย่างไรก็ตามสมมติฐานนี้มีพื้นฐานอยู่บนการศึกษาจำนวนมากที่ จำกัด การวัด neuroadaptations ใน homogenates ของพื้นที่สมองหรือในเซลล์ประสาทที่เลือกเป็นอิสระจากสถานะการเปิดใช้งานของพวกเขาในระหว่างพฤติกรรม

ความแตกต่างระหว่าง neuroadaptations ในการเปิดใช้งานกับเซลล์ประสาทที่ไม่ได้เปิดใช้งานเป็นสิ่งสำคัญเพราะพวกเขาอาจมีบทบาทที่แตกต่างกันในผลกระทบทางสรีรวิทยาพฤติกรรมและจิตใจของโคเคน การศึกษาจำนวนมากที่มีเครื่องหมายระบบประสาท Fos ระบุว่าโคเคนเปิดใช้งานเพียงสัดส่วนเล็ก ๆ ของเซลล์ประสาทกระจายอย่างกระจัดกระจายใน striatum หลังจากได้รับการกระตุ้นโดยใช้บริบทเฉพาะเราได้แสดงให้เห็นว่า Fos ถูกชักจูงเฉพาะเมื่อหนูถูกฉีดในสภาพแวดล้อมที่จับคู่ยาและไม่อยู่ในสภาพแวดล้อมที่ไม่ได้จับคู่ (Mattson et al., 2008; Koya และคณะ, 2009) สิ่งสำคัญที่สุดคือเราได้แสดงให้เห็นว่าเซลล์ประสาทที่ถูกกระตุ้นแบบเลือกสรรมีบทบาทเชิงสาเหตุในการเชื่อมโยงโคเคนและสภาพแวดล้อมที่จับคู่กับยาที่ได้เรียนรู้ซึ่งเป็นสื่อกลางKoya และคณะ, 2009) ดังนั้น neuroadaptations ภายในเซลล์ประสาทตาเปิดใช้งานที่เลือกอาจมีบทบาทที่ไม่ซ้ำกันและมีความสำคัญในการเรียนรู้ในระหว่างการไวเฉพาะบริบทและพฤติกรรมยากระตุ้นอื่น ๆ

จนถึงขณะนี้ข้อ จำกัด ทางเทคนิคทำให้ยากที่จะประเมินการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลภายในเซลล์ประสาทที่มีการกระจายแบบเบาบางจำนวนเล็กน้อยซึ่งถูกเลือกใช้ในระหว่างการทำงาน เทคนิคเช่นการจับเลเซอร์ขนาดเล็ก (Kwon และ Houpt, 2010) และอิมมูโนฮิโตเคมีวิทยาสองชั้น (Berretta และคณะ, 1992; Gerfen et al., 1995; Peters และคณะ, 1996) มีความสามารถในการระบุการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลที่เลือกสรรภายในเซลล์ประสาทที่ถูกกระตุ้น แต่เทคนิคเหล่านี้มีปริมาณงานที่ต่ำมากหรือไม่เชิงปริมาณ การแยกเซลล์ด้วยแสงฟลูออเรสเซนซ์ (FACS) สามารถเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการทำให้บริสุทธิ์เซลล์ประสาทของประชากรผู้ใหญ่สำหรับการวิเคราะห์โมเลกุล (Liberles and Buck, 2006; Lobo และคณะ, 2006) อย่างไรก็ตาม FACS ไม่ได้ใช้ในการชำระเซลล์ประสาทให้บริสุทธิ์ตามสถานะการเปิดใช้งาน ในการศึกษาปัจจุบันเราใช้ FACS ในการทำให้เซลล์ประสาทตาขาวโคเคนที่กระตุ้นการทำงานของโคเคนสลับจากการถ่ายยีน cFos-lacZ หนูและเปรียบเทียบรูปแบบการแสดงออกของยีนที่ไม่เหมือนใครกับเซลล์ประสาทส่วนใหญ่ที่ไม่ทำงาน

วิธี

สัตว์

หญิง cFos-lacZ หนูดัดแปรพันธุกรรม (Kasof et al., 1995; Koya และคณะ, 2009) และหนูตัวเมีย Sprague-Dawley (Charles River, Raleigh, NC, USA) ตั้งอยู่ในกรงพลาสติกมาตรฐานในห้องควบคุมอุณหภูมิและความชื้น พวกเขาได้รับการบำรุงรักษาใน 12: 12 h ไฟถอยหลัง: รอบมืด (เปิดไฟที่ 20.00 h) และอนุญาตให้เข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี พวกเขาเคยชินกับสภาพที่อยู่อาศัยเหล่านี้อย่างน้อย 7 วันก่อนการรักษาด้วยยา ขั้นตอนการทดลองได้รับการอนุมัติจาก NIDA Animal Care and Use Committee

ยารักษาโรค

สำหรับการทดลองโคเคนแบบเฉียบพลันหนูจะถูกฉีดด้วยโคเคน (30 mg / kg, ip; n = 8) หรือน้ำเกลือ (1 ml / kg; n = 6) และวางไว้ในห้องลูกแก้วกลม (38 cm เส้นผ่านศูนย์กลาง) หนูถูกสังเวย 90 นาทีหลังจากฉีดเพื่อให้เนื้อเยื่อสมอง การรักษานี้ทำซ้ำสามครั้งในแต่ละวันเพื่อให้ได้รับ 3 ซ้ำทางชีวภาพสำหรับการวิเคราะห์ microarray นอกจากนี้ยังมีการสร้างแบบจำลองทางชีวภาพที่เป็นอิสระสามตัวในทำนองเดียวกันสำหรับ PCR เชิงปริมาณ (qPCR) สำหรับการวิเคราะห์ qPCR ของ ส่วนโค้ง, pdyn, adora2aมีการใช้ซ้ำซ้ำทางชีวภาพทั้งสามเท่านั้น สำหรับการวิเคราะห์ qPCR ของ fosB, nr4a3, kcnc1 และ map2k6เรายังใช้ RNA ที่เหลือจากแต่ละตัวอย่าง microarray

สำหรับการทดลองโคเคนซ้ำ ๆ หนูตัวเมียไวต่อการฉีดโคเคน (15 mg / kg ip ip) สี่ครั้งทุกวันที่สอง ในวันฉีดหนูแต่ละตัวจะถูกนำไปวางไว้ในห้องกิจกรรมหัวรถจักร Plexiglas ของ 43 × 43 ซม. (Med Associates, St Albans, VT, USA) เพื่อทำให้เกิดความเคยชินเป็นเวลา 30 นาที หนูถูกฉีดด้วยโคเคนและการเคลื่อนไหวของหัวรถจักรถูกบันทึกเมื่อเดินทางไกลเป็นเวลา 60 นาที หลังจากฉีดโคเคนซ้ำสี่หนูยังคงอยู่ในกรงที่บ้านของพวกเขาเป็นเวลา 7 – 8 วัน ในวันทดสอบหนูถูกใช้งานเป็นเวลา 30 นาทีในห้องกิจกรรมของหัวรถจักรจากนั้นฉีดโคเคน (30 mg / kg ip) หรือยานพาหนะน้ำเกลือ หนูถูกตัดหัวและสมองถูกสกัดเก้าสิบนาทีหลังจากการฉีด การรักษาอาการแพ้ทั้งหมดซ้ำแล้วซ้ำอีกสามครั้งในช่วงสัปดาห์ที่แยกกันเพื่อให้ได้สามซ้ำทางชีวภาพของแต่ละกลุ่มสำหรับการวิเคราะห์ qPCR

การแยกเซลล์

กระดาษทิชชู่ Striatal ถูกแยกออกจากกันเพื่อให้ได้เซลล์เดียวที่แขวนลอย หนูถูกตัดหัวและแยก striata ออกภายในสองนาที แต่ละ striatum ถูกสับด้วยใบมีดโกนบนจานแก้วน้ำแข็งเย็นและวางไว้ใน 1 ml ของ Hibernate A (Cat # HALF; Brain Bits, Springfield, IL) Striata ถูกย่อยด้วยเอ็นไซม์ใน 1 ml ของ Accutase ต่อ striatum (Cat # SCR005; Chemicon, Billerica, MA) ด้วยการผสมแบบ end-over-end สำหรับ 30 นาทีที่ 4 ° C เนื้อเยื่อถูกปั่นแยกเป็นเวลาสองนาทีที่ 425 × g และถูกแขวนใหม่ใน 300 μlของ Hibernate น้ำแข็งเย็น A. ขั้นตอนการหมุนเหวี่ยงที่ตามมาทั้งหมดถูกดำเนินการที่ 4 ° C

