Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor at Attenuates Downstream Signaling (2013)

Pagbanggit: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Ang Cdk5 ay Nagpo-phosphorylate ng Dopamine D2 Receptor at Pinapahina ang Downstream Signaling. PLoS ONE 8(12): e84482. doi:10.1371/journal.pone.0084482

Patnugot: James Porter, Unibersidad ng Hilagang Dakota, Estados Unidos ng Amerika

Natanggap: Mayo 20, 2013; Tinanggap: Nobyembre 14, 2013; Inilathala: Disyembre 31, 2013

Karapatang-ari: © 2013 Jeong et al. Ito ay isang artikulong bukas sa pag-access na ipinamamahagi sa ilalim ng mga tuntunin ng Creative Commons Attribution License , na nagpapahintulot sa walang limitasyong paggamit, pamamahagi, at pagpaparami sa anumang midyum, basta't ang orihinal na may-akda at pinagmulan ay may kredito.

Pagpopondo: Ang gawaing ito ay sinuportahan ng mga gawad (NRF-2012R1A2A2A01012923 at NRF-2012R1A4A1028200) mula sa gobyerno ng Korea (MSIP) at sinuportahan din sa ilalim ng balangkas ng programang internasyonal na kooperasyon na pinamamahalaan ng NRF ng Korea (2012K2A1A2033117) at ng Korea Brain Research Institute (KBRI) Basic Research Program ng MSIP (2031-415). Ang SKP ay nakatanggap ng 2004 at 2006 National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) Young Investigator Awards. Ang mga nagpondo ay walang papel sa disenyo ng pag-aaral, pangongolekta at pagsusuri ng datos, desisyon na ilathala, o paghahanda ng manuskrito.

Mga nakikipagkumpitensyang interes: Ipinahayag ng mga may-akda na walang umiiral na mga nakikipagkumpitensyang interes.

pagpapakilala

Ang dopamine signaling ay sangkot sa iba't ibang tungkulin ng utak kabilang ang koordinasyon ng motor, pagkontrol ng mood, at mga mekanismo ng gantimpala [1] . Ang isang pangunahing bahagi ng dopamine signaling sa mga vertebrate ay ipinapatupad ng mga striatal medium spiny neurons (MSNs) na pumipiling nagpapahayag ng isang subset ng mga dopamine receptor at tumatanggap ng dopaminergic input pangunahin mula sa ventral tegmental area (VTA) at substantia nigra (SN ) [2] . Ang mga dopamine receptor ay mga G protein-coupled receptor (GPCR) na may pitong transmembrane domain at binubuo ng dalawang subtype, D1-like at D2-like receptor, na namamagitan sa mga reciprocal action sa dopamine signaling [1] . Halimbawa, ang dopamine D1-like receptors (D1, D5) ay nagpapagana ng adenylyl cyclase sa pamamagitan ng Gαs _at nagpapataas ng intracellular level ng cAMP, ngunit ang dopamine D2-like receptors (D2, D3, D4) ay pumipigil sa adenylyl cyclase sa pamamagitan ng Gαi _at nagpapababa ng intracellular level ng cAMP [1] , [3].

Sa mga dopamine receptor, ang D2 receptor (DRD2) ay sangkot sa pathophysiology ng maraming pangunahing sakit sa pag-iisip kabilang ang schizophrenia at adiksyon sa droga [4] , kaya naman maraming antipsychotic na gamot ang bahagyang tinatarget ang DRD2. Alam din na ang aktibidad ng DRD2 ay may mahusay na kaugnayan sa mga kahihinatnan sa pag-uugali ng mga drogang ginagamit sa mga modelo ng hayop [5] . Ang mga antidepressant at mood stabilizer efficacy ay naiugnay din sa mga pagbabago sa ekspresyon ng ibabaw ng selula ng DRD2 o downstream intracellular signaling na namamagitan sa PKA, ERK at GSK3 [1] , [4] , [6] . Sa kabila ng mga kritikal na papel na ito para sa DRD2 sa utak, ang detalyadong mga mekanismo ng regulasyon na nagbibigay ng heterogeneity at complexity sa mga katangian ng DRD2 ay hindi pa lubos na nauunawaan.

Ang mga nagtatagpong linya ng ebidensya ay nagpapahiwatig na maraming posttranslational modifications ang kasangkot sa fine-tuning ng aktibidad ng DRD2. Ang malawakang glycosylation ng DRD2 ay isiniwalat sa mga unang pag-aaral sa photo-affinity labeling [7] , at ang pagbuo ng disulfide bond sa loob ng DRD2 ay kinilala rin bilang isang mahalagang pagbabago para sa ligand binding [8] . Bukod pa rito, ang mga phosphorylation site ng DRD2 ay unang kinilala sa pamamagitan ng in vitro assay gamit ang mga radioisotopes, na nagbibigay ng mga ruta para sa iba't ibang regulatory pathways na namamagitan sa iba't ibang kinases [9] . Sa katunayan, ang protein kinase C (PKC) ay kumokontrol sa DRD2-mediated mobilization ng intracellular calcium at binabago ang interaksyon ng DRD2 sa mga cytoskeletal protein [10] . Ang phosphorylation sa pamamagitan ng GPCR kinase 2 (GRK2) ay kumokontrol sa mga agonist-induced resensitization patterns ng DRD2 [11].

