Kilde
Nathan Kline Institute, Orangeburg, New York, 10962, USA. [e-mail beskyttet]
Abstrakt
Børn og unge udsættes i stigende grad for psykostimulerende midler, enten ulovligt eller til behandling af almindelige neuropsykiatriske tilstande, såsom opmærksomhedsunderskridelse med og uden hyperaktivitet. På trods af den udbredte anvendelse af psykomotoriske stimulanter i yngre aldersgrupper vides der lidt om de kroniske molekylære neuroadaptive responser på disse midler i den umodne hjerne. Her demonstrerer vi, at efter kronisk administration af psykostimulanterne kokain , amfetamin, transkriptionsfaktoren DeltaFosB er opreguleret i nucleus accumbens of periadolescent mus men ikke i post-fravænning eller voksen mus. Induktion af DeltaFosB forekommer også udelukkende i caudate putamen af periadolescent mus efter amfetamin administration. Disse resultater demonstrerer den unikke plasticitet i den unge hjerne i et kritisk molekyle, der regulerer psykostimulerende handling og antyder, at disse neuroadaptive ændringer kan være involveret i formidlingen af forbedret vanedannende tendenser hos de unge i forhold til den voksne.
Introduktion
Psykostimulanter anvendes til behandling af almindelige barndomsforstyrrelser, såsom opmærksomhedsunderskudshyperaktivitetsforstyrrelse. Derudover er misbrug af stimulanter, herunder amfetamin og kokain, almindelig blandt unge, en alder, hvor der er tegn på forbedrede vanedannende tendenser i forhold til voksne (Estroff et al., 1989; Myers og Anderson, 1991). På trods af data, der indikerer udviklingsmæssigt regulerede adfærdseffekter, vides der kun lidt om de molekylære neuroadaptive responser i den umodne hjerne, der forekommer i administrationsperioden for disse midler. Kokain og amfetamin kan påvirke langvarige adfærdsændringer delvist via stimulering af dopamin D1receptorer og stigninger i niveauer af transkriptionsfaktorer, inklusive ΔFosB, i dorsalt striatum (dvs. caudate putamen) og det ventrale striatum (dvs. nucleus accumbens) (Chen et al., 1997). Stigninger i niveauer af osFosB, måske via stabilisering af proteinprodukter, opretholdes i flere uger efter kronisk eksponering for kokain eller amfetamin og reguleres i det mindste delvist af dopaminsignaltransduktionsvejen (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).
Unge dyrs centrale dopaminergiske system er meget i flux som et resultat af de ændrede niveauer af kritiske molekyler under normal udvikling, herunder dopamin D1receptor DARPP-32 (dopamin og cAMP-reguleret phosphoprotein; Mr af 32 kDa) og cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano et al., 1996; Tarazi et al., 1999;Andersen, 2002). Eksponering i denne periode for psykostimulerende midler, der forbedrer dopaminerg neurotransmission, kan derfor resultere i kvantitativt og / eller kvalitativt forskellige molekylære responser, herunder ændringer i ΔFosB-ekspression. For at teste hypotesen om, at der er aldersafhængig neuroadaptiv respons under kronisk eksponering for psykostimulerende stoffer, blev tre grupper mus analyseret i serieeksperimenter: voksne (60 d gamle ved indsprøjtningens begyndelse), periadolescent (33 d gammel ved indsprøjtningens begyndelse), og efter-fravænning (24 d gammel ved injektionens begyndelse). Dette er den første direkte sammenligning af molekylær neuroadaptiv respons på kronisk psykostimulerende eksponering i disse tre aldersgrupper. Vi fandt, at periadolescent mus efter identiske behandlingsparadigmer viser forbedret ΔFosB-opregulering som respons på både kokain og amfetamin.
