The Journal of Neuroscience, 15 Mart 2001, 21(6): 2123-2130;
+ Autorske veze
sažetak
Prenos dopamina u nukleusu accumbens može se aktivirati drogama, stresom ili motiviranim ponašanjem, a ponovljeno izlaganje ovim stimulansima može senzibilizirati ovaj odgovor na dopamin. Ciljevi ove studije bili su da se utvrdi da li seksualno ponašanje žena aktivira neurone nucleus accumbens i da li prošlo seksualno iskustvo unakrsno senzibiliše neuronske odgovore u nucleus accumbens na amfetamin. Korišćenjem imunocitokemijskog obilježavanja, ekspresija c-Fos u različitim subregijama (ljuska u odnosu na jezgru na rostralnom, srednjem i kaudalnom nivou) nukleusa accumbens ispitana je u ženskih hrčaka koji su imali različite količine seksualnog iskustva. Ženke hrčaka, koje su dobijale ili 6 sedmice seksualnog iskustva ili ostale seksualno naivne, testirane su na seksualno ponašanje izlaganjem odraslim mužjacima hrčaka. Prethodno seksualno iskustvo povećalo je obilježavanje c-Fos na rostralnom i kaudalnom nivou, ali ne iu srednjim nivoima nucleus accumbens. Testiranje seksualnog ponašanja povećalo je obilježavanje jezgre, ali ne i ljuske, nucleus accumbens. Da bi se potvrdilo da žensko seksualno ponašanje može senzibilizirati neurone u mezolimbičkom putu dopamina, zatim su uspoređeni lokomotorni odgovori seksualno iskusnih i seksualno naivnih ženki na injekciju amfetamina. Amfetamin je povećao opštu lokomotornu aktivnost kod svih žena. Međutim, seksualno iskusne životinje su ranije reagovale na amfetamin nego na seksualno naivne životinje. Ovi podaci ukazuju da seksualno ponašanje žena može aktivirati neurone u nukleusu accumbens i da seksualno iskustvo može unakrsno senzibilizirati neuronske odgovore na amfetamin. Pored toga, ovi rezultati pružaju dodatne dokaze za funkcionalne razlike između ljuske i jezgre nukleusa accumbens i preko njegove anteroposteriorne osi.
- seksualno ponašanje žena
- jezgra accumbens
- školjka
- jezgro
- c-Fos
- senzibilizacija
- unakrsna senzibilizacija
- amfetamin
Neuroni dopamina koji potiču iz srednjeg ventralnog tegmentalnog područja i projektuju se na različita jezgra prednjeg mozga, uključujući i nucleus accumbens, dio su mezolimbičkog dopaminskog sistema. Predloženo je da je ovaj sistem dopamina važan za regulaciju apetitivnog ponašanja (Mitchell i Gratton, 1994; Salamone, 1994, 1996; Ikemoto i Panksepp, 1999), kao i samoupravljanje droga zloupotrebe (Pierre i Vezina, 1998;Koob, 1999; Lorrain i dr., 1999; McKinzie et al., 1999; Peoples et al., 1999; Bradberry i drugi, 2000). Sistemsko davanje raznih droga zloupotrebe (npr. Kokain, amfetamin i heroin) aktivira putove dopamina (Pontieri et al., 1995; Nisell et al., 1997; Pierce i Kalivas, 1997a; Tanda et al., 1997; Tanda i Di Chiara, 1998; Barrot i dr., 1999; Cadoni i Di Chiara, 1999), i ponovljena izloženost ovim farmakološkim agensima može senzibilizirati ove neurone koji reaguju na dopamin (Robinson et al., 1988; Kalivas i dr., 1992; Kalivas i Duffy, 1993; Pierce i Kalivas, 1995; Kuczenski i dr., 1997; Nisell et al., 1997; Birrell i Balfour, 1998; Heidbreder i Feldon, 1998; Cadoni i Di Chiara, 1999; Cadoni i dr., 2000). Istraživanja su pružila dokaze da nucleus accumbens takođe odgovara na određena svojstva povezana sa parenjem. Ekstracelularni nivoi dopamina u nucleus accumbens se povećavaju tokom seksualnih interakcija kod ženki pacova (Mermelstein i Becker, 1995; Pfaus i dr., 1995) i hrčci (Meisel et al., 1993; Kohlert et al., 1997; Kohlert i Meisel, 1999). Slično ponovljenoj primjeni lijekova, višestruki testovi seksualnog ponašanja također povećavaju povećanje razine dopamina u nukleusu, što sugerira da seksualno iskustvo može senzibilizirati neurone u putu dopamina (Kohlert i Meisel, 1999).
Nukleus akumbens je sastavljen od mnogih anatomski različitih podregija, od kojih su najpoznatiji ljuska i jezgra. Anatomske veze ljuske i jezgre se razlikuju, što sugerira da ove dvije podregije reguliraju različite funkcije (Crawley i dr., 1985a,b; Heimer i dr., 1991; Zahm i Brog, 1992; Brog i dr., 1993;Kalivas i Duffy, 1995; Maldonado-Irizarry i dr., 1995; Pierce i Kalivas, 1995; Pontieri et al., 1995; Broening et al., 1997; Heimer i dr., 1997; Kelley i dr., 1997; Stratford i Kelley, 1997; Heidbreder i Feldon, 1998; Lanca i dr., 1998; Bassareo i Di Chiara, 1999; Di Chiara i drugi, 1999b; Groenewegen i dr., 1999; Kelley, 1999; McKinzie et al., 1999; Zahm, 1999; Brown i Molliver, 2000). Budući da je nucleus accumbens heterogeno jezgro, nije jasno da li su odgovori na žensko seksualno ponašanje lokalizirani na specifične subregije nukleusa accumbens ili raširene po cijelom jezgru. Tehnike koje su se ranije koristile za odgovor na ovo pitanje (npr. Mikrodijaliza) nisu dovoljno prostorno osjetljive da istraže funkcionalnu heterogenost akumbensa. Nasuprot tome, imunocitokemijska obrada za c-Fos protein osigurava metodu za ispitivanje diskretne stanične aktivacije među subregijama nucleus accumbens. Dakle, prva svrha ovog eksperimenta je bila da se utvrdi da li je ćelijska aktivacija nakon ženskog seksualnog ponašanja lokalizirana na specifične subregije nucleus accumbens.