เนื้อเยื่อ striatal ที่ย่อยสลายด้วยวิธี trituration สี่ striata รวมกันเป็นหนึ่ง Eppendorf หลอดและ triturated สิบครั้งด้วยปิเปตขนาดใหญ่เส้นผ่าศูนย์กลาง (~ 1.3mm) หลอดถูกวางไว้บนน้ำแข็งสั้น ๆ เพื่อให้เนื้อเยื่อชิ้นใหญ่ ๆ 600 μlของสารแขวนลอยที่มีเมฆที่มีเซลล์ที่แยกจากกันถูกถ่ายโอนไปยังหลอดฟอลคอน 15 ml บนน้ำแข็ง 600μLของ Hibernate A สดถูกเพิ่มเข้าไปในหลอด Eppendorf ดั้งเดิมจากนั้นทำซ้ำขั้นตอนการ trituration ดังกล่าวข้างต้นด้วยปิเปตขนาดกลางและขนาดเล็ก (~ 0.8mm และ ~ 0.4mm) การระงับของเมฆแต่ละครั้งที่มีเซลล์ที่แยกตัวออกจะถูกรวมเข้าด้วยการระงับก่อนหน้านี้

กลุ่มเซลล์ที่เหลืออยู่ในการระงับเซลล์ pooled ถูกลบออกโดยการกรองผ่าน 100 μmที่เปียกและ 40 μmตัวกรองเซลล์ล่วงหน้า (แบรนด์ Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA) เศษโทรศัพท์มือถือขนาดเล็กในระบบช่วงล่างลดลงโดยการหมุนเหวี่ยงกรองสำหรับ 3 min ที่ 430 × g ผ่านการไล่ระดับความหนาแน่นสามขั้นตอนของ Percoll (Cat # P1644; Sigma, St. Louis, MO) ชั้นบนสุดที่มีเมฆ (ประมาณ 2 ml) ที่มีเศษถูกทิ้ง เซลล์ในชั้นที่เหลือถูกแขวนลอยใหม่ในสารละลาย Percoll ที่เหลือและหมุนเหวี่ยงเป็นเวลาห้านาทีที่ 550xg เม็ดถูกแขวนใหม่ใน 1 ml ของ Hibernate A

การสร้างภูมิคุ้มกันและ FACS

เซลล์ที่ถูกแยกออกได้รับการแก้ไขและเพิ่มความสามารถโดยการเติมเอทานอลในปริมาณที่เท่ากันสำหรับความเข้มข้นสุดท้ายของ 50% เอทานอลและเก็บไว้ในน้ำแข็งเป็นเวลา 15 นาทีด้วยการผสมเป็นครั้งคราว เซลล์ถูกปั่นแยกเป็นเวลาสองนาทีที่ 425xg และแขวนลอยใหม่ในน้ำเกลือปราศจากฟอสเฟต RNase (PBS) เซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่มีปฏิกิริยาต่อ NeuN (1: 1000 เจือจาง, Cat # MAB377B, Chemicon) และแอนติบอดีปฐมภูมิกับβ-galactosidase (β-gal; 1: 10000: 4600: 1409: 30: Xogen X, 4: 425 , สหราชอาณาจักร). เซลล์ถูกหมุนแบบ end-over-end ในแอนติบอดีปฐมภูมิเป็นเวลา 800 นาทีที่ 700 ° C และหมุนเหวี่ยงเป็นเวลาสามนาทีที่ 1xg เซลล์ถูกล้างด้วย 1000 μlของ PBS และถูกแขวนใน 1004 μlของ PBS ด้วย streptavidin ที่มีป้ายเรืองแสง (Streptavidin-phycoerythrin, 1: 488 เจือจาง, แมว # SA1-1000, Invitrogen, Carlsbad, CA) และแอนติบอดีรอง (Alexa Fluor 11055: 15, Invitrogen) และการหมุนแบบ end-over-end เป็นเวลา 800 นาทีเซลล์ถูกล้างด้วย 425 μlของ PBS หมุนเหวี่ยงเป็นเวลาสามนาทีที่ 1 × g และหยุดการทำงานใน XNUMX ml ของ PBS

เซลล์ที่ไม่มีการติดฉลากถูกสแกนและจัดเรียงที่สถานที่หลักของเซลล์ไหลแบบ cytometry ของ Johns Hopkins Bayview FACS Aria (BD, Franklin Lakes, NJ) ใช้สำหรับการจัดเรียงเซลล์ ตัวอย่างควบคุมถูกวิเคราะห์ก่อนเพื่อกำหนดเกณฑ์ที่เหมาะสมสำหรับการจัดเรียงตัวอย่างทดสอบ โดยเฉพาะเซลล์ตายตัวที่ไม่มีการรักษาด้วยแอนติบอดีถูกนำมาใช้เพื่อตั้งประตูกระจายแสง เซลล์คงที่รับการรักษาด้วยแอนติบอดีรองเรืองแสง แต่ไม่มีแอนติบอดีปฐมภูมิถูกนำมาใช้ในการกำหนดเกณฑ์สำหรับการเรืองแสงของเนื้อเยื่อภายนอกและไม่ผูกพันเฉพาะโดย streptavidin หรือแอนติบอดีรอง ถัดไปตัวอย่างควบคุมที่มีป้ายกำกับเดี่ยวพร้อมแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิสำหรับโปรตีนแต่ละชนิด (NeuN หรือ gal-gal) ถูกใช้เพื่อชดเชยการทับซ้อนของฟลูออเรสเซนต์ในช่องทางใกล้เคียง ในที่สุดตัวอย่างการทดสอบที่มีป้ายกำกับทั้งเครื่องหมายถูกวิเคราะห์และจัดเรียง เซลล์ที่เรียงลำดับจะถูกรวบรวมไว้ในหลอดที่มีความผูกพันต่ำ (Cat # 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) ด้วย 100 μlของ PBS ในแต่ละหลอด

การสกัด RNA

หลังจากการเรียงลำดับตัวอย่างที่มีเซลล์ positivegal-positive หรือ negativegal-negative ทั้งคู่จากหนูโคเคนที่ฉีดโคเคนหรือเซลล์ NeuN-positive ทั้งหมดจากหนูที่ฉีดน้ำเกลือถูกปั่นแยกเป็นเวลา 8 x ที่ 2650 × g ที่ 18 ° C เซลล์ NeuN-positive จากหนูที่ฉีดน้ำเกลือถูก centrifuged เป็นเวลา 8 นาทีที่ 6000 ×g ที่ 18 ° C สำหรับการทดลอง microarray RNA ถูกสกัดด้วย Trizol Reagent (Cat # 15596-026, Invitrogen) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ประเมินคุณภาพและปริมาณของ RNA โดยใช้ Bioanalyzer Picochip (Cat # 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, CA) สำหรับการทดลอง qPCR นั้น RNA ถูกสกัดด้วย RNEasy Micro kit (Cat # 74004; Qiagen, Valencia, CA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตด้วยการรักษา DNase ปริมาณและความบริสุทธิ์ของ RNA ถูกประเมินโดยใช้เครื่องวัดปริมาณสเปคโตโฟโตมิเตอร์ Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE)

การทดลองขนาดเล็ก

Microarrays ใช้ในการวิเคราะห์ RNA จากเซลล์ NeuN-positive และ Neu-negative จากหนูที่ฉีดน้ำเกลือและเซลล์ andgal-positive และβgal-positive จากหนูโคเคนที่ฉีด ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในส่วนการรักษาด้วยยา microarrays มีการจำลองแบบทางชีวภาพสามแบบสำหรับแต่ละตัวอย่างสี่แบบ RNA ทั้งหมดห้าμlจากแต่ละตัวอย่างถูกระบุโดยใช้ Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Cat # IL1791; Ambion, Austin, TX) ในกระบวนการสองขั้นตอนของการสังเคราะห์ cDNA ตามด้วย ในหลอดทดลอง การถอดรหัส RNA พร้อมไบโอติน - 16-UTP 0.75 μgของ cRNA ที่ติดฉลากไบโอตินได้รับการผสมสำหรับ 16 ชั่วโมงเป็น Illumina Sentrix Rat Ref12_v1 BeadChips (Cat # BD-27-303; Illumina, San Diego, CA) ตรวจพบ cRNA แบบผสมทางชีวภาพกับชิปด้วย Streptavidin ที่ติดฉลาก Cy3 และวัดปริมาณโดยใช้เครื่องสแกนเนอร์ BeadStation 500GX Genetic Analysis Systems ของ Illumina การติดฉลากและการวิเคราะห์ทั้งหมดทำขึ้นที่วิทยาเขตการแพทย์ Johns Hopkins Bayview Core Lowe Genomics Family

PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์

PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ใช้เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของ FACS และผลลัพธ์ microarray RNA ถูกคัดลอกกลับเข้าไปใน cDNA โดยใช้ชุด RETROscript (Cat # AM1710, Ambion) พร้อมไพรเมอร์ oligo (dT) แต่ละปฏิกิริยา 25 μl PCR รวม 12.5 μlของ Taqman Gene Expression Master Mix (แมว #4369514 โพรบ Biosystems ประยุกต์, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย), 1.1 μMไปข้างหน้าและไพรเมอร์ย้อนกลับ, 20 μMของ 0.25 μM μlของน้ำและ 100 μlของ 5 ng / μl cDNA ชุดไพรเมอร์และโพรบ1 ตาราง] ได้รับการออกแบบโดยใช้ Roche Universal Probe Library Assay Design Center ในการขยายการใช้งาน ตรวจสอบปฏิกิริยา PCR โดยใช้ Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD) โปรแกรมเริ่มต้นด้วย 20 plate อ่านที่ 50 ° C สำหรับการถ่ายภาพโดยการถ่ายโฟโต้เบลอร์ตามด้วย 5 min ที่ 95 ° C จากนั้น 40 รอบของ 20 วินาทีที่ 94 ° C, 1 นาทีที่ 60 °ที่ XNUMX ° C, XNUMX ° C ที่ XNUMX ° C

1 ตาราง 

ไพรเมอร์และโพรบที่ใช้สำหรับ qPCR

ปฏิกิริยาของเส้นโค้งมาตรฐานถูกเรียกใช้ครั้งแรกสำหรับแต่ละยีนเพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพการขยาย1 ตาราง] ระดับการแสดงออกของยีนที่ถูกขยายแต่ละตัวนั้นถูกคำนวณโดยใช้ประสิทธิภาพ ^ ΔCq ที่ไหนΔCq = Cqยีนทดลองq(ยีนอ้างอิง) สำหรับการทำซ้ำทางชีวภาพแต่ละชนิด Gorasp2 ได้รับเลือกให้เป็นยีนอ้างอิงเพราะมันไม่ได้แสดงความแตกต่างระหว่างเซลล์ประสาทและ Glia ในการวิเคราะห์ microarray มันถูกตรวจสอบเพิ่มเติมว่าเป็นยีนอ้างอิงเนื่องจากการขยาย qPCR ที่เท่ากันในทุกตัวอย่างเมื่อโหลดเทมเพลตจำนวนเดียวกัน เทคนิคการทดสอบเพิ่มขึ้นสามเท่าq ค่าเฉลี่ยก่อนที่จะคำนวณΔCq สำหรับแต่ละยีนในตัวอย่าง สำหรับแต่ละ mRNA ที่วัดใน qPCR ค่าการแสดงออกของยีนจะถูกเฉลี่ยในการจำลองแบบทางชีวภาพ จากนั้นเพื่อสะท้อนค่าการเปลี่ยนแปลงแบบพับเราแบ่งค่าเฉลี่ยนี้ด้วยค่าการแสดงออกของยีนเฉลี่ยของเซลล์ NeuN-positive จากหนูที่ฉีดน้ำเกลือ ค่าเหล่านี้ระบุว่าเป็นวิธีการและข้อผิดพลาดมาตรฐานในกราฟและตาราง

immunohistochemistry

เนื้อเยื่อสมองนั้นได้มาจากหนูตัวผู้ Spraque-Dawley ซึ่งเป็นสัตว์ป่าตามการรักษาโคเคนแบบเฉียบพลันและแบบซ้ำ ๆ ที่อธิบายไว้ข้างต้นสำหรับการทดลอง microarray และ qPCR อย่างไรก็ตาม 90 นาทีหลังจากการฉีดยาวันทดสอบหนูได้รับการดมยาสลบอย่างละเอียดด้วย isoflurane และทำการ perfused ด้วย 100 ml ของ PBS ตามด้วย 400 ml ของ 4% paraformaldehyde (PFA) สมองถูกโพสต์ใน PFA เป็นเวลา 2 ชั่วโมงและโอนไปยังสารละลายซูโครส 30% ที่ 4 ° C เป็นเวลา 2 – 3 วัน สมองถูกแช่แข็งบนน้ำแข็งแห้งแบบผงและเก็บไว้ที่ −80 ° C จนกระทั่งการแบ่งส่วน ส่วนชเวียนถูกตัดหนา 40 μmระหว่าง Bregma 2.5 และ −0.5 (Paxinos และ Watson, 1998).

ส่วนถูก immunolabeled สำหรับ Fos และอาร์ค โดยย่อส่วนถูกล้างด้วยน้ำเกลือสามครั้ง (TBS) สามครั้งและซึมผ่าน 30 ขั้นต่ำใน TBS ด้วย 0.2% Triton X-100 ส่วนถูกล้างอีกครั้งใน TBS และบ่มในแอนติบอดีปฐมภูมิเจือจางใน PBS ด้วย 0.3% Triton X-100 เป็นเวลา 24 ชั่วโมงบนเครื่องปั่นที่ 4 ° C เราใช้กระต่าย polyclonal กับแอนติบอดี c-Fos (1: 500 เจือจาง, Cat # sc-52, เทคโนโลยีชีวภาพ Santa Cruz, Santa Cruz, CA) และ monoclonal Arc antibody (1: 100 เจือจาง, Cat # sc-17839, Santa เทคโนโลยีชีวภาพของครูซ) ส่วนถูกล้างสามครั้งใน TBS และบ่มในแอนติบอดีทุติยภูมิเจือจางใน PBS เป็นเวลา 1.5 ชั่วโมงบนเครื่องปั่นที่อุณหภูมิห้อง เราใช้ Alexa Fluor 488 ที่มีป้ายกำกับลาแอนติบอดีต่อต้านกระต่าย (1: การเจือจาง 200, Cat # A21206, Invitrogen) และ Alexa Fluor 568 แอนติบอดีต่อต้านหนูที่ติดป้ายชื่อแพะ (1: 200 เจือจาง XNUMX, Cat # A11004Invitrogen) ส่วนถูกล้างใน TBS ติดตั้งลงบนภาพนิ่งโครเมี่ยมสารส้มและครอบคลุมกับสื่อการติดตั้งยาก VectaShield

immunoreactivity ของ Fos และ Arc ใน Caudate-putamen และ NAc (ประมาณ 2.0 mm ก่อนหน้าถึง Bregma) ถ่ายภาพโดยใช้กล้อง CCD (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc. , Trenton, NJ) ที่ติดอยู่กับกล้องจุลทรรศน์ Zeiss Axioskop 2 รูปภาพสำหรับการนับเซลล์ที่มีฉลากถูกถ่ายที่กำลังขยาย 200x อิมเมจสำหรับพิจารณา Fos และ Arc colocalization ถูกถ่ายที่กำลังขยาย 400x เซลล์ที่ติดฉลากจากซีกโลกทั้งสี่ต่อหนูจะถูกนับโดยอัตโนมัติโดยใช้ซอฟต์แวร์ IPLab สำหรับ Macintosh เวอร์ชัน 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc. , Fairfax, VA) จำนวนจากซีกโลกทั้งสี่ถูกเฉลี่ยเพื่อให้ได้ค่าเดียวสำหรับแต่ละหนู

การวิเคราะห์ข้อมูล

วิเคราะห์ข้อมูลการแพ้ของหัวจักรโดยใช้ความแปรปรวนทางเดียวโดยใช้มาตรการซ้ำหลายครั้งเพื่อให้ได้ผลหลักในช่วงเวลาที่ฉีด 4 วัน นัยสำคัญทางสถิติตั้งไว้ที่ p <0.05 ข้อมูล Microarray ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ DIANE 6.0 ซึ่งเป็นโปรแกรมวิเคราะห์ microarray ที่ใช้สเปรดชีตโดยใช้ SAS JMP 7.0 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Garg et al., 2009) ข้อมูลความเข้มของฟลูออเรสเซนต์จากไมโครเรย์ถูกกรองโดยการตรวจจับ p- ค่าและ Z การฟื้นฟู วิเคราะห์คุณภาพตัวอย่างโดยใช้การกระจายการวิเคราะห์องค์ประกอบหลักและตัวอย่างยีน Z- จัดกลุ่มตามลำดับชั้นตามคะแนนเพื่อยกเว้นค่าผิดปกติที่เป็นไปได้ จากนั้นใช้การทดสอบ ANOVA เพื่อกำจัดยีนที่มีความแปรปรวนมากขึ้นภายในแต่ละกลุ่มเปรียบเทียบ ยีนถูกระบุว่าแสดงออกอย่างแตกต่างกันถ้า p <0.01 สัมบูรณ์ Z- อัตราส่วน≥ 1.5 และอัตราส่วนการค้นพบเท็จ (fdr) <0.07 สำหรับข้อมูล qPCR จะใช้ความแปรปรวนทางเดียวเพื่อเปรียบเทียบข้อมูลสำหรับยีนแต่ละยีน นัยสำคัญทางสถิติตั้งไว้ที่ p <0.05 สำหรับ Fos และ Arc immunohistochemistry ใช้ t-test ที่มีความแปรปรวนไม่เท่ากันในการคำนวณนัยสำคัญทางสถิติซึ่งกำหนดไว้ที่ p <0.05

