DeltaFosB reguleerib kaudselt Cck promootori tegevust (2010)

Brain Res. 2010 mai 6; 1329: 10 – 20.

Avaldatud Internetis 2010 märts 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ ja Colleen A. McClung^{2, *}

Autori teave ► Autoriõiguste ja litsentside teave ►

Väljaandja selle artikli lõplik redigeeritud versioon on saadaval aadressil Brain Res

Vaata teisi PMC artikleid tsitaat avaldatud artiklis.

Abstraktne

Mõned olulised biokeemilised, struktuurilised ja käitumuslikud muutused, mis on põhjustatud kroonilise ekspositsiooni tõttu narkootikumide kuritarvitamisest, näivad olevat vahendatud väga stabiilse transkriptsioonifaktori ΔFosB poolt. Eelmine töö on näidanud, et ΔFosB üleekspressioon hiirtel 2-nädalatega suurendab paljude geenide ekspressiooni striatumis, millest enamikku reguleeritakse hiljem pärast FNBX-i ekspressiooni 8-nädalat. Huvitav on ka see, et suur hulk neid geene reguleeriti transkriptsioonifaktorit CREB üleekspresseerivates hiirtes. Sellest uuringust ei olnud selge, kas lühiajaline ΔFosB reguleerib neid geene CREB kaudu. Siin leiame, et 2 nädala ΔFosB üleekspressioon suurendab CREB ekspressiooni striatumis, see efekt, mis hajub 8i nädalatelt. Varane indutseerimine on seotud suurenenud CREB seondumisega teatud sihtgeeni promootoritega selles aju piirkonnas. Üllataval kombel oli üks geen, mis oli varasemate aruannete põhjal oletatav CREB sihtmärk, koletsüstokiniin (Cck), ei kontrolli CREB striatumis. -. \ T Cck ΔFosB üleekspressiooni järel kinnitasime, et lühiajaline ΔFosB üleekspressioon suurendab mõlemat Cck promootori aktiivsus ja geeniekspressioon. Samuti suurendab see sidumisaktiivsust oletatavas CREB seondumiskohas (CRE) Cck promootor. Siiski, kuigi CRE sait on vajalik normaalse basaalse ekspressiooni jaoks Cck, see ei ole vajalik ΔFosB induktsiooni jaoks Cck. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et kuigi lühiajaline ΔFosB induktsioon suurendab CREB ekspressiooni ja aktiivsust teatud geeni promootorites, ei ole see ainus mehhanism, mille abil geenid neis tingimustes ülesreguleeritakse.

Märksõnad: tuumad, transkriptsioon, sõltuvus

SISSEJUHATUS

Krooniline kokkupuude narkootikumidega põhjustab biokeemilisi ja struktuurilisi muutusi mitmes aju piirkonnas. Arvatakse, et need muutused hõlmavad muutusi geeniekspressiooni profiilides mesolimbisüsteemis. See süsteem koosneb dopamiinergilistest neuronitest, mis ulatuvad keskjoonest ventralisest tegmentaalsest piirkonnast (VTA) keskmistesse närvirakkudesse (NAc) (ventral striatum) ja mitmetesse teistesse aju piirkondadesse. On tehtud ettepanek muuta kahe transkriptsioonifaktori, cAMP vastuse elemendi siduva valgu (CREB) ja ΔFosB (Fos perekonna valk) aktiivsust, et vahendada mitmeid biokeemilisi, struktuurilisi ja käitumuslikke muutusi, mida on täheldatud kroonilise kuritarvitamise korral ( läbi vaadanud Nestler, 2005).

CREB on kõikjal ekspresseeritud transkriptsioonifaktor, mis kuulub CREB / ATF perekonda. CREB homodimeerid seonduvad paljude geenide promootorites leitud CRE järjestuse variatsioonidega (konsensus: TGACGTCA). CREB-i fosforüülimist (peamiselt seriin 133-is, kuigi teised saidid on tuvastatud) võib stimuleerida mitmed signalisatsioonikaskaadid, kaasa arvatud need, mis asuvad dopamiini retseptoritest allavoolu (Cole et al., 1995). Pärast seriin 133i fosforüülimist värbab CREB kaasaktivaatori CREB siduva valgu (CBP) või sellega seotud valke, mis viib suurenenud geeniekspressioonini (vaadatud Johannessen et al., 2004). Krooniline kokkupuude opiaadi või psühhostimulantidega põhjustab CREB aktiivsuse mööduvat suurenemist tuumaklundis. (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman jt, 2002, 2003), kohanemine, mis arvab, et vähendada nende ravimite rahuldavaid omadusi ja aidata kaasa narkootikumide ärajätmise negatiivsele emotsionaalsele olekule (Nestler, 2005).