MATERIALER OG METODER
Dyr og medikamentadministration. Han-CD-1 mus (Charles River Laboratories, Kingston, NY) blev huse i en 12 timers lys / mørk cyklus (6: 00 AM til 6: 00 PM) med ad libitumadgang til mad og vand. Dyr fik lov til at rumme i dyrerummet i mindst 10 d inden initieringen af injektioner. Dyrene blev håndteret af to efterforskere, der udførte alle injektioner i det samme rum, hvor dyrene blev huse. Alle dyr blev fravænket ved alder 21 d. Injektioner begyndte ved 24 (post-fravænning), 33 (periadolescent) eller 60 (voksen) d alder. Dyr modtog 20 mg / kg kokain (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetamin (Sigma) eller et lige stort volumen saltvand intraperitonealt mellem 4: 00 og 5: 00 PM dagligt for 7 d. Dyr blev dræbt ved halshugning efter kort udsættelse for CO2 kl. 10: 00 AM dagen efter den endelige injektion. Hjerner blev straks fjernet fra kraniet, og caudate putamen og nucleus accumbens blev hurtigt dissekeret på is. Alle dissektioner blev udført fra koronale hjerneskiver af en enkelt undersøger, og proteinekstrakter blev fremstillet fra frisk væv uden frysning. Alle dyreprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee og var i overensstemmelse med de nationale institutter for sundhed Vejledning til pleje og brug af laboratoriedyr.
Western blot analyse. Til Western blot-analyser blev der ladet lige store mængder protein (40 μg for caudat-putamen og 20 μg for nucleus accumbens) fra hver prøve i hver bane af en 10% SDS-polyacrylamidgel efter måling af proteinkoncentrationer med BCA-assayet (Pierce, Rockford, IL). Lig proteinbelastning blev også verificeret ved visualisering af total protein med Ponceau Red efter overførsel til nitrocellulose og / eller blotting med anti-actin-antistof (1: 500; Sigma). Det Fos-relaterede antigen (FRA) antiserum, som genkender ΔFosB isoformerne, blev generøst tilvejebragt af Dr. M. Iadarola (National Institutes of Health, Bethesda, MD) og anvendt i en koncentration af 1: 4000. Tidligere undersøgelser (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), inklusive preadsorption af FRA-antiserum med M-peptidimmunogen, demonstrerede specificiteten af dette antiserum. Det monoklonale antistof DARPP-32 5a, anvendt ved 1: 10,000, blev generøst tilvejebragt af Drs. Hugh Hemmings og Paul Greengard (The Rockefeller University, New York, NY). Dopamin-transporter (DAT) -antistof var fra Chemicon (Temecula, Californien). Blots blev omsat med NEN-DuPont (Boston, MA) kemiluminescenssystem og udsat for film. Densitometriske værdier for ΔFosB-immunreaktivitet blev opnået under anvendelse af ScanAnalysis for Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af en envejs ANOVA efterfulgt af post hoc Tukeys multiple sammenligningstest eller en uparret, to-halet student t test som angivet i figurlegenderne. Til lægemiddelbehandlingseksperimenter blev analyse af hver aldersgruppe udført på en separat blot, og derfor blev hver saltvandgruppe vilkårligt tildelt en 100% -værdi til sammenligning mellem aldersgrupper. Til ontogenistudierne blev prøver fra alle aldersgrupper analyseret sammen på en enkelt blot.
RESULTATER
Induktion af ΔFosB efter kokain og amfetamin forekommer i nucleus accumbens hos kun periadolescent mus
Ekspressionen af ΔFosB blev målt i nucleus accumbens og caudate putamen fra post-fravænding, periadolescent og voksne mus efter 7 d amfetamin- eller kokainadministration. Kernen accumbens er hjerneområdet, der menes at være mest kritisk for at formidle de givende effekter af psykostimulanter. ΔFBB-immunreaktivitet (35 kDa) blev selektivt induceret i nucleus accumbens fra periadolescent dyr efter kronisk indgivelse af amfetamin (fig. 1 A) eller kokain (fig. 1 B). I modsætning hertil blev niveauerne af osFosB (35 kDa) ikke ændret signifikant i nucleus accumbens fra post-fravænning eller voksne dyr (fig.1 A,B). I caudate putamen blev osFosB-niveauer (35 kDa) også signifikant opreguleret efter kronisk amfetaminadministrering hos periadolescent dyr (fig.2 A). Alle tre aldersgrupper viste signifikante stigninger i osFosB (35 kDa) ekspression i caudat putamen efter kronisk administration af kokain (Fig.2 B). Størrelsen af induktion var imidlertid størst hos periadolescent dyr, især sammenlignet med post-fravænninger (fig. 2 B). Andre FRA- og Fos-isoformer var uændrede i alle aldersgrupper (data ikke vist).