ผล

หนูพันธุ์ดัดแปรพันธุกรรม cfos-lacZ

พื้นที่ cFos-lacZ ยีนในหนูเหล่านี้ควบคุมโดย a C-เหลวไหล ก่อการคล้ายกับว่าในภายนอก C-เหลวไหล ยีนและถูกกระตุ้นในทำนองเดียวกันในเซลล์ประสาทโดยระดับสูงของอินพุต synaptic excitatory (Shin และคณะ, 1990; Labiner และคณะ 1993; Sgambato และคณะ, 1997) ผลิตภัณฑ์โปรตีนของ cFos-lacZ transgene, β-galactosidase (βgal) มีการแสดงออกร่วมกับ c-Fos ในเซลล์ประสาทที่กระตุ้นการทำงานอย่างรุนแรง (Koya และคณะ, 2009) และใช้ในการติดฉลากเซลล์ประสาทตาเปล่าในขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ FACS ต่อไปนี้

FACS การทำให้บริสุทธิ์ของเซลล์ประสาทส่วนที่เปิดใช้งานหลังจากการฉีดโคเคนเฉียบพลันครั้งเดียว

ทั้ง striata ได้รับจาก cFos-lacZ หนู 90 นาทีหลังจากการฉีดโคเคนหรือน้ำเกลือออกจาก 30 mg / kg นอกกรงบ้านของพวกเขา เซลล์ที่แยกตัวออกจากกันของหนูที่ได้รับการรักษาในลักษณะเดียวกันนั้นจะถูกนำมารวมกันก่อนที่จะทำการทำให้บริสุทธิ์ด้วย FACS สำหรับการจำลองแบบทางชีวภาพในการวิเคราะห์ microarray และการคำนวณ PCR (qPCR) ในภายหลัง เซลล์แรกเกิดที่แยกตัวออกจากกันได้รับการวิเคราะห์ตามลักษณะการกระจายแสงไปข้างหน้าและด้านข้าง [รูปที่ 1a] ส่วนใหญ่ของเซลล์ประสาทที่ติดป้าย NeuN พบได้ในแถบของเหตุการณ์ตามส่วนล่างของพล็อต ดังนั้นการวิเคราะห์ที่ตามมาทั้งหมดถูกส่งต่อ gated เพื่อรวมเฉพาะเหตุการณ์ที่พบในแถบนี้

รูป 1 

การจัดเรียงเซลล์แบบเปิดใช้แสงเรืองแสงของเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับβgalจากหนูที่รักษาด้วยการฉีดโคเคนเพียงครั้งเดียว

เซลล์ภายในประตูนี้ถูกแยกออกตามระดับอิมมูโนลาเบลด้วย NeuN marker ของ neuronal และ activationgal marker ของระบบประสาท ในเนื้อเยื่อที่ได้จากหนูที่ฉีดโคเคนประมาณ 15% ของเซลล์ประสาทที่ติดฉลาก NeuN มีระดับ ofgal [ในระดับสูง]รูปที่ 1b] ซึ่งสัมพันธ์กับเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับประมาณ 100,000 ต่อหนู เซลล์ที่มีป้ายกำกับβgalทั้งหมดร่วมแสดง NeuN ระบุว่ามีเพียงเซลล์ประสาทเท่านั้นที่แสดงβgal ในทางตรงกันข้ามเซลล์ประสาทที่ติดฉลาก NeuN น้อยมากที่ได้จากหนูที่ฉีดน้ำเกลือแสดงเครื่องหมายการเปิดใช้งานβgalหรือ Fos ซึ่งรองรับ immungal และ Fos immunoreactivity เป็นเครื่องหมายของการกระตุ้นประสาทในหนูโคเคนที่ฉีดโคเคน จำนวนเซลล์ประสาทที่มีการแสดงออกของβgalในระดับต่ำจากหนูที่ฉีดน้ำเกลือไม่ได้ให้เซลล์เพียงพอสำหรับการวิเคราะห์ระดับโมเลกุลตามมา ดังนั้นเราจึงใช้การติดฉลาก NeuN เพียงอย่างเดียวเพื่อแยกเซลล์ประสาทออกจากเซลล์ที่ไม่ใช่เซลล์ประสาทในการทดลองที่ตามมาทั้งหมดด้วยเนื้อเยื่อ striatal ที่ได้จากหนูที่ฉีดน้ำเกลือ โดยรวมแล้วประมาณ 30% ของร่างกายเซลล์เปลื้องผ้าทั้งหมดเป็นบวก NeuN ซึ่งสอดคล้องกับเซลล์ประสาท striatal 600,000 ประมาณต่อหนู เมื่อตรวจสอบเซลล์ที่บริสุทธิ์ของ FACS ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เซลล์ทั้งหมดจะอยู่ในสภาพกลมและไร้กระบวนการ [รูป 2]. การสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ยืนยันว่าเซลล์ที่เรียงลำดับ FACS ได้รับการติดฉลากอย่างเหมาะสมสำหรับ NeuN− และβgal-immunoreactivity ตัวอย่างของเซลล์ที่ทำให้บริสุทธิ์ FACS พบว่าบริสุทธิ์> 90% เมื่อประเมินด้วยโฟลไซโตเมทรีรอบที่สอง (ไม่แสดงข้อมูล)

รูป 2 

ภาพถ่ายกล้องจุลทรรศน์ของเซลล์และเศษซากที่บริสุทธิ์ของ FACS

เราได้พิจารณาการคัดเลือกของกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ของ FACS ด้วย microarray เพื่อวิเคราะห์รูปแบบการแสดงออกของยีนของเซลล์ที่บริสุทธิ์ด้วย FACS เราเปรียบเทียบการแสดงออกของยีนในเซลล์ประสาท positivegal-positive และβgal-negative จากหนูโคเคนที่ฉีดเช่นเดียวกับเซลล์ NeuN-positive และ NeuN-positive จากหนูที่ฉีดน้ำเกลือ การวิเคราะห์องค์ประกอบหลักและการกระจุกตัวบ่งชี้ว่าปัจจัยที่มีความแตกต่างหลักคือเซลล์เป็นเซลล์ประสาทหรือ glia [รูปที่ 3a]. ปัจจัยที่ทำให้เกิดความแตกต่างที่สองคือ gal expression ที่ใช้เพื่อแยกการกระตุ้นจากเซลล์ประสาทที่ไม่ได้เปิดใช้ ยีนถูกระบุว่าแสดงออกอย่างแตกต่างกันถ้า p <0.01 สัมบูรณ์ Z- อัตราส่วน≥ 1.5 และอัตราส่วนการค้นพบเท็จ (fdr) <0.07 เราพบว่ามียีนเพิ่มขึ้น 125 ยีนและ 467 ยีนลดลงในเซลล์ประสาทβgal-positive เมื่อเทียบกับเซลล์ประสาท gal-negative ที่ได้จากเนื้อเยื่อ striatal เดียวกันของหนูที่ฉีดโคเคน [รูปที่ 3b]. เมื่อนำเซลล์ประสาท gal-positive จากหนูที่ฉีดโคเคนไปเปรียบเทียบกับตัวอย่างควบคุมของเซลล์ประสาทที่ติดฉลาก NeuN ทั้งหมดจากหนูที่ฉีดน้ำเกลือพบว่ามียีนเพิ่มขึ้น 133 ยีนและมียีนลดลง 890 ยีนในเซลล์ประสาทβgal-positive โดยเฉพาะกลุ่มควบคุมทั้งสองกลุ่มคือเซลล์ประสาทที่เป็นขั้วลบจากหนูที่ฉีดโคเคนและเซลล์ประสาทที่ติดฉลาก NeuN ทั้งหมดจากหนูที่ฉีดน้ำเกลือสร้างรูปแบบการแสดงออกของยีนที่คล้ายคลึงกันมาก การแสดงออกของยีนไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มควบคุมเหล่านี้ [รูปที่ 3b].