Interesantno svojstvo ovih putova dopamina je unakrsna senzibilizacija. Drugim riječima, dopaminski neuroni koji su prethodno senzitizirani na jedan lijek će pokazati senzibilizirane reakcije na drugi lijek koji se daje prvi put (Cunningham i Kelley, 1992; Pierce i Kalivas, 1997a; Birrell i Balfour, 1998; Taylor i Horger, 1999). Pored unakrsne senzibilizacije među lijekovima, nekoliko studija je izvijestilo o unakrsnoj senzibilizaciji između ponovljenih izloženosti farmakološkim agensima i prirodno motiviranih ponašanja (Mitchell i Stewart, 1990a,b; Tidey i Miczek, 1997; Fiorino i Phillips, 1999). Stoga smo ispitali da li bi seksualno iskusne i seksualno naivne životinje drugačije reagovale na novi stimulus za koji se zna da aktivira putove dopamina (tj. Unakrsnu senzibilizaciju), kao što je amfetamin. Ako žensko seksualno ponašanje senzibilizira puteve dopamina, onda seksualno iskusne žene treba da pokažu povećani odgovor ponašanja na jednu injekciju amfetamina.
MATERIJALI I METODE
Opšte metode
Životinje. Muški i ženski sirijski hrčak isporučen je iz Charles River Laboratories (Kingston, NY) u dobi od UM60 d starosti. Ženke su držane pojedinačno, a životinje muškog stimulusa su bile smeštene u grupe od po tri ili četiri u plastičnim kavezima (50.8 × 40.6 × 20.3 cm). Soba životinjske kolonije održavana je na konstantnoj temperaturi (22 ° C) sa isključenim svjetlima između 1: 30 i 11: 30 PM (14 / 10 hr ciklus svjetlo / mrak). Hrana i voda su bili dostupni ad libitum.
Procedure koje se koriste u ovom eksperimentu su u skladu sa Nacionalnim institutom za zdravlje Smernice za negu i upotrebu laboratorijskih životinja i odobreni su od strane Komiteta za njegu i upotrebu životinja Purdue.
Seksualno iskustvo. Približno 1 sedmice nakon što su ženke stigle u laboratoriju, one su bilateralno ovarijektomirane pod natrijevom pentobarbitalnom (Nembutalnom) anestezijom (8.5 mg po 100 gm tjelesne težine, ip). Nakon ovarijektomije, ženke su u početku bile podijeljene u dvije grupe. Jedna grupa žena dobila je 6 tjedna seksualnog iskustva sa stimulusom muškog pola; druga grupa je ostala seksualno naivna. Sve ženke su bile hormonski pripremljene jednom nedeljno tokom 6 nedeljnog perioda. I kod 48 i 24 sati prije seksualnog iskustva, ženke su injektirane subkutano sa 10 μg estradiol benzoata u 0.1 ml ulja pamučnog semena. Na dan testa iskustva, ženke su primile 500 μg progesterona u 0.1 ml ulja pamučnog semena (subkutana injekcija). Ženama koje nisu dobile seksualno iskustvo ubrizgan je hormonski režim i ostali su u kućnim kavezima u sobi u koloniji. U 4-5 h nakon primene progesterona, odrasli muški hrčak koji je primio seksualno iskustvo kroz upotrebu u drugim studijama seksualnog ponašanja je stavljen u kavez eksperimentalne ženke. Redoslijed kaveza koji su sadržavali mužjake rotirali su svake sedmice kako bi se smanjila vjerovatnoća da se pojedinačni muškarac i žena uparuju više od jednom tokom 6 tjedana seksualnog iskustva.
Immunocytochemistry. Ženke hrčaka, ubijene sa predoziranjem natrijum pentobarbitalom, intrakardijalno su perfundirane sa 25 mm PBS rastvor, pH 7.5, za 2 min (brzina protoka, 25 ml / min), zatim 4% paraformaldehid u PBS za 20 min. Mozgovi su post-fiksirani za 2 hr u paraformaldehidu i pohranjeni u 10% saharozi PBS preko noći na 4 ° C.
Serijske koronalne smrznute sekcije 40 μm uzimane su kroz cijeli nucleus accumbens. Posle tri ispiranja 10 min u PBS, sekcije su inkubirane u bilo primarnom antitelu sa c-Fos (1: 6000 u PBS sa 0.3% Triton X-100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ili u primarnom antitelu za calbindin-D (28 kDa) (1: 6000 u PBS sa 0.3% Triton X-100; Chemicon International, Temecula, CA) na 4 ° C za 48 hr. I sekcije c-Fos i calbindin-D su zatim inkubirane za 45 min na sobnoj temperaturi u biotiniliranim anti-zečjim IgG sekundarnim antitelima (1: 200 u PBS; Elite Vectastain ABC komplet; Vector Laboratories, Burlingame, CA), a zatim inkubacija sa kompleksom avin-biotin peroksidaze (1: 50 u PBS; Elite Vectastain ABC kit) za 45 min na sobnoj temperaturi, sa tri ispiranja 10 min u PBS pre svake inkubacije. Nakon dva ispiranja u PBS i 10 min isperite u 0.1 m Tris pufer, pH 7.6, sekcije c-Fos i calbindin-D inkubirane su za 5 i 10 min, u 0.08% diaminobenzidinu (DAB) (Aldrich, Milwaukee, WI) u Tris puferu koji sadrži 0.003% vodikov peroksid i 0.015% nikl hlorid. Sve sekcije su ponovo isprane u Tris puferu i deioniziranoj vodi i zatim montirane na krom-alumom obložene pločice. Slajdovi su sušeni, dehidrirani, očišćeni i pokriveni upotrebom Permount (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).