Larvatakse, et kuritarvitamise ravimite püsivaid kohandusi vahendab osaliselt osFosB, FosB väga stabiilne splaissingu variant (Nestler jt, 1999; McClung jt, 2004; Nestler, 2008). Fos pereliikmed dimereeruvad Jun perekonna liikmetega, et moodustada aktivaatorvalgu 1 (AP-1) kompleks. AP-1 transkriptsioonikompleksid seonduvad AP-1 vastuselemendi variatsioonidega (konsensus: TGACTCA) transkriptsiooni reguleerimiseks (vaadatud Chinenov ja Kerppola, 2001). Kuigi ägeda ekspositsiooni kuritarvitamine narkootikumidega põhjustab Fos-pereliikmete lühiajalist induktsiooni (tundi) (samuti suurenenud CREB aktiivsus), viib korduva ravimi ekspositsioon väga stabiilse ΔFosB (Hope et al., 1994; Perrotti jt, 2008), mille väljendus kestab nädalat.

Bi-transgeensetel hiirtel, kes indutseerivad täiskasvanud striatumis kas AFosB või CREB üle, ekspresseerivad paljud biokeemilised ja käitumuslikud fenotüübid, mida täheldatakse korduvalt psühhostimulantidele või teistele kuritarvitavatele ravimitele. Ageeniekspressiooni muutuste nalüüs nendes transgeensetes loomades identifitseeris arvukalt geene, mida reguleeriti lühiajaliste (2 nädalate) ΔFosB üleekspressiooniga, muutustega, mis on seotud samaaegse ravimihüvitise vähenemisega. Geeniekspressiooni ja käitumishäirete muutused lühiajaliste ΔFosB-ga olid märkimisväärselt sarnased CREB-i üleekspresseerivate loomade 2i või 8-nädalatele (McClung ja Nestler, 2003). Silmatorkava kontrastina vähendas ΔFosB pikaajaline üleekspressioon (8 nädalat) paljude nende samade geenide ekspressiooni ja tõi kaasa ravimi tasu suurenemise (Kelz et al., 1999; McClung ja Nestler, 2003).

Üks nendes uuringutes tuvastatud geenid on koletsüstokiniin (Cck), neuropeptiid, mis on toodetud mitmes aju piirkonnas, kaasa arvatud striatum (Hokfelt et al., 1980). CCK võib moduleerida dopamiinergilist ülekannet (Vaccarino, 1992) on seotud narkootikumide tasustamise ja tugevdamisega (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002) ja seda põhjustab krooniline kokaiin striatumis (Ding ja Mocchetti, 1992). Lisaks sellele Cck on näidatud, et promootor reageerib nii CREB kui ka AP-1 kompleksidele (Haun ja Dixon, 1990; Deavall et al., 2000; Hansen, 2001). Kuna paljud geenid (sh Cck) mis näitasid nii CREB kui ka lühiajalise ΔFosB ekspressiooni suurenenud ekspressiooni CREB sihtmärk-geenid (McClung ja Nestler, 2003), soovisime kindlaks teha, kas lühiajaline ΔFosB ekspressioon viib nende geenide reguleerimisele (keskendudes Cck) CREB reguleerimise või geenireguleerimise keerukamate mehhanismide kaudu.

TULEMUSED

ΔFosB üleekspressioon suurendab CREB taset mööduvalt

Me kasutasime Western blottingut, et uurida, kas ΔFosB üleekspressioon suurendab CREB valgu taset hiirte striatumis. Selle uuringu jaoks kasutasime bi-transgeenseid hiiri (liin 11A), mis kannavad nii NSE-tTA transgeeni kui ka TetOp-AFosB transgeeni. Doksitsükliini puudumisel näitavad need hiired αFosB ekspressiooni tugevat suurenemist diatorfiini positiivsetes neuronites striatumis (Kelz et al., 1999). See meetod FFosB üleekspresseerimiseks on laialdaselt dokumenteeritud ja võimaldab piirkonna spetsiifilist üleekspressiooni, mis paralleelne kroonilise kokaiiniga kokkupuutunud loomade ΔFosB induktsiooniga (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Leidsime, et 11A hiirtel, kes ΔFosB-d üleekspresseerivad, reguleeriti pärast 2-i ekspressiooni nädalat CREB-valgu taset oluliselt ja need tasemed naasisid 8-i ekspressiooninädalate algtasemeni (Joonis 1A, n = 8). Et teha kindlaks, kas lühiajalise ΔFosB üleekspressiooniga CREB taseme muutusi saab korrata teises süsteemis, ekspresseerisime PC12 rakkudes ajutiselt ΔFosB üle ja leidsime, et CREB tase tõusis kontrollidega võrreldes oluliselt (p <0.05) (Joonis 1B, n = 4). Need tulemused näitavad, et lühiajaline ΔFosB ekspressioon suurendab CREB valgu taset.

CREB tasemed suurenevad ΔFosB üleekspressiooniga. Lüsaatide Western blot analüüs (A) hiire striata 11A hiirtelt dox-ist 2 või 8 nädalateks või (B) ΔFosB üleekspresseerivad PC12 rakud. Andmed A on näidatud protsentuaalse muutusena off-doxis võrreldes ...

