Uticaj prekomjerne ekspresije ΔFosB na signalizaciju posredovanu opioidnim i kanabinoidnim receptorima u nucleus accumbens (2011)

Neurofarmakologija. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ, Cassidy MP, Sparta A, Zachariou V, Nestler EJ, Selley DE.

izvor

Odsjek za farmakologiju i toksikologiju i Institut za studije lijekova i alkohola, Medicinski fakultet Sveučilišta Virginia Commonwealth, Richmond, VA 23298, SAD.

sažetak

Stabilni transkripcijski faktor ΔFosB induciran je u nucleus accumbens (NAc) hroničnom izloženošću nekoliko lijekova zloupotrebe, a transgenska ekspresija ΔFosB u striatumu povećava nagrađivana svojstva morfina i kokainae. Me | utim, mehani ~ ka osnova za ova opaʻanja nije potpuno shva} ena. Koristili smo model bitransgenskog miša sa inducibilnom ekspresijom ΔFosB u dopamin D (1) receptori / dynorphin koji sadrže striatalne neurone za određivanje efekta ekspresije ΔFosB na signalizaciju opioidnog i kanabinoidnog receptora u NAc. Rezultati su pokazali da su aktivnost G-proteina posredovana opioidima i inhibicija adenilil ciklaze pojačani u NAc miševa koji su izražavali ΔFosB. Slično tome, kappa opioidna inhibicija adenilil ciklaze pojačana je u miševima koji eksprimiraju ΔFosB. Nasuprot tome, signaliziranje posredovano kanabinoidnim receptorima nije se razlikovalo između miševa koji su prekomjerno eksprimirali ΔFosB i kontrolnih miševa. TRezultati istraživanja ukazuju da su signalizacija opioidnog i kanabinoidnog receptora različito modulirana ekspresijom ΔFosB, i ukazuju na to da ekspresija ΔFosB može proizvesti neke od svojih efekata putem pojačanog signaliziranja mu i kapa opioidnih receptora u NAc.

Ključne riječi: G-protein, adenilil ciklaza, striatum

1. uvod

Opioidni receptori i kanabinoidni CB₁ receptori (CB₁R) su neurobiološki ciljevi za dvije najčešće korištene klase lijekova koje uključuju morfij, heroin i opioide na recept, te marihuanu (Δ).⁹-tetrahidrokanabinol (THC)). Akutni efekti opioida i kanabinoida posredovani su G-protein-vezanim receptorima koji aktiviraju primarno G_{i / o} proteini i proizvode nizvodne efektorske odgovore kao što je inhibicija adenilil ciklaze (Childers, 1991, Childers, et al., 1992, Howlett et al., 2002). Motori, poremećaji pamćenja i psihoaktivni efekti Δ⁹-THC proizvode CB₁R (Huestis, et al., 2001, Zimmer et al., 1999), koji su široko rasprostranjeni u mozgu, sa visokim nivoima u bazalnim ganglijima, hipokampusu i cerebelumu (Herkenham, et al., 1991). Analgetski i rewarding efekti većine klinički relevantnih i zloupotrebljenih opioidnih lijekova su uglavnom posredovani mu opioidnim receptorima (MOR) (Matthes et al., 1996), koji su obogaćeni limbičkim sistemom i moždanim stablom (Mansour, et al., 1994). Mezolimbički sistem, sastavljen od dopaminergičkih projekcija iz ventralnog tegmentalnog područja (VTA) do nucleus accumbens (NAc), igra važnu ulogu u efektima nagrađivanja opioida i kanabinoida (Bozarth i Wise, 1984, Vaccarino, et al., 1985, Zangen et al., 2006), kao i druge droge zloupotrebe (Koob i Volkow, 2010). Štaviše, endogeni opioidni i kanabinoidni sistemi su uključeni u efekte nagrađivanja više klasa psihoaktivnih droga (Maldonado, et al., 2006, Trigo, et al., 2010). Stoga je važno razjasniti mehanizme po kojima opioidi i CB₁R signalizacija je regulisana u NAc.

Centralno pitanje na polju zloupotrebe droga je bilo identifikovanje proteina koji posreduju u prelasku iz akutnih u dugoročne efekte psihoaktivnih droga. Faktor transkripcije AP-1 ΔFosB je posebno interesantan jer je stabilan proizvod sa skraćenim spojem fosb gen koji se akumulira pri ponovljenom izlaganju lijekovima ili prirodnim nagradama (McClung, et al., 2004, Nestler, 2008, Nestler et al., 1999). Ustanovili smo da se ΔFosB indukuje u mozgu nakon ponovljene izloženosti morfinu, Δ⁹-THC, kokain ili etanol, pri čemu svaki lijek proizvodi jedinstven regionalni obrazac ΔFosB ekspresije (Perrotti, et al., 2008). Konstantan nalaz među lijekovima bio je da je ΔFosB bio visoko induciran u striatumu, gdje su sva četiri lijeka inducirala ΔFosB u NAc jezgri i sve osim⁹-THC je značajno indukovao ekspresiju u NAc ljusci i kaudatu-putamenu.

Farmakološka ispitivanja su pokazala da istovremena primjena dopamina D₁ receptor (D₁R) antagonist SCH 23390 blokirao je indukciju ΔFosB u NAc i kaudat-putamen nakon intermitentne administracije kokaina ili morfina, što ukazuje na potencijalnu važnost D₁Neuroni koji eksprimiraju R (Muller i Unterwald, 2005, Nye, et al., 1995). Efekat indukcije ΔFosB na ponašanje posredovan lijekom ispitivan je pomoću bitransgenskih miševa koji eksprimiraju ΔFosB u specifičnim neuronskim populacijama NAc i dorzalnog striatuma (Chen, et al., 1998). Miševi koji eksprimiraju ΔFosB u dynorphin / D₁R pozitivni neuroni u NAc i dorzalnom striatumu (linija 11A) pokazuju promijenjene odgovore na droge zloupotrebe, posebno povećanu osjetljivost na efekte kokaina ili morfija (Colby, et al., 2003, Kelz, et al., 1999, Zachariou, et al., 2006). Ove promene su se desile u odsustvu promena nivoa MOR ili različitih podjedinica G-proteina. Međutim, nivoi mRNA dynorphina su smanjeni u NAc miševa koji eksprimiraju ΔFosB (Zachariou, et al., 2006), sugerirajući da je jedan cilj ΔFosB gen koji kodira endogeni opioidni peptid. Indukcija ΔFosB takođe može proizvesti promjene u ponašanju regulacijom signalizacije receptora u NAc, ali ta mogućnost nije istražena. Stoga, ove studije su koristile model bitransgenskog miša da bi utvrdile da li je prekomjerna ekspresija ΔFosB u dynorphin / D₁R koji sadrži striatalne neurone mijenja aktivnost G-proteina posredovanu MOR-om i inhibiciju adenil-ciklaze posredovane MOR- i KOR-om u NAc. Efekat ΔFosB na CB₁R-posredovana aktivnost G-proteina je takođe procijenjena zbog Δ⁹Davanje THTH inducira ΔFosB u NAc \ tPerrotti, et al., 2008i poznato je da endokanabinoidni sistem reguliše kolo nagrađivanja mozga (Gardner, 2005, Maldonado, et al., 2006), ali efekat ΔFosB na endokanabinoidni sistem nije istražen.