ΔFBB-immunreaktivitet i nucleus accumbens efter kronisk psykostimulerende indgivelse. CD-1 mus blev injiceret en gang dagligt med saltvand, amfetamin eller kokain til 7 d begyndende på dag 24 (P24; post-fravænning), dag 33 (P33; periadolescent) eller dag 60 (Voksen). Niveauer af ΔFosB (35 kDa) immunreaktivitet i nucleus accumbens er vist efter kronisk amfetamin (A) eller kokain (B) administration. Repræsentative immunoblots fra saltvand- (Samfetamin- (A) og kokain- (C) injiceret efter-fravænning (P24), periadolescent (P33), og voksne mus vises i øverste paneler. Bundpaneler viser gennemsnit ± SEM-procentdel af basal-FosB-ekspression. n værdier for hver gruppe vises i barer. Signifikante stigninger i ΔFB blev fundet i nucleus accumbens hos kun de periadolescent mus. *p <0.05; **p <0.01 (studerendes t prøve; saltvand mod stof).
ΔFBB-immunreaktivitet i caudate putamen efter kronisk psykostimulerende indgivelse. CD-1 mus blev injiceret en gang dagligt med saltvand, amfetamin eller kokain til 7 d begyndende på dag 24 (P24; post-fravænning), dag 33 (P33; periadolescent) eller dag 60 (Voksen). Niveauer af ΔFosB (35 kDa) immunreaktivitet i caudat-putamen er vist efter kronisk amfetamin (A) eller kokain (B) administration. Repræsentative immunoblots fra saltvand- (Samfetamin- (A) og kokain- (C) injicerede periadolescent mus (P33) vises iøverste paneler. Bundpaneler viser gennemsnit ± SEM-procentdel af basal-FosB-ekspression. n værdier for hver gruppe vises i barer. Signifikante amfetamin-inducerede stigninger i ΔFosB-immunreaktivitet blev fundet i caudat-putamen fra kun periadolescent mus (A). Kronisk kokainadministration producerede stigninger i osFosB i alle tre aldersgrupper (B). *p <0.05; **p <0.01 (studerendes t prøve; saltvand mod stof).
DAT- og DARPP-32-niveauer ændres ikke efter kronisk kokain eller amfetamin
Flere nøglemolekyler udtrykt af dopaminerge og / eller dopaminoceptive neuroner, herunder DARPP-32, D1 dopaminreceptor og DAT bidrager til akutte og kroniske responser på psykostimulanter (Moratalla et al., 1996; Fienberg et al., 1998; Sora et al., 1998; Gainetdinov et al., 2001). Data fra DARPP-32, D1 receptor, og DAT-nul- og DAT-knock-down-mus indikerer et kompliceret forhold mellem deres niveauer, regulering af dopaminerg aktivitet og respons på psykostimulanter. Faktisk forekommer ΔFosB-induktion ikke i DARPP-32 nullmus, der modtager kronisk kokain (Fienberg et al., 1998). Hos voksne mus ændrer 7 d eksponering for 20 mg / kg kokain imidlertid ikke de samlede niveauer af DARPP-32 (Fienberg et al., 1998). DAT-proteinregulering er ikke tidligere rapporteret hos mus, der er udsat for kronisk for psykostimulanter, skønt der er rapporteret om ændringer i radioligandbinding til dopamintransportøren efter eksponering for psykostimulanter i nogle arter (Letchworth et al., 2001). Her målte vi niveauerne af DARPP-32 og DAT-protein for at bestemme, om ekspressionen af disse proteiner ændres efter kronisk psykostimulerende indgivelse i en hvilken som helst af de tre aldre af mus. Vores fund indikerer, at der ikke var nogen signifikante ændringer i niveauer af total DARPP-32 eller DAT i hele caudate putamen eller nucleus accumbens efter kronisk administration af enten kokain eller amfetamin i nogen af de tre aldersgrupper (tabel 1).