Nii ΔFosB kui ka CREB seostuvad spetsiifiliste sihtgeenide promootoritega striatumis pärast lühiajalist ΔFosB üleekspressiooni

Me kasutasime striatkoe ChIP (kromatiini immunosadestamise) analüüse, et teha kindlaks, kas FosB või CREB seondumine toimus teatud sihtmärkgeeni promootorites ja kui see seondumine suurenes pärast lühiajalist ΔFosB üleekspressiooni. Me analüüsisime sidumist BDNF ja Cck promootorid, kuna mõlemad geenid on kõrgelt reguleeritud pärast lühiajalist ΔFosB üleekspressiooni, CREB üleekspressiooni või kroonilist kokaiiniravi (McClung ja Nestler, 2003). Analüüsime ka sidumist CDK5 promootor, kuna see on ΔFosB teadaolev otsene sihtmärk (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Lõpuks me mõõdeti sidumist prodünorfiin kuna eelmised uuringud on avastanud, et seda saab siduda nii ΔFosB kui ka CREB erinevates tingimustes (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

ChIP analüüs viidi läbi 11A hiirtel 2-i nädalat üleekspresseerivate XNUMXA hiirte striatal, kasutades CREB või AFosB-d tuvastavaid antikehi. Normaalsetes tingimustes leiti, et ΔFosB seondub CDK5 ja prodünorfiin promootorid, samas kui. \ t BDNF or Cck promootorid (Tabel 1). Lisaks suurendas ΔFosB üleekspressioon ΔFosB seondumist CDK5 promootor, kuid mitte prodünorfiin promootor. Järgnevalt mõõdeti CREB-i sidumist nendes promootorites ja leidsime, et CREB seondub CDK5, BDNF ja prodünorfiin promootorid, kuid mitte Cck promootor, normaalses striatumis ja et ΔFosB üleekspressioon 2i nädalatel suurendab CREB sidumist \ t BDNF ja prodünorfiin promootorid, kuid mitte CDK5 promootor. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et ΔFosB ja CREB võivad mõlemad seonduda teatud geeni promootoritega nagu prodünorfiin ja CDK5aga CREB sidumine on spetsiifiline teistele promootoritele, näiteks BDNF. Lisaks põhjustab FosB üleekspressioon AFosB seondumise suurenemist teatud promootorites, nagu oleks oodata, aga ka CREB-ga seondumist spetsiifiliste promootoritega, mis on kooskõlas ajahetkel täheldatud AFosB-vahendatud CREB induktsiooniga.

Kahel nädalal ΔFosB-d üleekspresseerivate hiirte oletatavate regulatiivsete valkude seondumine erinevate promootoritega.

Eelmine töö on näidanud, et pikaajalise AFosB üleekspressiooniga indutseeritud geeniekspressiooni muutused on seotud kromatiini modifikatsioonidega, eriti histooni H3 atsetüülimisega spetsiifilistes geeni promootorites (Kumar et al., 2005). Et teha kindlaks, kas see võib kaasa tuua muutusi geeniekspressioonis lühemaajalise AFosB üleekspressiooniga, mõõdeti atsetüülitud histooni H3i (transkriptsiooniliselt aktiivse kromatiiniga seotud histooni modifikatsiooni) või metüülitud histooni H3i (Lys9, transkriptsiooniliselt seotud histooni modifikatsioon) seondumist inaktiivne kromatiin). Leidsime, et ΔFosB üleekspressioon 2-nädalatel ei põhjustanud muutusi atsetüülitud H3-i seondumises üheski uuritud geenipromootoris (Tabel 1). Me leidsime märkimisväärse vähenemise metüülitud histooni H3i sidumisel prodünorfiin promootor, kuid mitte siduv Cck promootor ja muutused siduvates CDK5 ja BDNF näitavad, et see ei ole üldine mehhanism, mille abil ΔFosB lühiajaliselt reguleerib geeniekspressiooni. Olime üllatunud ja huvitatud sellest, et me ei leidnud mingeid erinevusi meie ChIP testides, mis võiksid kaasa tuua suurenemise Cck mRNA ekspressioon 11A hiirtel pärast AFosB ekspressiooni 2 nädalat ja otsustas seda mehhanismi edasi uurida.

Lühiajaline AFosB suureneb Cck väljendus mitmes süsteemis

Biotransgeensete 11A hiirte mikroarray iseloomustus striatumis ΔFosB üleekspresseerides leidis, et Cck ekspressioonitasemed suurenevad pärast 2i nädala üleekspressiooni ja seejärel vähenevad järk-järgult pikemate ΔFosB ekspressiooni perioodidega (Joonis 2A, n = 3). Kinnitasime selle efekti Cck kasutades reaalajas PCR-i eraldi loomade rühmas 2 ja 8 nädalatel ning leidis kahe ajapunkti tulemused sarnaselt microarray analüüsiga (andmeid ei ole näidatud).

AFosB lühiajaline üleekspressioon suureneb Cck geeniekspressiooni. (A) Cck mRNA ekspressioon striatumis pärast AFosB üleekspressiooni 11A hiirtel 1, 2, 4 või 8 nädalatel. Microarray analüüs viidi läbi striatali proovidega ja Cck taset ...