Mikroskopska analiza. Neuralno tkivo obojeno za calbindin-D, koje ocrtava ljusku i jezgru nukleusa accumbens (Jongen-Relo i dr., 1994a; Johnson i Wood, 1999) je korišćen za identifikaciju jedne sekcije na rostralnom, srednjem i kaudalnom nivou dorzalne jezgre akumbensa. Dijelovi od nucleus accumbens na rostralnom, srednjem i kaudalnom nivou obojeni za calbindin prikazani su na slici 1 A – C. Prijavljeno je da postoje manje izražene razlike između jezgre i ljuske u imunoreaktivnosti kalbindina-D u sirijskom hrčku u usporedbi sa štakorima, ali bojenje za ovaj peptid je još uvijek u stanju razgraničiti podregije nukleusa accumbens (Johnson i Wood, 1999). Kutija koja obuhvata područje uzorkovanja od 0.1 mm2 (0.2 × 0.5 mm) postavljen je iznad dorzalne ljuske i jezgre nukleusa accumbens za svaku sekciju. Slika svake sekcije je odštampana na prozirnom filmu i slike su zatim postavljene na odgovarajuće c-Fos sekcije za svaku životinju, osiguravajući da je kutija postavljena u istom položaju za sve životinje. Slika 1, D i E, ilustrira jednu kaudalnu sekciju od životinje koja je primila 6 tjedna seksualnog iskustva i testirana je na seksualno ponašanje. Kutija je postavljena u jezgru kaudalnog jezgra akumbensa na slici 1 Di u ljusci kaudalnog akumbensa na slici1 E. Kutija s istim dimenzijama postavljena je u isti presjek tkiva u medijalni cingulativni korteks i preko medijalne i bočne leđne kaudaste jezgre na svakoj od tri razine uzorkovane za jezgro accumbens. Budući da smo pretpostavili da mogu postojati rostralno-kaudalne varijacije u efektima parenja na c-Fos, analiziran je samo jedan odjeljak po nivou kako bi se povećala anatomska preciznost našeg uzorkovanja. Broj c-Fos-imunoreaktivnih ćelija u svakom odabranom području prebrojan je uz pomoć video kamere povezane na kompjuterizovani sistem za analizu slike (BioQuant MegM; R & M Biometrics, Nashville, TN).
Nucleus accumbens sekcije tkiva obojene za calbindin-D i c-Fos. A – C su sekcije od rostralne (A), srednji (B), i kaudalna (C) nucleus accumbens bojen (srednja linija je lijevo) za calbindin, ilustrujući podjelu između ljuske i jezgrenih podregija (asterisks). Između rostralnih i srednjih sekcija i 320 μm između srednjeg i kaudalnog dijela nalazi se 240 μm. Donje slike (D, E) su primjeri c-Fos bojenja iz kaudalne jezgre (D) i ljuska (E) nucleus accumbens (srednja linija je u pravu) seksualno iskusne žene ubijene nakon testa seksualnog ponašanja. Thepravougaonik prikazuje područje uzorkovanja (0.2 × 0.5 mm).
Eksperiment 1
Prvi eksperiment je istraživao efekte seksualnog iskustva i testiranja na c-Fos indukciju u nucleus accumbens, dorzalnom kaudatnom jezgru i cingularnom korteksu. Cilj eksperimenta bio je dvostruk. Prvi cilj je bio da se utvrdi da li postoje razlike u staničnoj aktivaciji u bilo kom delu mozga zbog prethodnog seksualnog iskustva i / ili testiranja ponašanja. Ako je ekspresija c-Fosa promijenjena, tada je utvrđeno da li se promjene mogu lokalizirati na specifične subregije unutar tri analizirana područja mozga.
Ženski sirijski hrčak dobio je 6 tjedana seksualnog iskustva ili je ostao seksualno naivan. Tokom 6 nedelje iskustva, kumulativna količina vremena koja je žena preuzela lordozu (nepokretnost praćena dorsofleksijom leđa) je merena za svaki 10 min test test. Nisu zabeležene mjere muškog seksualnog ponašanja. Tokom nedelje 7, data je ista serija injekcija estradiol benzoata i progesterona. Ovog puta, polovina seksualno iskusnih i naivnih ženki testirana je na seksualno ponašanje stavljanjem odraslog muškarca u kućni kavez. Preostale ženke su ostavljene u kućnim kavezima. Na 60-90 min nakon izlaganja muškom, ženke su intracardialno perfundirane, a njihov mozak je obrađen za c-Fos ekspresiju. Ženke koje nisu testirane na seksualno ponašanje su perfundirane 4 h nakon davanja progesterona.