Ang Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) ay isang proline-directed serine/threonine kinase na may preferential activity dahil sa brain-specific expression ng mga essential activator nito, ang p35 at p39 [12] . Ang Cdk5 ay kasangkot sa iba't ibang neuronal processes kabilang ang neuronal migration at axon guidance, at ang Cdk5 at p35 null mice ay nagpapakita ng mga depekto sa cortical layering [13] . Kamakailan lamang, ipinakita na ang phosphorylation ng WAVE1 at ephexin ng Cdk5 ay nagreregula sa dendritic spine morphogenesis [14] . Bukod pa rito, kinokontrol din ng Cdk5 ang mga surface expression levels ng NMDA receptor, NR2B, at NR2A-mediated NMDA currents [15] , [16] . Kapansin-pansin na maraming ebidensya ang nagmumungkahi ng isang malapit na ugnayan sa pagitan ng Cdk5 at ng dopamine system. Ang Cdk5 ay nagpo-phosphorylate ng tyrosine hydroxylase (TH), na nagreregula sa stability nito, at sa gayon ay pinapanatili ang dopaminergic homeostasis [17] . Sa mga postsynaptic neuron, kapag ang T75 residue ng dopamine at cyclic-AMP regulated phosphoprotein-32kD (DARPP-32) ay na-phosphorylate ng Cdk5, maaari nitong pigilan ang aktibidad ng PKA at sa gayon ay ma-antagonize ang dopamine na pinamagitan ng DRD1 na PKA signaling [18] . Kapansin-pansin, kapag ang cocaine, isang indirect agonist ng mga dopamine receptor, ay ibinibigay nang kroniko sa mga daga, tumataas ang antas ng mRNA at protina ng Cdk5 sa mga medium spiny neuron [19] . Sa pangkalahatan, ang Cdk5 ay tila kasangkot sa mga drug-induced synaptic adaptation. Sa pag-aaral na ito, ipinapakita namin ang isang functional interaction ng DRD2 at Cdk5 na lalong nagpapalawak sa papel ng Cdk5 sa dopamine signaling.

Mga Materyal at Mga Paraan

Antibodies

Ang mga anti-rabbit serums ay itinaas laban sa peptides na naglalaman ng phospho-serine 321 (pS321) ng ikatlong intracellular loop ng DRD2 (D2i3). Ang Phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), ay ginamit upang gumawa ng isang peptide-conjugated na haligi para sa pagdalisay ng affinity (20401, PIERCE). Anti-pS321 antibody ay enriched sa pamamagitan ng isang sistema ng pagdalisay ng pagkakahawig kasunod ng pagtuturo ng tagagawa. Ang purified phospho-antibody ay naka-imbak sa PBS na may 0.1% sodium azide at 0.1% gelatin. Ang Anti-mouse anti-Cdk5 antibody (sc-249) at antibog anti-p35 antibody (sc-820) ay ginagamit para sa Western blotting at immunocytochemistry ng Cdk5 / p35. Ang anti-mouse anti-GFP antibody (sc-9996) ay ginamit para sa immunoprecipitation at Western blotting ng DRD2-GFP. Antibody antibodies antibody (sc-807), anti-antibacterial anti-HA antibody (sc-805), anti-mouse anti-GST antibody (sc-138) at anti-mouse anti-GAPDH antibody (sc- 32293) ay binili mula sa Santa Cruz Biotechnologies.

hayop

Ang p35 knockout mouse ay isang magandang regalo mula kay Dr. Katsuhiko Mikoshiba sa RIKEN Brain Science Institute sa Japan at ginamit para sa primary neuron culture. Ang mga primer set para sa genotyping ay 5′- GGTCTCCTCTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC at 5′- TCCATCT GCACGAGACTAGT gaya ng naunang inilarawan [20] . Ang mga daga ng ICR at mga daga ng Sprague Dawley ay ginamit para sa paghahanda ng brain lysate. Ang lahat ng mga pamamaraan sa hayop ay inaprubahan ng Pohang University of Science and Technology Institutional Animal Care and Use Committee.

Plasmid Constructs

Ginamit ang human DRD2 long isoform sa isang EGFP-N1 plasmid vector at ang ikatlong intracellular loop ng DRD2 (212–373 amino acid residues kabilang ang 29 na karagdagang amino acid residues na natatangi sa DRD2 long isoform) sa isang pFLAG-CMV-2 plasmid vector. Ang Human Cdk5 ay ipinasok sa isang pCMV-HA plasmid vector at ang human p35 ay ipinasok sa isang pcDNA 3.1 plasmid vector. Ang Human Cdk5 ay ipinasok sa ilalim ng isang cytomegalovirus (CMV) promoter kasama ang human p35 sa isang pcDNA 3.1 vector upang makagawa ng dual expression construct (Cdk5/p35) para sa immunocytochemistry, receptor internalization assay, [ ³⁵ S]-GTP _γ S binding assay, radioligand binding assay at cAMP enzyme immunoassay.

