izvor
Institut Nathan Kline, Orangeburg, New York, 10962, SAD. [email zaštićen]
sažetak
Djeca i adolescenti su sve više izloženi psihostimulansima, bilo nezakonito ili za liječenje uobičajenih neuropsihijatrijskih stanja, kao što je poremećaj deficita pažnje sa i bez hiperaktivnosti. Uprkos širokoj upotrebi psihomotornih stimulansa u mlađim dobnim skupinama, malo se zna o hroničnim molekularnim neuroadaptivnim odgovorima na ove agense u nezrelom mozgu. Ovde ćemo pokazati da, posle hronične primene psihostimulansa Kokain i amfetamin, faktor transkripcije DeltaFosB je regulisan u nucleus accumbens periadolescent miševi ali ne u post-weanling ili odrasle osobe miševi. Indukcija DeltaFosB javlja se isključivo u kaudatnom putamenu periadolescent miševi nakon amfetamin uprave. Ovi rezultati pokazuju jedinstvenu plastičnost u adolescentskom mozgu kritičnog molekula koji reguliše psihostimulantno delovanje i ukazuju na to da ove neuroadaptivne promene mogu biti uključene u posredovanje poboljšano sklonosti ovisnosti kod adolescenata u odnosu na odraslu osobu.
Uvod
Psihostimulansi se koriste u liječenju uobičajenih poremećaja u djetinjstvu, kao što je poremećaj hiperaktivnosti s nedostatkom pažnje. Pored toga, zloupotreba stimulansa, uključujući amfetamine i kokain, je uobičajena među adolescentima, starosti u kojoj postoje dokazi o pojačanim sklonostima zavisnosti u odnosu na odrasle (Estroff i dr., 1989; Myers i Anderson, 1991). Uprkos podacima koji ukazuju na razvojno regulisane bihevioralne efekte, malo je poznato u vezi molekularnih neuroadaptivnih odgovora u nezrelom mozgu koji se javljaju u vreme primene ovih agenasa. Kokain i amfetamin mogu izazvati dugotrajne promjene u ponašanju djelomično putem stimulacije dopamina D1receptori i povećanje nivoa transkripcijskih faktora, uključujući ΔFosB, u dorzalnom striatumu (tj. kaudatni putamen) i ventralnom striatumu (tj. nucleus accumbens) (Chen et al., 1997). Povećanje nivoa ΔFosB, možda putem stabilizacije proteinskih produkata, održava se nekoliko nedelja nakon hronične izloženosti kokainu ili amfetaminu i reguliše se bar delimično putem transmisije dopaminskog signala (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).
Centralni dopaminergički sistem mladih životinja je u velikoj mjeri u toku, kao rezultat promjene nivoa kritičnih molekula tokom normalnog razvoja, uključujući dopamin D1receptor DARPP-32 (dopamin i cAMP regulisan fosfoprotein; Mr 32 kDa) i cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano i dr., 1996; Tarazi i dr., 1999;Andersen, 2002). Izloženost tokom ovog perioda psihostimulansima, koji pojačavaju dopaminergičku neurotransmisiju, može stoga rezultirati kvantitativnim i / ili kvalitativno različitim molekularnim odgovorima, uključujući promjene u ekspresiji ΔFosB. Da bi se testirala hipoteza da postoje neuroadaptivni odgovori koji zavise od uzrasta tokom hronične izloženosti psihostimulansima, tri grupe miševa su analizirane u serijskim eksperimentima: odrasli (60 d stari na početku injekcija), periadolescent (33 d stari na početku injekcija), i post-weanling (24 d stari na početku injekcije). Ovo je prvo direktno poređenje molekularnih neuroadaptivnih odgovora na hroničnu izloženost psihostimulantima u ove tri starosne grupe. Otkrili smo da, nakon identičnih paradigmi liječenja, periadolescentni miševi pokazuju pojačanu regulaciju ΔFosB kao odgovor na kokain i amfetamin.