Et uurida täiendavalt ΔFosB võimet reguleerida Cck kasutasime PC12 rakke, mis olid transientselt transfekteeritud a Ccklutsiferaasi reporterplasmiid ja kas FosB ekspressiooniplasmiid või võrdne kogus pCDNA. Nii kaks (n = 5-9) kui ka kolm (n = 11-13) päeva ΔFosB üleekspressiooni põhjustasid olulise suurenemise Ccklutsiferaasi ekspressioon. Lisaks põhjustas kolm päeva ΔFosB üleekspressiooni oluliselt rohkem Ccklutsiferaasi induktsioon võrreldes kahe päeva üleekspressiooniga (Joonis 2B). ΔFosB üleekspressioon ei indutseerinud promootorita lutsiferaasi konstruktsiooni ekspressiooni (andmeid ei ole näidatud). Üheski ravitingimustes oli vähenemine Ccklutsiferaasi aktiivsus on ilmne. Need tulemused näitavad, et lühiajaline ΔFosB ekspressioon suurendab Cck promootor ja jätab vastamata mehhanismi, mille abil pikaajaline ΔFosB üleekspressioon pärsib Cck väljend.

ΔFosB üleekspressioon suurendab sidumist oletatavas CREB sidumissaidis Cck promootor

Meie analüüsid näitasid seda Cck ekspressioon suureneb pärast lühiajalist AFosB ekspressiooni, kuid meie ChIP testides leiti, et CREB ega ΔFosB ei seondu Cck promootor. Et teha kindlaks, kas valkudega seonduvad muutused on Cck AFosB üleekspressiooni järgne promootor, kasutasime elektroforeetilise liikuvuse nihke analüüse (EMSA) sondiga, mis sisaldas oletatavat CRE-sarnast saiti, mis esines Cck promootor. Kasutades 11A hiirtel 2-i nädala jooksul üleekspresseerivate XNUMXA hiirte tuumaekstrakte, leidsime, et suurenenud on oletatav CRE saidi sidumine Cck promootor (Joonis 3 A, C, n = 4). Huvitav on see, et 11A hiired, kes pressFosB üleekspresseerivad 8-nädalateks, mis näitavad, et see väheneb Cck väljendus, samuti näitas see saidil suuremat sidumist (Joonis 3B, C, n = 4). Võrdluseks vaadeldi seostumist konsensuse CRE saidiga osFosB üleekspresseerivatel hiirtel 2 nädalateks ja leidsime tugeva CRE sidumise striaaltekstides, kuid ei suurenenud seondumine pärast ΔFosB induktsiooni (Joonis 3F, n = 4). Seega, vaatamata sellele ajahetkele täheldatud osFosB-indutseeritud CREB tasemete suurenemisele, on need tulemused kooskõlas meie ChIP testidega, mille kohaselt suureneb CREB seondumine promootoritega, mis järgivad ΔFosB üleekspressiooni, ainult spetsiifiliste geenide suhtes ja ei ole globaalne nähtus . Et määrata, kas CREB on seotud Cck EMSA analüüsis kasutasime promootorit CREB-spetsiifilise antikehaga. Kokkuleppel meie ChIP testidega ei leidnud me CREB sidumist a-ga Cck sond, mis sisaldab oletatavat CRE saiti EMSA testides, samas kui CREB seostus oluliselt ja asendas konsensuse CRE saiti (Joonis 3D, E, n = 4). DNA seondumisaktiivsus Cck promootorit ei mõjutanud ka AFosB-vastane antikeha (andmed pole näidatud) tingimustes, mida on näidatud mitmetes eelnevates uuringutes, et blokeerida AFosB seondumist bona fide AP-1 saitidega (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi jt, 1998). Samuti teostasime 11A loomade striata ChIP analüüse pärast ΔFosB ekspressiooni 8 nädalaid ja ei leidnud ikka veel CREB või ΔFosB sidumist. Cck promootor (andmed pole näidatud). Seega põhjustab ΔFosB ekspressioon proteiini seondumise suurenemist Cck pärast 2i ja 8-i ekspressiooni nädalat; siiski ei ole nende tegurite identiteet teada.

Valgu sidumine Cck promootor. (A, B) Elektroforeetilise liikuvuse nihke analüüs, kasutades Cck CRE-sarnane koht striatoonkoega, mis pärineb loomadest, kes ΔFosB üleekspresseerivad 2-nädalateks (A) või 8-nädalateks (B). Punktis (A) võistlus liigse märgistamata konkurendiga ...

Võimalik CRE veebileht Cck promootor ei vastuta suurema promootori tegevuse eest

Kuna leidsime valgu sidumise suurenemise, kasutades. \ T Cck promootor, mis sisaldab oletatavat CRE saiti pärast ΔFosB üleekspressiooni, soovisime kindlaks teha, kas see sait on vajalik suurenenud Cck ekspressioon pärast ΔFosB üleekspressiooni. Selle võimaluse testimiseks transfekteeriti PC12 rakke a Cck- lutsiferaasi plasmiid, mis sisaldab selle tervet CRE-sarnast saiti või mis sisaldab saidi mutatsiooni, mis kaotaks igasuguse koostoime CREB-ga. Huvitav on, et CRE-sarnase saidi mutatsioon vähenes basaal Cck 32% promootori aktiivsus (Joonis 4A, n = 9), kuid ei mõjutanud Cck promootori induktsioon ΔFosB üleekspressiooniga (Joonis 4B, n = 11-13). See viitab sellele, et kuigi Cck promootor vajab täielikku CRE-sarnast saiti täieliku basaalse aktiivsuse jaoks, ΔFosB üleekspressiooniga indutseeritud suurenenud promootori aktiivsus ei vaja CRE-sarnast järjestust.