2. Materijali i metode

2.1. Reagensi

[³⁵S] GTPγS (1250 Ci / mmol), [α-³²P] ATP (800 Ci / mmol) i [³H] cAMP (26.4 Ci / mmol) je nabavljen od PerkinElmer (Shelton, CT). ATP, GTP, GDP, cAMP, albumin goveđeg seruma, kreatin fosfokinaza, papaverin, imidazol i WIN-55212-2, nabavljeni su od Sigma Aldrich (St. Louis, MO). GTPγS je kupljen od Roche Diagnostic Corporation (Chicago, IL). DAMGO je obezbijeđen od strane Programa snabdijevanja drogom Nacionalnog instituta za zloupotrebu droga (Rockville, MD). Econo-1 scintilacijska tekućina dobivena je od tvrtke Fisher Scientific (Norcross, GA). Ecolite scintilacijska tekućina dobivena je od ICN (Costa Mesa, CA). Sve druge hemikalije su dobijene od Sigma Aldrich ili Fisher Scientific.

2.2. Miševi

Muški bitransgenični miševi izvedeni iz NSE-TTA (linija A) × TetOp-ΔFosB (linija 11) su generirani kao što je opisano u Kelz et al. (\ TKelz, et al., 1999). Bitransgenični miševi su koncipirani i uzgojeni na doksiciklinu (100 µg u vodi za piće) kako bi se suzbila ekspresija transgena. U starosti 8 nedelje, doksiciklin je izostavljen iz vode za polovinu miševa da bi se omogućila ekspresija transgena, dok su preostali miševi održavani na doksiciklinu da bi se suzbila transgena. Mozgovi su sakupljeni 8 tjedna kasnije, vrijeme u kojem su transkripcijski efekti ΔFosB maksimalni (McClung i Nestler, 2003). Korišćena je druga transgena linija miša u kojoj je Δc-Jun, dominantni negativni antagonist c-Jun, izražen u D₁R / dynorphin i D₂R / enkefalinske stanice striatuma, hipokampusa i parietalnog korteksa (Peakman, et al., 2003). C-Jun i srodni proteini Jun-a se dimeriziraju sa proteinima porodice Fos i vezuju se za AP-1 mjesto ciljnih gena da bi regulirali transkripciju. Međutim, skraćivanje N-terminusa c-Jun (Δc-Jun) čini kompleks transkripcijski neaktivnim i sposoban da ometa vezivanje DNK aktivnih AP-1 kompleksa. Muški bitransgenični miševi izvedeni iz NSE-TTA (linija A) × TetOp-FLAG-Δc-Jun (linija E) su generirani kao što je opisano u Peakman et al. (\ TPeakman, et al., 2003). Bitransgenični miševi su koncipirani i uzgojeni na doksiciklinu (100 µg u vodi za piće) kako bi se suzbila ekspresija transgena. Mladunci su bili odbijeni u 3 nedeljama, genotipizirani i razdvojeni u grupe, pri čemu je polovina zadržana na vodi koja sadrži doksiciklin, a polovina na redovnoj vodi za piće kako bi se izazvala ekspresija FLAG-Δc-Jun. Mozgovi su sakupljeni 6 tjedna kasnije, vrijeme u kojem su izmjereni maksimalni nivoi FLAG-Δc-Jun (Peakman, et al., 2003). Sve procedure na životinjama su sprovedene u skladu sa Nacionalnim vodičem za zdravstvenu njegu i upotrebu laboratorijskih životinja.

2.3. Priprema membrana

Mozgovi su skladišteni na -80 ° C do dana ispitivanja. Prije ispitivanja, svaki mozak je odmrznut, a NAc je diseciran na ledu. Svaki uzorak je homogeniziran u 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, pH 7.4 (membranski pufer) sa 20 potezima iz staklenog homogenizatora na 4 ° C. Homogenat je centrifugiran na 48,000 × g na 4 ° C za 10 min, resuspendiran u membranskom puferu, ponovo centrifugiran na 48,000 × g na 4 ° C za 10 min i resuspendiran u 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl₂, 0.2 mM EGTA, 100 mM NaCl, pH 7.4 (testni pufer). Nivoi proteina određeni su metodom Bradforda (Bradford, 1976) korišćenjem goveđeg serumskog albumina (BSA) kao standarda.

2.4. Stimulisani agonist [³⁵S] GTPγS Binding

Membrane su pre inkubirane tokom 10 minuta na 30 ° C sa adenozin deaminazom (3 mU / ml) u puferu za ispitivanje. Membrane (protein 5 – 10 µg) su zatim inkubirane tokom 2 sati na 30 ° C u puferu za ispitivanje koje sadrži 0.1% (w / v) BSA, 0.1 nM [³⁵S] GTPγS, 30 µM GDP i adenozin deaminaza (3 mU / ml) sa i bez odgovarajućih koncentracija DAMGO ili WIN55,212-2. Nespecifično vezivanje je izmereno sa 20 µM GTPγS. Inkubacija je prekinuta filtracijom kroz filtere od staklenih vlakana GF / B, praćeno sa 3 ispiranjem sa 3 ml ledeno hladnim 50 mM Tris-HCl, pH 7.4. Vezana radioaktivnost određena je tekućinskom scintilacijskom spektrofotometrijom nakon ekstrakcije filtera preko noći u Econo-1 scintilacijskoj tekućini.

