(HUMAN) Bihevioralni i strukturalni odgovori na hronični kokain zahtevaju povratnu petlju koja uključuje ΔFosB i protein-kinazu zavisnu od kalcijuma i kalmodulina II u ljusci nuklearnog akumulatora (2013)

Faktor transkripcije ΔFosB i proteinska kinaza II (CaMKIIα) obogaćena mozgom inducirana je u nucleus accumbens (NAc) hroničnom izloženošću kokainu ili drugim psihostimulantima, u kojima dva proteina posreduju u senzibiliziranim odgovorima lijekova . Iako ΔFosB i CaMKIIa regulišu ekspresiju i funkciju AMPA glutamatnog receptora u NAc, formiranje dendritske kičme na NAc srednjim neuronima (MSNs), i lokomotornu senzibilizaciju na kokain, do danas nije istražena direktna veza između ovih molekula. Ovdje pokazujemo da je ΔFosB fosforiliran CaMKIIα na Ser27 koji stabilizira protein i da je CaMKII potreban za kokainom posredovanu akumulaciju ΔFosB u NAc pacova.

Nasuprot tome, pokazali smo da je ΔFosB i neophodan i dovoljan za kokainsku indukciju ekspresije CaMKIIα gena in vivo, efekt selektivan za D \ t₁-Tip MSN-ovi u podregionu NAc ljuske.

Osim toga, indukcija dendritičnih bodljika na NAc MSN-ima i povećana reakcija ponašanja na kokain nakon prekomjerne ekspresije NAc ΔFosB su oba ovisna o CaMKII.

Važno je da prvi put demonstriramo indukciju ΔFosB i CaMKII u NAc od ovisnici o ljudskom kokainu, sugerirajući moguće ciljeve za buduću terapijsku intervenciju. Ovi podaci pokazuju da ΔFosB i CaMKII učestvuju u pozitivnoj feedforward petlji specifičnoj za tip ćelije i mozak-region kao ključni mehanizam za regulisanje kruga nagrađivanja mozga kao odgovor na kronični kokain.

Uvod

Sve veći broj dokaza podržava mišljenje da promjene u ekspresiji gena doprinose mehanizmima ovisnosti o drogama (Robison i Nestler, 2011). Jedan od važnih posrednika ovih promena je ΔFosB, transkripcijski faktor porodice Fos (Nestler, 2008). Hronično davanje praktično bilo kog droge izaziva dugotrajnu akumulaciju ΔFosB u nucleus accumbens (NAc), limbičkom regionu neophodnom za ponašanje nagrađivanja. Sindukcija pojavljuje se specifično za klasu NAc srednjeg neuronskog kičmena (MSN) koji izražava D1 dopaminske receptore. Induktivna prekomerna ekspresija ΔFosB u ovim NAX MSN-ovima tipa D1 povećava lokomotorne i nagrađivane odgovore na kokain i morfijum (Kelz i dr., 1999; Zachariou i dr., 2006), uključujući povećanu samokontrolu kokaina (Colby i drugi, 2003). Nadalje, genetska ili virusna blokada ΔFosB transkripcijske aktivnosti smanjuje efekte ovih lijekova (Zachariou i dr., 2006), ukazujući da je ova kontinuirana indukcija ΔFosB kritični medijator trajnih promjena izazvanih u NAc hroničnoj primjeni lijeka.

Neuobičajena stabilnost ΔFosB (u odnosu na sve ostale proteine ​​porodice Fos) je i intrinzično svojstvo molekula, zbog skraćivanja degron domena prisutnih u FosB-u pune dužine (Carle et al., 2007), i regulisan proces. ΔFosB je fosforilisan in vitro i in vivo na Ser27, i ova reakcija dalje stabilizira ΔFosB, ~ 10-fold, u kulturi ćelija i NAc in vivo (Ulery-Reynolds i dr., 2009). Iako se pokazalo da je Ser27-ΔFosB supstrat za kazein-kinazu-2 in vitro (Ulery i dr., 2006), njegov mehanizam in vivo fosforilacija ostaje nepoznata.

Proteinska kinaza II (CaMKII) zavisna od kalcijuma i kalmodulina je visoko eksprimirana serin / treonin kinaza čije α i β izoforme formiraju dodekamerne homo- i hetero-holoenzime in vivoi neophodni su za višestruke oblike neuroplastičnosti (Lisman i dr., 2002; Colbran i Brown, 2004). CaMKIIα se selektivno indukuje u NAc ljusci hroničnim amfetaminom (Loweth i dr., 2010), a farmakološka blokada CaMKII aktivnosti u NAc ljusci smanjuje senzibilizaciju ponašanja na amfetamin (Loweth i dr., 2008) i kokain (Pierce i dr., 1998), dok prekomjerna ekspresija virusa CaMKIIα u ovoj NAc subregiji povećava lokomotornu senzibilizaciju i samoprimjenu amfetamina (Loweth i dr., 2010). CaMKIIα može uticati na ponašanje nagrađivanja putem modulacije podjedinica receptora glutamata AMPA (Pierce i dr., 1998), pošto je aktivnost CaMKIIa dugo povezana sa funkcijom AMPA receptora i sinaptičkim ciljanjem u nekoliko oblika neuroplastičnosti (Malinow i Malenka, 2002).

Ova literatura pokazuje nekoliko paralela između ΔFosB i CaMKII: oba su neophodna i dovoljna za višestruke bihejvioralne efekte droga, oba regulišu dendritične bodlje u različitim vrstama neuronskih ćelija in vivo (Jourdain i drugi, 2003; Maze et al., 2010), i oboje vrše barem neke svoje efekte ponašanja kroz modulaciju AMPA receptora (Kelz i dr., 1999; Malinow i Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Uprkos ovim paralelama, nije poznata nikakva funkcionalna veza između ΔFosB i CaMKII. Ovde uspostavljamo recipročnu regulaciju između ΔFosB i CaMKII, i demonstriramo da dva proteina formiraju D1-tip MSN specifične feed-forward petlje u NAc ljusci koja je inducirana kokainom i reguliše niz odgovora kokaina. in vivo.

Idi:

Materijali i metode

Eksperiment 1: iTRAQ Proteomska analiza NAc ljuske i jezgra nakon tretmana kokainom (Fig 1A)

Odraslim (8 sedmicama) mužjacima štakora je davano 20 mg / kg kokaina ili fiziološki rastvor IP jednom dnevno tokom sedam dana. 24 h nakon zadnje injekcije, NAc ljuska i jezgra su mikrodisekcionisane (Fig 1A) i zamrznuti. iTRAQ analize su izvršene kao što je prethodno opisano (Ross i dr., 2004; Davalos i dr., 2010).

Slika 1

Shema specifična indukcija CaMKII u NAc kokainom

Eksperiment 2: Kvantifikacija promena proteina u NAC jezgru štakora i ljusci nakon tretmana kokainom (Slika 1B – D)

Odraslim (8 sedmicama) mužjacima pacova je davano 10 mg / kg kokaina ili fiziološki rastvor IP jednom dnevno tokom sedam dana u komorama za lokomotorno snimanje. Lokomotorni odgovori na jednu injekciju kokaina (5 mg / kg IP) zabilježeni su kod onih životinja koje su prethodno liječene kokainom (zvanim „kronični“) i dijela onih koji su tretirani fiziološkom otopinom (nazvani „akutni“), a lokomotorni odgovori na slanu otopinu sam je zabilježen u preostalim kroničnim životinjama koje su tretirane fiziološkom otopinom (nazvanom "slanina"). Ispitivanja lokomotorne aktivnosti izvršena su kako je opisano (Hiroi et al., 1997). Ukratko, odrasli mužjaci pacova su smješteni u 18 ”× 24” PAS kutije za snimanje na otvorenom polju (San Diego Instruments) za 30 min da bi se habituirali, dobili su jednu IP injekciju slane otopine i pratili dodatnih 30 min, i dobili su jednu IP injekciju 5 mg / kg kokaina i prati se 30 min.

24 hr nakon ove finalne injekcije, pacovi su bili bez glave bez anestezije kako bi se izbegli efekti anestetika na nivoe proteina neurona i fosfo-stanja. Mozgovi su serijski rezani u matrici 1.2 mm (Braintree Scientific), a ciljno tkivo je uklonjeno u fosfatnom puferu koji sadrži proteazne (Roche) i fosfatazne (Sigma Aldrich) inhibitore upotrebom 14 mjernog udarca za NAc jezgru i 12 mjerni udar preostalih tkivo za NAc ljusku (Vidi Fig 1A) i odmah zamrznuti na suvom ledu. Uzorci su homogenizirani laganim soniciranjem u modificiranom RIPA puferu: 10 mM Tris baza, 150 mM natrijum klorid, 1 mM EDTA, 0.1% natrij dodecil sulfat, 1% Triton X-100, 1% natrij deoksiholat, pH 7.4, inhibitori proteaze i fosfataze Kao što je gore. Nakon dodavanja Laemmli pufera, proteini su razdvojeni na 4-15% poliakrilamidnim gradijentima (Criterion System, BioRad), i Western blotting je izveden koristeći Odyssey sistem (Li-Cor) prema proizvođačkim protokolima.

Eksperiment 3: Kvantificiranje promjena proteina u jezgri i ljusci NAc štakora nakon povlačenja kokainaFig 1E)

Odraslim (8 sedmicama) mužjacima štakora je davano 10 mg / kg kokaina ili fiziološki rastvor IP jednom dnevno tokom sedam dana. 14 dana nakon završne injekcije, životinje koje su tretirane fiziološkom otopinom dobile su još jednu injekciju fiziološke otopine (pod nazivom "fiziološka otopina), a životinje koje su primale kokain dobile su još jednu injekciju fiziološkog rastvora (zvanu 14 dan povlačenje ili" 14d WD ") ili jednu injekciju kokaina ( zove se “14d WD Chal” za izazov). Jedan sat nakon završne injekcije, životinje su odsečene glave i Western bloting je izveden kao u eksperiment 2.