Analiza podataka. Pošto se broj ćelija nije razlikovao između žena koje nisu testirane na seksualno ponašanje tokom nedelje 7, bez obzira na prošlo seksualno iskustvo (vidi tabelu)1 na primer, eksperimentalne ženke su na kraju podeljene u tri grupe za analizu. Prva grupa je sadržavala ženke koje su primile 6 nedjelju seksualnog iskustva i testirane su na seksualno ponašanje (iskustvo / test, n = 6). Drugu grupu činile su žene koje nisu primile nikakvo prethodno iskustvo, ali su testirane na seksualno ponašanje (bez iskustva / testa,n = 8). Posljednja grupa je sadržavala sve ženke hrčaka koje nisu testirane na seksualno ponašanje, bez obzira na bilo koje prethodno seksualno iskustvo (bez testa, n = 13). Dvije grupe koje nisu dobile testiranje seksualnog ponašanja kombinovane su kako bi povećale statističku snagu u analizama. Broj c-Fos-obojenih ćelija dorzalne jezgre akumbensa, dorzalnog kaudatnog jezgra i cingularnog korteksa uspoređivane su među tri grupe.
Poređenje srednjeg ± SEM broja c-Fos-imunoreaktivnih ćelija u ljusci i jezgru nucleus accumbens između grupa bez testnog tretmana
Broj ćelija je analiziran pomoću multifaktorskih ANOVA. Jednostavne ANOVA-e sa glavnim efektima i post hoc Newman-Keuls testovi su izvedeni tamo gdje je bilo potrebno. Podaci o ponašanju (trajanja lordoze) analizirani su pomoću dvosmjernog t test.
Eksperiment 2
Drugi eksperiment je uporedio sposobnost novog stimulansa, amfetamina, da proizvede senzibilizaciju ponašanja kod seksualno iskusnih i seksualno naivnih ženskih hrčaka. Ekspresija c-Fosa u nucleus accumbens, dorzalnom kaudatnom jezgru i cingulatnom korteksu ponovo su analizirani kako bi se utvrdilo da li je obrazac stanične aktivnosti sličan rezultatima dobijenim u eksperimentu 1.
Ženski sirijski hrčak dobio je 6 tjedna seksualnog iskustva ili je ostao seksualno naivan. U nedelji 7, sve ženke su prevezene u novo okruženje (tj. Akvarijum od stakla 10 stakla u nepoznatoj sobi) 4 hr nakon primjene progesterona. Ženke su smještene u 10 galon stakleni akvarij za 10 min, nakon čega je polovina seksualno iskusnih i seksualno naivnih ženki davanad-amfetamin sulfat (1 mg po 1 kg tjelesne težine u 1.0 ml 0.9% NaCl; poklon dr. David Nichols, Purdue University). Preostale ženke su bile injektirane sa 0.9% NaCl (1 mg po 1 kg telesne težine). Ženke su zatim vraćene u akvarijum 10 galona za dodatnih 60 min. 70 min sesije su snimljene za analizu opšte lokomotorne aktivnosti ženki. Unutar 30 min nakon testa opšte aktivnosti, ženke su intracardialno perfundirane, a njihov mozak je obrađen za c-Fos ekspresiju.
Analiza video kaseta. Tokom nedelje 7, snimljene su sesije 70 min testiranja lokomotorne aktivnosti. Akvarijumi od galonskog stakla 10 podijeljeni su na tri jednaka područja na video ekranu, a lokomotorna aktivnost ženki je zabilježena u smislu broja križa područja.
Analiza podataka. Prethodna seksualna istorija nije uticala na lokomotornu aktivnost ženskih hrčaka ubrizganih fiziološkim rastvorom; stoga su eksperimentalne ženke podeljene u tri grupe za analizu. U prvoj grupi su bile ženke koje su primile 6 sedmice seksualnog iskustva i kojima je ubrizgan amfetamin (iskustvo / amfetamin, n = 8). Druga grupa se sastojala od žena koje su primale amfetamin, ali nisu primile nikakvo seksualno iskustvo (bez iskustva / amfetamina,n = 8). Posljednja grupa je sadržavala sve ženke hrčaka koje su injektirane fiziološkom otopinom, bez obzira na bilo koje prethodno seksualno iskustvo (slan, n = 15). Srednja lokomotorna aktivnost ženki je upoređena između tri grupe za tretman u 70 min testiranja (u 10 min periodima) korišćenjem dva faktora ANOVA. Jednostavne ANOVA-e sa glavnim efektima i post hoc Newman-Keuls testovi su izvedeni tamo gdje je bilo potrebno.
Broj ćelija obojenih za c-Fos nije se razlikovao između onih ženki koje su injektirane fiziološkom otopinom, bez obzira na seksualno iskustvo iz prošlosti. Prema tome, broj c-Fos-obojenih ćelija iz dorzalne jezgre akumbensa, dorzalnog kaudatnog jezgra i cingularnog korteksa su uspoređeni među istim trima tretiranim skupinama kao u prvom eksperimentu. Broj ćelija je analiziran pomoću multifaktorskih ANOVA. Jednostavne ANOVA-e sa glavnim efektima i post hoc Newman-Keuls testovi su izvedeni tamo gdje je bilo potrebno.
REZULTATI
Eksperiment 1
Mere seksualnog ponašanja
Trajanje lordoze tokom testa za seksualno ponašanje na nedelji 7 je upoređeno između iskustva / testa i grupe bez iskustva / testa. Prosečno trajanje lordoze tokom 10 min testa je bilo 341 ± 53 sek za iskustvo / test grupu i 478 ± 20 sek za grupu bez iskustva / test. Ženke u grupi bez iskustva / testu su pretpostavile lordozu za značajno duže trajanje nego što su žene u iskustvu / test grupi (t 6 = 5.131; p = 0.05). Osim toga, seksualno iskustvo nije uticalo na trajanje lordoze. Analiza nije pokazala značajne razlike između prosječnog trajanja 1 sedmice (399 ± 44 sek) i sedmice 7 (341 ± 53 sec) za žene u grupi sa iskustvom / testom.