Sa Vitro Kinase Assay

Ang IP-linked in vitro kinase assay ay isinagawa gaya ng sumusunod. Isang buong utak ng daga ang ini-lyse sa 3 mL erythrocytes lysis buffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) sa pamamagitan ng 20 stroke ng isang Dounce homogenizer upang makakuha ng homogenized brain lysates. Ang mga lysate ay in-incubate sa yelo sa loob ng 30 minuto, ni-sonicate, at sinentrifuga sa 16,000 × g sa loob ng 10 minuto. Ang mga supernatant ay immunoprecipitated gamit ang anti-rabbit anti-p35 antibody upang makakuha ng aktibong Cdk5/p35 complex. Ang Cdk5/p35 complex at purified GST fusion protein ay hinaluan ng adenosine 5′-triposphate, [γ- ^32P ] (NEG-502H, PerkinElmer) at in-incubate sa kinase buffer (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2 , _0.2 mM DTT) sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid [18] , [21] . Ang purified Cdk5/p25 complex (14–516, Millipore) ay ginamit din para sa in vitro kinase assay gaya ng inilarawan sa itaas. Ang 2× sample loading buffer ay idinagdag sa reaction mixture at pinakuluan sa 100°C. Ang mga sample ay isinailalim sa SDS-PAGE at ang pinatuyong gel ay tinasa sa pamamagitan ng autoradiography.

Liquid Chromatography (LC) -Mass Spectrometry (MS) / MS Analysis

Ang recombinant na GST-D2i3 protein ay sinuri gamit ang LC-MS/MS kasunod ng IP-linked in vitro kinase assay. Isinagawa namin ang peptide identification ng LC-MS/MS data gamit ang X!!Tandem (bersyon Disyembre-01-2008). Ang bawat RAW data file ay unang na-convert sa mzXML gamit ang trans-proteomic pipeline (TPP; bersyon 4.3). Ang mga MS/MS scan sa mga na-convert na mzXML ay isinailalim sa paghahanap laban sa UniProt mouse protein sequence database (release 2010_07) kabilang ang GST-D2i3 sequence gamit ang X!!Tandem. Ang tolerance ay itinakda sa 3 Da para sa mga precursor ion at 2 Da para sa mga fragment ion. Ginamit ang enzyme specificity para sa trypsin. Ginamit ang mga opsyon sa pabagu-bagong pagbabago para sa carbamidomethylation ng cysteine ​​(57.021 Da), ang oksihenasyon ng methionine (15.995 Da), ang hydrolysis ng asparagine (0.987 Da) at ang phosphorylation ng serine (79.966 Da).

Immunoprecipitation

Ang immunoprecipitation ay isinagawa sa mga cell lysates sa ELB lysis buffer. Ang anti-GFP antibody ay idinagdag sa lysates at incubated para sa 3 h sa 4 ° C. Ang mga immunocomplex ay pinadalisay gamit ang protina-Isang agarose. Ang precipitates ay incubated sa SDS sample loading buffer para sa 30 min sa 37 ° C, at sumailalim sa SDS-PAGE at Western blots.

GST Pull-down Assay

10 µg ng purified GST at GST–D2i3 ay in-incubate kasama ng rat brain lysate sa loob ng 1.5 oras sa 4°C. 30 µL ng glutathione (GSH)-conjugated Sepharose 4B beads (17-0756-01, GE Healthcare) na nilagyan ng equilibrium sa lysis buffer ay idinagdag at in-incubate pa ng 1 oras. Ang mga beads ay kinolekta sa pamamagitan ng centrifugation sa 2,000× g at hinugasan gamit ang lysis buffer nang 4 na beses [22] , [23] . Ang mga precipitate ay sinuri sa pamamagitan ng Western blotting gamit ang anti-Cdk5 at anti-p35 antibodies.

Immunocytochemistry

Transfected HEK 293 cells at striatal neurons na pinag-aralan sa coverlips ay hugasan minsan sa pospeyt buffered saline (PBS) at naayos sa pamamagitan ng paglulubog sa malamig 4% paraformaldehyde / PBS para sa 30 min. Ang pangunahing antibody ay sinipsip sa solusyon sa pag-block (2% kabayo suwero at 1% Triton X-100 sa PBS). Ang Alexafluor-647-conjugated anti-mouse antibody (A20990, Invitrogen) at Alexafluor-568-conjugated anti-rabbit antibody (A11011, Invitrogen) ay ginamit bilang pangalawang antibodies. Ang Hoechst ay ginagamit para sa pag-iinit ng nucleus. Ang mga imahe ay nakuha sa pamamagitan ng confocal mikroskopya (Olympus, FluoView-1000).