Eksperiment 4: Kvantificiranje promjena proteina u jezgri i ljusci NAc štakora nakon samo-administracije kokainaSlika 2A – C)

Štakori su obučavani da samostalno administriraju 0.5 mg / kg / infuziju kokaina u jednočasovnim sesijama pod rasporedom 1 za fiksni odnos za devet dana. Nakon devet početnih sesija, pacovi su podijeljeni u dvije grupe koje su bile uravnotežene unosom kokaina na posljednje dvije sesije. Jednoj grupi pacova je dozvoljeno da samostalno daju kokain (0.5 mg / kg / infuzija) tokom jednog sata (kratak pristup, ShA), dok je druga grupa pacova samostalno uzimala kokain u šest sati (dugi pristup, LgA). ) za dodatnih deset dana (sesije eskalacije).

Sekcije mozga su obrađene za imunohistokemiju kako je opisano (Perrotti i drugi, 2004). Mozgovi su perfundirani 18-24 hr nakon posljednjeg izlaganja lijeku, što je rezultiralo degradacijom bilo kojeg preostalog FosB proteina pune dužine tako da sva preostala imunoreaktivnost odražava ΔFosB. Ova degradacija je potvrđena Western blottingom, koji nije pokazao značajno bojenje sa antitelom usmerenim protiv C terminusa FosB pune dužine koji ne prepoznaje ΔFosB (podaci nisu prikazani). Nakon rezanja u sekcije 35 µm, broj ΔFosB imunopozitivnih ćelija je kvantifikovan od strane slepog posmatrača u dve sekcije kroz NAc svakog pacova, a srednje vrednosti po 40 × polju su zatim izračunate po regionima za svaku životinju. Svaka životinja je smatrana individualnom opservacijom za statističku analizu. Regioni od interesa su identifikovani koristeći Paxinos i Watson (Paxinos i Watson, 2007).

Kvantifikacija imunoreaktivnosti CaMKIIa izvršena je pomoću Licor sistema kako je opisano (Covington i dr., 2009). Integrirani intenziteti CaMKII i GAPDH su određeni pomoću Odyssey softvera. Rezultati su prikazani kao integrirane vrijednosti intenziteta po mm² i prikazani su kao sredstva ± sem (n = 4 – 10 po grupi). Vrijednosti za GAPDH su korištene kao referenca za normalizaciju CaMKII intenziteta za debljinu i uvjete rezova.

Slika 2

Indukcija CaMKII u NAc ljusci pacova i kokaina

Eksperiment 5: Kvantifikovanje nivoa proteina kod ljudi zavisnih od kokaina (Fig 2D)

postupak

Postmortem tkiva ljudskog mozga dobivena su od banke suicidnog mozga u Quebecu (Univerzitetski institut za mentalno zdravlje Douglas, Montreal, Quebec, Kanada). Očuvanje tkiva se odvijalo u suštini kako je opisano (Quirion i dr., 1987). Ukratko, nakon što je izvađen, mozak se stavlja na vlažan led u kutiji od stiropora i odlazi u objekte za samoubilačke banke u Kvebeku. Hemisfere se odmah razdvajaju sagitalnim rezom u sredini mozga, moždanog stabla i malog mozga. Krvni sudovi, pinealna žlezda, horoidni pleksus, polu cerebelum i polu moždano stablo su obično secirani od lijeve hemisfere koja se zatim presijeca u koronarne rezove debljine 1 cm prije zamrzavanja. Potonja polovina cerebeluma se presjeca sagitalno u kriške debljine 1cm prije zamrzavanja. Tkiva su zamrznuta u 2-metilbutanu na -40 ° C za ~ 60 sek. Sva zamrznuta tkiva se čuvaju odvojeno u plastičnim kesama na -80 ° C za dugotrajno skladištenje. Specifični regioni mozga se seciraju od smrznutih koronalnih rezova na ploči od nerđajućeg čelika sa suvim ledom svuda oko sebe da bi se kontrolisala temperatura okoline. Western blotting je izveden kao što je opisano u eksperiment 2.

Cohort

Kohorta je bila sastavljena od 37 muških i 3 ženskih subjekata, u rasponu godina između 15 – 66 godina. Svi ispitanici su iznenada umrli bez produženog agonalnog stanja ili dugotrajne medicinske bolesti. U svakom slučaju, uzrok smrti je utvrđen od strane Quebecovog Coroner ureda, a toksikološki ekran je proveden s uzorcima tkiva kako bi se dobile informacije o lijekovima i nedopuštenoj upotrebi tvari u vrijeme smrti. Grupa ispitanika se sastojala od 20 pojedinaca koji su ispunjavali SCID-I kriterije za ovisnost o kokainu. Kontrolna grupa se sastojala od 20 ispitanika bez istorije kokainske zavisnosti i bez većih psihijatrijskih dijagnoza. Svi subjekti su iznenada umrli iz uzroka koji nisu imali direktan uticaj na moždano tkivo. Grupe su uparene za srednju starosnu dob, odlaganje hlađenja i pH. Za sve ispitanike izvršene su psihološke autopsije kako je prethodno opisano (Dumais i dr., 2005), omogućujući nam da imamo pristup detaljnim informacijama o psihijatrijskoj i medicinskoj istoriji, kao i druge relevantne kliničke i sociodemografske podatke. Ukratko, obučeni anketar je sproveo Strukturirani klinički intervju za DSM-IV Psihijatrijski poremećaji (SCID-I) sa jednim ili više doušnika umrlih. Panel kliničara pregledao je SCID-I procjene, izvještaje o slučajevima, bilješke mrtvozornika i medicinsku dokumentaciju kako bi se postigla konsenzusna psihijatrijska dijagnoza.

Eksperiment 6: Imunoprecipitacija hromatina za NAc pacova (Slika 3A – C)

Odraslim (8 sedmicama) mužjacima štakora je davano 10 mg / kg kokaina ili fiziološki rastvor IP jednom dnevno tokom sedam dana. 24 hr nakon zadnje injekcije, NAc ljuska i jezgra su mikrodisekcionisane. Hromatin imunoprecipitacija (ChIP) je izvršena objedinjavanjem bilateralnih NAc udaraca ljuske ili jezgra od sedam pacova u grupi u 14 ukupnim grupama (98 ukupno životinja, 7 kokainski bazeni, 7 slani bazeni). Tkiva su umrežena, isprana i skladištena na -80 ° C do smicanja kromatina sonikacijom. Skraćeni hromatin inkubiran je preko noći sa antitelima prethodno vezanim za magnetne kuglice (Dynabeads M-280, Invitrogen). Neimunski IgG je korišćen kao kontrola. Nakon reverznog umrežavanja i pročišćavanja DNK, qPCR je korišten za mjerenje nivoa CaMKIIα promotorske DNA. Prajmeri su dizajnirani tako da amplifikuju region koji sadrži AP-1 konsenzus sekvencu lociranu ~ 450 bp prije početka transkripcije (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Slika 3

TypeFosB indukcija CaMKIIα in vivo

Eksperiment 7: Mjerenje transkripta CaMKII i ekspresije proteina sa ΔFosB prekomjernom ekspresijom specifičnom za tip stanicaFig 3D)

Muški bitransgenični miševi izvedeni iz NSE-TA (linija A) × TetOp-ΔfosB (linija 11) i NSE-TA (linija B) × TetOp-FLAG-ΔfosB miševi (linija 11) (Chen et al., 1998; Kelz i dr., 1999; Werme i dr., 2002; Zachariou i dr., 2006) su koncipirani i uzgojeni na 100 µg / ml doksiciklina da bi se suzbila ekspresija ΔFosB tokom razvoja. Legla su podeljena na odbiće: polovina je ostala na doksiciklinu, a polovina je prebačena u vodu, a životinje su korišćene 8 do 11 nedelja kasnije kada su transkripcioni efekti ΔFosB maksimalni (Kelz i dr., 1999; McClung i Nestler, 2003). Za transkripcijske analize, miševi su brzo dekapitirani, a mozgovi su uklonjeni i stavljeni na led. Disekcije NAc-a su uzimane sa 14-iglom i brzo smrznute na suvom ledu dok se RNA ne ekstrahuje. Izolacija RNK, qPCR i analiza podataka izvršeni su kao što je prethodno opisano (LaPlant et al., 2009). Ukratko, RNA je izolovana sa TriZol reagensom (Invitrogen), dalje prečišćena sa RNAeasy mikro kitom Qiagena, i proverena za kvalitet sa Agilentovim Bioanalyzer-om. Reverzna transkripcija je izvršena koristeći iScript (BioRad). qPCR je proveden sa primijenjenim PCN sistemom Applied Biosystems 7900HT RT sa sljedećim parametrima ciklusa: 10 min na 95 ° C; 40 ciklusi 95 ° C za 1 min, 60 ° C za 30 sek, 72 ° C za 30 sec; stepen zagrijavanja na 95 ° C kako bi se dobile krivulje disocijacije za potvrdu pojedinačnih PCR proizvoda. Imunohistokemijske analize ekspresije ΔFosB i CaMKIIα proteina izvršene su kako je opisano u eksperiment 4.