c-Fos ekspresija u nucleus accumbens
Trodelna ANOVA tretmana puta rostralno-kaudalnog vremena, ljuske i jezgre, nije našla značajne glavne efekte tretmana i nema trostruke interakcije između tretmana, nivoa akumbensa i ljuske jezgre (sl. 2); Međutim, otkrivene su dvije važne dvosmjerne interakcije (vrijeme obrade - vrijeme jezgre i vrijeme tretmana rostralno - kaudalni).
c-Fos ekspresija u ljusci i jezgri nukleusa accumbens na rostralnom, srednjem i kaudalnom nivou za svaku od tretiranih grupa. Trosmjerna ANOVA (vrijeme tretmana rostralno-kaudalnog vremena, ljuska - jezgra) je korišteno za ispitivanje efekata seksualnog iskustva i ponašanja na srednji ± SEM broj c - Fos stanica. Nisu pronađeni značajni glavni efekti tretmana i nikakva trostruka interakcija između tretmana, akumensa i ljuske.
Ispitivanje interakcije vremena tretmana ljuske i jezgre otkrilo je značajne glavne efekte tretiranih grupa samo u jezgri nukleusa accumbens (sl. 3). Parene višestruke usporedbe pokazale su da su žene testirane na seksualno ponašanje tokom 7 tjedna (iskustvo / test i bez iskustva / testa) imale značajno više c-Fos-obojenih stanica u jezgru nucleus accumbens nego one žene koje nisu bile testirane (ne test) (Newman-Keuls, p <0.01). Nisu primijećeni efekti ispitivanja u ljusci jezgra accumbens. Nadalje, nije bilo eksplicitnih efekata seksualnog iskustva na broj ćelija koje eksprimiraju c-Fos ni u ljusci ni u jezgri gomila.
Izraz c-Fos u ljusci i jezgri nukleusa accumbens, srušio se preko rostralno-kaudalnog nivoa. Trosmerna ANOVA otkrila je dvosmjernu interakciju između tretmana i srednjeg ± SEM broja c-Fos stanica u ljusci i jezgri nukleusa accumbens (vrijeme obrade ljuske - jezgra;F (2,24) = 4.243; p<0.026). Jednosmjerno ANOVA sondiranje ove interakcije pronašlo je značajne glavne efekte tretiranih grupa samo u jezgru jezgra jezgra (F (2,24) = 7.341; p<0.003) a ne u ljusci akumbena (F (2,24) = 1.271; p> 0.1). Različita slova ukazuju na značajne razlike između grupa.
Ispitivanje interakcije rostralno-kaudalnog nivoa tretmana pokazalo je značajne glavne efekte tretmanskih grupa kako na rostralnom tako i na kaudalnom nivou, ali ne i na srednjem nivou nucleus accumbens (sl. 4). Newman-Keuls post hoc testovi su pokazali da su žene koje su primile 6 sedmice seksualnog iskustva i da su testirane na seksualno ponašanje (iskustvo / test) imale više c-Fos-pozitivnih ćelija u rostralnom nukleusu accumbens nego žene koje su testirane, ali koje nisu primile nikakvo prethodno seksualno iskustvo (nema iskustva / testa; p <0.05) i one ženke koje nisu testirane na seksualno ponašanje (nema testa;p <0.01). The post hoc testovi su otkrili slične rezultate za kaudalnu jezgru akumbensa. Ženke u grupi sa iskustvom / testom imale su veći broj ćelija koje izražavaju c-Fos u kaudalnom nukleusu accumbens nego žene u grupi bez iskustva / testa (p <0.05) i nijedna test grupa (p <0.01). Prema tome, ispitivanje seksualnog ponašanja tokom sedme sedmice povećalo je broj ćelija obojenih c-Fosom u rostralnom i kaudalnom jezgru, samo za one ženke koje su imale šest tjedana iskustva.
Izraz c-Fos kroz rostralno-kaudalnu dimenziju nucleus accumbens, srušio se preko jezgre i ljuske. Iako je trosmjerna ANOVA pokazala da je dvosmjerna interakcija između tretiranih grupa i srednjih ± SEM broj c-Fos ćelija kroz rostralno-kaudalnu razinu nukleusa accumbens samo približila značaj (F (4,48) = 2.365; p <0.066), ispitivali smo svaki nivo jezgra accumbens odvojeno radi učinka tretmana na bojenju c-Fos. Jednosmjerna ANOVA otkrila je značajne glavne efekte tretiranih grupa na oba rostralna nivoa (F (2,48) = 5.230; p<0.009) i kaudalni nivo (F (2,48) = 7.455; p <0.002), ali ne na srednjem nivou (F (2,48) = 1.744; p> 0.1) jezgra gomile. Različita slovaukazuju na značajne razlike između grupa.
c-Fos ekspresija u kaudatnom jezgru i cingularnom korteksu
Broj ćelija iz dorzalnog kaudatnog jezgra je takođe analiziran korišćenjem trostazne ANOVA. Analiza je otkrila samo interakciju između tretmana i ekspresije c-Fos u medijalnom i lateralnom kaudatnom jezgru (F (2,24) = 3.514;p <0.046). Međutim, odvojena analiza medijalne i lateralne kaudaste jezgre jednosmjernom ANOVA-om nije ukazala na razliku u broju ćelija obojenih c-Fos između iskustva / testa, bez iskustva / testa i nijedne test grupe.2). Osim toga, u cingularnom korteksu nisu pronađeni glavni efekti seksualnog iskustva ili ponašanja na broj ćelija koje izražavaju c-Fos ili bilo kakve interakcije (podaci nisu prikazani).