รูป 3 

การวิเคราะห์แบบ microarray ของเซลล์ที่เรียงลำดับจากหนู striata หลังจากฉีดโคเคนหรือน้ำเกลือเพียงครั้งเดียว

พบยีนที่เฉพาะเจาะจงในกลุ่มตัวอย่างที่แตกต่างกันยืนยันว่ามีการเปิดใช้งานจากเซลล์ประสาทที่ไม่ทำงานและเซลล์ประสาทจากเซลล์ที่ไม่ใช่เซลล์ประสาทโดยใช้ FACS2 ตาราง] เซลล์ประสาทบวกβgalจากหนูโคเคนที่ฉีดแสดงระดับที่สูงขึ้นของยีนเครื่องหมายการเปิดใช้งานระบบประสาทจำนวนมากเมื่อเทียบกับเซลล์ประสาท negativegal ลบในหนูหนูโคเคนเดียวกันหรือเซลล์ประสาทที่ติดฉลาก NeuN ทั้งหมดจากหนูเกลือฉีด [รูปที่ 3c] ยีนเครื่องหมายกิจกรรมเหล่านี้รวมอยู่ด้วย C-เหลวไหล, มิ.ย., เส้นโค้ง, EGR ตระกูล (1, 2, 4) และ nr4a3 (Guzowski และคณะ, 2005) น่าสนใจเซลล์ประสาทชนิด positivegal-positive เหล่านี้ยังแสดงระดับที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของตัวรับสัญญาณเซลล์ชนิด prodynorphin marker ชนิด D1 dopamine receptor และระดับที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญของยีนตัวรับ dopamine D2

2 ตาราง 

สรุปข้อมูล microarray และ qPCR จากการทดลองโคเคนเฉียบพลัน

ข้อมูลการแสดงออกของยีน microarray ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ qPCR ยีนเครื่องหมายกิจกรรม fosB, เส้นโค้งและ nr4a3 มีการแสดงออกในระดับที่สูงขึ้นในเซลล์ประสาท positivegal-positive จากหนูโคเคนที่ฉีดเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ประสาทβgal-positive จากหนูโคเคนที่ฉีดเดียวกันและไปยังเซลล์ประสาททั้งหมดจากหนูที่ฉีดน้ำเกลือ [รูปที่ 4a; ข้อมูลและข้อมูลสถิติใน 2 ตาราง] βgal-positive neurons ยังแสดงระดับที่สูงขึ้นของยีน prodynorphin [รูปที่ 4b] ในขณะที่เซลล์ประสาทบวก hadgal มีระดับการแสดงออกที่ต่ำกว่าสำหรับยีนหลาย ๆ อันรวมถึงตัวรับ adenosine A2A adNosine คือ Kv3.1 ที่แตกต่างกันโดยใช้การแสดงออก Kv2 ที่แตกต่างกันโดยเฉพาะ Kv6 และ map63.1KKรูปที่ 4c] โดยรวมแล้วการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนที่ประเมินด้วย qPCR นั้นเกือบจะเหมือนกับการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนที่ประเมินโดยการทดลอง microarray

รูป 4 

Quantitative PCR แสดงให้เห็นถึงรายละเอียดการแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันสำหรับเซลล์ประสาท positivegal-positive หลังจากการฉีดโคเคนเฉียบพลันเมื่อเปรียบเทียบกับ -gal-positive neurons จากหนูเดียวกันหรือเซลล์ประสาททั้งหมดจากหนูที่ฉีดน้ำเกลือ

เพื่อตรวจสอบว่าการเปลี่ยนแปลง mRNA ในเซลล์ประสาทที่เปิดใช้งานถูกสะท้อนในระดับโปรตีนหรือไม่เราใช้การวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมีของสมองส่วนโคโรนาจากโคเคน - และหนูเพศเมียที่ฉีดน้ำเกลือ [รูป 5] ส่วนเหล่านี้ไม่ได้ถูกแยกออกจากกันหรือ FACS ดังนั้นการวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮีสโตเคมีจึงไม่ได้รับผลกระทบจากการแยกตัวของเซลล์ที่พบในกระบวนการ FACS ในช่องท้อง striatum จากหนูโคเคน - ฉีด [รูปที่ 5a] เครื่องหมายกิจกรรมของระบบประสาท Fos และ Arc ถูกแสดงร่วมกันในเซลล์เดียวกัน: 85 ± 4% ของเซลล์ Fos-positive ทั้งหมดเป็น Arc-positive ในขณะที่ 82 ± 3% ของเซลล์ Arc-positive ทั้งหมดเป็น Fos-positive การฉีดโคเคนทำให้เพิ่มขึ้น 2.7- เท่าในเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับ Fos และเพิ่มขึ้น 2.7- เท่าในเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับ Arc ในหลัง striatum จากหนูโคเคนฉีด [รูปที่ 5b], 80 ± 2% ของเซลล์ Fos-positive ทั้งหมดคือ Arc-positive ในขณะที่ 86 ± 3% ของเซลล์ Arc-positive ทั้งหมดเป็น Fos-positive การฉีดโคเคนทำให้เพิ่มขึ้น 4.4- เท่าในเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับ Fos และเพิ่มขึ้น 3.8- เท่าในเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับ Arc

รูป 5 

Fos and Arc แสดงร่วมใน (a) ventral striatum และ (b) dorsal striatum หลังจากฉีดโคเคนเพียงครั้งเดียว

FACS การทำให้บริสุทธิ์ของเซลล์ประสาทตาเปล่าจากหนูโคเคนที่ไวต่อแสง

ในการทดลอง FACS ครั้งที่สองหนูทุกคนจะไวต่อการฉีดโคเคนซ้ำ การบริหารโคเคนซ้ำ ๆ ในกล่องควบคุมการเคลื่อนไหวที่เพิ่มขึ้นเนื่องจากการโคเคนโคเคน: การเคลื่อนไหวในวันที่ 7 คือ 180 ± 18% ของวันการเคลื่อนไหว 1 (ผลหลักของเวลาในการฉีดซ้ำซ้ำ 4, F3, 363 = 24.9, p <0.001) ซึ่งบ่งบอกถึงความไวต่อจิตประสาทอย่างมีนัยสำคัญ เจ็ดวันต่อมาในวันทดสอบโคเคนหรือน้ำเกลือถูกฉีดให้หนูในกล่องขมิ้นชันเดียวกัน เก้าสิบนาทีต่อมาเนื้อเยื่อ striatal รวมทั้ง NAc ถูกสกัดและเซลล์ถูกทำให้บริสุทธิ์ FACS โดยใช้ขั้นตอนที่อธิบายไว้ข้างต้น

เซลล์ภายในแถบแสงกระจัดกระจายแสงเดียวกันของเหตุการณ์ที่เกิดขึ้นในการทดลองก่อนหน้านี้ถูกแยกออกตามระดับอิมมูโนโลเบลด้วย NeuN marker ของเซลล์ประสาทและเครื่องหมายกระตุ้นประสาท andgal ในเนื้อเยื่อที่ได้จากหนูที่ฉีดโคเคนประมาณ 10% ของเซลล์ประสาทที่ติดฉลาก NeuN มีระดับ ofgal [ในระดับสูง]รูป 6] ซึ่งสัมพันธ์กับเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับประมาณ 60,000 ต่อหนู เซลล์ที่มีป้ายกำกับβgalทั้งหมดร่วมแสดง NeuN ระบุว่ามีเพียงเซลล์ประสาทเท่านั้นที่แสดงβgal อีกครั้งเนื้อเยื่อที่ได้จากหนูที่ถูกฉีดด้วยน้ำเกลือในวันทดสอบนั้นมีเซลล์ประสาทβgal-หรือ Fos-expressing น้อยมากทำให้เซลล์ไม่เพียงพอสำหรับการวิเคราะห์โมเลกุลในเวลาต่อมา ดังนั้นเราจึงใช้เพียงการติดฉลาก NeuN เพื่อแยกเซลล์ประสาทออกจากเซลล์ที่ไม่ใช่เซลล์ประสาทที่ได้รับจากหนูที่ฉีดน้ำเกลือ ประมาณ 30% ของเซลล์ร่างกายทั้งหมดในหนูที่ฉีดน้ำเกลือนั้นเป็นบวก NeuN ซึ่งในการทดลองนี้มีความสอดคล้องกับเซลล์ประสาทส่วนตา 400,000 แบบประมาณต่อหนู

รูป 6 

เปิดใช้งานการจัดเรียงเซลล์เรืองแสงของเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับβgalจากหนูไวแสงที่ถูกท้าทายด้วยโคเคน 7 วันหลังจากการรักษาโคเคนซ้ำ

เราใช้ qPCR เพื่อเปรียบเทียบการแสดงออกของยีนในเซลล์ประสาทβgal-positive และβgal-negative จากหนูที่ฉีดโคเคนรวมทั้งเซลล์ประสาท NeuN-positive ทั้งหมดจากหนูที่ฉีดน้ำเกลือหลังจากเกิดอาการแพ้โคเคน เซลล์ประสาท gal-positive จากหนูที่ฉีดโคเคนจะแสดงระดับที่สูงขึ้นของยีนเครื่องหมายกิจกรรมประสาทสามตัว - fosB, เส้นโค้งและ nr4a3- สัมพันธ์กับเซลล์ประสาท gal-negative จากหนูที่ฉีดโคเคนตัวเดียวกันและเซลล์ประสาททั้งหมดจากหนูที่ฉีดน้ำเกลือ [รูปที่ 7a; ข้อมูลและข้อมูลสถิติใน 3 ตาราง] βgal-positive neurons ยังแสดงระดับที่สูงขึ้นของยีน prodynorphin ที่คล้ายกับในการทดลองฉีดโคเคนเดี่ยว [รูปที่ 7b] ในทางตรงกันข้ามเซลล์βgal-positive มีระดับการแสดงออกที่ต่ำกว่าสำหรับยีนหลาย ๆ ตัว [รูปที่ 7c] รวมถึง Drd2 การเข้ารหัสตัวรับโดปามีน D2 และ Map2k6 การเข้ารหัส kinase ที่เปิดใช้งาน p38 MAPK คล้ายกับการทดลองฉีดโคเคนเฉียบพลัน ในที่สุดเซลล์ประสาทβgalบวกได้เพิ่มการแสดงออกของ dusp1หรือที่รู้จักในชื่อ mkp1 [รูปที่ 7c] ซึ่งเข้ารหัสฟอสฟาเตสที่ยับยั้ง p38 MAPK (Sgambato และคณะ, 1998).