2.5. Adenilil ciklaza test

Membrane (protein 5 – 25 µg) su prethodno inkubirane sa adenozin deaminazom kao što je gore opisano, a zatim inkubirane za 15 min na 30 ° C u prisustvu ili odsustvu forsolina 1µM, sa ili bez DAMGO, U50,488H ili WIN55,212-2, u testnom puferu koji sadrži 50 µM ATP, [α-³²P] ATP (1.5 µCi), 0.2 mM DTT, 0.1% (w / v) BSA, 50 µM ciklični AMP, 50 µM GTP, 0.2 mM papaverin, 5 mM fosfokreatin, 20 jedinice / ml kreatin fosfokinaze i adenozin deaminaza (3 mU / ml) u konačnoj zapremini 100 µl. Pod ovim uslovima, ukupno [α-³²P] regenerisan cAMP je bio općenito manji od 1% od ukupne količine dodane [α-³²P] ATP u svakom uzorku. Reakcija je prekinuta ključanjem za 3 min i³²P] Ciklični AMP izoliran je dvostrukom kolonom (Dowex i aluminijev oksid) metodom Salomona (Salomon, 1979). [\ T³H] cAMP (10,000 dpm) je dodavan u svaku epruvetu prije kromatografije na koloni kao interni standard. Radioaktivnost je određena tekućinskom scintilacijskom spektrofotometrijom (45% efikasnost za ³H) nakon što je 4.5 ml eluata otopljen u 14.5 ml Ecolite scintilacijske tekućine.

2.6. Analiza podataka

Ako nije drugačije naznačeno, podaci se prikazuju kao srednje vrijednosti ± SE odvojenih eksperimenata 4-8, od kojih je svaki izveden u triplikatu. Net-stimulirani [³⁵S] GTPyS vezivanje je izračunato kao agonist-stimulisano vezivanje minus bazalno vezivanje. Aktivnost adenil ciklaze stimulisane forskolinom definisana je kao forskolin-stimulisana aktivnost - bazalna aktivnost (pmol / mg / min). Procenat inhibicije aktivnosti forskolinom stimulisane adenilil ciklaze definiše se kao (neto forskolin-stimulisana aktivnost u odsustvu agonista - neto forskolin-stimulisana aktivnost u prisustvu agonist / net forskolin-stimulisane aktivnosti u odsustvu agonista) × 100. Sve krivulje i statističke analize izvršene su pomoću Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Krivulje koncentracije i efekta analizirane su iterativnom nelinearnom regresijom kako bi se dobila EC₅₀ i E_maksimum vrijednosti. Statistička značajnost podataka o koncentraciji-efektu određena je dvosmjernom analizom varijance (ANOVA), korištenjem doze agonista i indukcije gena (uključeno ili isključeno) kao glavnih faktora. Statistička značajnost vrijednosti uklapanja krivulje (E_maksimum ili EC₅₀) određen je nesparenim dvostranim Studentovim t-testom, koristeći Welchovu korekciju ili transformaciju kvadratnog korijena podataka, gdje je to potrebno za korekciju nejednakih varijansi (otkrivenih F-testom) u EC₅₀ vrijednosti.

3. Rezultati

3.1. Uticaj ekspresije ΔFosB na aktivaciju G-proteina posredovanom opioidnim i kanabinoidnim receptorima

Da biste odredili da li MOR- ili CB₁R-posredovana aktivacija G-proteina je promenjena inducibilnom transgenskom ekspresijom ΔFosB u NAc, agonist-stimulisana [³⁵S] GTPyS vezivanje je ispitano na izolovanim membranama pripremljenim iz ovog područja bitransgenskih miševa koji uslovno eksprimiraju (ΔFosB na) ili ne eksprimiraju (ΔFosB off) transgene ΔFosB. Za aktiviranje MOR-a korišćen je MOR-selektivni enkefalinski analog DAMGO, a kanabinoid aminoalkilindol WIN55,212-2 je korišćen za aktiviranje CB₁R. Ovi ligandi su ranije pokazani kao puni agonisti u MOR i CB₁R, respektivno (Breivogel, et al., 1998, Selley, et al., 1997). Nije bilo moguće ispitati aktivnost G-proteina posredovanu KOR-om jer je signal prenizak u mozgu glodara (Childers, et al., 1998). Rezultati su pokazali stimulaciju aktivnosti G-proteina ovisno o koncentraciji i od DAMGO i WIN55,122-2 u NAc iz ΔFosB off i ΔFosB na miševima (Slika 1). Za DAMGO-stimuliranu aktivnost (Slika 1A), dvosmjerna ANOVA podataka o koncentracijskim efektima otkrila je značajne glavne efekte ΔFosB statusa (p <0.0001, F = 22.12, df = 1) i DAMGO koncentracije (p <0.0001, F = 29.65, df = 5) bez značajna interakcija (p = 0.857, F = 0.387, df = 5). Nelinearna regresijska analiza krivulja koncentracija-efekt otkrila je značajno veći DAMGO E_maksimum vrijednost u ΔFosB na miševima (E_maksimum = 73 ± 5.2% stimulacija) u odnosu na ΔFosB kod miševa (E_maksimum = 56 ± 4.1% stimulacija; p <0.05 različito od ΔFosB na miševima Studentovim t-testom). DAMGO EC₅₀ vrijednosti nisu bile različite između ΔFosB i ΔFosB kod miševa (302 ± 72 nM naspram 212 ± 56 nM, redom, p = 0.346).

Uticaj ekspresije ΔFosB na agonist-stimulisane³⁵S] GTPyS vezivanje u NAc. Membrane iz ΔFosB-ekspresujućih (ΔFosB-a) ili kontrolnih (ΔFosB-off) miševa su testirane kao što je opisano u Metodama koje koriste različite koncentracije ...

Za razliku od rezultata dobijenih sa MOR agonistom DAMGO, nisu uočene razlike u aktivaciji G-proteina zavisne od statusa ΔFosB kod kanabinoidnog agonista WIN55,212-2 (Slika 1B). Dvosmjerna ANOVA podataka o efektu koncentracije WIN55,212-2 otkrila je značajan glavni efekt koncentracije WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 112.4, df = 7), ali ne i statusa ΔFosB (p = 0.172 , F = 1.90, df = 1) i nije bilo interakcije (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). Slično tome, nije bilo utjecaja statusa ΔFosB na WIN55,212-2 E_maksimum vrijednosti (103 ± 6% naspram 108 ± 8% stimulacije u ΔFosB miševima, odnosno, p = 0.813 pomoću Studentovog t-testa) ili EC₅₀ vrijednosti (103 ± 20 nM nasuprot 170 ± 23 nM u ΔFosB miševima, odnosno, p = 0.123).