. Ccksarnane CRE sait ei ole vajalik Cck ΔFosB induktsioon. (A) Ccklutsiferaasi aktiivsust mõõdeti 2 päeva pärast transfektsiooni kas normaalsel viisil Cck-lutsiferaas või selline, milles CRE-sarnane sait oli muteerunud. * p <0.05 (B) Ccklutsiferaas ...

cFos seob Cck promootor

Varasemad uuringud on seda leidnud cFos mRNA suureneb lühiajalise AFosB ekspressiooniga, kuid pärast pikendatud AFosB ekspressiooni väheneb kokaiiniravi võime indutseerida cFos striatumis.McClung ja Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Seetõttu võib olla võimalik, et cFos aitab kaasa kasvule Cck ekspressioon pärast lühiajalist ΔFosB ekspressiooni. Me teostasime ChIP analüüse cFosele spetsiifilise antikehaga ja mõõdeti cFos'e sidumist Cck promootor koos lühiajalise AFosB ekspressiooniga ja ilma selleta. Kuigi me leidsime, et cFos seob Cck promootor, ei suurendanud see sidumine pärast ΔFosB üleekspressiooni (Joonis 5, n = 5). See viitab sellele, et kuna cFos seob Cck edendaja, võib see kaasa aidata üldise reguleerimisele Cck väljendus, kuid see ei ole tõenäoliselt seotud \ t Cck ΔFosB promootor.

cFos seob Cck promootor. Kromatiini immunosadestamise testid viidi läbi spetsiifilise antikehaga cFos'e jaoks, kasutades striat-koe ΔFosB üleekspresseerivatest hiirtest kas doxil või pärast 2 nädalat dox eemaldamist. Reaalaja PCR analüüs oli ...

ARUTLUS

See uuring kinnitab ja laiendab varasemaid tulemusi, mis näitavad, et ΔFosB reguleerib geeniekspressiooni striatumis ja leiame, et see toimib lühiajalise ekspressiooni järel mitme mehhanismi kaudu. Näitame, et pärast 2i nädala üleekspressiooni seondub ΔFosB otseselt teatud geenide promootoritega, mis viivad ekspressiooni muutusteni (st CDK5). Lisaks suurendab see CREB valgu taset, mis on nii kultiveeritud rakkudes kui ka striatumis täheldatud, mis suurendab CREB seondumist teiste geenipromootoritega (st dünorfiin ja BDNF). Eelmises uuringus leiti, et ΔFosB lühiajaline üleekspressioon striatumis viib paljude samade geeniekspressiooni muutustega, mis leitakse CREB üleekspresseerimisel ja põhjustab sarnaseid käitumuslikke reaktsioone kokaiini eelistuste mõõtmisel (McClung ja Nestler, 2003). Seega aitab käesolev järeldus, et AFosB põhjustab CREB indutseerimist, samuti CREB seondumine teatud geeni promootoritega, aitab selgitada, miks nii paljud geeniekspressiooni muutused olid nende kahe transkriptsioonifaktori vahel.

CREB indutseerimine ΔFosB poolt on huvitav, kuna on näidatud, et kuritarvitamise ravimid põhjustavad muutusi seriini 133-fosforüülitud CREB tasemetes (Mattson et al., 2005) ja suurendada CRE-vahendatud transkriptsiooni (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman jt, 2002, 2003), muutmata CREB üldist taset. On võimalik, et CREB taseme muutused võivad olla mööduvad ja seetõttu muudes uuringutes kergesti vahele jäänud. Meie käes oleme näinud kokaiini indutseeritud CREB mRNA suurenemist teatud katsetes, kuid see efekt on väga muutuv (avaldamata vaatlus). Kuna nii 11A transgeensetel hiirtel kui ka PC-12 rakkudel on lühiajaline AFosB üleekspressioon CREB induktsioon, viitab see sellele, et CFB indutseerib tõepoolest ΔFosB (või ΔFosB sihtmärk), pakkudes veel ühte mehhanismi ravimi poolt indutseeritud muutuste selgitamiseks geenis väljend.