Srednje ± SEM broj c-Fos-imunoreaktivnih ćelija u medijalnom i lateralnom dorzalnom kaudatnom jezgru
Eksperiment 2
Lokomotorna aktivnost
Dvosmjerna ANOVA (period testiranja vremena liječenja), uspoređujući srednju aktivnost ženki u iskustvu / amfetamin, bez iskustva / amfetamina i grupe za tretman fiziološkom otopinom u 70 min testiranja, otkrila je interakciju između grupe za tretman i perioda testiranja. Da bi se ispitala ova interakcija, pojedinačne tretirane grupe su ispitivane odvojeno sa jednosmjernom ANOVA-om. Analize su ukazale na značajne promene u srednjoj opštoj aktivnosti tokom 70 min testiranja za dve grupe ženki koje su bile injektirane amfetaminom (iskustvo / amfetamin i bez iskustva / amfetamin). Međutim, opšta aktivnost ženki koje su primale slanu otopinu nije se značajno promijenila u 70 min (sl.5). Newman-Keuls post hoctestovi su zatim korišćeni da bi se utvrdilo koji se periodi ispitivanja 10 min razlikuju. Parene višestruke usporedbe pokazale su da je opća aktivnost seksualno iskusnih ženki s amfetaminom značajno povećala 10 min nakon injekcija (p <0.05). Nadalje, u usporedbi s 10 minuta prije injekcija, žene u grupi koja je liječila iskustvom / amfetaminom ostale su značajno aktivnije 20 minuta (p <0.05) i 30 min (p<0.05) nakon injekcija. Suprotno tome, efekti amfetamina na seksualno naivne ženke nisu bili vidljivi tek 20 minuta nakon injekcija. U ovom trenutku, ove su ženke bile znatno aktivnije u odnosu na 10 minuta prije injekcija (p <0.05). Pored toga, aktivnost seksualno naivnih žena kojima je davan amfetamin ostala je značajno povećana tokom 30 minuta (p <0.05) i 40 min (p<0.01) nakon injekcija.
Efekti amfetamina na opštu aktivnost seksualno iskusnih i seksualno naivnih ženskih hrčaka. Dvosmjerna ANOVA (period testiranja vremena liječenja) otkrila je interakciju između grupe za tretman i perioda testiranja (F (12,150) = 2.288;p <0.011) za srednju vrijednost ± SEM broj aktivnosti. Jednosmjerno ANOVA sondiranje pojedinih grupa liječenih pokazalo je značajne promjene u općoj aktivnosti žena u iskustvu / amfetamin (F (6,150) = 3.0468; p <0.008) i nema iskustva / amfetamin (F (6,150) = 3.893;p <0.001) grupe liječenja. Aktivnost ženki kojima je ubrizgana fiziološka otopina nije se promijenila (F (6,150) = 1.619;p <0.1). Post hoc testovi su pokazali da su seksualno iskusne ženke brže reagovale na amfetamin, pokazujući povećanje aktivnosti u toku prvog 10 min nakon injekcije. Seksualno naivne ženke nisu reagovale na amfetamin sve do 20 min nakon injekcije. * \ Tp <0.05 u odnosu na period pre testiranja.
c-Fos izraz
Trosmjerna ANOVA (vrijeme tretmana rostralno-kaudalnog vremena, ljuske i jezgre) korišteno je za ispitivanje efekata seksualnog iskustva i amfetamina na c-Fos ekspresiju u nucleus accumbens. Nisu pronađeni značajni glavni efekti tretmana i nikakva trostruka interakcija između tretmana, akumensa i ljuske. Štaviše, analiza nije otkrila nikakve interakcije između tretiranih grupa i c-Fos ekspresije u ljusci i jezgru akumbensa ili između tretiranih grupa i c-Fos označavanja na rostralnom, srednjem i kaudalnom nivou nukleusa accumbens ( podaci nisu prikazani).
Broj ćelija iz dorzalnog kaudatnog jezgra je takođe analiziran korišćenjem trostazne ANOVA. Inicijalna analiza nije pokazala značajan efekat prethodnog seksualnog iskustva ili amfetamina na broj c-Fos-pozitivnih ćelija. Pored toga, nijedan efekat prethodnog seksualnog iskustva ili amfetamina na broj ćelija koje eksprimiraju c-Fos nije pronađen u cingularnom korteksu koristeći dvosmjernu ANOVA (podaci nisu prikazani).
DISKUSIJA
Svrha ove istrage bila je dvostruka. Prvo smo ispitali efekte seksualnog iskustva na staničnu aktivnost u različitim subregijama nucleus accumbens. Drugo pitanje, da li bi prethodno seksualno iskustvo moglo senzibilizirati mezolimbički put dopamina, ispitivano je poređenjem ponašajnih reakcija seksualno iskusnih i naivnih životinja na injekciju amfetamina. Naši nalazi ne samo da ukazuju na to da žensko seksualno ponašanje može aktivirati neurone u nukleusu accumbens, već i da seksualno iskustvo može unakrsno senzibilizirati neuronske odgovore na amfetamin.