MATERIJALI I METODE
Upotreba životinja i lijekova. Mužjaci CD-1 miševa (Charles River Laboratories, Kingston, NY) su bili smješteni na 12 hr svjetlosnom / mračnom ciklusu (6: 00 AM do 6: 00 PM) sa ad libitumpristup hrani i vodi. Životinjama je bilo dozvoljeno da se smjeste u prostorije za životinje na minimum 10 d prije početka injekcija. Životinjama su rukovala dva istraživača koji su izvršili sve injekcije u istoj prostoriji u kojoj su bile smještene životinje. Sve životinje su bile odbijene u dobi od 21 d. Injekcije su počele na 24 (post-weanling), 33 (periadolescent), ili 60 (odrasli) d starosti. Životinje su primale 20 mg / kg kokaina (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetamina (Sigma), ili jednak volumen fiziološke otopine intraperitonealno između 4: 00 i 5: 00 PM dnevno za 7 d. Životinje su ubijene decapitation nakon kratkog izlaganja CO2 na 10: 00 AM na dan nakon završne injekcije. Mozgovi su odmah uklonjeni sa lobanje, a kaudatni putamen i nucleus accumbens brzo su se secirali na ledu. Sve disekcije su izvedene od koronalnih rezova mozga od strane jednog istraživača, a proteinski ekstrakti su pripremljeni iz svježeg tkiva bez zamrzavanja. Sve procedure za životinje su odobrene od strane Institucionalnog odbora za njegu i upotrebu životinja i bile su u skladu sa Nacionalnim institutom za zdravlje Vodič za njegu i upotrebu laboratorijskih životinja.
Western blot analiza. Za Western blot analize, jednake količine proteina (40 μg za kaudatni putamen i 20 μg za nucleus accumbens) iz svakog uzorka su napunjene u svaku stazu 10% SDS-poliakrilamidnog gela nakon mjerenja koncentracije proteina pomoću BCA testa (Pierce, Rockford, IL). Jednako punjenje proteina potvrđeno je i vizualizacijom ukupnog proteina Ponceau crvenim nakon transfera u nitrocelulozu i / ili bloting sa anti-aktin antitelom (1: 500; Sigma). Antisum antigena FOS-a (FRA), koji prepoznaje izoforme ΔFosB, velikodušno je osiguravao dr. M. Iadarola (Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, MD) i koristio se u koncentraciji 1: 4000. Prethodne studije (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), uključujući preapsorpciju FRA antiseruma sa imunogenom M-peptida, pokazao specifičnost ovog antiseruma. Monoklonsko antitijelo DARPP-32 5a, koje se koristi na 1: 10,000, velikodušno je dalo Drs. Hugh Hemmings i Paul Greengard (The Rockefeller University, New York, NY). Antitelo transportera dopamina (DAT) je bilo od Chemicon (Temecula, CA). Blotovi su reagirali sa NEN-DuPont (Boston, MA) sistemom hemiluminescencije i izloženi filmu. Denzitometrijske vrednosti za ΔFosB imunoreaktivnost su dobijene pomoću ScanAnalysis za Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Statistička značajnost je određena pomoću jednosmjerne ANOVA, nakon čega slijedi post hoc Tukeyev višestruki test upoređivanja ili neupareni, dvostrani Studentov test t test kao što je navedeno u legendi slike. Za eksperimente sa tretmanom lekovima, analiza svake starosne grupe je izvršena na posebnom blotu, i stoga je svaka fiziološka grupa dobrovoljno dodeljena vrednost 100% za poređenje između starosnih grupa. Za studije ontogeneze, uzorci svih starosnih grupa analizirani su zajedno na jednom blotu.
REZULTATI
Indukcija ΔFosB nakon što se kokain i amfetamin pojavljuju u nucleus accumbens samo periadolescentnih miševa
Ekspresija ΔFosB mjerena je u nucleus accumbens i kaudatnom putamenu nakon mlijeka, periadolescenata i odraslih miševa nakon primjene 7 d amfetamina ili kokaina. Nukleus akumbens je oblast mozga za koju se smatra da je najkritičnija za posredovanje u nagrađivanju psihostimulansa. ΔFosB imunoreaktivnost (35 kDa) selektivno je inducirana u nukleusu akumbensa periadolescentnih životinja nakon hronične primjene amfetamina (sl. 1 A) ili kokain (sl. 1 B). Nasuprot tome, nivo ΔFosB (35 kDa) nije bio značajno promenjen u nukleusu akumbensa post-odskakanja ili odraslih životinja (sl.1 A,B). Kod kaudatnog putamena, razine ΔFosB (35 kDa) su također značajno povećane nakon hronične primjene amfetamina samo kod periadolescentnih životinja (sl.2 A). Sve tri starosne grupe pokazale su značajno povećanje ekspresije ΔFosB (35 kDa) u kaudatnom putamenu nakon hronične primjene kokaina (sl.2 B). Međutim, veličina indukcije bila je najveća kod periadolescentnih životinja, posebno u poređenju sa post-weanlings (sl. 2 B). Ostale FRA i Fos izoforme bile su nepromijenjene u svim dobnim skupinama (podaci nisu prikazani).