Üllatuslikult leiti, et ei CREB ega ΔFosB seostuvad Cck promootor, kuigi Cck ekspressioon on ilmselgelt reguleeritud pärast lühiajalist ΔFosB ekspressiooni. Cck on rikkalik neuropeptiid, mida väljendatakse nii VTA kui ka NAc-s (Hokfelt et al., 1980) ja on tõenäoliselt seotud kuritarvitatavate ravimite käitumuslike reaktsioonidega (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). Rakukultuuri testides on Cck promootor on laialdaselt iseloomustatud ja osutunud vastuseks CREB ja AP-1 pereliikmetele (vaadanud Hansen, 2001). Haun ja Dixon (1990) näitas, et AP-1 kompleksid võivad seonduda Cck CRE-sarnane sait vitroja hiljem näidati SK-N-MC neuroblastoomi rakke kasutades, et CRE-sarnase saidi mutatsioon vähendas promootori reageerimist üleekspresseeritud cFos / cJun-le (Rourke et al., 1999). Tõepoolest, leiame ka suurenenud Cck promootori tegevus (Joonis 2) ja siduvad CRE-sarnase elemendi juures või selle ümber (Joonis 3) teise AP-1i pereliikme ΔFosB üleekspressioonil, kuid me ei leia ΔFosB otsest seondumist Cck promootor in vivo or vitro, isegi pärast selle üleekspressiooni.

Palju tööd on näidanud CREB rolli Cck promootori aktiivsus. The Cck CRE-sarnane sait on säilinud selgroogsetel (Hansen, 2001) ja mõnedes rakukultuuri testides seonduvad nii CREB kui ka AP-1 kompleksid selle saidiga ja on vajalikud Cck promootori tegevus (Haun ja Dixon, 1990; Deavall et al., 2000; Hansen, 2001). Lisaks on mitmed tuntud aktivaatorid Cck ekspressioon (kaasa arvatud bFGF, PACAP, peptoonid ja depolarisatsioon) toimivad CREB kaudu (Hansen et al., 1999; Deavall et al., 2000; Bernard et al., 2001; Gevrey jt, 2002; Hansen et al., 2004). Meie Ccklutsiferaasi reportergeeni andmed toetavad CRE-sarnase saidi olulist rolli Cck promootori aktiivsus, kuna selle saidi mutatsioon vähendab basaalset Cck promootori aktiivsus ja CckVP16-CREB poolt indutseeritud lutsiferaasi ekspressioon, CREB konstitutiivselt aktiivne vorm, kaob selle saidi muteerumisel (avaldamata vaatlus). Seega olime üllatunud, et CREB ei seostu Cck promootori striatsiooniekstraktides kas algtaseme või lühiajalise ΔFosB üleekspressiooni korral, kui CREB tasemed on suurenenud. See väidab, et CREB tasemed Rep ei ole ainsaks teguriks selle saidi sidumise summa kindlaksmääramisel ning seda toetavad ka teiste töö (Cha-Molstad jt, 2004). Kuna teiste eelnevalt tuvastatud CREB sihtmärkgeenide promootorid, nagu BDNF ja prodünorfiin, sidus CREB, oleme kindlad, et CREB ei ole siduv Cck promootor striatali tuumaekstraktides. Pealegi on CckΔFosB poolt põhjustatud lutsiferaasi aktiivsus ei sõltunud puutumata CRE-sarnasest saidist, mis viitab sellele, et ΔFosB ei reguleeri Cck CREBi otsese sidumise reguleerimisega Cck promootor.

Meie võimetus tuvastada CREBi, kes suhtleb Cck promootorit toetab Renthal et al. (2009), kes kasutas ChIP-kiipi, et vaadata pärast kroonilist kokaiini kokkupuudet fosforüülitud CREB (pCREB) ja ΔFosB seondumise striatumis globaalsete muutustega. Nendes katsetes immuniseeriti DNA-valgu kompleksid AFosB või pCREB antikehadega ja sadestunud DNA hübridiseeriti pärast märgistamist promootori mikrorihmaga. Kuigi paljud eelnevalt iseloomustatud CREB sihtmärkgeenid identifitseeriti selle lähenemisviisiga (nt. BDNF, prodünorfiin), Cck ei leitud. Lisaks on näidatud, et CREB sidumine konsensuse CRE saidiga on kultiveeritud rakuliinides väga erinev (Cha-Molstad jt, 2004). Kõik varasemad uuringud, mis leidsid CREBi koostoime Cck promootor viidi läbi rakukultuuris (mitte ajus, millest saadi meie EMSA ja ChIP proovid) ja kasutati geelsiirde analüüse valgu-DNA interaktsioonide uurimiseks. Kuigi EMSA suudab hinnata teguri potentsiaali seonduda DNA järjestusega, annavad ChIP analüüsid uudse ülevaate nendest interaktsioonidest in vivo. Lisaks sellele on suur osa andmetest, mis näitavad kas Cck promootori aktiivsus või CREB siduv Cck promootorid saadi rakkudest, mida stimuleerisid sellised faktorid nagu peptoonid (Bernard et al., 2001), depolarisatsioon (Hansen et al., 2004) või mitmesuguseid intratsellulaarsete signaaliülekandekaskaadide aktiveerijaid, kaasa arvatud cAMP ja ERK (Hansen et al., 1999). Meie katsetes oli ainus kasutatav stiimul ΔFosB üleekspressioon, mis on piisav, et indutseerida Cck väljend. Kokkuvõttes viitab see sellele, et CREB võime siduda (ja potentsiaalselt reguleerida) Cck promootor sõltub suuresti rakutüübist ja teatud signaaliradade aktiveerimisest. Lisaks sellele Cck CRE-sarnane promootorelement (vähemalt indutseerimata PC12-rakkudes ja hiire striatumis) ei ole kas CREB või ΔFosB otsene sihtmärk. Huvitav on see, et FosB CREB-i ekspressioon on samuti spetsiifiline rakutüübile ja stimulatsiooni tüübile. Anderssoni uuring et al. leidis, et CREB antisenss-oligonukleotiidide süstimine hiire striatumis inhibeeris osaliselt indutseerimist FosB pärast kokaiini manustamist (\ tAndersson et al., 2001). Kuid nad leidsid ka, et L-Dopa võime esile kutsuda FosB CREB antisenss-oligonukleotiidide olemasolu ei mõjutanud ekspressiooni 6-OHDA-ga kahjustatud striatumis.