Efekti seksualnog ponašanja na ekspresiju c-Fosa u ljusci i jezgri nukleusa accumbens
Ispitivanje seksualnog ponašanja povećalo je ekspresiju c-Fos u jezgru, ali ne iu ljusci, nucleus accumbens, podržavajući prethodna istraživanja koja pokazuju da jedan seksualni susret može aktivirati neurone u nucleus accumbens kod ženki glodavaca (Meisel et al., 1993; Joppa et al., 1995; Mermelstein i Becker, 1995; Pfaus i dr., 1995; Kohlert et al., 1997; Kohlert i Meisel, 1999). Literatura koja se bavi funkcionalnom dihotomijom nucleus accumbens sastoji se od brojnih izvještaja o diferencijalnim promjenama u prijenosu dopamina unutar ljuske i jezgre nukleusa accumbens kao odgovor na farmakološke i fiziološke podražaje. Primena nekoliko lekova zloupotrebe dovodi do selektivnog povećanja nivoa vanćelijskog dopamina u ljusci nukleusa accumbens (Pontieri et al., 1995; Nisell et al., 1997; Pierce i Kalivas, 1997a; Tanda et al., 1997; Tanda i Di Chiara, 1998; Barrot i dr., 1999; Cadoni i Di Chiara, 1999). Na sličan način, vrlo ukusna hrana (Tanda i Di Chiara, 1998; Di Chiara i dr., 1999a; Kelley, 1999), blagi stres (npr. šok u stopalu) (Kalivas i Duffy, 1995; Tidey i Miczek, 1997; Bruijnzeel i dr., 1999; Wu et al., 1999), i ekološka novost (Rebec et al., 1997;Rebec, 1998) također selektivno povećavaju prijenos dopamina u ljusci nukleusa accumbens.
Naši nalazi su konzistentni sa hipotezom da su ljuska i jezgra funkcionalno različiti, iako smo našli jezgro, a ne ljusku, da reaguje na seksualno ponašanje. Moguće je, međutim, da je došlo do promjena u c-Fos imunoreaktivnosti u ljusci nukleusa accumbens, ali te promjene nisu otkrivene. Ljuska je kompleksno organizirana u različite podregije, medijalnu, ventralnu i lateralnu ljusku, pri čemu su trbušna i dorzalna područja medijalne ljuske možda dva različita podregiona (Groenewegen i dr., 1999). Ove podregije ljuske, kao i srednji i bočni dijelovi jezgre, primaju različite kombinacije ulaza iz kortikalnih i subkortikalnih područja (Groenewegen i dr., 1999). Nadalje, smješteni unutar ovih podregija su funkcionalno različiti sklopovi neurona koji su organizirani u različite anatomske odjeljke (Groenewegen i dr., 1999). Budući da su efekti seksualnog ponašanja na ekspresiju c-Fosa u ovoj studiji ispitivani samo u dorsomedijalnoj ljusci, moguće je da se broj c-Fos-pozitivnih ćelija zapravo promijeni u različitoj subregiji ljuske.
Uprkos zapažanjima da su mnoge funkcije nucleus accumbens lokalizirane na područje ljuske, razumno je pretpostaviti da različite neuronske krugove unutar nucleus accumbens posreduju pojačavajuće osobine različitih ponašanja. Carelli et al. (2000)nedavno su izvijestili da nukleus akumbens neuroni kod štakora pokazuju sličnu neuronsku aktivnost u toku operanta koji reagira na dva prirodna pojačivača (tj. hrana i voda), ali različiti uzorci pečenja tijekom odgovora za prirodni pojačivač u odnosu na kokain. Zaključili su da odvojeni neuronski krugovi u nucleus accumbens procesuiraju informacije o pojačanju hrane i vode u odnosu na nagradu za kokain (Carelli et al., 2000).
Seksualno iskustvo utiče na ekspresiju c-Fosa kroz rostralno-kaudalnu osu nucleus accumbens
Literatura koja istražuje subnuklearnu organizaciju kroz rostralno-kaudalnu jezgru akumbensa je mala; međutim, uočene su jasne funkcionalne i anatomske razlike. Naši nalazi su u skladu sa studijama koje su ukazale na diferencijalno regulisanje neurohemijskih i motoričkih odgovora preko rostralno-kaudalne osi akumbensa. Kolecistokinin (CCK) diferencijalno modulira efekte dopamin-indukovane u rostralnom i kaudalnom jezgru akumbensa (Crawley i dr., 1985a,b), potenciranje dopamin-indukovane hiperlokomocije kada se infundira u kaudalni akkumbens, region koji je inervisan neuronskim CCK kolokaliziranim dopaminom (Crawley i dr., 1985a,b; Lanca i dr., 1998). Međutim, CCK je neaktivan u ponašanju kada se ubrizgava u rostralnu nukleus akkumbens, oblast koja prima odvojene CCK i dopaminske projekcije (Crawley i dr., 1985a,b; Lanca i dr., 1998). Takođe je prijavljeno da direktna infuzija amfetamina u rostralnu školjku, kaudalnu ljusku ili jezgru različito utiče na aktivnost ponašanja i ekstracelularni nivo dopamina i serotonina (Heidbreder i Feldon, 1998). Regulacija opioidnih peptida, supstance P, receptora dopamina D1 (Voorn i Docter, 1992; Jongen-Relo i dr., 1994b; Voorn i dr., 1994), i otpuštanje acetilholina (Jongen-Relo i dr., 1995) dopaminskim i dopaminskim receptorskim agonistima također se razlikuje između rostralnog i kaudalnog dijela akumbensa, pri čemu su rostralni akumbensi osjetljiviji na oštećenje dopamina i administraciju. Iako su navedene funkcionalne razlike između rostralnog i kaudalnog nukleusa accumbens, zašto ove funkcionalne razlike još uvijek nisu u potpunosti shvaćene.