Eksperiment 8: Uticaj antagonista dopaminskih receptora D-NUMX i D1-a na NA-kokain-izmenjene proteinske promjeneFig 3H)

Odraslim (8 sedmicama) mužjacima pacova je davana 10 mg / kg kokaina ili fiziološki rastvor (grupa "nosač") IP jednom dnevno tokom sedam dana. 30 min prije svake injekcije kokaina, štakori su primali IP antagonist D1 receptora SCH 23390 (0.5 mg / kg, “D1 Ant” grupa) ili antagonist D2 receptora etikloprid (0.5 mg / kg, “D2 Ant” grupa). ili kontrolna injekcija slane vode (grupa „kokain“). 24 hr nakon završne injekcije, životinje su dekapitirane i proteini su kvantificirani pomoću Western blot-a po per eksperiment 2.

Eksperiment 9: Efekti AAV-posredovanog ΔFosB preterane ekspresije na ekspresiju proteina (Slika 4 A – C)

Stereotaksijska hirurgija je izvedena na odraslim mužjacima štakora (8 sedmica) za ubrizgavanje AAV-GFP (zeleni fluorescentni protein) ili AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). 33 igle za mjerenje (Hamilton) korištene su za sve operacije, tijekom kojih je 0.5 µl pročišćenog virusa visokog titra bilateralno infundiran u vremenskom periodu od 5 min, nakon čega je uslijedio dodatni 5 min post-infuzijski period odmora. Sve udaljenosti se mjere u odnosu na Bregmu: 10 ° kut, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 dana nakon operacije, životinjama je dana jedna IP injekcija 10 mg / kg kokaina u komorama za lokomotorno praćenje kako bi se procijenili efekti ponašanja prekomjerne ekspresije ΔFosB. 24 hr nakon ove završne injekcije, štakori su odsečeni glave prema per eksperiment 2i mikrodisekcija tkiva je izvedena pod fluorescentnim mikroskopskim vodičem da bi se dobilo GFP-pozitivno NAc tkivo. Zatim je izvršena Western blotting prema per Eksperiment 2.

Slika 4

ΔFosB je i neophodan i dovoljan za indukciju CaMKIIα zavisne od D1 receptora posredovanog kokainom u NAc ljusci

Eksperiment 10: Uticaj AAV-posredovane ΔJunD preterane ekspresije na ekspresiju proteina zavisnih od kokaina (Slika 4 D – F)

Stereotaksijska injekcija AAV-GFP ili AAV-GFP-ΔJunD izvršena je prema Eksperiment 8. 14 dana nakon operacije, životinjama je davano 10 mg / kg kokaina ili fiziološki rastvor IP jednom dnevno tokom sedam dana u komorama za lokomotorno snimanje. Zabilježeni su lokomotorni odgovori na jednu injekciju kokaina (5 mg / kg IP) ili fiziološke otopine. 24 hr nakon ove završne injekcije, štakori su odsečeni glave, tkivo sakupljeno, i Western blotovi su izvedeni kao u Eksperiment 9.

Eksperiment 11: In Vitro Testovi proteinske kinaze (Slika 5A – D)

Rekombinantni CaMKIIα i ΔFosB su pročišćeni iz ćelija insekata (Brickey i dr., 1990; Jorissen et al., 2007), i testovi protein kinaze (Colbran, 1993), kao što je prethodno opisano. Ukratko, CaMKII je preinkubiran na ledu sa 2.5 µM ​​(ili naznačenom koncentracijom) ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 µM ​​kalmodulina i 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforilacija je inicirana dodavanjem 200 µM ​​ATP sa ili bez [γ-³²P] ATP i dozvoljeno da se nastavi tokom 10 min na sobnoj temperaturi (Slika 5A i B) ili 2 min na ledu (Slika 5C & D). Proizvodi su riješeni Western blottingom (Slika 5A i B) ili autoradiogramom i scintilacionim brojanjem (slika B – D).

Slika 5

ΔFosB je moćan supstrat za CaMKIIα

Eksperiment 12: Identifikacija Ser27 ΔFosB fosforilacije (Fig 5E)

In vitro Kinazni testovi su izvedeni po per eksperiment 11, proteini su razdvojeni pomoću SDS-PAGE, a trake koje odgovaraju ΔFosB izrezane su i podvrgnute tandemskoj masenoj spektrometriji. M / z zadaci odgovarajućih ionskih fragmenata u svim panelima su označeni na vrhu vršnih iona. Nisu svi fragmenti ioni označeni zbog ograničenja prostora. Uopšteno, tekst za oznake jona fragmenta je obojen u crno, osim kada direktno potvrđuju ili dodaju dokaz prisutnosti mesta fosforilacije od interesa, u kom slučaju su označene crvenom bojom. Dokazi za proizvode fragmentacije kičmenog stuba prikazani su u redoslijedu očitavanja fosfopeptida sa detektiranim mjestom ostatka fosforilacije označenim crvenom bojom s oznakom pojedinačne aminokiseline. Numerički opisi uočenih fragmentnih iona su takođe označeni na peptidnoj sekvenci kao b i y ioni. Faktori zumiranja za sekcije m / z osi da bi se pokazali fragmenti jona nižeg intenziteta označeni su na vrhu svakog masenog spektra fragmenta. Fragmentni ioni prikazani na panelu H potvrđuju prisustvo fosforilizirane izoforme Ser27, međutim, unutar mješavine drugih fosforiliranih izoformi na mjestima Ser28, Ser31, Ser34 i Thr37. Prisustvo pa5, pa5-P, pb5 i pb5-P jona jedinstveno potvrđuje fosforilaciju Ser27 ostatka.

Eksperiment 13: Kvantifikacija fosforilacije Ser27 (Fig 5F)

Standardni peptidi su dizajnirani tako da imitiraju fosfo i nefosfo oblike Ser27 ΔFosB. Nakon sinteze i prečišćavanja, svaki “teški” idiotipski peptid je otopljen u puferu za acetonitril / vodu 50 / 50 i poslan na analizu aminokiselina kako bi se odredila apsolutna koncentracija na sintetskom baznom rastvoru peptida. Svaki "teški" peptid je zatim direktno infundiran u 4000 QTRAP maseni spektrometar (MS) kako bi se odredila najbolja energija sudara za MS / MS fragmentaciju i dvije do četiri MRM tranzicije. Zatim, čisti "teški" peptidi su podvrgnuti LCMS na 4000 QTRAP kako bi se osiguralo odvajanje peptida. Instrument je pokrenut u trostrukom kvadrupolnom modu, sa Q1 postavljenim na specifičnu prekursorsku vrijednost m / z (Q1 nije skeniranje), a Q3 postavljen na specifičnu m / z vrijednost koja odgovara specifičnom fragmentu tog peptida. U MRM modu, serija pojedinačnih reakcija (prekursorski / fragmentni ionski prijelazi u kojima je energija sudara podešena da optimizira intenzitet fragmentiranih iona) mjerena je sekvencijalno, a ciklus (tipično 1 – 2 sek) je bio petlja cijelo vrijeme HPLC separacije. MRM tranzicije su određene iz MS / MS spektara postojećih peptida. Potom su izabrane dve tranzicije po peptidu, koje odgovaraju fragmentima jona visokog intenziteta, a energija sudara optimizirana je da maksimizira jačinu signala MRM prijelaza koristeći softver za automatizaciju. Vrhovi koji su rezultat standardnih peptida i ΔFosB uzoraka koji su izloženi CaMKII ili kontroli su zatim upoređeni da bi se odredio apsolutni broj svakog oblika peptida u reakciji. Analiza podataka na LC-MRM podacima vrši se pomoću softvera AB Multiquant 1.1.

Eksperiment 14: Indukcija ΔFosB u CaMKII preterano eksprimirajućim miševima (Slika 5G & H)

Transgeni miševi prekomerno eksprimiraju T286D CaMKII (Mayford i dr., 1996; Kourrich et al., 2012) i divljeg tipa littermates su uzgojeni u odsustvu doksiciklina da bi se omogućila ekspresija transgena. Odrasli miševi su primali 20 mg / kg kokaina ili slane IP jednom dnevno tokom 14 dana. 24 h nakon završne injekcije, životinje su dekapitirane i imunohistokemija i kvantifikacija ΔFosB ekspresije je izvedena kao u eksperiment 4.

Eksperiment 15: Efekti HSV-posredovane ΔFosB prekomerne ekspresije i inhibicije CaMKII na NAc dendritične bodlje (Slika 6A – E)

Odrasli muški miševi (8 sedmice) su stereotaksijski injektirani u NAc sa HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I, ili HSV-GFPAC3I-ΔFosB. U ovim konstruktima, AC3I, inhibitor CaMKII na bazi peptida, spaja se sa C-terminusom GFP. GFPAC3I je kloniran PCR-om koristeći pMM400-vektor koji sadrži GFPAC3I kao uzorak sa sledećim prajmerima: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3'; GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Rezultirajući PCR proizvod je ubačen u p1005 + i p1005 + -Δ FosB vektore koristeći NheI i BspEI lokacije. Konstrukcija je validirana sekvenciranjem. Stereotaksične koordinate su: 10 ° kut, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = -4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfuzija i segmentacija mozga je izvedena po per eksperiment 4.

Analiza kičme izvršena je kako je opisano (Christoffel et al., 2011). Ukratko, dendritički segmenti 50-150 µm udaljeni od soma su nasumično izabrani iz HSV-inficiranih stanica koje izražavaju GFP. Slike su dobijene na konfokalnom LSM 710-u (Carl Zeiss) za morfološku analizu koristeći NeuronStudio sa rayburst algoritmom. NeuronStudio klasificira bodlje kao tanke, gljive ili stubby na osnovu sljedećih vrijednosti: (1) omjer širine i visine, (2) omjer glave i vrata, i (3) promjer glave. Kičme sa vratom mogu se klasifikovati kao tanke ili gljive, a one bez značajnog vrata klasifikuju se kao tvrdoglavi. Kičme sa vratom su označene kao tanke ili gljive na osnovu prečnika glave.