Kuna CREB ja ΔFosB ilmselt kaudselt reguleerivad Cck promootor ja muutused kromatiini struktuuris on dokumenteeritud vastuseks mitmesugustele ΔFosB-d indutseerivatele stiimulitele (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), põhjendasime, et ΔFosB võib muuta promootori aktiivsust kaudselt, muutes kromatiini struktuuri. Siiski ei muutunud NFosB üle 2 nädalateks üleekspresseerivates hiirtes histooni H3 atsetüülimisel \ t Cck promootor (Tabel 1). Seda toetavad ChIP-kiibi andmed Renthal et al. (2009), kes teatasid, et atsetüülitud H3i sidumine ei muutunud Cck kroonilise kokaiiniga kokku puutunud hiirtel. Alates Cck promootor on striatumis aktiivne, ei oodata ega täheldatud repressiivset metüülitud histooni H3-i seondumist. Huvitav on ka see, et ΔFosB üleekspressioon atsetüülitud H3-i sidumisel ei muutunud. BDNF promootor (mis näitas CREB sidumise suurenemist) või CDK5 ja prodünorfiin promootorid (mis näitasid suurenenud ΔFosB sidumist). Kuna promootori aktiivsuse muutustega on seotud hulgaliselt histooni modifikatsioone (mida on läbi vaadanud Rando ja Chang, 2009) on tõenäoliselt ka teisi kromatiini modifikatsioone, mis seostuvad nende geenide indutseerimisega. Iga üksiku kromatiini modifikatsioon, kuigi sageli ennustav promootori aktiivsuse tase, ei pruugi teatud geeni aktiveerimise ajal muutuda. Tulevases töös oleks huvitav uurida teisi võimalikke muutusi kromatiini struktuuris Cck promootor pärast ΔFosB üleekspressiooni. Huvitav, krooniline kokaiin (tõenäoliselt kaudu ΔFosB induktsioon) on näidanud, et see kutsub esile sirtuiini 1 ja 2, III klassi histooni deatsetülaaside ekspressiooni, mis näivad muutvat neuronaalset füsioloogiat, ERK signaaliülekannet ja käitumuslikke vastuseid kokaiinile (Renthal et al., 2009). Histooni deatsetülaasi induktsioonil oleks võime samaaegselt reguleerida suure hulga geenide ekspressiooni kaudu globaalsed muutused kromatiini struktuuris.

Üks võimalik kandidaat Cck ΔFosB üleekspressiooni järgne regulatsioon oli AP-1 perekonna liige cFos. CFose väljendamist reguleerib CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004) ja cFose üleekspressioon (mis on kooskõlas selle siduva partneri cJun üleekspressiooniga) suureneb Cck promootori tegevus (Rourke et al., 1999). Seetõttu võib lühiajalise ΔFosB üleekspressiooni tõttu suurenenud CREB tasemed suurendada cFose taset ja põhjustada suurenenud seondumist Cck CRE-sarnane sait. cfos mRNA indutseeritakse hiirtel pärast kahe nädala ΔFosB üleekspressiooni (McClung ja Nestler, 2003) ja vähenenud kroonilise kokaiiniga või pikaajalise ΔFosB üleekspressiooniga \ tRenthal et al., 2008). Siin leiame, et cFos seob otse Cck promootor promenaalses koes, aga FosB üleekspressioon ei suurenda märkimisväärselt seondumist. See viitab sellele, et kuigi cFos võib olla seotud reguleerimisega Cck üldiselt ei ole cFoside sidumise muutumine tõenäoliselt mehhanism, millega ΔFosB reguleerib Cck väljend. Siiski on võimalik, et ΔFosB võib indutseerida kas translatsioonijärgseid muutusi cFosides (nt muutunud fosforüülimine) või indutseerida siduva partneri (nagu cJun) või kaasaktivaatori valgu ekspressiooni. Siiski, kuna puutumatu CRE-sarnane sait (mis on eelnevalt osutunud AP-1i komplekside seondumiskohaks, vt. Haun ja Dixon, 1990) ei ole selle suurendamiseks vajalik Cck osFosB üleekspressiooniga täheldatud promootori aktiivsus (mida hinnati meie reportergeeni katsetes) on põhjendatud, et ka teisi trans-mõjutavaid tegureid reguleerib ΔFosB.