Asseptive Internal Receptor

24 oras pagkatapos ng transfection, ang mga selula ay ginamot gamit ang 1 µM quinpirole (Q102, Sigma) sa loob ng 30 minuto at 90 minuto sa 37°C. Ang mga selula ay muling isinalin sa 2 mL na malamig na PBS at 200 µL aliquots ang ginamit para sa bawat reaksyon. Ang mga paggamot sa gamot ay isinagawa sa temperatura ng silid sa loob ng 3 oras sa mga sumusunod na konsentrasyon; 3 nM [ ^3H ]-spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 µM sulpiride (895, TOCRIS), 10 µM haloperidol (H1512, Sigma). Ang hydrophobic [ ^3H ]-spiperone ay ginamit upang lagyan ng label ang kabuuang expressed receptors at ang hydrophilic sulpiride ay ginamit upang palitan ang membranous receptor-bound [ ^3H ]-spiperone signals. Ang membrane-associated receptor signals ay kinalkula sa pamamagitan ng pagbabawas ng intracellular receptor values ​​mula sa kabuuang expressed receptor values. Ang mga selula ay sinala gamit ang isang GF/B (Millipore) filter at hinugasan nang 3 beses gamit ang washing buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Ang mga filter ay pinatuyo at ang natitirang radioactivity ay sinukat gamit ang isang liquid scintillation counter [24].

Paghahanda ng Cell Membrane

Ang mga confluent cell sa 100 mm culture-dish pagkatapos ng transfection ay hinugasan gamit ang ice-cold PBS at kinuha sa 1 mL HME buffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2 _, 1 mM EDTA). Ang mga homogenized lysate ay sinentripuga gamit ang 500×g sa loob ng 15 minuto at ang mga supernatant ay sinentripuga gamit ang 36,000×g sa loob ng 30 minuto. Ang mga pellet na muling sinuspinde sa HME buffer ay ginamit para sa mga assay.

[³⁵S] -GTP_γS Binding Assay

Ang mga fraction ng cell membrane ay paunang incubated gamit ang 1 µM quinpirole (Q102, Sigma) sa assay buffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2 , ₁₀₀ mM NaCl, 1 mM EDTA at 0.01 mM GDP) sa loob ng 10 minuto. Ang [ ^35S ]-GTP _γS (NET-030H, PerkinElmer) ay idinagdag sa huling konsentrasyon na 3 nM sa 30 µL at karagdagang incubated sa loob ng 90 minuto. 170 µL ng ice-cold buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 _, at 0.1 mM GTP) ay idinagdag upang ihinto ang reaksyon. Ang mga lamad ay sinala sa isang GF/B filter (Millipore) at hinugasan nang 3 beses gamit ang washing buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Ang mga filter ay pinatuyo at ang radioactivity ay sinukat gamit ang scintillation counter [25] , [26].

Radioligand Binding Assay

Ang mga inihandang lamad ng selula ay in-incubate gamit ang 0.01 nM [ ^3H ]-spiperone (NET-565, PerkinElmer) at pagtaas ng konsentrasyon ng quinpirole (Q102, Sigma) sa loob ng 30 minuto sa assay buffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2 _, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Ang mga lamad ay sinala sa isang GF/B filter (Millipore) at hinugasan ng 3 beses gamit ang washing buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Ang reaksyon ay tinapos sa pamamagitan ng mabilis na pagsasala sa pamamagitan ng mga GF/C filter. Ang natitirang radioactivity ay sinukat gamit ang isang liquid scintillation counter [27] – [29].

cAMP Enzyme Immunoassay

Ang mga transfected na HEK 293 cells ay pretreated gamit ang 10 µM rolipram (R6520, Sigma) sa loob ng 1 oras, at pagkatapos ay ginamot gamit ang 0.1 µM forskolin (F6886, Sigma) at pinataas na konsentrasyon ng quinpirole (Q102, Sigma) sa loob ng 30 minuto. Ang mga primary cultured striatal neurons ay ginamot gamit ang 10 µM rolipram sa loob ng 1 oras, at pagkatapos ay 1 µM dopamine sa loob ng 1 oras [22] . Ang mga cell lysate ay inihanda gamit ang 0.1 M HCl at ang mga antas ng cAMP ay natukoy gamit ang cAMP enzyme immunoassay kit (Sapphire Bioscience) kasunod ng tagubilin ng gumawa.