รูป 7 

Quantitative PCR แสดงให้เห็นถึงรายละเอียดการแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันในเซลล์ประสาทบวก fromgal จากหนูโคเคนที่ไวต่อความรู้สึกเมื่อเทียบกับเซลล์ประสาทβgal-positive จากหนูเดียวกันหรือเซลล์ประสาททั้งหมดจากหนูที่มีน้ำเกลือ
3 ตาราง 

สรุปข้อมูล qPCR จากการทดลองโคเคนซ้ำ

เพื่อตรวจสอบว่าการเปลี่ยนแปลง mRNA ในเซลล์ประสาทที่เปิดใช้งานมีการสะท้อนในระดับโปรตีนหรือไม่เราใช้การวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมีของสมองส่วนโคโรนาจากหนูเพศเมียที่ไวต่อโคเคนชนิดไวต่อการกระตุ้นโคเคนหรือการฉีดน้ำเกลือในวันทดสอบ ใน ventral striatum จากหนูที่ฉีดโคเคนหนูกิจกรรมเครื่องหมาย Fos and Arc ร่วมแสดงในเซลล์เดียวกัน: 90 ± 2% ของเซลล์ Fos-positive ทั้งหมดคือ Arc-positive และ 83 ± 2% ของ Arc-positive ทั้งหมด เซลล์เป็นบวก Fos การทดสอบการฉีดโคเคนทำให้เพิ่มขึ้น 2.3-fold ในเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับ Fos และการเพิ่มขึ้น 2.2-fold ในเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับ Arc ใน dorsal striatum จากหนูที่ฉีดโคเคน 93 ± 2% ของเซลล์ Fos-positive ทั้งหมดคือ Arc-positive และ 90 ± 3% ของเซลล์ Arc-positive ทั้งหมดเป็น Fos-positive การทดสอบการฉีดโคเคนทำให้เพิ่มขึ้น 4.4-fold ในเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับ Fos และการเพิ่มขึ้น 4.5-fold ในเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับ Arc ดังนั้นเซลล์ที่ไม่มีป้ายกำกับ Fos จำนวนน้อยมากที่แสดงอาร์คและเซลล์ที่ไม่มีป้ายกำกับอาร์คจำนวนมากแสดง Fos ซึ่งสนับสนุนการค้นพบของเราจากเซลล์ที่เรียงลำดับ

อภิปราย

เราพัฒนาขั้นตอนสำหรับการทำให้บริสุทธิ์และประเมินการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลภายในเซลล์ประสาทที่กำหนดโดยสถานะการเปิดใช้งานก่อนหน้านี้ในระหว่างกิจกรรมการเคลื่อนไหวของโคเคนที่เกิดจากโคเคน ข้อมูลจากการทดลอง microarray, qPCR และ immunohistochemistry ยืนยันว่ากระบวนการ FACS ของเราระบุการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลที่ไม่ซ้ำกันภายในเซลล์ประสาทที่เปิดใช้งานตามที่กำหนดโดย C-เหลวไหล โปรโมเตอร์เหนี่ยวนำการแสดงออกของβgal การค้นพบทางชีวภาพที่สำคัญโดยใช้ขั้นตอนนี้คือการกระตุ้นให้เกิดยีนต้นในทันที (IEGs) เฉพาะในเซลล์ประสาทที่ถูกกระตุ้นในขณะที่การแสดงออกของ IEG นั้นไม่เปลี่ยนแปลงหรือลดลงในเซลล์ประสาทส่วนใหญ่ที่ไม่ทำงาน กิจกรรมของ IEG เนื่องจากเครื่องหมายของระบบประสาทของ IEG เหล่านี้หลายตัวก็เป็นปัจจัยการถอดความมันมีแนวโน้มว่ารูปแบบที่แตกต่างกันมากของการแสดงออกของยีนจะถูกเหนี่ยวนำให้เกิดขึ้นภายในเซลล์ประสาทที่เปิดใช้งานเหล่านี้ซึ่งอาจนำไปสู่ผลกระทบทางสรีรวิทยาและพฤติกรรมของโคเคนCurran และ Franza, 1988; Nestler et al., 1993; McClung และคณะ, 2004; Loebrich และ Nedivi, 2009).

การเหนี่ยวนำ IEG ที่ต่างกันระหว่างเซลล์ประสาทที่ถูกกระตุ้นและไม่ถูกกระตุ้นนั้นสนับสนุนสมมติฐานที่ว่ามีเพียงเซลล์ประสาทส่วนน้อยเท่านั้นที่ถูกกระตุ้นอย่างรุนแรงในระหว่างการเคลื่อนไหวของโคเคนที่เกิดจากโคเคนในขณะที่เซลล์ประสาทส่วนใหญ่จะทำงานในระดับที่น้อยกว่าหรือไม่เลย การทดลองทางไฟฟ้าวิทยาในหนูป่าพบว่าการแสดงออกของโปรตีนฟอสมีความสัมพันธ์กับระดับสูงของการป้อนข้อมูล synaptic excitatory (Shin และคณะ, 1990; Labiner และคณะ 1993; Sgambato และคณะ, 1997) เรารู้ว่าการแสดงออกของ Fos และβgalนั้นมีการควบคุมคล้ายกันในเซลล์ประสาทเดียวกัน cFos-lacZ หนู (Koya และคณะ, 2009) ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่าการแสดงออกของβgalและ IEG ที่เพิ่มขึ้นในเซลล์ประสาทส่วนตาจำนวนน้อยบ่งชี้ว่ามีเพียงส่วนน้อยของเซลล์ประสาทส่วนบนเท่านั้นที่ได้รับระดับสูงของการป้อนข้อมูล synaptic excitatory เพื่อตอบสนองต่อการบริหารโคเคน

การเปิดใช้งานแบบไม่ต่อเนื่องของเซลล์ประสาท striatal มีความสอดคล้องกับสมมติฐานของ upstate-downstate ที่อธิบายถึงผลตรงกันข้ามของโดปามีนที่มีต่อกิจกรรมของเซลล์ประสาทของทารกในครรภ์ โดปามีนที่เกิดจากโคเคนเป็นความคิดที่จะเพิ่มความแตกต่างระหว่างกิจกรรมสูงและเซลล์ประสาทกิจกรรมต่ำโดยการเพิ่มกิจกรรม electrophysiological อย่างต่อเนื่องของเซลล์ประสาทที่อยู่ในสถานะที่กิจกรรมสูงในขณะที่ลดทอนกิจกรรมต่อเนื่องของเซลล์ประสาทส่วนใหญ่Wilson และ Kawaguchi, 1996; Hernandez-Lopez et al., 1997; Nicola และคณะ 2000; O'Donnell, 2003; Nicola และคณะ 2004) การเพิ่มขึ้นของอัตราส่วนสัญญาณต่อเสียงรบกวนนั้นไม่เพียง แต่ช่วยเพิ่มการคัดเลือกในระหว่างการส่งสัญญาณเฉียบพลันเท่านั้น แต่ตามที่แนะนำในการศึกษาของเรานั้นอาจช่วยกระตุ้นการเหนี่ยวนำของระบบประสาทโมเลกุลที่เป็นเอกลักษณ์เฉพาะในเซลล์ประสาทกิจกรรมสูง ในขณะเดียวกันการแสดงออกของยีนในเซลล์ประสาท negativegal-negative ซึ่งประกอบไปด้วยเซลล์ประสาทส่วนใหญ่จากหนูโคเคนที่ฉีดโคเคนดูเหมือนว่าจะไม่แตกต่างจากการแสดงออกของยีนในเซลล์ประสาทของทารกแรกเกิดจากหนูที่ฉีดน้ำเกลือ นี่สนับสนุนสมมติฐานที่ว่าเซลล์ประสาทส่วนใหญ่ยังคงอยู่ในสถานะ downstate ระหว่างการสัมผัสโคเคน