Na osnovu oblika krivulja i činjenice da su naše prethodne studije pokazale bifazne krivulje koncentracije-efekta WIN55,212-2 u mozgu (Breivogel, et al., 1999, Breivogel, et al., 1998), krive WIN55,212-2 su takođe analizirane pomoću modela sa dva mesta. Analiza prosječnih podataka pokazala je blago poboljšanje u dobroj formi koristeći model s dva mjesta (R² = 0.933 i 0.914, suma kvadrata = 3644 i 5463 u ΔFosB miševima, odnosno) u odnosu na model jednog mjesta (R)² = 0.891 i 0.879, suma kvadrata = 6561 i 6628 u ΔFosB miševima, odnosno). Međutim, nisu nađene značajne razlike između ΔFosB i miševa u oba E_maksimum ili EC₅₀ vrijednosti mjesta visoke ili niske potencijeDodatna tabela 1), iako je postojao trend ka nižoj EC₅₀ vrijednost na mjestu visoke potencije u miševa s ΔFosB na (EC₅₀visok = 28.0 ± 10.6 nM) u odnosu na one sa ΔFosB off (EC₅₀visok = 71.5 ± 20.2 nM; p = 0.094). Štaviše, nije bilo efekta ΔFosB statusa na bazalnu [³⁵S] GTPyS vezivanje u NAc membranama (253 ± 14 u odnosu na 226 ± 14 fmol / mg u ΔFosB miševima, odnosno, p = 0.188). Ovi podaci ukazuju da je indukovana transgenska ekspresija ΔFosB u NAc miševa povećala aktivaciju G-proteina posredovanog MOR bez značajnog uticaja na CB₁R-posredovana ili bazalna aktivnost G-proteina.

3.2. Uticaj ΔFosB na inhibiciju adenil ciklaze posredovanu opijatima i kanabinoidnim receptorima \ t

Proceniti efekat inducibilne transgenske ekspresije ΔFosB na modulaciju efektorske aktivnosti nizvodno od MOR i CB₁R, inhibicija aktivnosti 1 µM forskolin-stimulisane adenilil ciklaze ispitana je u NAc membranama. Pored MOR- i CB₁R-posredovana inhibicija aktivnosti adenilil ciklaze, efekti KOR aktivnosti su takođe ispitivani korišćenjem KOR-selektivnog potpunog agonista U50,488 (Zhu, et al., 1997), jer su prethodni rezultati pokazali da je dynorphin mRNA meta ΔFosB u bitransgenskom modelu (Zachariou, et al., 2006). Rezultati su pokazali da su DAMGO, U50,488 i WIN55,212-2 proizveli zavisnu koncentraciju inhibicije aktivnosti adenilil ciklaze u oba ΔFosB i ΔFosB na miševima (Slika 2). Dvosmjerna ANOVA podataka o DAMGO koncentraciji-efektu (Slika 2A) su otkrili značajne glavne efekte ΔFosB statusa (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) i koncentracije DAMGO (p <0.0001, F = 29.61, df = 6), ali bez značajne interakcije (p = 0.441, F = 0.986 , df = 6). Nelinearna regresijska analiza krivulja koncentracije-efekta DAMGO otkrila je značajno niži DAMGO EC₅₀ vrijednost u ΔFosB na miševima (101 ± 11 nM) u odnosu na ΔFosB kod miševa (510 ± 182 nM, p <0.05 studentskim t-testom). Međutim, nije bilo značajne razlike u DAMGO E_maksimum vrijednosti (20.9 ± 1.26% nasuprot 19.8 ± 1.27% inhibicije u ΔFosB na i izvan miševa, redom, p = 0.534).

Uticaj ekspresije ΔFosB na inhibiciju aktivnosti adenilil ciklaze u NAc. Membrane od ΔFosB-ekspresujućih (ΔFosB) ili kontrolnih (ΔFosB off) miševa su testirane kao što je opisano u Metodama u prisustvu 1 µM ...

Inhibicija adenil ciklaze posredovana KOR-om takođe se razlikovala kao funkcija inducibilne transgenske ekspresije ΔFosB (Slika 2B). Dvosmjerna ANOVA podataka o efektu koncentracije U50,488 pokazala je značajne glavne efekte statusa ΔFosB (p = 0.0006, F = 14.53, df = 1) i koncentracije U50,488 (p <0.0001, F = 26.48, df = 3) , bez značajne interakcije (p = 0.833, F = 0.289, df = 3). Nelinearna regresijska analiza krivulja koncentracija-efekt otkrila je veći U50,488 E_maksimum vrijednost u ΔFosB na miševima (18.3 ± 1.14% inhibicije) u odnosu na ΔFosB kod miševa (12.5 ± 2.03% inhibicija; p <0.05 različita od ΔFosB na Studentovom t-testu), bez značajne razlike u U50,488 EC₅₀ vrijednosti (310 ± 172 nM nasuprot 225 ± 48 nM u ΔFosB miševima, odnosno, p = 0.324).

Za razliku od efekata koji su uočeni sa MOR i KOR, nije bilo značajnog efekta indukovane transgenske ekspresije ΔFosB na inhibiciju adenilil ciklaze kanabinoidnim agonistom WIN55212-2 (Slika 2C). Dvosmjerni ANOVA podataka WIN55,212-2 o koncentracijskim efektima pokazao je značajan učinak koncentracije lijeka (p <0.0001, F = 23.6, df = 2), ali ne i statusa ΔFosB (p = 0.735, F = 0.118, df = 1) niti je došlo do značajne interakcije (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). Nadalje, nije bilo utjecaja statusa ΔFosB na bazalnu ili forskolin-stimuliranu aktivnost adenilil ciklaze u odsustvu bilo kojeg agonista. Bazalna aktivnost adenilil ciklaze bila je 491 ± 35 pmol / mg / min kod ΔFosB na miševima u odnosu na 546 ± 44 kod ΔFosB kod miševa (p = 0.346 Studentovim t-testom). Slično tome, aktivnost adenilil ciklaze u prisustvu 1 µM forskolina iznosila je 2244 ± 163 pmol / mg / min u ΔFosB na miševima naspram 2372 ± 138 pmol / mg / min kod ΔFosB kod miševa (p = 0.555).