ΔFosB imunoreaktivnost u nucleus accumbens nakon hronične psihostimulantne administracije. CD-1 miševi su injektirani jednom dnevno sa fiziološkom otopinom, amfetaminom ili kokainom za 7 d počevši od dana 24 (P24; post-weanling), dan 33 (dan)P33; periadolescent), ili dan 60 (odrasla osoba). Nivoi imunoreaktivnosti ΔFosB (35 kDa) u nucleus accumbens prikazani su nakon hroničnog amfetamina (A) ili kokain (B) uprava. Reprezentativni imunobloti iz slane vode- (S), amfetamin- (A), i kokain- (C) ubrizgavanje post-weanling-a (P24), periadolescent (P33), a odrasli miševi su prikazani u gornje ploče. Donji paneli pokazuju srednju vrijednost ± SEM postotak bazalne ΔFosB ekspresije. n vrijednosti za svaku grupu prikazane su u barovi. Značajna povećanja ΔFosB su pronađena u nucleus accumbens samo periadolescentnih miševa. * \ Tp <0.05; **p <0.01 (studentska t test; saline vs drug).
ΔFosB imunoreaktivnost u kaudatnom putamenu nakon hronične primjene psihostimulanta. CD-1 miševi su injektirani jednom dnevno sa fiziološkom otopinom, amfetaminom ili kokainom za 7 d počevši od dana 24 (P24; post-weanling), dan 33 (dan)P33; periadolescent), ili dan 60 (odrasla osoba). Nivoi imunoreaktivnosti ΔFosB (35 kDa) u kaudatnom putamenu prikazani su nakon hroničnog amfetamina (A) ili kokain (B) uprava. Reprezentativni imunobloti iz slane vode- (S), amfetamin- (A), i kokain- (C) ubrizgane periadolescentne miševe (P33) su prikazani ugornje ploče. Donji paneli pokazuju srednju vrijednost ± SEM postotak bazalne ΔFosB ekspresije. n vrijednosti za svaku grupu prikazane su u barovi. Značajna povećanja imunoreaktivnosti ΔFosB izazvana amfetaminom nađena su u kaudatnom putamenu samo periadolescentnih miševa (A). Primena hroničnog kokaina povećala je ΔFosB u sve tri starosne grupe (B). * \ Tp <0.05; **p <0.01 (studentska t test; saline vs drug).
Nivoi DAT i DARPP-32 se ne menjaju nakon hroničnog kokaina ili amfetamina
Nekoliko ključnih molekula izraženih dopaminergičkim i / ili dopaminoceptivnim neuronima, uključujući DARPP-32, D1 dopamin receptor, i DAT, doprinose akutnim i hroničnim odgovorima na psihostimulanse (Moratalla i dr., 1996; Fienberg i dr., 1998; Sora i dr., 1998; Gainetdinov i dr., 2001). Podaci iz DARPP-32, D1 Receptor i DAT null i DAT knock-down miševi ukazuju na komplikovan odnos između njihovih nivoa, regulaciju dopaminergičke aktivnosti i reakcije na psihostimulanse. U stvari, indukcija ΔFosB se ne javlja u DARPP-32 null miševima koji primaju kronični kokain (Fienberg i dr., 1998). Međutim, kod odraslih miševa izloženost 7 d 20 mg / kg kokaina ne mijenja ukupne nivoe DARPP-32 (Fienberg i dr., 1998). Regulacija proteina DAT nije ranije prijavljena kod miševa koji su hronično izloženi psihostimulansima, iako su u nekim vrstama zabilježene promjene u vezivanju radioliganda za transporter dopamina nakon izlaganja psihostimulansima (Letchworth i dr., 2001). Ovde smo merili nivoe DARPP-32 i DAT proteina da bismo utvrdili da li se ekspresija ovih proteina menja posle hronične primene psihostimulanta u bilo kom od tri uzrasta miševa. Naši nalazi pokazuju da nije bilo značajnih promjena u nivou ukupnog DARPP-32 ili DAT u cijelom kaudatnom putamenu ili nukleusu akumbensa nakon hronične primjene kokaina ili amfetamina u bilo kojoj od tri dobne skupine 1).