Relative densitometriværdier for DARPP-32 og DAT i amfetamin- og kokainbehandlede P24, P33 og voksne mus i forhold til kontrol, saltvandsværdier, der vilkårligt er sat til 100%
Baseline-niveauer af osFosB er udviklingsmæssigt reguleret
Vi undersøgte ontogenien af ΔFosB, fordi voksne mus med genetisk manipuleret øget ekspression af ΔFosB i striatum har en øget adfærdsrespons på psykostimulanter (Kelz et al., 1999). Vi fandt, at baseline-niveauer af osFB var signifikant lavere hos yngre dyr sammenlignet med voksne i både caudate putamen og nucleus accumbens (fig.3 A). Niveauer af funktionelle markører for dopaminsystemet, inklusive DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano et al., 1996) og dopaminreceptorer (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999) er også udviklingsmæssigt reguleret. Tidligere rapporter i CD-1-mus indikerer en top i striatal DARPP-32 på postnatal dag 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). I rotte caudate putamen og nucleus accumbens, D1receptorniveauer toppede fra P28 til P40 (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999), men lignende undersøgelser er ikke blevet udført i musen. I modsætning hertil fandt vi her, at DAT-proteinniveauer i caudate putamen og nucleus accumbens var konstante mellem postnatal dag 24 og voksen alder (fig. 3 B). De relative forhold mellem D1 receptorer, DAT, DARPP-32 og ΔFosB er forskellige mellem aldersgrupper, hvilket potentielt resulterer i forskelle i D1 receptoraktivitet, der kunne påvirke graden af osFosB-induktion.
Udviklingsudtryk for ΔFosB og DAT. A, ΔFosB (35 – 37 kDa) immunreaktivitet i caudate putamen og nucleus accumbens af naive CD-1 mus som en funktion af alderen. Representative immunoblots er vist i øverste paneler.Bundpaneler viser betyder ± SEM af tre mus pr. gruppe. *p <0.05, voksen versus P24; #p <0.05, voksen versus P36 (Tukeys multiple sammenligningstest efter ANOVA). B, Densitometriske værdier af DAT-immunreaktivitet i caudate putamen og nucleus accumbens for naive CD-1-mus som en funktion af alderen. Niveauer af DAT var ikke forskellig mellem de tre aldersgrupper.
DISKUSSION
Adfærdsmæssige virkninger af psykomotoriske stimulanter er aldersafhængige. Vanedannende tendenser er højest i ungdomsårene, når brug af ulovlige stoffer eskalerer (Estroff et al., 1989; Myers og Anderson, 1991). Faktisk bliver yngre børn ofte dysforiske, når de udsættes for psykostimulerende midler, mens unge og voksne oplever eufori (Rapoport et al., 1980). I gnavermodeller antyder nogle undersøgelser, at periadolescent dyr har højere aktivitetsniveauer for baseline (Spyd og bremse, 1983) og ændrede responser på psykostimulanter i forhold til yngre og ældre dyr. De viser således mindre lokomotorisk stimulering og nyhedssøgning som svar på akut lavdosisadministration af psykostimulanter i forhold til fravænning og voksne dyr, men øget hyperaktivitet efter højdosisbehandling. Ved kronisk indgivelse er sensibiliseringen for kokaininduceret bevægelse større hos periadolescent rotter sammenlignet med voksne, mens sensibiliseringen for stereotypi er lavere. Mikrodialysedata har også afsløret forskelle mellem periadolescerende og voksne rotter med hensyn til sensibilisering til amfetamininduceret dopaminfrigivelse (Laviola et al., 1995; Adriani et al., 1998; Adriani og Laviola, 2000;Laviola et al., 2001). Der er imidlertid modstridende undersøgelser med hensyn til den langsigtede reaktivitet over for kokain efter methylphenidatadministration hos unge rotter (Brandon et al., 2001; Andersen et al., 2002). Disse to sidstnævnte rapporter fremhæver vanskeligheden ved at sammenligne studier, når der anvendes forskellige eksperimentelle paradigmer. Forsøg på at sammenligne adfærdsundersøgelser hos yngre dyr forvirres yderligere ved anvendelse af forskellige arter og stammer.