3.3. Efekat ΔcJun na inhibiciju adenil ciklaze posredovane opijatima i kanabinoidnim receptorima

Zbog induktivne transgenske ekspresije ΔFosB pojačane inhibitorne transdukcije signala iz MOR i KOR u adenilil ciklazu u NAc, bilo je od interesa utvrditi da li bi dominantni negativni inhibitor ΔFosB-posredovane transkripcije modulirao signalizaciju opioidnog receptora na suprotan način. Da bi se odgovorilo na ovo pitanje, inhibicija aktivnosti forskolinom stimulisane adenilil ciklaze od strane DAMGO i U50,488 ispitana je na membranama pripremljenim od NAc bitransgenskih miševa koji uslovno eksprimiraju ΔcJun. Rezultati nisu pokazali značajan efekat ekspresije ΔcJun na inhibiciju aktivnosti adenilil ciklaze pomoću MOR ili KOR (Slika 3). Dvosmjerna ANOVA krivulja koncentracije efekta DAMGO pokazala je značajan glavni efekt koncentracije DAMGO (p <0.0001, F = 20.26, df = 6), ali ne i statusa ΔcJun (p = 0.840, F = 0.041, df = 1) i nije bilo značajne interakcije (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). Slično tome, nije bilo značajne razlike u E_maksimum ili EC₅₀ vrijednosti između miševa s ΔcJun na (E_maksimum = 23.6 ± 2.6%; EC₅₀ = 304 ± 43 nM) ili ΔcJun off (E_maksimum = 26.1 ± 2.5%, p = 0.508; EC₅₀ = 611 ± 176 nM, p = 0.129). Slični rezultati viđeni su i kod U50,488, tako da je dvosmjerna ANOVA krivulja koncentracija-efekt pokazala značajan učinak koncentracije (p <0.0001, F = 11.94, df = 6), ali ne i ΔcJun statusa (p = 0.127 , F = 2.391, df = 1) i nije bilo značajne interakcije (p = 0.978, F = 0.190, df = 6). Isto tako, nije bilo značajnih razlika u E_maksimum ili EC₅₀ vrijednosti između miševa s ΔcJun na (E_maksimum = 14.8 ± 2.9%; EC₅₀ = 211 ± 81 nM) ili isključeno (E_maksimum = 16.7 ± 1.8%, p = 0.597; EC₅₀ = 360 ± 151 nM, p = 0.411).

Uticaj ekspresije ΔcJun na inhibiciju aktivnosti adenilil ciklaze u NAc. Membrane iz ΔcJun-ekspresujućih (ΔcJun na) ili kontrolnih (ΔcJun off) miševa inkubirane su u prisustvu DAMGO (A), U50,488H (B) ili WIN55,212-2 ...

Ekspresija ΔcJun takođe nije značajno uticala na inhibiciju adenilil ciklaze u NAc od strane kanabinoidnog agonista. Dvosmjerna ANOVA krivulja koncentracije WIN55,212-2 pokazala je značajan glavni efekt koncentracije WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 15.53, df = 6), ali ne i genotipa (p = 0.066, F = 3.472, df = 1) i nije bilo značajne interakcije (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). Isto tako, nije bilo značajnih razlika u WIN55,212-2 E_maksimum vrijednosti (13.0 ± 2.3% i 13.6 ± 0.9% inhibicije u ΔcJun nasuprot off miševima, redom, p = 0.821) i ili EC₅₀ vrijednosti (208 ± 120 nM i 417 ± 130 nM u ΔcJun nasuprot off miševima, p = 0.270). Dakle, iako je došlo do blagog trenda smanjenja potentnosti WIN55,212-2 kod miševa koji eksprimiraju ΔcJun, transgen nije značajno promijenio kanabinoidnu inhibiciju adenilil ciklaze. Štaviše, nije bilo efekta ΔcJun statusa na bazalnu ili forskolin-stimuliranu aktivnost adenilil-ciklaze. Bazalna aktivnost adenilil ciklaze bila je 1095 ± 71 pmol / mg / min i 1007 ± 77 pmol / mg / min (p = 0.403) kod miševa sa uključenim ili isključenim ΔcJun. Aktivnost adenilil ciklaze stimulisana sa 1 µM forskolinom bila je 4185 ± 293 pmol / mg / min u odnosu na 4032 ± 273 pmol / mg / min (p = 0.706) kod miševa sa uključenim ili isključenim ΔcJun.

3.4. Diskusija

Rezultati ove studije otkrili su pojačanu aktivaciju G-proteina posredovanu MOR-om i inhibiciju adenilil ciklaze u NAc miševa sa inducibilnom transgenskom ekspresijom ΔFosB u dynorphin / D₁R koji sadrži neurone. KOR-posredovana inhibicija aktivnosti adenilil ciklaze je takođe povećana u NAc ΔFosB ekspresionih miševa, sugerirajući da ΔFosB reguliše endogeni opioidni sistem u NAc. DAMGO E_maksimum vrijednost je bila veća za MOR-stimulirane³⁵S] GTPyS vezivanje, i njegova EC₅₀ vrednost je bila niža za inhibiciju adenilil ciklaze, u ΔFosB nad-ekspresionim miševima u poređenju sa kontrolnim miševima. Ovi nalazi ukazuju na mogućnost rezerve receptora za efektorsku modulaciju, ali ne i za aktivaciju G-proteina u ispitivanim uslovima analize. Nalaz da je maksimalna inhibicija adenilil ciklaze od KOR agonista pogođena ekspresijom ΔFosB ukazuje na nisku rezerve receptora za KOR-posredovani odgovor, u skladu sa niskim nivoima mesta vezivanja KOR u mozgu miša (Unterwald, et al., 1991). Nasuprot tome, CB₁Aktivnost G-posredovanog G-proteina i inhibicija adenilil ciklaze nisu bile pod uticajem ekspresije ΔFosB, sugerirajući da se opijatni i kanabinoidni sistemi razlikuju u odgovoru na ΔFosB u ovim NAc neuronima.

Efekat ΔFosB na signalizaciju posredovan opioidnim receptorima je u skladu sa našim prethodnim izveštajem da je ekspresija ΔFosB u striatumu izmenila akutne i hronične efekte morfijuma (Zachariou, et al., 2006). Jedan nalaz te studije bio je da miševi sa transgenskom ekspresijom ΔFosB u dynorphin / D₁R striatalni neuroni su bili osjetljiviji na morfijum na licu mjesta, nego na kontrole. Pored toga, ovaj efekat je oponašan virusno posredovanom ekspresijom ΔFosB od strane specifične injekcije u NAc. Ova opažanja su konzistentna sa trenutnim rezultatima koji pokazuju poboljšanu MOR signalizaciju u NAc.

Prethodno smo identifikovali kodiranje gena dynorphin kao meta ΔFosB, i predložio da bi redukovani dynorphin bio u skladu sa poboljšanim svojstvima morfina u ΔFosB bitransgenskim miševima (Zachariou, et al., 2006). Sadašnji rezultati pokazuju da je inhibicija adenilil ciklaze posredovana KOR-om u NAc povećana kod miševa koji eksprimiraju ΔFosB, što bi moglo odražavati kompenzatorno povećanje KOR osjetljivosti nakon reduciranog dinorfina. Prethodne studije su pokazale da je KOR regulisan u određenim regionima mozga prodynorphin knockout miševa, uključujući NAc (Clarke, et al., 2003).