Slika 6

Blokada CaMKII aktivnosti sprečava morfološke i bihejvioralne efekte ΔFosB u NAc

Eksperiment 16: Efekti HSV-posredovane ΔFosB prekomerne ekspresije i CaMKII inhibicije na kokainske odgovore (Fig 6F)

Odraslim muškim miševima ubrizgavali su se virusi po per eksperiment 15, a lokomotorni odgovori na jednu 5 mg / kg injekciju kokaina su mereni po per Eksperiment 9. Lokomotorni podaci se izražavaju kao ukupni prekidi snopa preko 30 min nakon injekcije kokaina.

Dodatne informacije

Animal Housing

Muški pacovi Sprague Dawley (250-275 g; Charles River Laboratories) su bili smešteni u paru. Muški miševi C57BL / 6J sa osam nedelja (The Jackson Laboratory) bili su smešteni u grupi sa najviše pet životinja po kavezu. Sve životinje su naviknute na životinjski objekat za ≥1 sedmicu prije eksperimentalnih manipulacija i smještene u klimatiziranim sobama (23 – 25 ° C) na 12 hr svjetlo / mrak (svjetla u 7: 00 AM) s pristupom hrani i vode ad libitum. Eksperimenti su sprovedeni u skladu sa smjernicama Društva za neuronauku i institucionalnog odbora za njegu i upotrebu životinja (IACUC) na planini Sinaj.

droga

Lijekovi su primijenjeni IP i otopljeni u sterilnom fiziološkom rastvoru, uključujući kokain (5 – 20 mg / kg po 10 µl za miševe, po 1 ml za pacove, NIDA) i SCH 23390 ili etikloprid hidroklorid (0.5 mg / kg po 1 ml, Tocris) . Za stereotaksijsku hirurgiju, miševi su anestezirani sa "koktelom" ketamina (100 mg / kg) i ksilazinom (10 mg / kg) (Henry Schein) u sterilnom fiziološkom rastvoru.

antitela

CaMKIIα (ukupno): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (ukupno): Signalizacija ćelija 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfo-Ser27: Fosforne otopine, 1: 500

GluA1 (ukupno): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statističke analize

Sve statističke analize izvršene su pomoću programskog paketa Prism 6 (GraphPad). Studentski t-testovi su korišteni za sve parne usporedbe (navedene u Rezultati gdje je dana vrijednost t), a za sve višestruke usporedbe korištene su jednosmjerne ANOVA-e (naznačeno u sekciji rezultata gdje je zadana vrijednost F).

Idi:

Rezultati

Kronični kokain izaziva CaMKII u NAc Shell

Mnoge studije su pokazale da MSN u NAc ljusci i jezgri imaju različite biohemijske i fiziološke reakcije na hroničnu izloženost drogama zlostavljanja (Kourrich i Thomas, 2009; Loweth i dr., 2010) i da ove dvije podregije različito regulišu ponašanje koje traži drogu (Ito et al., 2004). Odrediti diferencijalne efekte kokaina na sastojke proteina NAc ljuske vs. Koristili smo Multiplexed Isobaric Tagging (iTRAQ) i tandem masovnu spektroskopiju (MS / MS). Odraslim mužjacima pacova je injiciran IP sa kokainom (20 mg / kg) ili fiziološkom otopinom dnevno tokom 7 dana; 24 h nakon zadnje injekcije, NAc ljuska i jezgra su mikrodisekcionisane (Fig 1A) i zamrznuti. Proteini u ovim uzorcima su zatim kvantifikovani korišćenjem iTRAQ. Sve četiri izoforme CaMKII pokazale su veliko povećanje ekspresije nakon tretmana kokainom koji je bio specifičan za NAc školjku u odnosu na jezgro. Nekoliko proteinskih fosfataza, uključujući PP1 katalitičke i regulatorne podjedinice i PP2A, koje su prethodno bile povezane sa različitim CaMKII supstratima u drugim sistemima (Colbran, 2004), slijedio je sličan obrazac. Ovi nalazi su pružili nove, nepristrasne dokaze da je signalni put CaMKII na vidljiv način regulisan kokainom u NAc.

Da bismo potvrdili ovaj nalaz više kvantitativno, tretirali smo pacove kao gore sa kokainom (u različitim dozama) ili fiziološkom otopinom i mjerili smo lokomotorni odgovor na kokain (5 mg / kg) ili dozirnu dozu fiziološkog rastvora. Ponovljena izloženost 10 mg / kg kokaina dovela je do tipičnog obrasca lokomotorne senzibilizacije (Fig 1B). Daljnje studije ovog režima doziranja otkrile su, primjenom Western blotinga, da ponovljeni kokain inducira CaMKIIα selektivno u NAc ljusci 24 h nakon završne injekcije kokaina (Slika 1C i D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Pored toga, fosforilacija kanonskog CaMKII supstrata Ser831 podjedinice GluA1 receptora AMPA značajno je povećana u NAc ljusci, a ne u jezgru (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), dok je autofosforilacija CaMKIIα Thr286 imala jaku ali ne značajan trend ka indukciji samo u ljusci (Fig 1D). Nekoliko drugih receptora za glutamat nije bilo zahvaćeno. Za razliku od ovih mjera CaMKII, isti uzorci tkiva prikazali su indukciju ΔFosB u obje ljuske (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) i jezgru (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) NAc (\ TSlika 1C i D), u skladu sa prethodnim nalazima (Perrotti i drugi, 2008).

Budući da je nekoliko prethodnih studija kokainske regulacije AMPA receptora analiziralo životinje nakon N 14 dana povlačenja iz kroničnog kokaina (vidi Diskusiju), ponovili smo ove biokemijske analize u ovom trenutku. Otkrili smo da, 14 dana nakon završne injekcije kokaina, ΔFosB ostaje povišen u NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), dok ni CaMKII ni fosforilacija GluA1 Ser831 ostaje povećana (Fig 1E). Međutim, 1 h nakon jedne 10 mg / kg izazovne doze kokaina, nivoi ukupnog CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) i GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforilacija su povišene do stepena sličnog onome koji je pronađen nakon početnog hroničnog izlaganja kokainu (Fig 1E). Ovi podaci ukazuju na to da su neuroni NAc ljuske pripremljeni za indukciju CaMKII tokom produženih perioda apstinencije, možda putem direktnog primovanja promotora CaMKII gena (vidi diskusiju). Štaviše, činjenica da je indukcija ΔFosB perzistentnija od indukcije CaMKII ukazuje na postojanje dodatnih mehanizama, bez obzira na to da li je baziran na kromatinu ili na drugi način, koji imaju „kočnicu“ na regulaciju CaMKII, kao što je opisano u diskusiji.

Da bismo dodatno ojačali ova opažanja, istražili smo modele samo-administracije kokaina, koji uključuju voljni unos droge. Odraslim mužjacima pacova je dat ili kratak ili dugačak pristup kokainu; kao što je očekivano (Ahmed i Koob, 1998), samo dugi uslovi pristupa doveli su do eskalacije samouprave lijeka (Fig 2A). ΔFosB je bio indukovan u većoj mjeri dugotrajno vs. kratak pristup kokainu u obje NAc ljuske (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) i jezgra (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Nasuprot tome, CaMKIIα je indukovan u NAc ljusci samo dugim pristupom kokainu (Slika 2B i C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Zanimljivo je usporediti prosječni dnevni unos kokaina kod životinja kratkog pristupa (12 mg / kg IV), životinja sa dugim pristupom (70 mg / kg IV) i životinja koje su primile eksperimente (10 mg / kg), i pitati zašto potonji izaziva snažnu indukciju ΔFosB i CaMKII dok kratki pristup ne. Ova razlika je vjerovatno posljedica razlika u vršnim razinama kokaina (kokain koji se primjenjuje na eksperimentu daje se kao jedan bolus IP, dok se kokain koji se primjenjuje samostalno daje putem višestrukih IV doza), ili razlikama u dužini izloženosti lijeku (7 dana za eksperimentatora administracije, 19 dana za samoupravu).

Uprkos velikoj literaturi o ΔFosB i CaMKII u djelovanju kokaina, nema istraživanja ovih proteina kod korisnika kokaina. Ovdje predstavljamo prvi dokaz da su razine i ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) i CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) povećane u NAc ljudi ovisnih o kokainu (Fig 2D, Tabela 1). Ovi podaci ukazuju da je naše ispitivanje ΔFosB i CaMKII indukcije kokainom kod glodara NAc klinički relevantno za ovisnost o kokainu.

Tabela 1

Karakterizacija uzoraka od ovisnika o ljudskom kokainu i usklađene kontrolne grupe

ΔFosB reguliše transkripciju CaMKII selektivno u MSN-ovima tipa D1 iz NAc Shell-a

Nalaz da su i CaMKII i ΔFosB regulirani kokainom u NAc glodara, doveli su nas do toga da odredimo da li ΔFosB može regulirati transkripciju CaMKII gena. Prethodno smo naveli CaMKIIα kao moguću metu za ΔFosB u nepristrasnoj mikroarjskoj analizi NAc (McClung i Nestler, 2003), ali ovaj nalaz nije dalje potvrđen u toj studiji. Prvo smo koristili kvantitativni ChIP (qChIP-ChIP praćen kvantitativnim PCR-om) kako bismo utvrdili da li se ΔFosB veže za CaMKIIα promotor gena u NAc odraslih mužjaka pacova, i utvrdili da je ovo vezanje značajno povećano kod kronične administracije kokaina u ljusci ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), ali ne i jezgro, podregija (Fig 3A). Da bi se dalje razumeli mehanizmi vezani za ovu subregion-specifičnu razliku u ΔFosB vezivanju za CaMKIIα promotor, koristili smo qChIP za karakterizaciju stanja modifikacija histona u ovoj genomskoj regiji. Prethodne studije pokazale su indukciju H3 acetilacije kokainom na CaMKIIα promotoru u ukupnom NAc miša (Wang et al., 2010). Nasuprot tome, otkrili smo da kokain smanjuje H3 acetilaciju na CaMKIIα promotoru selektivno u NAc jezgri (Fig 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), bez ikakvih promjena u ljusci, u skladu sa subregion-specifičnim promjenama kromatina izvan ΔFosB vezivanja. qCHIP za represivni znak, dimetilirani H3 lizin 9 (H3K9me2), otkrio je trendove smanjenja i u pod-okvirima ljuske i jezgre (Fig 3C).