Musen bliver en stadig vigtigere dyremodel i studiet af brug og misbrug af psykostimulanter, og dette er den første systematiske analyse af molekylære neuroadaptive responser i tre forskellige udviklingsalder hos mus eller enhver anden art. Tidligere undersøgelser, hvorfra vi afledte vores behandlingsparadigmer, har vist en stigning i ΔFosB i det isolerede ryg og ventral striatum hos voksne rotter efter vildtype efter administration af kronisk kokain og amfetamin (Håber et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon et al., 1997) men kun i det kombinerede dorsale og ventrale striatum eller isoleret ryggstriatum hos vildtype voksne mus efter kronisk kokain (Fienberg et al., 1998; Zachariou et al., 2001).
Vi demonstrerer nu en rumlig og kvantitativ forskel i psykostimulant-induceret ΔFosB i post-fravænningsmus, periadolescent og voksen mus. Observationen af en forøget respons hos periadolescerende dyr sammenlignet med voksne og post-fravænninger styrkes af det faktum, at responsen er den samme hos kokain- og amfetaminbehandlede mus. De psykostimulerende stoffer kokain og amfetamin øger begge synaptisk dopamin såvel som serotonin og noradrenalin, men ved forskellige mekanismer. Kokain binder sig til plasmalemmetransportørerne for dopamin, serotonin og noradrenalin og hæmmer deres genoptagelse i presynaptiske terminaler. I modsætning hertil fremmer amfetamin frigørelsen af disse sendere. Den selektive induktion af ΔFosB i nucleus accumbens i kun den periadolescent aldersgruppe efter 7 d af stimulantadministration og den relativt forøgede induktion af ΔFosB i caudat putamen kan være en neurobiologisk repræsentation eller årsag til den tidligere bemærkede øgede tendens til at misbruge psykostimulanter i dette aldersgruppe (Estroff et al., 1989; Myers og Anderson, 1991) og andre langsigtede ændringer i genekspression, som adskiller sig fra aldersgrupper (Andersen et al., 2002). Desuden kan disse forskelle reguleres i sig selv ved udviklingsændringer i niveauer af nøglemolekyler, herunder ΔFosB i sig selv. De potentielle implikationer af forskelle i baseline-niveauer af ΔFosB mellem aldersgrupper er analoge med de foreslåede for forskelle mellem rotte-stammerHaile et al., 2001). Faktisk forventer vi, at lignende stammeforskelle findes blandt indavlede mus. Det er også muligt, at mus i forskellige aldre viser forskellige molekylære tilpasninger i andre områder af hjernen end nucleus accumbens. Yderligere analyse ved anvendelse af periadolescent mus med genetisk konstruerede ændringer i niveauer af nøglemolekyler og samtidige adfærdsobservationer vil yderligere teste disse hypoteser.
Fodnoter
- Modtaget April 8, 2002.
- Revision modtaget August 6, 2002.
- Accepteret August 8, 2002.
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health / National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant NS41871 (MEE and EMU) og National Institute on Drug Abuse Grant P30-DA13429 (EMU).
Korrespondance bør rettes til Dr. Michelle E. Ehrlich, Thomas Jefferson University, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. E-mail: [e-mail beskyttet].
- Copyright © 2002 Society for Neuroscience
;