Relativne denzitometrijske vrijednosti za DARPP-32 i DAT u P24, P33 i odraslim miševima tretiranim amfetaminom i kokainom u odnosu na kontrolu, slane vrijednosti, proizvoljno postavljene na 100%
Osnovni nivo ΔFosB je regulisan razvojno
Mi smo ispitali ontogeniju ΔFosB zato što odrasli miševi sa genetski modifikovanom povećanom ekspresijom ΔFosB u striatumu imaju pojačan odgovor na psihostimulanse (Kelz i dr., 1999). Otkrili smo da su osnovni nivoi ΔFosB bili značajno niži kod mlađih životinja u poređenju sa odraslim u oba kaudatna putamena i nucleus accumbens (sl.3 A). Nivoi funkcionalnih markera dopaminskog sistema, uključujući DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano i dr., 1996i dopaminskih receptora (Teicher et al., 1993; Tarazi i dr., 1999) takođe su regulisani razvojno. Prethodni izvještaji kod CD-1 miševa ukazuju na vrhunac u striatnom DARPP-32 u postnatalnom danu 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). U štakorskom patuljastom putamenu i nucleus accumbens, D1nivoi receptora od P28 do P40 (Teicher et al., 1993; Tarazi i dr., 1999), ali slične studije nisu provedene na mišu. Nasuprot tome, ovdje smo otkrili da su nivoi DAT proteina u kaudatnom putamenu i nucleus accumbens konstantni između postnatalnog dana 24 i odrasle dobi (sl. 3 B). Dakle, relativni omjeri između D1 receptori, DAT, DARPP-32 i ΔFosB razlikuju se između starosnih grupa, što potencijalno rezultira razlikama u D1 aktivnost receptora koja bi mogla da utiče na stepen indukcije ΔFosB.
Razvojna ekspresija ΔFosB i DAT. A, ΔFosB (35-37 kDa) imunoreaktivnost u caudate putamenu i nucleus accumbens naivnih CD-1 miševa kao funkcija starosti. Reprezentativni imunoblotovi su prikazani u gornje ploče.Donji paneli pokazuju značenje ± SEM od tri miševa po grupi. * \ Tp <0.05, odrasla osoba nasuprot P24; #p <0.05, odrasla osoba nasuprot P36 (Tukeyev test višestruke usporedbe nakon ANOVA). B, Denzitometrijske vrijednosti DAT imunoreaktivnosti u kaudatnom putamenu i nucleus accumbens za naivne CD-1 miševe kao funkciju starosti. Nivoi DAT nisu se razlikovali u tri starosne grupe.
DISKUSIJA
Bihevioralni efekti psihomotornih stimulansa zavise od starosti. Sklonosti ovisnosti su najviše u adolescenciji, kada se upotreba nezakonitih supstanci eskalira (Estroff i dr., 1989; Myers i Anderson, 1991). U stvari, mlađa djeca često postaju disforična kada su izložena psihostimulansima, dok adolescenti i odrasli doživljavaju euforiju (Rapoport i dr., 1980). Kod modela glodavaca, neke studije ukazuju da periadolescentne životinje imaju viši osnovni nivo aktivnosti (Koplje i kočnice, 1983) i izmenjeni odgovori na psihostimulanse u odnosu na mlađe i starije životinje. Prema tome, oni pokazuju manju stimulaciju lokomotora i traženje novosti kao odgovor na akutnu primenu psihostimulansa na male doze u odnosu na odojče i odrasle životinje, ali povećanu hiperaktivnost nakon tretmana visokim dozama. Kod hronične primene, senzibilizacija na lokomociju izazvanu kokainom je veća u periadolescentnih pacova u poređenju sa odraslim osobama, dok je senzibilizacija na stereotipiju niža. Takođe, podaci o mikrodijalizi su otkrili razlike između periadolescentnih i odraslih pacova u odnosu na senzibilizaciju na oslobađanje dopamina izazvanog amfetaminom (Laviola i dr., 1995; Adriani i dr., 1998; Adriani i Laviola, 2000;Laviola i dr., 2001). Međutim, postoje kontradiktorne studije o dugoročnoj reaktivnosti na kokain nakon primene metilfenidata kod adolescentnih pacova (Brandon i dr., 2001; Andersen i dr., 2002). Ova poslednja dva izveštaja naglašavaju teškoće u poređenju studija kada se koriste različite eksperimentalne paradigme. Pokušaji da se uporede studije ponašanja kod mlađih životinja dodatno su zbunjeni upotrebom različitih vrsta i sojeva.