Da bi se utvrdilo da li ΔFosB reguliše transkripciju CaMKIIα in vivo, koristili smo dvije bitransgenične linije miša koje inducibno prekomjerno eksprimiraju ΔFosB posebno u D1 vs. MNS tipa D2 na način kontroliran administracijom doksiciklina u vodi za piće (Chen et al., 1998; Kelz i dr., 1999; Werme i dr., 2002). Odrasli mužjaci miševa koji su prekomerno eksprimirali ΔFosB isključivo u MSN-ovima tipa D1 imali su značajno povišene nivoe CaMKIIα mRNA u NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), efekat koji nije primećen kod miševa koji prekomerno eksprimiraju ΔFosB pretežno u MSNX tipaFig 3D). Povećanje mRNA CaMKIIα, indukovano ekspresijom ΔFosB u MSN-ovima tipa D1, praćeno je istovremenim povećanjem CaMKIIα proteina u obe ljuske NAc (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) i jezgra (p = 0.0392; t Df = 2.275; Sl. 3E i F). Ovi podaci pokazuju da je ΔFosB sposoban da izazove ekspresiju CaMKIIα gena u MSN-ovima tipa D1 u obe podregije, iako Slika 3B sugerira da promjene kromatina uzrokovane kokainom na CaMKIIα promotoru (npr. smanjenoj acetilaciji) sprečavaju da ΔFosB regulira CaMKII u središnjoj subregiji nakon kokaina.

Budući da su naši podaci o transgenim mišima ukazali da je ΔFosB indukcija ekspresije gena CaMKII specifična za MSN tipa D1 u NAc, dalje smo pokušali utvrditi da li kokuinski zavisna regulacija CaMKII zahtijeva aktivaciju D1 dopaminskog receptora. Odraslim mužjacima pacova davani su hronični kokain ili fiziološka otopina kao i ranije, ali 30 minuta pre svake injekcije, pacovima iz grupe kokaina davana je IP injekcija fiziološke otopine, D1 antagonist SCH 23390 (0.5 mg / kg) ili antagonist D2 receptora etikloprid (0.5 mg / kg). Životinje su analizirane 24 sata nakon posljednje injekcije kokaina. Western blotting otkriva da je antagonist D1, ali ne i D2, u potpunosti blokirao porast ΔFosB posredovanog kokainom (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), kako je ranije objavljeno (Nye et al., 1995), kao iu CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Slika 3G i H). Ovi podaci potkrepljuju hipotezu da kokain uključuje ΔFosB-posredovano povećanje ekspresije CaMKII gena posebno u MSN-ovima tipa D1 u NAc ljusci. U budućim studijama bilo bi važno da se direktno pokaže ovaj specifični efekat kokaina na tip ćelije na ekspresiju CaMKII unutar ovog područja mozga.

ΔFosB je neophodan i dovoljan za indukciju kokaina CaMKII u NAc ljusci

Da bi se upotpunila upotreba bitransgeničnih miševa, zatim smo proučavali ulogu ΔFosB u posredovanju indukcije CaMKIIa kokaina upotrebom virusnog prenosa gena kod pacova. Mi smo bilateralno ubrizgali adeno-povezane virusne (AAV) čestice u NAc ljusku odraslih mužjaka pacova (gde se ljuska može selektivno ciljati) da prekomerno eksprimiraju ΔFosB plus GFP ili GFP sam. Životinje su zatim primile jednu IP injekciju 10 mg / kg kokaina. Životinje koje su prekomjerno eksprimirale ΔFosB / GFP pokazale su povećan lokomotorni odgovor u odnosu na životinje koje su prekomjerno eksprimirale GFP sam (Fig 4A). 24 hr nakon pojedinačne injekcije kokaina, GFP-pozitivna NAc tkiva su izrezana iz tih životinja disekcijom pod fluorescentnim izvorom svjetlosti. Western bloting ovog tkiva (Slika 4B i C) otkrila je jaku prekomernu ekspresiju ΔFosB, kao i značajno povećanje ukupnog CaMKIIα proteina u poređenju sa GFP životinjama (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), slično indukciji koja se vidi kod hronične primene kokaina. Osim toga, CaMKIIα autofosforilacija na Thr286 (indikator aktivacije enzima) je povećana prekomjernom ekspresijom ΔFosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), kao i fosforilacija CaMKII supstrata, Ser831 od GluA1 (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), opet oponašajući hronični kokain (Slika 1C i D). Tzajedno, ovi podaci pružaju dodatne dokaze da je ekspresija ΔFosB u ljusci NAc dovoljna za senzitivizaciju lokomotora na kokain i za indukciju i aktivaciju CaMKII u ovoj podregiji.

Koristili smo sličan pristup kako bismo odredili da li je ΔFosB neophodan i za indukciju CaMKIIα posredstvom kokaina u NAc ljusci. AAV je korišten za prekomjernu ekspresiju skraćenog JunD proteina, nazvanog ΔJunD, koji je negativni regulator ΔFosB transkripcijske aktivacije (Winstanley i dr., 2007) plus samo GFP ili GFP. Dve nedelje kasnije, kada je ekspresija transgena maksimalna, životinje su dobijale kokain (10 mg / kg) ili fiziološki rastvor dnevno tokom 7 dana, i testirane na lokomotorni odgovor na izazivanje kokaina (5 mg / kg) 24 h nakon poslednjeg hroničnog ubrizgavanja (Fig 4D). ΔJunD prekomjerna ekspresija spriječila je lokomotornu senzibilizaciju na kokain, a također je spriječila CaMKIIα indukciju i aktivaciju u NAc ljusci (Slika 4E i F; p = 0.0437; F = 2.997; ukupno df = 38), što ukazuje da je ΔFosB transkripciona aktivnost neophodna za indukciju CaMKIIa posredovanu kokainom u ovoj podregiji. Interesantno je da smo otkrili da ΔJunD smanjuje nivo ΔFosB u uslovima fiziološkog i kokainskog tretmana (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), povećavajući novu mogućnost da ΔFosB zavisi od AP-1 aktivnosti za sopstvene nivoe ekspresije.

CaMKII Fosforilati ΔFosB na Ser27

korišćenje in vitro Testovi kinaze proteina, utvrdili smo da je prečišćeni ΔFosB robustan supstrat za CaMKIIα. Inkubacija Njegovog₆-ΔFosB sa CaMKIIα i ATP uzrokovali pomak prema gore u elektroforetskoj pokretljivosti ΔFosB (Fig 5A); nekoliko rezultirajućih bendova ukazalo je na više mjesta fosforilacije. Slično in vitro testovi kinaze pomoću [γ-³²P] ATP je pokazao inkorporaciju radioaktivno obilježenog fosfata u pomaknute ΔFosB trake (Fig 5B), pokazujući direktnu fosforilaciju proteina. Generisali smo fosfo-specifično antitelo na prethodno okarakterisani Ser27 ΔFosB (Ulery i dr., 2006). Iako ovo antitelo ne proizvodi signal protiv ekstrakta mozga koji sadrže Ser27-fosforilirani ΔFosB (podaci nisu prikazani), bili smo u mogućnosti da detektujemo fosforilaciju Ser27 u in vitro ispitivanje kinaze pomoću CaMKII (Fig 5B). Kinetička analiza CaMKII fosforilacije ΔFosB ukazuje da je ona moćan supstrat za kinazu (Fig 5C), sa očiglednim K_M 5.7 ± 2.0µM i K_CAT od 2.3 ± 0.3min^-1. Ovi rezultati su uporedivi sa mnogim dobro okarakterisanim in vivo supstrati CaMKII (Colbran i Brown, 2004). Pored toga, utvrdili smo da CaMKII fosforilira ΔFosB sa stehiometrijom 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), ukazujući da postoje najmanje tri mesta fosforilacije CaMKII unutar His-a₆-ΔFosB protein, u skladu sa Fig 5A.

Da bismo istražili pojedinačne lokacije fosforilacije, koristili smo MS analize uzoraka iz naše in vitro testovi kinaze. Fig 5E pokazuje ΔFosB fosforilaciju na prethodno okarakterisanim Ser27 i na nekoliko dodatnih lokacija (podaci nisu prikazani). S obzirom na prethodnu funkcionalnu karakterizaciju Ser27-a, fokusirali smo se na ovo mjesto generiranjem obilježenih sintetskih peptida koji oponašaju fosfo- i nefosfo-stanja Ser27-a, a zatim koristili poznate količine ovih peptida kao standarde u MRM analizama ΔFosB prije i poslije in vitro fosforilacija CaMKII. Naknadna kvantifikacija (Fig 5F) potvrđuje da je Ser27 moćan supstrat za CaMKII. Ovi rezultati pokazuju da je, između više fosforilisanih ostataka unutar ΔFosB, Ser27 posebno efikasan supstrat za CaMKII.