องค์ประกอบของเส้นทางการส่งสัญญาณ kinase ของ p38 MAP ก็ถูกเปลี่ยนแปลงด้วยเช่นกันระหว่างเซลล์ประสาทที่ถูกกระตุ้นและไม่ทำงาน การแสดงออกของยีนของ Map2k6 / MEKK6 ไคเนสที่เปิดใช้งาน p38 ลดลงในขณะที่การแสดงออกของยีนของ Mkp1 / Dusp1 เป็นฟอสฟาเตสที่ไม่ทำงาน p38 (Sgambato และคณะ, 1998) เพิ่มขึ้นในเซลล์ประสาทที่ถูกกระตุ้น แต่ไม่ได้อยู่ในเซลล์ที่ไม่ถูกกระตุ้น ดังนั้นสัญญาณ p38 MAPK โดยรวมแสดงให้เห็นว่ามีบทบาทในพลาสติกซินแนปท์ (Bolshakov และคณะ, 2000; Izumi และคณะ, 2008) อาจถูกลดทอนในเซลล์ประสาทที่เปิดใช้งานซึ่งสัมพันธ์กับเซลล์ประสาทส่วนใหญ่ที่ไม่ได้ทำงาน

FACS ยังสามารถช่วยระบุประเภทของเซลล์ประสาทที่เปิดใช้งานหลังจากการสัมผัสโคเคนแบบเฉียบพลันหรือแบบซ้ำ ๆ เราพบการแสดงออกที่สูงขึ้นของ prodynorphin neuronal marker ยีน D1 ในเซลล์ประสาทที่เปิดใช้งานและการแสดงออกที่ต่ำกว่าของ D2 marker neuronal marker ยีน D2 dopamine receptor และ A2A adenosine receptor ในเซลล์ประสาท สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า Fos นั้นถูกเหนี่ยวนำให้เกิดในเซลล์ประสาท D1 striatal ในขณะนี้เห็นด้วยกับการศึกษา immunohistochemical หลายที่รายงานการเหนี่ยวนำ Fos หลักในเซลล์ประสาท D1 หลังจากการฉีด psychostimulant ใน บ้านกรง (Berretta และคณะ, 1992; Cenci et al., 1992) มันขัดแย้งกับการเปิดใช้งานที่เท่ากันของเซลล์ประสาท D1 และ D2 พบต่อไปนี้การฉีด psychostimulant ในค่อนข้าง สภาพแวดล้อมใหม่ นอกกรงบ้านของหนูJaber et al., 1995; Badiani et al., 1999; ความหวังและคณะ, 2006).

เนื่องจากเราใช้เครื่องหมายβgalเดียวกันเพื่อระบุเซลล์ประสาทที่เปิดใช้งานในระหว่าง FACS ตามที่เราใช้สำหรับขั้นตอนการยับยั้ง Daun02 ที่เราอธิบายไว้ก่อนหน้า (Koya และคณะ, 2009) เป็นไปได้ว่าเรากำลังสังเกตการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลที่เป็นเอกลักษณ์ภายในวงประสาทที่จำเป็นสำหรับองค์ประกอบที่เรียนรู้จากการแพ้ในบริบทเฉพาะของการเคลื่อนไหวที่เกิดจากโคเคน ก่อนหน้านี้เราพบว่าการยับยั้งการทำงานของเซลล์ประสาทที่กระจัดกระจายเพียงเล็กน้อยในวงดนตรีสมมุตินั้นเพียงพอที่จะทำลายการกระตุ้นจิตโคเคนในบริบทที่เฉพาะเจาะจง (Koya และคณะ, 2009) การค้นพบนี้ถูกจำลองแบบโดยใช้ผู้หญิงคนเดียวกัน cFos-lacZ หนูและระบบการแพ้ที่ใช้ในการศึกษานี้ [http://irp.drugabuse.gov] เซลล์ประสาทเหล่านี้ไม่ไวต่อสิ่งกระตุ้นโดยธรรมชาติมากขึ้นเนื่องจากการเปลี่ยนแปลงสภาพแวดล้อมหรือบริบทที่มีการใช้ยาก็ทำให้เกิดเซลล์ประสาทที่แตกต่างจากการฉีดโคเคนMattson et al., 2008; Koya และคณะ, 2009) การเลือกชุดเฉพาะของเซลล์ประสาท striatal ปรากฏขึ้นส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับรูปแบบของกิจกรรมจากเยื่อหุ้มสมองและ subcortical glutamatergic afferents (Pennartz และคณะ, 1994; O'Donnell, 2003) และปัจจัยเหล่านี้จะถูกกำหนดโดยสิ่งเร้าสิ่งแวดล้อมและ interoceptive เฉพาะที่มีอยู่ในระหว่างพฤติกรรม จากการทำงานก่อนหน้านี้พร้อมกับข้อมูลปัจจุบันของเราเราตั้งสมมติฐานว่าการจับคู่โคเคนซ้ำกับสิ่งเร้าทางสิ่งแวดล้อมในช่วงการกระตุ้นอาการแพ้ของเราผลิตการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลที่ไม่ซ้ำกันภายในวงประสาทเซลล์ประสาทที่เปิดใช้งานซ้ำแล้วซ้ำอีก

โดยรวมแล้วเราแสดงให้เห็นถึงการประยุกต์ใช้นวนิยายของ FACS ในการแยกเซลล์ประสาทสำหรับผู้ใหญ่ที่ถูกกระตุ้นการทำงานในระหว่างการเคลื่อนไหวของโคเคนที่เกิดจากโคเคนเฉียบพลันและการกระตุ้นด้วยโคเคนที่เกิดจากโคเคนซ้ำ เราเสนอว่าวิธีการนี้ยังสามารถใช้ในการระบุ neuroadaptations โมเลกุลที่ไม่ซ้ำกันในวงประสาทเซลล์ประสาทที่เข้ารหัสผลกระทบพฤติกรรมของยาเสพติดและพฤติกรรมอื่น ๆ ที่เรียนรู้ บทบาทเชิงสาเหตุของ neuroadaptations โมเลกุลที่ไม่ซ้ำกันเหล่านี้ในพลาสติกปั้นและพฤติกรรมในที่สุดจะต้องตรวจสอบโดยการจัดการการแสดงออกของยีนในเซลล์ประสาทเปิดใช้งานเท่านั้น อย่างไรก็ตามเทคนิคนี้ยังไม่ได้รับการพัฒนา

กิตติกรรมประกาศ

งานวิจัยนี้ได้รับการสนับสนุนโดยโครงการวิจัยภายในสถาบันแห่งชาติว่าด้วยยาเสพติด D. Guez-Barber ได้รับการสนับสนุนจาก NIH MSTP TG 5T32GM07205 หมายเลขรางวัล F30DA024931 จากสถาบันแห่งชาติว่าด้วยการใช้ยาในทางที่ผิดและเก้าอี้ Charles BG Murphy ในสาขาจิตเวชศาสตร์ที่มหาวิทยาลัยเยล เราขอขอบคุณ Joe Chrest สำหรับความช่วยเหลือด้านเทคนิคที่ยอดเยี่ยมของเขากับ FACS และ Chris Cheadle, Tonya Watkins และ Alan Berger สำหรับการทำงานในเรื่อง microarray เราขอขอบคุณ Yavin Shaham สำหรับความคิดเห็นที่เป็นประโยชน์เกี่ยวกับต้นฉบับ

เชิงอรรถ

 

ไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์สำหรับผู้เขียนต้นฉบับนี้

อ้างอิง

  1. Badiani A, Oates MM, วัน HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE การปรับสิ่งแวดล้อมของการแสดงออกของแอมเฟตามีนที่เกิดจาก c-fos ใน D1 และ D2 striatal เซลล์ประสาท Behav Brain Res 1999; 103: 203 209- [PubMed]
  2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM agonists โดพามีนและกลูตาเมตกระตุ้นการแสดงออกของเซลล์ประสาทที่เฉพาะเจาะจงของโปรตีนเช่น Fos ใน striatum J Neurophysiol 1992; 68: 767 777- [PubMed]
  3. Bolshakov VY, Carboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. แผนที่เส้นทางคู่ kinase เป็นสื่อกลางในรูปแบบที่ตรงข้ามกับพลาสติกในระยะยาวที่ซินซินซ์ CA3-CA1 Nat Neurosci 2000; 3: 1107 1112- [PubMed]
  4. Bowers MS, Chen BT, Bonci A. AMPA ตัวรับ synaptic ปั้นพลาสติกที่เกิดจาก psychostimulants: อนาคตปัจจุบันและอนาคตการรักษา เซลล์ประสาท 2010; 67: 11 24- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  5. Cenci MA, แคมป์เบลเค, Wictorin K, Bjorklund A. การชักนำ c-fos โดยโคเคนหรือ Apomorphine เกิดขึ้นโดยเฉพาะอย่างยิ่งในเซลล์ประสาทเอาท์พุทที่ฉายไปที่ Substantia Nigra ในหนู Eur J Neurosci 1992; 4: 376 380- [PubMed]
  6. Curran T, Franza BR., Jr Fos และ Jun: การเชื่อมต่อ AP-1 เซลล์ 1988; 55: 395 397- [PubMed]
  7. Garg S, Nichols JR, Esen N, Liu S, Phulwani NK, Syed MM, ไม้ WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. MyD88 การแสดงออกของเซลล์ประสาทส่วนกลางมีความสำคัญต่อการกระตุ้นภูมิคุ้มกันในฝีในสมอง ASN Neuro 2009: 1 [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB ฟังก์ชั่นตัวรับ dopamine ของ D1 และ D2 ใน striatum: coactivation ของตัวรับ D1- และ D2-dopamine ในเซลล์ที่แยกจากกันของเซลล์ประสาทส่งผลให้เกิดการตอบสนองของยีนต้นที่มีศักยภาพในเซลล์ประสาท D1 J Neurosci 1995; 15: 8167 8176- [PubMed]
  9. Guzowski JF, Timlin JA, Roysam B, McNaughton BL, Worley PF, Barnes CA การทำแผนที่วงจรประสาทที่เกี่ยวข้องกับพฤติกรรมด้วยการแสดงออกของยีนในช่วงต้นทันที Curr Minnes Neurobiol 2005; 15: 599 606- [PubMed]
  10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, Surmeier DJ, Reyes A, Galarraga E. การกระตุ้นการรับ D1 ช่วยเพิ่มการปลดปล่อยที่เกิดขึ้นในเซลล์ประสาททรงกรวยขนาดกลางโดยการปรับ Ca2 + สื่อนำไฟฟ้า J Neurosci 1997; 17: 3334 3342- [PubMed]
  11. Hope B, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. กิจกรรมการเคลื่อนไหวของโคเคนที่เกิดจากโคเคนและการแสดงออกของ Fos ในนิวเคลียส accumbens จะไวสำหรับ 6 เดือนหลังจากการบริหารโคเคนซ้ำนอกกรงบ้าน Eur J Neurosci 2006; 24: 867 875- [PubMed]
  12. Izumi Y, Tokuda K, Zorumski CF การยับยั้ง potentiation ระยะยาวโดยการเปิดใช้งานตัวรับ N-methyl-D-aspartate ในระดับต่ำนั้นเกี่ยวข้องกับการกระตุ้น calcineurin, ไนตริกออกไซด์และไคเนสโปรตีน p38 mitogen ฮิบโป 2008; 18: 258 265- [PubMed]
  13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. การรักษาแอมเฟตามีนแบบเฉียบพลันและเรื้อรังแตกต่างกันควบคุม neuropeptide messenger ระดับ RNA และ Fos immunoreactivity ในเซลล์ประสาทส่วนล่างของหนู ประสาทวิทยาศาสตร์ 1995; 65: 1041 1050- [PubMed]
  14. Kalivas PW. สมมุติฐานสภาวะสมดุลของกลูตาเมตของการเสพติด Nat Rev Neurosci 2009; 10: 561 572- [PubMed]
  15. Kasof GM, Mahanty NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI การส่งสัญญาณกลูตาเมตที่เกิดขึ้นเองและเกิดขึ้นเองนั้นมีอิทธิพลต่อการแสดงออกของ Fos-lacZ และการตายของเซลล์เสี้ยมในเสี้ยวฮิปโปแคมปัสจากหนูพันธุ์ ความต้านทานของสมอง Mol ความต้านทานของสมอง 1995; 34: 197 208- [PubMed]
  16. Koya E, Golden S, Harvey B, Guez-Barber D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farquhar D, Ghosh S, Mattson B, Hope B. เป้าหมายการหยุดชะงักของ นิวเคลียสที่เปิดใช้งานโคเคน accumbens เซลล์ประสาทป้องกันการแพ้ตามบริบทที่เฉพาะเจาะจง Nat Neurosci 2009; 12: 1069-U1152 [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  17. Kwon B, Houpt TA วิธีการรวมกันของการจับภาพด้วยเลเซอร์ microdissection และ histology X-Gal เพื่อวิเคราะห์การแสดงออกของยีนในเซลล์ประสาทที่เฉพาะเจาะจงของ C-Fos วิธีการ J Neurosci 2010; 186: 155 164- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  18. Labiner DM, Butler LS, Cao Z, Hosford DA, Shin C, McNamara JO การเหนี่ยวนำของ c-fos mRNA โดยอาการชักแบบจุด: ความสัมพันธ์ที่ซับซ้อนกับการยิงระเบิดของเซลล์ประสาท J Neurosci 1993; 13: 744 751- [PubMed]
  19. Liberles SD, Buck LB. ตัวรับเคมีบำบัดชั้นสองในเยื่อบุผิวจมูก ธรรมชาติ. 2006; 442: 645 650- [PubMed]
  20. Lobo MK, Karsten SL, สีเทา M, Geschwind DH, Yang XW การจัดทำโปรไฟล์ FACS แบบอาเรย์ของเซลล์ประสาทชนิดโครงร่างโครงร่างในสมองของเด็กและผู้ใหญ่ Nat Neurosci 2006; 9: 443 452- [PubMed]
  21. Loebrich S, Nedivi E. การทำงานของยีนที่ควบคุมกิจกรรมในระบบประสาท Physiol Rev. 2009; 89: 1079 – 1103 [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  22. Mattson B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Hope B. การแพ้ที่เฉพาะเจาะจงจากบริบทของกิจกรรมการเคลื่อนไหวโคเคนที่เกิดจากโคเคนและการแสดงออกของเซลล์ประสาทที่เกี่ยวข้องในนิวเคลียสหนูนิวเคลียส Eur J Neurosci 2008; 27: 202 212- [PubMed]
  23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ DeltaFosB: สวิตช์ระดับโมเลกุลสำหรับการปรับตัวในระยะยาวในสมอง ต้านทานสมอง Mol ต้านทานสมอง. 2004; 132: 146 154- [PubMed]
  24. Nestler E, Hope B, Widnell K. การติดยา - แบบจำลองสำหรับพื้นฐานโมเลกุลของความเป็นพลาสติกในระบบประสาท เซลล์ประสาท. 1993; 11: 995–1006 [PubMed]
  25. Nestler EJ พื้นฐานระดับโมเลกุลของการติดอยู่กับพลาสติกในระยะยาว Nat Rev Neurosci 2001; 2: 119 128- [PubMed]
  26. Nicola SM, Surmeier J, Malenka RC การปรับ Dopaminergic ของความตื่นเต้นง่ายของเซลล์ประสาทใน striatum และนิวเคลียส accumbens Annu Rev Neurosci 2000; 23: 185 215- [PubMed]
  27. Nicola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO การเพิ่มความคมชัด: ผลทางสรีรวิทยาของโดปามีนที่เกี่ยวกับตา? Res เนื้อเยื่อเซลล์ 2004; 318: 93 106- [PubMed]
  28. O'Donnell P. Dopamine gating ของตระการตาประสาท forebrain Eur J Neurosci 2003; 17: 429 435- [PubMed]
  29. Paxinos G, Watson C. สมองหนูในพิกัด stereotaxic 4 San Diego: Academic Press; 1998
  30. CM Pennartz, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH นิวเคลียส accumbens เป็นความซับซ้อนของวงประสาทเซลล์ประสาทที่แตกต่างกันการใช้งาน: การรวมกันของข้อมูลพฤติกรรม electrophysiological และกายวิภาค Prog Neurobiol 1994; 42: 719 761- [PubMed]
  31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ การแสดงออกของ c-Fos ในแผ่นพับ intergeniculate ของหนู: การควบคุมด้วยแสง, การปรับให้เข้ากับท้องถิ่นด้วย Fos-B และการจำแนกเซลล์ ความต้านทานของสมอง 1996; 728: 231 241- [PubMed]
  32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM ผลของการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าของเปลือกสมองในการแสดงออกของโปรตีน Fos ในปมประสาท Neurosci 1997; 81: 93 112- [PubMed]
  33. Sgambato V, หน้า C, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. ไคเนสที่ควบคุมสัญญาณ Extracellular (ERK) ควบคุมการเหนี่ยวนำของยีนในช่วงต้นทันทีในการกระตุ้น corticostriatal J Neurosci 1998; 18: 8814 8825- [PubMed]
  34. Shaham Y, BT หวัง บทบาทของ neuroadaptations ในการกำเริบของการแสวงหายาเสพติด Nat Neurosci 2005; 8: 1437 1439- [PubMed]
  35. Shin C, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Cohen DR การเหนี่ยวนำการแสดงออกของ c-fos mRNA โดย afterdischarge ในฮิบโปของหนูที่ไร้เดียงสาและมีสติ J Neurochem 1990; 55: 1050 1055- [PubMed]
  36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. ต้นกำเนิดของพังผืดที่เกิดขึ้นเองสองสถานะที่อาจเกิดขึ้นของเซลล์ประสาทหนามเส้นประสาทไขสันหลัง J Neurosci 1996; 16: 2397 2410- [PubMed]
  37. Wolf ME, Ferrario CR แอมป์พลาสติกรีเซพเตอร์ในนิวเคลียส accumbens หลังจากสัมผัสโคเคนซ้ำแล้วซ้ำอีก Neurosci Biobehav Rev 2010 [บทความฟรี PMC] [PubMed]