Miš postaje sve važniji životinjski model u proučavanju upotrebe i zloupotrebe psihostimulansa, a ovo je prva sistematska analiza molekularnih neuroadaptivnih odgovora u tri različite razvojne dobi kod miša ili bilo koje druge pojedinačne vrste. Prethodne studije iz kojih smo izveli naše paradigme lečenja pokazale su povećanje ΔFosB u izolovanom dorzalnom i ventralnom striatumu odraslih pacova divljeg tipa nakon hronične primene kokaina i amfetamina (Hope i dr., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon et al., 1997) ali samo u kombinovanom dorzalnom i ventralnom striatumu ili izolovanom dorzalnom striatumu odraslih miševa divljeg tipa nakon kroničnog kokainaFienberg i dr., 1998; Zachariou i dr., 2001).
Sada demonstriramo prostornu i kvantitativnu razliku u ΔFosB izazvanoj psihostimulansom u post-weanling, periadolescentnim i odraslim miševima. Opažanje povišenog odgovora kod periadolescentnih životinja u poređenju sa odraslim i post-vezanjem se pojačava činjenicom da je odgovor sličan kod miševa tretiranih kokainom i amfetaminom. Psihostimulansi kokain i amfetamin povećavaju sinaptički dopamin, kao i serotonin i norepinefrin, ali različitim mehanizmima. Kokain se veže za transportere plazmaleme za dopamin, serotonin i norepinefrin i inhibira njihovo ponovno prihvatanje u presinaptičke terminale. Nasuprot tome, amfetamin promoviše oslobađanje ovih predajnika. Selektivna indukcija ΔFosB u nukleus akumbensu samo periadolescentne starosne grupe nakon primene stimulansa 7 d i relativno povišena indukcija ΔFosB u kaudatnom putamenu može biti neurobiološka reprezentacija ili uzrok ranije zabeležene povećane tendencije zloupotrebe psihostimulanata u ovoj starosna grupa (Estroff i dr., 1989; Myers i Anderson, 1991) i druge dugoročne promjene u ekspresiji gena, koje se razlikuju po starosnim grupama (Andersen i dr., 2002). Štaviše, ove razlike mogu biti intrinzično regulisane razvojnim promenama u nivoima ključnih molekula, uključujući i sam ΔFosB. Potencijalne implikacije razlika u osnovnim nivoima ΔFosB između starosnih grupa analogne su onima koje su predložene u vezi sa razlikama između sojeva pacova (Haile et al., 2001). U stvari, očekujemo da će se slične razlike u soju naći i među inbred miševima. Takođe je moguće da će miševi različite starosti pokazati različite molekularne adaptacije u područjima mozga osim nukleusa accumbens. Dodatna analiza pomoću periadolescentnih miševa sa genetski modifikovanim promenama u nivoima ključnih molekula i istovremenim posmatranjima ponašanja dodatno će testirati ove hipoteze.
Fusnote
- Primljeno April 8, 2002.
- Revizija je primljena Avgust 6, 2002.
- prihvaćeni Avgust 8, 2002.
Ovaj rad su podržali Nacionalni instituti za zdravlje / Nacionalni institut za neurološke poremećaje i grantove za moždani udar NS41871 (MEE i EMU) i Nacionalni institut za zloupotrebu droga P30-DA13429 (EMU).
Korespondenciju treba uputiti Dr. Michelle E. Ehrlich, Univerzitet Thomas Jefferson, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. E-mail: [email zaštićen].
- Copyright © Društvo za neuronauku 2002
;