Za razliku od ΔFosB, inducibilna transgenska ekspresija ΔcJun, dominantnog negativnog skraćenog mutanta ΔFosB veznog partnera cJun, nije promenila inhibiciju adenilil ciklaze sa MOR ili KOR agonistima. Ovi rezultati ukazuju da bazalni nivoi ekspresije ΔFosB, koji su relativno niski, ne igraju značajnu ulogu u održavanju signalizacije opioidnih receptora na ovom nivou transdukcije signala u NAc. Činjenica da je uslovljeni efekat nagrađivanja morfina smanjen izražavanjem ΔcJun u našoj prethodnoj studiji (Zachariou, et al., 2006) sugeriše da je indukcija morfina ΔFosB tokom kondicionog postupka važna za regulaciju ponašajnih odgovora na lijek ili da transkripcijski efekti ΔFosB, osim onih koji utječu na proksimalno signaliziranje od strane opioidnih receptora, mogu utjecati na opioidnu nagradu. U svakom slučaju, rezultati ove studije jasno pokazuju da, kada je ekspresija ΔFosB povišena iznad bazalnih nivoa u striatalnom dynorphin / D₁Neuroni koji eksprimiraju R, postoji snažno povećanje vezanja MOR i KOR u inhibiciju adenilil ciklaze u NAc.

Mehanizmi kojima se signaliziranje posredstvom MOR- i KOR-a pojačava prekomjernom ekspresijom ΔFosB-a su nejasni, ali smo prethodno pokazali da su razine MOR-a, procjenjene od [³H] vezivanje naloksona, ne razlikuju se u NAc ΔFosB u odnosu na off miševe (Zachariou, et al., 2006). Ista studija je pokazala da je Gα_iNivoi proteina 1 i 2 nisu bili pogođeni u ovom području izrazom ΔFosB. Međutim, prethodna analiza ekspresije gena pokazala je da Gα_o mRNA je regulirana u NAc ΔFosB na miševima (McClung i Nestler, 2003). Biće od interesa u budućim istraživanjima sveobuhvatno ispitati efekat transgene ekspresije ΔFosB na ekspresiju podjedinice G-proteina na nivou proteina kao i na ekspresiju mnogih proteinskih modulatora G-proteina.

Zanimljivo je da ekspresija ΔFosB nije povećala CB₁R-posredovana signalizacija u NAc. Moguće je da su promjene u CB-u₁R signalizacija se javlja u diskretnoj populaciji neurona koja je zamagljena u čitavom NAc preparatu. Na primjer, administracija Δ⁹- THC je značajno inducirao ΔFosB u jezgri, ali ne i u ljusci NAc (Perrotti, et al., 2008). IPokazalo se da je izazov sa Δ⁹-THC nakon ponovljenog davanja Δ⁹-THC povećava oslobađanje dopamina u NAc jezgru, ali smanjuje oslobađanje u ljusci (Cadoni, et al., 2008). Takođe je važno napomenuti da linija 11A miševa koji imaju bitransgenične ekspresije eksprimira ΔFosB samo u dynorphin / D.₁R pozitivni srednji kičasti neuroni striatuma, ali CB₁R su izraženi u oba dynorphin / D₁R i enkefalin / D₂R pozitivni striatni neuroni (Hohmann i Herkenham, 2000), kao i na terminalima kortikalnih aferenta (Robbe, et al., 2001). Ekspresija dominantnog negativnog regulatora ΔFosB-posredovane transkripcije, ΔcJun, takođe nije imala značajan uticaj na signaliziranje kanabinoidnih receptora, iako je ΔcJun inducibno izražen u oba D₁ i D₂koji sadrže populacije srednjih kičmenih neurona u ovim miševima (Peakman, et al., 2003). Moguće je, međutim, da je bazalna ΔFosB ekspresija dovoljno niska da ΔcJun ne utiče na signalizaciju receptora, kao što sugeriraju rezultati sa MOR i KOR. Takođe je moguće da CB₁R signaliziranje je umjereno pojačano bazalnom ekspresijom ΔFosB, tako da je daljnje povećanje ΔFosB ekspresije ili blokiranje njenih akcija s ΔcJun imalo samo neznatne efekte koji nisu dostigli nivo statističke značajnosti. Indirektna podrška za ovo tumačenje može se videti upoređivanjem WIN55,212-2 EC₅₀ vrijednosti između miševa koji izražavaju ΔcJun naspram ΔFosB. Odnos WIN55,212-2 EC₅₀ vrednost za inhibiciju adenilil ciklaze kod miševa sa indukovanom ekspresijom ΔcJun do njene EC₅₀ Vrijednost za aktivaciju G-proteina kod miševa s induciranom ekspresijom ΔFosB bila je 4.0, dok je isti omjer kod miševa bez indukcije bilo kojeg transgena bio 1.2.

Alternativno, kanabinoidi mogu indukovati ekspresiju ΔFosB bez direktnog efekta na CB₁R signalizacija. U ovom scenariju, kanabinoidi mogu modulirati reakciju na psihoaktivne efekte drugih lijekova putem ΔFosB-posredovane transkripcijske regulacije. IU stvari, administracija Δ⁹-THC proizvodi unakrsnu senzibilizaciju na opioide i amfetamin (Cadoni, et al., 2001, Lamarque, et al., 2001), u skladu sa ovom hipotezom. Štaviše, ponovljeno je davanje kanabinoidnog agonista CP55,940-a za povećanje aktivacije G-proteina posredstvom MOR u NAc, slično kao kod miševa koji induciraju ekspresiju ΔFosB u ovoj studiji (Vigano, et al., 2005). Efekat ekspresije ΔFosB na Δ⁹- Ponašanja koja su posredovana THC-om nisu procijenjena, ali sadašnji rezultati ne isključuju interakciju. Rezultati ovog i našeg prethodnog istraživanja (Zachariou, et al., 2006) pokazuju ΔFosB-indukovane promjene u MOR i KOR / dinorfinu u striatumu. Nagrađeni efekti Δ⁹-THC, mjeren po preferenciji mjesta, ukida se u MOR nultim miševima, dok se brisanje KOR-a smanjuje Δ⁹-THC averzija mesta i otkriveno Δ⁹-THC preferencija mjesta (Ghozland, et al., 2002). Slično, uslovljena averzija prema Δ⁹-THC nije prisutan u nokautu pro-dinorfina u odnosu na miševe divljeg tipa (Zimmer et al., 2001). Ovi podaci sugerišu da je Δ⁹-THC može biti korisniji nakon indukcije ΔFosB i posljedične indukcije MOR signalizacije sa smanjenjem ekspresije dinorfina.