Pangunahing Kultura na Striatal Neuron

Ang striatal area ay inihiwalay mula sa utak ng embryonic ng daga (E15). Ang hiniwang tisyu ay pinaghiwalay sa minimal essential media (MEM) (11095, Invitrogen) na naglalaman ng 0.25% trypsin (T4549-100, Sigma) at 0.1% DNase I sa loob ng 6 na minuto sa 37°C. Ang mga selula ay muling isinalin sa plating media (MEM na may 0.01 M HEPES (pH 7.4) at 10% (vol/vol) horse serum (16050-122, GIBCO)). Ang mga neuron ay kinultura sa loob ng 7 araw in vitro (DIV 7) sa MEM na may B27 supplement (17504-044, Invitrogen) bago ilapat sa cAMP enzyme immunoassays.

Mga resulta

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 sa Third Intracellular Loop ng DRD2 sa vitro

Upang matukoy ang mga nobelang substrate ng Cdk5, nagsagawa kami ng sistematikong paghahanap gamit ang (S/T)PX(K/H/R) bilang mga sequence ng consensus sa pagkilala ng Cdk5 [30] at kinilala ang DRD2 bilang isang kandidatong substrate. Ang sequence ng consensus, kabilang ang serine 321, ay matatagpuan sa ikatlong intracellular loop ng DRD2 (D2i3) kung saan iba't ibang mekanismo ng regulasyon ang nasangkot [3] , [10] , [11] . Ang sequence ay napanatili sa ebolusyon sa DRD2 sa mga vertebrate, na nagpapahiwatig ng kahalagahan ng residue sa paggana ( Fig. 1A ).

Upang masuri ang kapasidad ng Cdk5 na mag-phosphorylate ng D2i3, nagsagawa kami ng IP-linked in vitro kinase assays gamit ang isang aktibong Cdk5/p35 complex na pinayaman mula sa lysate ng utak ng daga sa pamamagitan ng p35 immunoprecipitation na may purified recombinant GST-D2i3 (amino acid residues 212–373) na mga protina bilang substrates. Naobserbahan namin ang mga signal ng phosphorylation sa mga purified GST-D2i3 at GST-D2i3 S297A na mga protina, ngunit ang signal ay lubhang nabawasan gamit ang GST-D2i3 S321A ( Fig. 1B ). Upang higit pang mapatunayan ang phosphorylation ng serine 321 sa GST-D2i3, nagsagawa kami ng LC-MS/MS analysis ng mga sample mula sa IP-linked in vitro kinase assays gamit ang LTQ XL mass spectrometry. Palagiang narekober ang mga phospho-peptide na katumbas ng masa ng phospho-serine 321 peptide ( Fig. 1C ). Kung isasaalang-alang na ang pagkuha ng datos na nakadepende sa panahon ng pagsusuri ng LC-MS/MS ay may posibilidad na matukoy ang masaganang protina sa sample [31] , ipinahihiwatig ng datos na ito na ang serine 321 residue ang dominanteng phosphorylation site ng Cdk5 sa rehiyon ng D2i3. Upang patunayan ang direktang phosphorylation ng serine 321 sa GST-D2i3 sa pamamagitan ng Cdk5, isinagawa ang in vitro kinase assay gamit ang purified Cdk5/GST-p25 complex na may purified recombinant GST-D2i3 proteins. Natukoy namin ang isang makabuluhang phosphorylation signal sa GST-D2i3 na wala sa GST-D2i3 S321A ( Fig. 1D ). Kung pagsasama-samahin, ipinapahiwatig ng mga resultang ito na ang D2i3 S321 residue ay isang preferential target para sa Cdk5-mediated phosphorylation.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 sa Third Intracellular Loop ng DRD2 sa Cells

Upang matukoy ang phosphorylation ng serine 321, nagtaas kami ng antibody na partikular para sa phospho-serine 321 (pS321). Ang mga sample mula sa IP-linked in vitro kinase assay ay sinuri sa pamamagitan ng Western blotting gamit ang anti-pS321 antibody. Ang mga blot ay nagpakita ng isang natatanging banda sa kinase reaction na nakadepende sa GST-D2i3 ( Fig. 2A ). Upang mapatunayan ang potensyal na phosphorylation ng serine 321 sa DRD2 ng Cdk5 sa mga cell, ang mga anti-GFP immunoprecipitates mula sa mga HEK 293 cell na nagpapahayag ng DRD2-GFP at DRD2 S321A-GFP na mayroon o walang HA-Cdk5 at p35 ay sinuri sa pamamagitan ng Western blotting gamit ang anti-GFP at anti-pS321 antibodies. Ang mga katangiang smeared band signal ng anti-GFP antibody na kilalang dahil sa labis na glycosylation ng DRD2 ay naobserbahan lamang sa presensya ng DRD2-GFP, at ang anti-pS321 antibody ay nakakita lamang ng mga katulad na signal ng DRD2 na may Cdk5/p35 co expression ( Fig. 2B ) [7] . Upang higit pang mapatunayan ang phosphorylation ng serine 321 ng Cdk5, nabuo ang D2i3 (FLAG-D2i3) at mutant form ng D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). Ang FLAG-D2i3 at FLAG-D2i3 S321A na ipinahayag na mayroon o walang HA-Cdk5 at p35 sa mga HEK 293 cells ay sinuri sa pamamagitan ng isang SDS-gel mobility shift assay. Isang makabuluhang Cdk5-dependent mobility shift ang naobserbahan para sa FLAG-D2i3, ngunit hindi para sa FLAG-D2i3 S321A ( Fig. 2C ). Sinuri rin namin ang antas ng phosphorylation ng DRD2 sa Ser321 sa panahon ng agonist stimulation. Ang mga selula ng HEK 293 na nagpapahayag ng DRD2-GFP at Cdk5/p35 complex ay pinasigla ng quinpirole, at ang mga anti-GFP immunoprecipitates mula sa mga cell lysate ay sinuri sa pamamagitan ng Western blotting gamit ang mga anti-GFP at anti-pS321 antibodies. Natuklasan namin na ang Cdk5-mediated phosphorylation ng DRD2 sa Ser321 ay hindi naapektuhan ng agonist stimulation, na tila naiiba sa mga GRK- at PKC-mediated phosphorylations ( Fig. 2D ) [32] , [33] . Sama-sama, ipinapahiwatig ng mga resultang ito na maaaring i-phosphorylate ng Cdk5 ang serine 321 residue ng DRD2 sa cellular environment.