CaMKII posreduje u kokainu Akumulacija ΔFosB u NAc ljusci

Pošto CaMKII može fosforilisati ΔFosB in vitro na lokaciji koja dramatično povećava njenu stabilnost in vitro i in vivo (Ulery i dr., 2006; Ulery-Reynolds i dr., 2009), utvrdili smo da li aktivnost CaMKII kontrolira ΔFosB nivoe u NAc in vivo. Da bismo odgovorili na ovo pitanje, prvo smo koristili liniju miša koja je prekomerno eksprimirala mutant CaMKIIa (T286D) koji je nezavisan od kalcijuma u više regiona mozga uključujući NAc (Mayford i dr., 1996; Kourrich et al., 2012). Mužjacima i divljim tipovima divljeg tipa koji su odgovarali uzrastu, ubrizgavali smo 20 mg / kg kokaina ili fiziološki rastvor jednom dnevno tokom 14 dana, a zatim smo analizirali životinje dan nakon završne injekcije. Ustanovili smo da su bazalni nivoi ΔFosB povećani kod mutantnih životinja u NAc ljusci (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), ali ne i jezgra (Slika 5G i H). Iznenađujuće, indukcija ΔFosB zavisna od kokaina blokirana je kod mutantnih životinja u ljusci i jezgru, što ukazuje na to da, iako CaMKII može direktno regulirati stabilnost ΔFosB u NAc ljusci, može također ležati uzvodno od ΔFosB u kokain-aktiviranim putevima u obje NAc subregije .

CaMKII aktivnost je potrebna za ΔFosB-posredovanu strukturalnu i bihejvioralnu plastičnost

Indukcija kokaina dendritičnih bodljika na NAc MSNs je jedna od najbolje ustanovljenih adaptacija izazvanih lekovima u ovom području mozga, a takva indukcija kičme je korelirana sa senzibilisanim odgovorima na ponašanje leka (Robinson i Kolb, 2004; Russo i dr., 2010) i prijavljeno da je selektivno za MSN-ove tipa D1 (Lee i saradnici, 2006). Nedavno smo pokazali da je indukcija kokaina dendritičnih bodljika u NAc zavisna od ΔFosB i njegovog nizvodnog transkripcionog programa (Maze et al., 2010). Iako postoji opsežna literatura o uključenosti CaMKII u morfologiju dendritske kičme i indukciju u drugim regijama mozga i eksperimentalnim sistemima (Jourdain i drugi, 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto i dr., 2009), njegova uloga u formiranju kičme NAc MSN nije istražena. Stoga smo utvrdili da li je aktivnost CaMKII potrebna za indukciju ΔFosB induciranih MSN dendritičnih spina pomoću HSV posredovane prekomjerne ekspresije peptida AC3I inhibitora CaMKII spojenog na GFP, konstrukta za koju se ranije pokazalo da inhibira aktivnost CaMKII in vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). Virusna prekomerna ekspresija ΔFosB u NAc ljusci odraslih miševa izazvala je značajan porast MSN dendritične gustine kičme (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Slika 6A i B) kao što je prethodno navedeno (Maze et al., 2010), a ovo povećanje je prvenstveno vođeno tankim (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) i stubby (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) tipovima kičme (oba su smatrana nezrelim bodljama) (Slika 6C – E). Nije bilo efekta na zrelije bodlje u obliku gljiva. Međutim, kada je GFP-AC3I bio koeksprimiran, indukcija ΔFosB bodljama je potpuno ukinuta (Slika 6A – E), što ukazuje na to da je aktivnost CaMKII potrebna za indukciju ΔFosB dendritičnih bodlji u ljusci NAc.

Zatim smo koristili iste viralne alate da utvrdimo da li je aktivnost CaMKII potrebna za efekte ΔFosB-a na osjetljivost na kokain. 72 hr nakon injekcije virusa u NAc ljusku, životinjama je dana jedna injekcija 5 mg / kg kokaina i njihova lokomotorna aktivnost je zabeležena. Kao što je ranije prikazano sa produženom AAV prekomjernom ekspresijom ΔFosB (Fig 4A), HSV posredovana prekomjerna ekspresija ΔFosB povećala je lokomotorsku osjetljivost na kokain (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig 6F). Kao i kod indukcije dendritičnih bodova, inhibicija aktivnosti CaMKII koekspresijom GFP-AC3I potpuno je blokirala povećanje osjetljivosti kokaina posredstvom ΔFosB, ukazujući da je aktivnost CaMKII potrebna za promjene u ponašanju kokaina uzrokovane ΔFosB.

Idi:

rasprava

Ova studija ocrtava novi mehanizam u kojem se kokain inducira ΔFosB u NAc, koji selektivno prepravlja transkripciju CaMKIIα gena u NAc ljusci.. CaMKIIα zatim fosforilira i stabilizira ΔFosB što dovodi do veće akumulacije ΔFosB i dalje indukcije CaMKIIα (Fig 6G). Ko-eskalirajući nivoi dva proteina tokom hroničnog izlaganja kokainu doprinose na bitan način senzibilisanim odgovorima na ponašanje leka. Ovo je posebno privlačna hipoteza jer su i ΔFosB i CaMKII prethodno pokazali da su potrebni za povećane odgovore na kokain (Pierce i dr., 1998; Peakman i dr., 2003), i repliciramo ovaj nalaz za ΔFosB u NAc ljusci specifično koristeći virusni pristup (Figs 4 i And66).

Iako transgenska prekomjerna ekspresija ΔFosB u MSN-ovima tipa D1 može dovesti do indukcije CaMKII u obje ljuske i jezgre NAc životinja na kokainu, u kontekstu kokaina, akumulacija endogenog ΔFosB, koji se javlja u obje podregije, pokreće indukciju CaMKII posebno u NAc ljusci . Ova razlika bi se mogla odnositi na više nivoe ΔFosB induciranog u našem bitransgenskom modelu, međutim, to bi moglo odražavati i sposobnost kokaina da diferencijalno promijeni CaMKIIα promotor u ljusci. vs. jezgra MSN-a da ili promoviraju ΔFosB vezivanje u bivšoj ili ga isključe u potonjoj podregiji. Zapravo, naši ChIP podaci, koji otkrivaju kokainom posredovanu deacetilaciju histona na CaMKIIα genskom promotoru samo u NAc jezgri, podržavaju mogući zahvat mehanizma hromatina. U skladu s ovom hipotezom, prekomjerna ekspresija ΔFosB u MSN-ovima tipa D1 uspjela je inducirati CaMKIIα indukciju u NAc jezgri u odsustvu kokaina (Fig 3F), sugerirajući da postoje aktivne modifikacije CaMKIIα promotora koje sprečavaju ovu indukciju tokom kronične izloženosti kokainu. Regulacija pejzaža kromatina kod promotora CaMKII može takođe objasniti zašto je CaMKII izazvan izazovnom dozom kokaina u NAc ljusci hroničnih pacova koji se povlače iz kokaina (Fig 1E) ali ne i od naivnih životinja (Fig 1D). Ovo bi moglo predstavljati epigenetski efekat ΔFosB-a na primarnu gen.Robison i Nestler, 2011), i može biti jedan molekularni mehanizam inkubacije žudnje za kokainom (Pickens et al., 2011). Međutim, da bi se ova promena kromatina uzročno vezala za inkubaciju žudnje, morala bi se vremenom povećavati. Biće zanimljivo utvrditi da li je to slučaj, i proučiti da li drugi geni pokazuju ΔFosB-ovisnu, subregion-specifičnu regulaciju kokainom. Takođe je važno napomenuti da napojna petlja koju opisujemo ne dovodi do beskrajne akumulacije CaMKII ili ΔFosB (Fig 1E); otkrivanje molekularne “kočnice” odgovorne za ovo je važan cilj budućih studija.

Poznate funkcije ΔFosB i CaMKII u nekoliko eksperimentalnih sistema i regija mozga konvergiraju se na mnogim nivoima (Fig 6F). Obe molekule su blisko povezane sa dendritičkim rastom kičme: CaMKII interagira sa aktinskim citoskeletom (Okamoto i dr., 2009), reguliše veličinu glave kičme (Matsuzaki i dr., 2004), i neophodan je i dovoljan za plastično-indukovano povećanje filopodije i broja sinapsi u hipokampalnim organotipskim kulturama kriške (Jourdain i drugi, 2003), whil ΔFosB je i neophodan i dovoljan za dendritsku formaciju kičme izazvanu kokainom u NAc MSNs (Maze et al., 2010). Pored toga, oba molekula povezana su sa regulacijom receptora glutamata AMPA. CaMKII ne regulira ukupne nivoe podjedinica AMPA receptora, ali pokreće umetanje AMPA receptora u sinapse i povećava provodljivost AMPA kanala fosforilacijom GluA1 na Ser831 u hipokampalnim piramidnim neuronima u kulturi i in vivo (pregledano u (Malinow i Malenka, 2002; Colbran i Brown, 2004)). Takva povećana trgovina GluA1-om sinapsi je uključena iu kroničnu aktivnost kokaina (Boudreau i Wolf, 2005). Štaviše, reakcije ponašanja na aktivaciju AMPA receptora u NAc pojačane su prekomjernom ekspresijom CaMKIIα na način zavisan od D1 dopamin receptora (Singer i dr., 2010). Pokazalo se da dugotrajna D1-specifična prekomjerna ekspresija ΔFosB inducira GluA2 transkripciju u NAc (Kelz i dr., 1999), koji umanjuje reakcije AMPA posredovane putem GluA1-a, dok ovdje pokazujemo da kratkotrajna ΔFosB prekomjerna ekspresija - kao i kratkoročna izloženost kokainu - nemaju učinka na ovu podjedinicu (Fig 1). Ipak, nedavno smo otkrili da kratkoročna ΔFosB prekomjerna ekspresija ipak smanjuje AMPA odgovore u D1 tipovima MSN u NAc (Grueter i dr., 2013). Ovi podaci sugerišu vremenski različite mehanizme koji mogu predstavljati seriju neuroadaptacija koje zavise od vremena do kokaina i koje su u osnovi različitih aspekata progresije zavisnosti koji još nisu dobro shvaćeni. Na nivou ponašanja, i CaMKII i ΔFosB su potrebni za lokomotornu senzibilizaciju prema kokainu (vidi gore), a oba su potrebna za kontinuiranu kokainsku samoupravu kod glodara (Colby i drugi, 2003; Wang et al., 2010), sugerirajući da su ova dva proteina važna i za kratkoročne i dugoročne prilagodbe ponašanja izloženosti lijekovima, iako putem djelimično različitih mehanizama. Pretpostavlja se da ΔFosB i CaMKII regulišu tako kompleksne prilagodbe ponašanja kroz promjene u NAs sinaptičkoj funkciji, iako je potrebno mnogo daljeg rada kako bi se sinaptičke pojave direktno povezale s promjenom ponašanja.