Seksualno iskustvo utiče na amfetamin-indukovanu lokomotornu aktivnost
Rezultati prikazani ovdje i u ranijoj studiji ukazuju da prethodna seksualna iskustva senzibiliziraju neuronske odgovore na testiranje seksualnog ponašanja, ukazujući na senzibilizirano povećanje oslobađanja dopamina (Kohlert i Meisel, 1999) i staničnu aktivnost u nucleus accumbens (ova studija). Jedna od briga je, međutim, da su iskusne žene u prethodnoj studiji možda odgovorile i na testiranje seksualnog ponašanja i na ekološke znakove, jer su seksualno iskustvo i testiranje obavljeni u istoj prostoriji. Ekološki signali uslovno povezani sa motivisanim ponašanjem mogu steći poticajna svojstva i dodatno povećati nivo dopamina u nucleus accumbens (Reid i dr., 1996, 1998; Watson i Little, 1999). Druga zabrinutost je da zbog toga što mjere muškog seksualnog ponašanja nisu zabilježene, nije poznato da li su dvije grupe žena testirane na seksualno ponašanje dobile usporedive količine vaginocervikalne stimulacije. Prijavljeno je da je vaginocervikalna stimulacija neophodna za oslobađanje dopamina u nucleus accumbens tokom parenja (Kohlert et al., 1997). Možda su seksualno iskusne ženke dobile više vaginocervikalne stimulacije (ne mjerene u ovoj studiji), čime se povećala indukcija c-Fos. Stoga, da bismo potvrdili da žensko seksualno ponašanje senzibilizira mezolimbički put dopamina, istražili smo da li su seksualno iskusne i naivne žene reagirale drugačije na injekciju amfetamina, drugi stimulus za koji se zna da posreduje njegove efekte putem dopaminskih puteva. Nadalje, kako bi se osiguralo da su senzibilizirani odgovori uočeni zbog ponovljenog seksualnog ponašanja, a ne zbog uvjetovanog povezivanja okoline sa seksualnim ponašanjem, reakcije ponašanja hrčaka na amfetamin testirane su u novom okruženju.
Amfetamin je povećao opštu aktivnost kod svih ženki hrčaka. Međutim, seksualno iskusne žene su ranije reagovale na amfetamin nego na seksualno naivne žene. Ovi rezultati potvrđuju hipotezu da ponovljeno seksualno ponašanje može senzibilizirati neurone u mezolimbičkom putu dopamina i sugeriraju da promjene u putanji proizvode senzibilizirane reakcije ponašanja kako na prirodno motivirano ponašanje tako i na psihomotorni stimulans (unakrsnu senzibilizaciju).
Ovi nalazi su u skladu sa hipotezom da postoje konvergentni neuronski mehanizmi koji posreduju u odgovoru na droge i seksualno ponašanje (Robinson i Berridge, 1993; Pierce i Kalivas, 1997b). Nekoliko nedavnih studija je uočilo unakrsnu senzibilizaciju između ponovljenog izlaganja lijekovima i prirodno motiviranog ponašanja. Društveni poraz umanjuje vreme akvizicije kokainske samouprave kod pacova (Tidey i Miczek, 1997). Okruženje upareno sa ponovljenim injekcijama morfina može olakšati seksualno ponašanje kod mužjaka štakora (Mitchell i Stewart, 1990a,b). Predtretman amfetaminom takođe olakšava seksualno ponašanje kod seksualno naivnih muških pacova i povezan je sa povećanim oslobađanjem dopamina u nucleus accumbens (Fiorino i Phillips, 1999).
Ekspresija c-Fos analizirana je u nucleus accumbens nakon tretmana amfetaminom. Pretpostavljeno je da će amfetamin povećati ekspresiju c-Fos u nucleus accumbens, au većoj mjeri i kod seksualno iskusnih ženki. Međutim, nijedan efekat amfetamina na broj ćelija koje eksprimiraju c-Fos nisu nađene u bilo kojoj od subregija nucleus accumbens. To je vidljivo iz tabele3 da su kontrolne životinje u eksperimentu 2 (slane ženke) imale veći broj c-Fos-pozitivnih ćelija u poređenju sa kontrolnim životinjama u eksperimentu 1 (bez test ženki). Badiani et al. (1998) izvijestio da se novost povećala c-fos sadržaj mRNK u nucleus accumbens, i to na ovaj efekatc-fos sadržaj je bio toliko jak u nekoliko područja mozga da primjena amfetamina u novom okruženju nije proizvela dodatni inkrementalni odgovor. Prema tome, čini se mogućim da u našem istraživanju stres prenošenja u novu okolinu sobe za testiranje aktivira sintezu c-Fos proteina, čime se prikrivaju promene u ekspresiji c-Fos indukovane amfetaminom i seksualnim iskustvom.
Srednje ± SEM bazalni broj c-Fos-imunoreaktivnih ćelija u ljusci i jezgru nucleus accumbens za kontrolne životinje u eksperimentima 1 i 2
Potencijalni značaj
Ovi eksperimenti se pridružuju rastućoj listi studija (Mitchell i Stewart, 1990b; Fiorino i Phillips, 1999; Miczek et al., 1999) ukazujući da iskustva životinje mogu senzibilizirati reakciju mezolimbičkog puta dopamina i na ponašanje koje je dio prirodnog repertoara životinje i na određene lijekove za koje se zna da ljudi zlostavljaju (Wise i Bozarth, 1987). Ključno pitanje u istraživanju zloupotrebe droga je individualna ranjivost na efekte droga (Newcomb, 1992; Robinson i Berridge, 1993), a kolektivno ovo istraživanje može ponuditi uvid u razvoj ovisnosti kod ljudi.
Fusnote
- Primljeno Jun 8, 2000.
- Revizija je primljena Decembar 12, 2000.
- prihvaćeni Decembar 20, 2000.
Ovo istraživanje je podržao Nacionalni fond za nauku Grant IBN-9723876. Zahvaljujemo Melissi Zila, Shannon McCanna, Marchelle Baker, Michael Huntington i Deborah Shelley na njihovoj stručnoj pomoći u testiranju ponašanja i c-Fos obradi.
Dopisivanje treba uputiti Dr. Robertu L. Meiselu, Odsjek za psihološke nauke, Univerzitet Purdue, West Lafayette, IN 47907-1364. E-mail: [email zaštićen].
- Copyright © Društvo za neuronauku 2001
;