Ang Cdk5 / p35 Complex at DRD2 ay Associated sa Pisikal

Sinuri namin ang potensyal na pisikal na interaksyon sa pagitan ng Cdk5/p35 complex at DRD2 dahil maraming Cdk5 substrates ang kilalang pisikal na nauugnay sa Cdk5/p35 complex [23] , [34] , [35] . Una, isinagawa ang GST pull-down experiment. Ang purified recombinant GST-D2i3 protein ay in-incubate kasama ng rat brain lysate at ang GST pull-down precipitates ay sinuri para sa Western blotting. Gaya ng ipinapakita sa Fig. 3A , ang endogenous Cdk5 at p35 ay natukoy sa mga pull-down precipitates, na nagpapahiwatig ng pisikal na interaksyon sa pagitan ng DRD2 at ng Cdk5/p35 complex ( Fig. 3A ). Bukod dito, ang HA-Cdk5 at p35 ay natukoy sa mga anti-GFP immunoprecipitates mula sa HEK 293 cell lysates na nagpapahayag ng DRD2-GFP at Cdk5/p35 ( Fig. 3B ). Bukod pa rito, nagsagawa kami ng mga immunocytochemical analyses at naobserbahan na ang DRD2-GFP, HA-Cdk5 at p35 ay nagpapakita ng mga makabuluhang co-localization signal sa membranous area ng HEK 293 cells ( Fig. 3C , upper panels). Sinuri rin namin ang co-localization ng DRD2 at Cdk5/p35 sa neuronal context. Kasabay nito, ang DRD2-GFP ay nagpakita rin ng makabuluhang co-localization sa endogenous Cdk5 at p35 sa mga cultured striatal neurons (DIV7), na higit na sumusuporta sa mga functional link sa pagitan ng DRD2 at Cdk5/p35 ( Fig. 3C , bottom panels). Ipinapahiwatig ng mga resulta na ang DRD2 at Cdk5/p35 ay maaaring bumuo ng isang complex at sa gayon, sumusuporta sa paniwala na ang DRD2 ay isang physiological substrate ng Cdk5.

Cdk5-mediated Phosphorylation ng DRD2 Attenuates Receptor Activity

Naiulat na ang phosphorylation ay nagmo-modulate sa mga kritikal na katangian ng mga GPCR tulad ng G protein coupling, receptor internalization, intracellular localization, at association sa mga modulator protein [9] , [11] , [24] . Ang gonist-induced receptor internalization ay isang kritikal na proseso ng regulasyon ng signal transduction. Sinuri namin ang Cdk5-mediated modulation ng DRD2 internalization. Ang mga HEK 293 cells na nagpapahayag ng DRD2-GFP at DRD2 S321A-GFP na mayroon o walang Cdk5/p35 ay in-incubate na may 1 µM quinpirole upang mag-induce ng agonist-stimulated DRD2 internalization ( Fig. 4A ). Ang [ ^3H ]-spiperone signals ng mga DRD2-GFP expressing cells ay makabuluhang nabawasan sa 30 minutong quinpirole treatment at nakabawi sa 90 minuto. Kapansin-pansin, ang mga signal ng [ ^3H ]-spiperone ng mga selulang nagpapahayag ng DRD2-GFP at Cdk5/p35 ay nabawasan din sa 30 minutong paggamot ng quinpirole ngunit hindi nabawi sa 90 minuto ( Fig. 4A , ikalawang seksyon). Sa kabilang banda, ang mga signal ng [ ^3H ]-spiperone ng mga selulang nagpapahayag ng DRD2 S321A-GFP ay nabawasan sa 30 minuto at nabawi sa 90 minuto, anuman ang co-expression sa Cdk5/p35. Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang internalized na DRD2 ay nagre-recycle pabalik sa plasma membrane sa pamamagitan ng matagal na agonist stimulation [11] . Kaya naman, lumalabas na ang Cdk5-mediated phosphorylation ng DRD2 ay kasangkot sa mga proseso ng resensitization kasunod ng agonist-induced DRD2 internalization.