In summary, rezultati ove studije su pokazali da ekspresija ΔFosB u D₁R / dynorphin pozitivni striatalni neuroni pojačali su MOR- i KOR-posredovanu signalizaciju na nivou G-proteina posredovane inhibicije aktivnosti adenilil ciklaze u NAc. Ovaj nalaz je u skladu sa studijama koje su pokazale ulogu endogenog opioidnog sistema u nagradi (Trigo, et al., 2010), i obezbijediti potencijalni mehanizam za efekte ΔFosB posredovanog na nagradu. Nasuprot tome, CB₁R-posredovana signalizacija u NAc nije bila značajno pogođena striatalnom ekspresijom ΔFosB u ispitivanim uvjetima, iako su daljnje studije opravdane za određivanje efekta indukcije ΔFosB na endokanabinoidni sistem.

Istaknuta istraživanja

MOR signalizacija je pojačana u nucleus accumbens miševa koji izražavaju ΔFosB
KOR inhibicija adenilil ciklaze je takođe pojačana kod miševa koji eksprimiraju ΔFosB
Izraz ΔFosB ne mijenja CB₁R signalizacija u nucleus accumbens

Dopunski materijal

01

Kliknite ovdje za pregled.^{(45K, pdf)}

Priznanja

Autori zahvaljuju Hengjun He, Jordan Cox i Aaron Tomarchio za tehničku pomoć sa [³⁵S] GTPyS testovi vezivanja. Ova studija je podržana od strane USPHS Grants DA014277 (LJS), DA10770 (DES) i P01 DA08227 (EJN).

Fusnote

Izjava izdavača: Ovo je PDF fajl neregistrovanog rukopisa koji je prihvaćen za objavljivanje. Kao uslugu našim klijentima pružamo ovu ranu verziju rukopisa. Rukopis će biti podvrgnut kopiranju, slaganju i pregledu rezultirajućeg dokaza prije nego što bude objavljen u konačnom obliku. Imajte na umu da se tokom proizvodnog procesa mogu otkriti greške koje mogu uticati na sadržaj, a sve pravne izjave koje se odnose na časopis pripadaju.