CaMKII holoenzim istovremeno stupa u interakciju sa različitim proteinima povezanim sa sinapsi (Robison i dr., 2005) za koje se smatra da regulišu njegovo ciljanje na postsinaptičnu gustinu (PSD), fenomen za koji se pretpostavlja da je važan za sinaptičku plastičnost. Naročito je pokazano da interakcija CaMKII sa podjedinicom GluN2B glutamatnog receptora tipa NMDA reguliše i sinaptičku plastičnost i učenje (Halt et al., 2012). Dok AC3I peptid oponaša autoinhibitorni domen CaMKII, i tako inhibira katalitičku aktivnost enzima, on također blokira višestruke interakcije proteina i proteina (Strack i dr., 2000; Robison i dr., 2005). Prema tome, bihevioralni i morfološki efekti HSV-GFP-AC3I prijavljenih ovdje mogli bi se pojaviti kroz smanjenu fosforilaciju CaMKII ciljnih proteina, promjene u CaMKII ciljanju, ili promjenu u predloženoj strukturnoj ulozi CaMKII na sinapsama (Lisman i dr., 2002).

Ograničenje predložene ΔFosB-CaMKII petlje na NAc ljusci je posebno zapaženo, jer su nedavni radovi pokazali nekoliko fizioloških razlika između NAc ljuske i jezgre kao odgovor na administraciju kokaina, što je potvrđeno našim nepristrasnim iTRAQ (Tabela S1) podacima . MSN-ovi u NAc ljusci pokazuju depresiju kapaciteta paljenja nakon kroničnog kokaina koji se održava tjednima, dok osnovne MSN poruke istih životinja pokazuju prolazno (1 – 3 dan) povećanje kapaciteta paljenja koje se vraća na bazalne razine u 2 tjedana (Kourrich i Thomas, 2009). Pored toga, brojni sinaptički proteini su različito regulisani u NAc ljusci vs. jezgra životinja izloženih kroničnom kokainu, uključujući GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Kako hronični amfetamin indukuje CaMKIIα posebno u NAc ljusci (Loweth i dr., 2010), nije iznenađujuće da sličan efekat nalazimo kod kokaina. Međutim, kako je ΔFosB indukovan iu NAc ljusci iu jezgru hroničnim kokainom (Perrotti i drugi, 2008), i pošto smo pokazali da CaMKIIα indukcija u školjci je zavisna od ΔFosB, naši nalazi pružaju nove dokaze za različite transkripcione mehanizme na CaMKIIα promotoru između ove dvije podregije, koje su odgovorne za selektivnu indukciju CaMKIIα u ljusci.

Veliki broj nedavnih radova fokusiran je na ocrtavanje razlika između NAX MSN-ova tipa D1 i D2. Iako su i receptori D1 i D2 uključeni u nagrađivanje kokaina (Self, 2010), nedavni rad pokazuje da optogenetska aktivacija MSN D1 tipa povećava reakcije ponašanja na kokain, dok MSN aktivacija tipa D2 ima suprotan efekat (Lobo i drugi, 2010). U skladu sa ovim nalazima, miševi koji nokautiraju D1-receptor su deficitarni u sticanju kokainske samouprave (Caine et al., 2007), dok D2 nokaut nisu (Caine et al., 2002). Administracija D1 agonista direktno u NAc aktivira ponašanje koje traži kokain u paradigmama za ponovno uspostavljanjeSelf, 2010). Interesantno je da ovaj efekat zahteva povećanje zavisnosti CaMKII-a od D1-receptora u NAc ljusci, ali ne i jezgru (Anderson i dr., 2008), rezultat koji se dobro slaže sa D1- i specifičnom -FosB-CaMKII petljom predloženom ovdje.

Prethodno smo izvijestili da se Ser27 u ΔFosB može fosforilirati kazeinom kinaza-2 (Ulery i dr., 2006), međutim, ovdje utvrđujemo da CaMKII fosforilira ΔFosB na ovom i drugim mjestima s daleko većom kinetikom i stehiometrijom i može replicirati višu očitu M_r uočeno za ΔFosB (Fig 5A) sa izlaganjem kokainu in vivo (Nestler, 2008). Već znamo da Ser27 fosforilacija povećava stabilnost ΔFosB i aktivnost transkripcije (Ulery i dr., 2006; Ulery i Nestler, 2007; Ulery-Reynolds i dr., 2009). Budući rad će se sada fokusirati na identifikaciju i funkcionalne posljedice novih mjesta ΔFosB fosforilacije naznačenih u ovoj studiji.

Opisana petlja naprijed-natrag pruža uvjerljiv novi mehanizam pomoću kojeg ponovna primjena kokaina pokreće progresivne abnormalnosti u NAc. Kao takav, ovaj biohemijski put može pružiti važan cilj za buduće terapeutske intervencije kod poremećaja ovisnosti. Pošto je CaMKII sveprisutan i potreban za mnoge bazalne neuronske i bihevioralne funkcije, direktna upotreba CaMKII inhibitora je izbegnuta kao tretman zavisnosti. Naši podaci sugerišu da suptilnije ciljanje mehanizma CaMKII indukcije, koje je specifično za pojedinačni tip ćelija i subregion mozga, može da obezbedi terapeutski cilj koji bi izbegao komplikacije sistemske inhibicije CaMKII.

Idi:

Priznanja

Ovaj rad je podržan grantovima Nacionalnog instituta za zloupotrebu droga (EJN), NIDA-Yale Centra za proteomiku DA018343 (AJR i EJN) i Hartwell Fondacije (AJR). Autori bi željeli zahvaliti Gabby Rundenko za velikodušni dar pročišćenog ΔFosB i Rogera Colbrana za velikodušan dar pročišćenog CaMKIIα.

Idi:

reference

1. Ahmed SH, Koob GF. Prelazak sa umerenog na preteran unos leka: promena u hedoničnoj vrednosti. Nauka. 1998: 282: 298 – 300. [\ TPubMed]
2. Anderson SM, Famous KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: biohemijski most koji povezuje dopuminske i glutamatne sisteme u traženju kokaina. Nat Neurosci. 2008: 11: 344 – 353. [\ TPubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Bihevioralna senzibilizacija na kokain povezana je sa povećanom ekspresijom AMPA receptora u nucleus accumbens. J Neurosci. 2005: 25: 9144 – 9151. [\ TPubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Ekspresija i karakterizacija alfa-podjedinice proteinske kinaze II zavisne od Ca2 + / kalmodulina pomoću sistema ekspresije bakulovirusa. Biochem Biophys Res Commun. 1990: 173: 578 – 584. [\ TPubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Uloga dopaminskih D2 receptora u samokontroli kokaina: studije sa mutantnim miševima receptora D2 i novim D2 receptorom antagonisti. J Neurosci. 2002: 22: 2977 – 2988. [\ TPubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Nedostatak samoprimjene kokaina u dopamin D1 receptoru nokaut-miševa. J Neurosci. 2007: 27: 13140 – 13150. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasom-ovisni i neovisni mehanizmi za destabilizaciju FosB-a: identifikacija FosB degron domena i implikacije za stabilnost DeltaFosB-a. Eur J Neurosci. 2007: 25: 3009 – 3019. [\ TPubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgene životinje sa inducibilnom ekspresijom gena u mozgu. Mol Pharmacol. 1998: 54: 495 – 503. [\ TPubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Ruso SJ. IkappaB kinaza reguliše društveni poraz sinaptičke i bihevioralne plastičnosti izazvane stresom. J Neurosci. 2011: 31: 314 – 321. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inaktivacija proteinske kinaze II zavisne od Ca2 + / kalmodulina bazalnom autofosforilacijom. J Biol Chem. 1993: 268: 7163 – 7170. [\ TPubMed]
11. Colbran RJ. Proteinska fosfataza i sinaptička plastičnost zavisna od protein kinaze II zavisna od kalcij / kalmodulin. J Neurosci. 2004: 24: 8404 – 8409. [\ TPubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Protein kinaza II zavisna od kalcijuma i kalmodulina i sinaptička plastičnost. Curr Opin Neurobiol. 2004: 14: 318 – 327. [\ TPubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Striatalna tipska prekomjerna ekspresija DeltaFosB-a povećava poticaj za kokain. J Neurosci. 2003: 23: 2488 – 2493. [\ TPubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Antidepresivno djelovanje inhibitora histon deacetilaze. J Neurosci. 2009: 29: 11451 – 11460. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Kvantitativna proteomika proteina regulisanih caveolin-1-om: karakterizacija polimeraze i faktora oslobađanja transkripta / CAVIN-1 IN endotelnih stanica. Mol Cell Proteomics. 2010: 9: 2109 – 2124. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Faktori rizika za završetak samoubistva u velikoj depresiji: studija slučaja kontrole impulsivnog i agresivnog ponašanja u ljudi. Am J Psychiatry. 2005: 162: 2116 – 2124. [\ TPubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, RC Malenka. ΔFosB diferencijalno modulira nukleus accumbens direktnu i indirektnu funkciju puta. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 u štampi. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. CaMKII vezivanje za GluN2B je kritično za vrijeme konsolidacije memorije. EMBO J. 2012; 31: 1203 – 1216. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Mutirani miševi FosB: gubitak hronične indukcije kokaina proteina povezanih s Fosom i povećana osjetljivost na psihomotorne i korisne efekte kokaina. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC besplatan članak] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Nuklearna akumbensova jezgra i ljuska diferencijalna kontrola ponašanja koje traži kokain. Nat Neurosci. 2004: 7: 389 – 397. [\ TPubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerizacija i svojstva vezivanja DNA faktora transkripcije DeltaFosB. Biochemistry. 2007: 46: 8360 – 8372. [\ TPubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Protein kinaza II zavisna od kalcija / kalmodulina doprinosi rastu filopodije i formiranju kičme ovisne o aktivnosti. J Neurosci. 2003: 23: 10645 – 10649. [\ TPubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Ekspresija transkripcionog faktora deltaFosB u mozgu kontrolira osjetljivost na kokain. Priroda. 1999: 401: 272 – 276. [\ TPubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genetička inhibicija CaMKII u dorzalnom stratalnom mediju Spiny Neurons smanjuje funkcionalne ekscitatorne sinapse i povećava unutrašnju ekscitabilnost. PLoS One. 2012: 7: e45323. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Trening ekstinkcije nakon samo-administracije kokaina izaziva glutamatergičnu plastičnost da inhibira traženje kokaina. J Neurosci. 2010: 30: 7984 – 7992. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Slični neuroni, suprotne adaptacije: psihostimulantno iskustvo diferencijalno mijenja svojstva paljenja u akumbens jezgru u odnosu na ljusku. J Neurosci. 2009: 29: 12275 – 12283. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-Nezavisni efekat Striatal alphaCaMKII promovira senzitizaciju nagrade za kokain. J Neurosci. 2012: 32: 6578 – 6586. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Uloga nuklearnog faktora kappaB u stresnoj hipersenzitivnosti stresnog hormona kod ženki miševa. Biol Psychiatry. 2009: 65: 874 – 880. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Stvaranje dendritske kičme izazvane kokainom u D1 i D2 dopaminskim receptorima koji sadrže srednje štitne neurone u nucleus accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399 – 3404. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Molekularna osnova CaMKII funkcije u sinaptičkoj i bihevioralnoj memoriji. Nat Rev Neurosci. 2002: 3: 175 – 190. [\ TPubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Specifični gubitak tipa BDNF-a za tip ćelije oponaša optogenetsku kontrolu nagrade za kokain. Nauka. 2010: 330: 385 – 390. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibicija CaMKII u ljusci nucleus accumbens smanjuje pojačani unos amfetamina u senzibilisane pacove. Neurosci Lett. 2008: 444: 157 – 160. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr., Neve RL, Vezina P. Prolazna prekomjerna ekspresija alfa-Ca2 + / kalmodulina zavisna protein kinaza II u shellus nucleus accumbens poboljšava ponašanje u ponašanju prema amfetaminu. J Neurosci. 2010: 30: 939 – 949. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. Trgovina AMPA receptorima i sinaptička plastičnost. Annu Rev Neurosci. 2002: 25: 103 – 126. [\ TPubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Strukturna osnova dugoročnog potenciranja u pojedinačnim dendritskim bodljama. Priroda. 2004: 429: 761 – 766. [\ TPubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Kontrola formiranja memorije putem regulisane ekspresije transgena CaMKII. Nauka. 1996: 274: 1678 – 1683. [\ TPubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Bitna uloga histonske metiltransferaze G9a u plastičnosti izazvanoj kokainom. Nauka. 2010: 327: 213 – 216. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Regulacija ekspresije gena i nagrade kokaina od strane CREB i DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003: 6: 1208 – 1215. [\ TPubMed]
39. Nestler EJ. Pregled. Transkripcijski mehanizmi zavisnosti: uloga DeltaFosB-a. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008: 363: 3245 – 3255. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakološke studije regulacije kronične indukcije antigena povezane s FOS kokainom u striatumu i nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995: 275: 1671 – 1680. [\ TPubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Uloge CaMKII i F-aktina u strukturalnoj plastičnosti dendritičnih bodova: potencijalni molekularni identitet sinaptičke oznake? Fiziologija (Bethesda) 2009; 24: 357 – 366. [\ TPubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB u nucleus accumbens reguliše instrumentalno ponašanje i motivaciju ojačanu hranom. J Neurosci. 2006: 26: 9196 – 9204. [\ TPubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Mozak pacova u stereotaksičnim koordinatama. 6th Edition. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducibilna, specifična ekspresija dominantnog negativnog mutanta c-Jun-a u transgenim miševima mozga smanjuje osjetljivost na kokain. Brain Res. 2003: 970: 73 – 86. [\ TPubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Konvergentni CaMK i RacGEF signali kontroliraju dendritsku strukturu i funkciju. Trends Cell Biol. 2008: 18: 405 – 413. [\ TPubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Indukcija deltaFosB u moždanim strukturama povezanim sa nagradom nakon hroničnog stresa. J Neurosci. 2004: 24: 10594 – 10602. [\ TPubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Različiti obrasci indukcije DeltaFosB u mozgu putem droga zloupotrebe. Synapse. 2008: 62: 358 – 369. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiologija inkubacije žudnje za drogom. Trends Neurosci. 2011: 34: 411 – 420. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Drugi glasnici posredovani kalcijem moduliraju izražavanje senzibilizacije ponašanja na kokain. J Pharmacol Exp Ther. 1998: 286: 1171 – 1176. [\ TPubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Autoradiografija receptora ljudskog mozga korištenjem cijelog dijela hemisfere: opći metod koji minimizira artefakte tkiva. Synapse. 1987: 1: 446 – 454. [\ TPubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Strukturna plastičnost povezana sa izloženošću drogama. Neuropharmacology. 2004 (47): 1 – 33. [\ TPubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkripcijski i epigenetski mehanizmi ovisnosti. Nat Rev Neurosci. 2011: 12: 623 – 637. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Multivalentne interakcije protein kinaze II zavisne od kalcijuma / kalmodulina sa proteinima postsinaptičke gustine NR2B, densin-180 i alfa-aktinin-2. J Biol Chem. 2005: 280: 35329 – 35336. [\ TPubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Multipleksirana kvantifikacija proteina u Saccharomyces cerevisiae upotrebom aminoreaktivnih izobaričnih reagensa za obilježavanje. Mol Cell Proteomics. 2004: 3: 1154 – 1169. [\ TPubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Ovisni sinapsi: mehanizmi sinaptičke i strukturne plastičnosti u nucleus accumbens. Trends Neurosci. 2010: 33: 267 – 276. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
56. Self DW. U: The Dopamine Receptors. Neve KA, urednik. New York: Humana Press; 2010. 479 – 524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Prelazna prekomjerna ekspresija alfa-kalcij / kalmodulin zavisne proteinske kinaze II u ljusci nucleus accumbens uzrokuje dugotrajnu funkcionalnu regulaciju alfa-amino-3-hidroksil-5 -metil-4-izoksazol-propionatni receptori: receptor dopaminskog tipa-1 i zavisnost od protein kinaze A. Eur J Neurosci. 2010: 31: 1243 – 1251. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mehanizam i regulacija ciljanja protein kinaze II zavisne od kalcij / kalmodulin na podjedinicu NR2B receptora N-metil-D-aspartata. J Biol Chem. 2000: 275: 23798 – 23806. [\ TPubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforilacija DeltaFosB posreduje njenu stabilnost in vivo. Neuroscience. 2009: 158: 369 – 372. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Regulacija transkripcijske aktivnosti DeltaFosB fosforilacijom Ser27. Eur J Neurosci. 2007: 25: 224 – 230. [\ TPubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Regulacija stabilnosti DeltaFosB fosforilacijom. J Neurosci. 2006: 26: 5131 – 5142. [\ TPubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB u krugovima nagrađivanja mozga posreduje otpornost na stres i antidepresivne reakcije. Nat Neurosci. 2010: 13: 745 – 752. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Hronična kokainom indukovana H3 acetilacija i transkripcijska aktivacija CaMKIIalpha u nucleus accumbens je kritična za motivaciju za pojačanje droge. Neuropsychopharmacology. 2010: 35: 913 – 928. [\ TPMC besplatan članak] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB regulira rad kotača. J Neurosci. 2002: 22: 8133 – 8138. [\ TPubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB indukcija u orbitofrontalnom korteksu posreduje u toleranciji kokain-indukovane kognitivne disfunkcije. J Neurosci. 2007: 27: 10497 – 10507. [\ TPubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Bitna uloga za DeltaFosB u nucleus accumbens u morfinu. Nat Neurosci. 2006: 9: 205 – 211. [\ TPubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Cijena EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Inhibicija kalmodulin kinaze II štiti od strukturnih bolesti srca. Nat Med. 2005: 11: 409 – 417. [\ TPubMed]