Mas sinuri pa namin ang isang potensyal na pagbabago ng agonist-stimulated G protein coupling sa DRD2 na nauugnay sa Cdk5-mediated phosphorylation gamit ang [ ³⁵ S]-GTP _γ S binding assay [25] , [26] . Ang DRD2-GFP at DRD2 S321A-GFP na mayroon o walang Cdk5/p35 ay ipinahayag sa mga selula ng HEK 293. Ang mga lamad ay inihanda at pinasigla gamit ang 1 µM quinpirole at karagdagang pinayagan ang [ ³⁵ S]-GTP _γ S incorporation. Ang DRD2-GFP at Cdk5/p35 na nagpapahayag ng lamad ng selula ay nagpakita ng makabuluhang kapansanan sa [ ³⁵ S]-GTP _γ S binding kumpara sa lahat ng iba pang lamad ng selula ( Fig. 4B ). Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang Cdk5-mediated phosphorylation ay nagpapababa sa regulasyon ng agonist-stimulated G protein binding sa DRD2.

Bukod pa rito, isinagawa ang mga quinpirole-competing [ ^3H ]-spiperone binding assays upang siyasatin ang anumang potensyal na pagbabago sa agonist-affinity sa DRD2 sa pamamagitan ng Cdk5-mediated phosphorylation. Sinukat ang competitive binding ng [3H]-spiperone sa paggamot ng tumataas na konsentrasyon ng quinpirole sa membrane preparation mula sa transfected. Ang competitive binding ng quinpirole at [ ^{3H ]} -spiperone sa DRD2-GFP at DRD2 S321A-GFP ay gumawa ng magkatulad na logK _i values ​​(−9.789 para sa DRD2-GFP; −9.691 para sa DRD2 S321A-GFP), na nagpapahiwatig na ang affinity ng ligand sa DRD2 ay hindi gaanong naapektuhan ng Cdk5-mediated phosphorylation sa DRD2 ( Fig. 4C ).

Cdk5-mediated Phosphorylation Down-regulates ang DRD2-cAMP Signaling Pathway

Susunod, sinuri namin kung ang pagbabago ng DRD2 sa pamamagitan ng Cdk5 ay nakakaapekto sa mga downstream signaling pathway. Minarkahan namin ang DRD2-mediated inhibition ng forskolin-stimulated cAMP production sa pamamagitan ng adenylyl cyclase sa mga cell na nagpapahayag ng DRD2-GFP at DRD2 S321A-GFP gamit ang cAMP enzyme immunoassay. Ang mga DRD2-expressing cell ay nagpakita ng pagbaba ng mga antas ng cAMP bilang tugon sa quinpirole sa isang dose-dependent na paraan. Kapansin-pansin, ang co-expression ng Cdk5/p35 ay makabuluhang nagbawas sa maximal inhibition ng cAMP formation ( Fig. 4D, kaliwang panel ). Sa kabilang banda, sa mga DRD2 S321A-GFP expressing cell, ang mga cAMP formation ay epektibong na-inhibit bilang tugon sa paggamot ng quinpirole anuman ang expression ng Cdk5/p35 ( Fig. 4D, kanang panel ). Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang Cdk5-mediated phosphorylation ng DRD2 ay nagpapahina sa inhibitory activity ng DRD2 sa downstream cAMP signaling pathway. Upang higit pang kumpirmahin ang phenomena sa isang mas pisyolohikal na kaugnay na setting, ginamit namin ang mga primary cultured neuron mula sa mga knockout embryo na kulang sa p35, isang mahalagang Cdk5 activator. Ang mga primary cultured striatal neuron ay ginamot gamit ang 1 µM dopamine at sinuri gamit ang cAMP enzyme immunoassay. Ang mga neuron mula sa p35 knockout mice ay nagpakita ng mas mababang antas ng cAMP kumpara sa mga wild-type neuron nang pinasigla ng dopamine ( Fig. 4E ). Kung pagsasama-samahin, napagpasyahan namin na ang Cdk5-mediated phosphorylation ng DRD2 ay nagreresulta sa pagbaba ng inhibitory tone sa cAMP pathway na ginagawa ng DRD2.

Pagtalakay

Natukoy namin ang DRD2 bilang isang nobelang substrate ng Cdk5. Lumilitaw na binabawasan ng phosphorylation ang ekspresyon sa ibabaw ng DRD2 sa pamamagitan ng pag-apekto sa kapalaran ng DRD2 kasunod ng internalization ng receptor sa gayon ay binabawasan ang DRD2 G _i- coupling at downstream cAMP pathway. Dahil ang phosphorylation residue S321 ay umiiral kapwa sa mahaba at maiikling isoform ng DRD2, ang mekanismong iminungkahi sa pag-aaral na ito ay maaaring isang pangkalahatang paraan ng regulasyon sa DRD2-mediated signaling.