reference

Bozarth MA, Wise RA. Anatomski različita polja receptora opijata posreduju nagradu i fizičku zavisnost. Nauka. 1984;224: 516-517. [PubMed]
Bradford MM. Brza i osetljiva metoda za kvantifikaciju mikrogramskih količina proteina upotrebom principa vezivanja proteina-boje. Anal. Biochem. 1976;72: 248-254. [PubMed]
Breivogel CS, Childers SR, Deadwyler SA, Hampson RE, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Chronic delta⁹Tetrahidrokanabinol tretman uzrokuje gubitak G-proteina aktiviranih kanabinoidnim receptorima koji ovise o vremenu u mozgu. J. Neurochem. 1999;73: 2447-2459. [PubMed]
Breivogel CS, Selley DE, Childers SR. Efikasnost agonista kanabinoidnih receptora za stimulaciju [³⁵S] GTPyS vezivanje za cerebelarne membrane pacova korelira sa smanjenjem afiniteta prema BDP-u. J. Biol. Chem. 1998;273: 16865-16873. [PubMed]
Cadoni C, Pisanu A, Solinas M, Acquas E, Di Chiara G. Senzibilizacija ponašanja nakon ponovljene izloženosti Delta 9-tetrahidrokanabinolu i unakrsna senzibilizacija morfinom. Psihofarmakologija (Berl) 2001;158: 259-266. [PubMed]
Cadoni C, Valentini V, Di Chiara G. Senzibilizacija ponašanja na delta 9-tetrahidrokanabinol i unakrsnu senzibilizaciju morfijem: diferencijalne promjene u prijenosu dopamina akumalnog ljuske i jezgre dopamina. J. Neurochem. 2008;106: 1586-1593. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgene životinje sa inducibilnom ekspresijom gena u mozgu. Mol. Pharmacol. 1998;54: 495-503. [PubMed]
Childers SR. Drugi glasnici povezani sa opioidnim receptorima. Life Sci. 1991;48: 1991-2003. [PubMed]
Childers SR, Fleming L, Konkoy C, Marckel D, Pacheco M, Sexton T, Ward S. Opioidna i kanabinoidna receptorska inhibicija adenilil ciklaze u mozgu. Ann. NY Acad. Sci. 1992;654: 33-51. [PubMed]
Childers SR, Xiao R, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Kappa stimulacija opioidnim receptorima³⁵S] GTPγS vezivanje u mozgu zamorca: Nedostatak dokaza za kapa₂-selektivna aktivacija G-proteina. Biochem. Pharmacol. 1998;56: 113-120. [PubMed]
Clarke S, Zimmer A, Zimmer AM, Hill RG, Kitchen I. Regija selektivne up-regulacije mikro-, delta- i kappa-opioidnih receptora ali ne i receptora sličnih opioidnim receptorima u mozgu enkefalina i dynorphin knockout miševa. Neuronauka. 2003;122: 479-489. [PubMed]
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Striatalna tipska prekomjerna ekspresija DeltaFosB-a povećava poticaj za kokain. J. Neurosci. 2003;23: 2488-2493. [PubMed]
Gardner EL. Endokanabinoidni signalni sistem i nagrada za mozak: naglasak na dopaminu. Pharmacol. Biochem. Behav. 2005;81: 263-284. [PubMed]
Ghozland S, Matthes HW, Simonin F, Filliol D, Kieffer BL, Maldonado R. Motivacioni efekti kanabinoida posredovani su mu-opioidnim i kapa-opioidnim receptorima. J. Neurosci. 2002;22: 1146-1154. [PubMed]
Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvin LS, de Costa BR, Rice KC. Karakterizacija i lokalizacija kanabinoidnih receptora u mozgu štakora: kvantitativna autoradiografska studija in vitro. J. Neurosci. 1991;11: 563-583. [PubMed]
Hohmann AG, Herkenham M. Lokalizacija kanabinoidne CB (1) receptorske mRNA u neuronskim subpopulacijama striatuma štakora: dvostruka oznaka in situ hibridizacijske studije. Synapse. 2000;37: 71-80. [PubMed]
Howlett AC, Barth F, Bonner TI, Cabral G, Casellas P, Devane WA, Felder CC, Herkenham M, Mackie K, Martin BR, Mechoulam R, Pertwee RG. Međunarodna farmakološka unija. XXVII. Klasifikacija kanabinoidnih receptora. Pharmacological Review. 2002;54: 161-202.
Huestis MA, Gorelick DA, Heishman SJ, Preston KL, Nelson RA, Moolchan ET, Frank RA. Blokada efekata dimljene marihuane od strane antagonista kanabinoidnih receptora CB1-a SR141716. Arch. Gen. Psychiatry. 2001;58: 322-328. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Ekspresija transkripcionog faktora deltaFosB u mozgu kontrolira osjetljivost na kokain. Nature. 1999;401: 272-276. [PubMed]
Koob GF, Volkow ND. Neurocircuitry of addiction. Neuropsihofarmakologija. 2010;35: 217-238. [PMC besplatan članak] [PubMed]
Lamarque S, Taghzouti K, Simon H. Kronični tretman sa Delta (9) -tetrahidrokanabinolom pojačava lokomotorni odgovor na amfetamin i heroin. Implikacije na ranjivost na ovisnost o drogama. Neurofarmakologija. 2001;41: 118-129. [PubMed]
Maldonado R, Valverde O, Berrendero F. Uključenost endokanabinoidnog sistema u ovisnosti o drogama. Trends Neurosci. 2006;29: 225-232. [PubMed]
Mansour A, Fox CA, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. ekspresija mRNA opioidnog receptora u CNS-u štakora: usporedba s vezivanjem za mu-receptor. Brain Res. 1994;643: 245-265. [PubMed]
Matthes HWD, Maldonado R, Simonin F, Valverde O, Slowe S, kuhinja I, Befort K, Dierich A, LeMeur M, Dolle P, Tzavara E, Hanoune J, Roques BP, Kieffer BL. Gubitak analgezije izazvane morfijem, efekat nagrađivanja i simptomi ustezanja kod miševa kojima nedostaje gen g-opioidnog receptora. Nature. 1996;383: 819-823. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Regulacija ekspresije gena i nagrade kokaina od strane CREB i DeltaFosB. Nat. Neurosci. 2003;6: 1208-1215. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekularni prekidač za dugoročnu adaptaciju u mozgu. Brain Res. Mol. Brain Res. 2004;132: 146-154. [PubMed]
Muller DL, Unterwald EM. D1 receptori dopamina moduliraju indukciju deltaFosB u striatumu štakora nakon intermitentne primjene morfina. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005;314: 148-154. [PubMed]
Nestler EJ. Pregled. Transkripcijski mehanizmi zavisnosti: uloga DeltaFosB-a. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2008;363: 3245-3255. [PMC besplatan članak] [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen J. DeltaFosB: molekularni posrednik dugotrajne neuralne i bihevioralne plastičnosti. Brain Res. 1999;835: 10-17. [PubMed]
Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakološke studije regulacije kronične indukcije antigena povezane s FOS kokainom u striatumu i nucleus accumbens. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995;275: 1671-1680. [PubMed]
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducibilna, specifična ekspresija dominantnog negativnog mutanta c-Jun-a u transgenim miševima mozga smanjuje osjetljivost na kokain. Brain Res. 2003;970: 73-86. [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Različiti obrasci indukcije DeltaFosB u mozgu putem droga zloupotrebe. Synapse. 2008;62: 358-369. [PMC besplatan članak] [PubMed]
Robbe D, Alonso G, Duchamp F, Bockaert J, Manzoni OJ. Lokalizacija i mehanizmi djelovanja kanabinoidnih receptora na glutamatergične sinapse mišjeg nucleus accumbens. J. Neurosci. 2001;21: 109-116. [PubMed]
Salomon Y. Test adenilat ciklaze. Adv. Ciklični nukleotidni rez. 1979;10: 35-55. [PubMed]
Selley DE, Sim LJ, Xiao R, Liu Q, Childers SR. Mu opioidni receptori stimulirani³⁵S] GTPyS vezivanje u talamusu štakora i kultivisanih ćelijskih linija: Mehanizmi transdukcije signala na kojima se zasniva agonistička efikasnost. Mol. Pharmacol. 1997;51: 87-96. [PubMed]
Trigo JM, Martin-Garcia E, Berrendero F, Robledo P, Maldonado R. Endogeni opioidni sistem: zajednički supstrat u ovisnosti o drogama. Alkohol zavisi od droge. 2010;108: 183-194. [PubMed]
Unterwald EM, Knapp C, Zukin RS. Neuroanatomska lokalizacija κ1 i κ2 opioidnih receptora u mozgu štakora i zamorca. Brain Res. 1991;562: 57-65. [PubMed]
Vaccarino FJ, Bloom FE, Koob GF. Blokada receptora nukleusa akumbensa umanjuje intravenoznu heroinsku nagradu kod pacova. Psihofarmakologija (Berl) 1985;86: 37-42. [PubMed]
Vigano D, Rubino T, Vaccani A, Bianchessi S, Marmorato P, Castiglioni C, Parolaro D. Molekularni mehanizmi uključeni u asimetričnu interakciju kanabinoidnih i opioidnih sistema. Psihofarmakologija (Berl) 2005;182: 527-536. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Bitna uloga za DeltaFosB u nucleus accumbens u morfinu. Nat. Neurosci. 2006;9: 205-211. [PubMed]
Zangen A, Solinas M, Ikemoto S, Goldberg SR, Wise RA. Dva mesta mozga za kanabinoidnu nagradu. J. Neurosci. 2006;26: 4901-4907. [PubMed]
Zhu J, Luo LY, Li JG, Chen C, Liu-Chen LY. Aktivacija kloniranog ljudskog kappa opioidnog receptora pomoću agonista pojačava vezivanje [35S] GTPyS za membrane: određivanje potencijala i efikasnosti liganda. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997;282: 676-684. [PubMed]
Zimmer A, Valjent E, Konig M, Zimmer AM, Robledo P, Hahn H, Valverde O, Maldonado R. Odsustvo delta-9-tetrahidrokanabinol disforičnih efekata kod miševa s nedostatkom dinorfina. J. Neurosci. 2001;21: 9499-9505. [PubMed]
Zimmer A, Zimmer AM, Hohmann AG, Herkenham M, Bonner TI. Povećana smrtnost, hipoaktivnost i hipoalgezija kod kanabinoidnih CB1 receptora nokautnih miševa. Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 1999;96: 5780-5785. [PMC besplatan članak] [PubMed]