Ang DRD2 sa mga medium spiny neuron ay hindi lamang itinuturing na isang pangunahing subtype ng dopamine receptor kundi kinilala rin dahil sa pagiging madaling kapitan nito sa mga pagbabago sa availability bilang tugon sa mga environmental stimuli. Ang agonist-induced desensitization at resensitization ng DRD2 ay malawakang pinag-aralan [11] , [24] . Sa partikular, ipinakita ng ilang pag-aaral na ang mga epekto ng talamak na pagkakalantad sa psychostimulant, tulad ng cocaine at amphetamine, na nagpapataas ng extracellular level ng dopamine sa striatal synapse, ay sinasamahan ng mga dynamic na pagbabago ng DRD2 postsynaptically [36] . Sa katunayan, ang mga talamak na gumagamit ng cocaine ay kilalang may nabawasang antas ng DRD2 sa striatal area, at ang availability ng DRD2 sa nucleus accumbens (NAcc) ay nagpapakita ng negatibong ugnayan sa mga pag-uugali sa paghahanap ng gamot at reinforcement sa mga daga at primate [37] - [39] . Ipinapahiwatig ng mga natuklasang ito na ang functionality ng DRD2 ay lubos na madaling kapitan ng adaptive o compensatory regulation bilang tugon sa iba't ibang stimuli kabilang ang talamak na pagkakalantad sa gamot. Ipinapakita ng aming mga resulta na ang S321 residue sa ikatlong intracellular loop ng DRD2 ay maaaring i-phosphorylate ng Cdk5, na nagreresulta sa pagbaba ng inhibitory influence ng DRD2 sa cAMP pathway. Ang interaksyong ito ay nagmumungkahi ng isang nobelang regulatory mechanism na nauugnay sa Cdk5 sa mga dopaminoceptive neuron na maaaring maiugnay sa dynamic na katangian ng DRD2 surface availability.

Dapat pansinin na ang Cdk5 ay kilala bilang isang mahalagang sangkap sa pamamagitan ng mediating adaptive changes ng neuronal environment. Halimbawa, ang estruktural at functional na pagbabago ng dendritic spines sa neurons ng limbic circuit ay isa sa mga kahihinatnan ng paulit-ulit na psychostimulant exposure [40]. Ang mga pagbabagong ito ay sinamahan ng iba't ibang mga pagbabago sa molecular kabilang ang induction ng cAMP na tugon ng elemento na nagbubuklod (CREB) at ΔFosB, mga transcription factor na nagpapakita ng isang matatag na up-regulasyon bilang tugon sa talamak na cocaine administration [41], [42]. Mahalaga, ang Cdk5 ay isang target ng ΔFosB [19], at maraming kritikal na sangkap na kasangkot sa dynamics ng dendritic spine, tulad ng PSD-95, p21-activate kinase (PAK), β-catenin, at spinophilin, ay iniulat na Cdk5 substrates [43]-[46]. Kasabay, ang genetic o pharmacological manipulations ng Cdk5 na aktibidad ay nagpapakita ng mga pagbabago sa dendritic spine morphology at mga tugon sa pag-uugali sa kokaina, na nagpapahiwatig ng mga kritikal na tungkulin para sa Cdk5 sa molecular and morphological changes ng mesolimbic dopamine circuits [47], [48]. Ang aming mga resulta na nagpapakita na ang DRD2 ay isang nobelang target ng Cdk5 ay nagbibigay ng karagdagang pananaw sa mga nakakapag-agpang pagbabago ng sistema ng dopamine bilang tugon sa mga talamak na pag-expose ng gamot dahil sa kasunod na ΔFosB-mediated up-regulasyon ng Cdk5 ay maaaring magbuod ng isang tonic na pagtaas sa phosphorylation ng DRD2 . Dagdag pa rito, ang DRD2 ay kilala na nakakaapekto sa maraming mga proseso ng cellular, kabilang ang regulasyon ng cAMP at MAP kinase pathways at sa ibaba ng agos transcriptional mga kaganapan [42], [49]. Kaya, ang mga natuklasan sa pag-aaral na ito ay hindi maaaring maglarawan lamang ng isang direktang regulasyon ng DRD2 ng Cdk5 ngunit nagbibigay din ng isang nobelang pananaw sa adaptive na mga tugon ng dopamine system sa talamak na pagkalantad sa gamot.

Mga Kontribusyon ng May-akda

Iniharap at dinisenyo ang mga eksperimento: JJ YUP DH SKP. Isinagawa ang mga eksperimento: JJ YUP DKK YK. Sinuri ang data: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Mga kontribusyon ng mga reagent / materyales / pagtatasa: YHS. Isinulat ang papel: JJ SKP.