. Cck meie lutsiferaasi reportergeeni eksperimentides kasutatud promootorfragment sisaldab konserveeritud Sp1-i sidumissaiti ja E-kasti (vaadanud Hansen, 2002). Eelkõige on näidatud, et E-kasti järjestused seovad arvukalt transkriptsioonifaktoreid (vaadatakse läbi Forrest ja McNamara, 2004). PC12 rakke kasutades oleme näinud, et E-kasti mutatsioon väheneb Cck promootori aktiivsus, kuid see ei muuda promootori vastust ΔFosB-le (andmeid ei ole näidatud). Huvitav, a CckLutsiferaasi reporter, mis sisaldab mutatsioone nii CRE saidis kui ka E-karbis, ei ole tuvastatav basaalaktiivsus ja ei reageeri ΔFosB üleekspressioonile (avaldamata vaatlus). Teine FosB toime potentsiaalne vahendaja Cck promootorid on ATF-id, mille teatud vormid on teadaolevalt põhjustatud striatumis kroonilise psühhostimulandi ekspositsiooni poolt (Green et al., 2008). Kuid me ei leidnud tõendeid nende ATF-de indutseerimise kohta FosB-ga (andmeid ei ole näidatud) ja ATF-idelt ei eeldata, et nad seonduksid muteeritud CRE-sarnase saidiga Cck promootor.

Selle uuringu üks hoiatus on see, et kasutame ΔFosB üleekspresseerimiseks bi-transgeenset süsteemi ja seega peab olema konservatiivne paralleelide vahel selle paradigma ja kroonilise kokaiini manustamise vahel. Kuid 11A transgeensed hiired annavad ainulaadse võimaluse uurida ΔFosB spetsiifilisi toimeid striatumis, kuna üleekspressioon piirdub selle aju piirkonnaga (Chen et al., 1998), samas kui kokaiini manustamine põhjustab muutusi paljudes teistes aju piirkondades, mis võivad kaudselt mõjutada striatumit. Lisaks on mitmed uuringud dokumenteerinud sarnaseid käitumuslikke ja molekulaarseid fenotüüpe 11A hiirtel võrreldes mitte-transgeensete loomadega, keda raviti kroonilise kokaiiniga (Kelz et al., 1999; McClung ja Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Lisaks sellele Bibb et al. (2001) teatas sarnane striatsiumi tase Cdk5 mRNA ja valgu induktsioon selles samas 11A tüves võrreldes kokaiiniga töödeldud mitte-transgeensete pesakonnakaaslastega, samuti sarnased muutused CDK5 sihtmärkides, p35 ja DARPP-32.

Kokkuvõttes leiame, et lühiajaline AFosB ekspressioon viib geenide indutseerimiseni striatumis mitmete mehhanismide kaudu. Nende hulka kuuluvad otsene promootori seondumine, CREB valgu indutseerimine ja aktiivsus, kromatiini modifitseerimine lisaks veel kindlaksmääratavatele radadele.

EKSPERIMENTLIKUD MENETLUSED

Loomad

Selles uuringus kasutati isaseid bi-transgeenseid 11A loomi (NSE-tTA x TetOP-AFosB) ja neid iseloomustatakse Kelz et al., 1999. ΔFosB üleekspresseerimiseks eemaldati hiired doksütsükliinist 3i ja 6-i nädala vanuste vahel, samas kui kontrolli hiirtel hoiti doksitsükliini. Kõik hiired paigutati rühmale ja neid hoiti 12: 12 valguse / pimeduse tsüklis, tuled 7 am'i juures ja tuli 7 pm ajal välja lülitatud, ad lib juurdepääs toidule ja veele. Kõik hiire katsed olid kooskõlas Dallasis asuva Texase Ülikooli Southwestern Medical Centeri loomade hooldamise ja kasutamise komitee poolt heakskiidetud protokollidega.

Reporter- ja ekspressiooniplasmiidid

Metsik (WT) Cck promootor-lutsiferaasi reporter valmistati pGL200-luc vektorisse (Promega) ligikaudu 3 bp PCR fragmendi sisestamisega. See fragment saadi hiire genoomse DNA-st (praimerid: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' ülesvoolu ja 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' allavoolu) ja sisestati algselt pGEM-T Easy vektorisse (Promega, # A1360). Seejärel klooniti promootori fragment pGL1-luc Kpn1 / Xho3 restriktsiooniensüümi saitidesse.

CRE punkti mutatsiooni loomiseks Cck promootor, mutageenne praimer, mis oli suunatud varem teatatud CRE-taolise saidi vastu (sense-praimer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGAAACA 3 ', antisenss-praimer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGAGenes Kombinatsioonikomplektis The Change . See teisendab teatatud CRE-laadse saidi (ACTGCGTCAGC) ACTGAGCTCC-ks. Kõiki reporterplasmiide kinnitati DNA järjestamise teel. ΔFosB ekspressiooniplasmiid sisaldab täispikka ΔFosB järjestust, mis on sisestatud pCDNA 3 mitmekordsesse kloonimiskohta ja mida on varem kirjeldatud (Ulery ja Nestler, 2007).

Rakukultuur ja DNA transfektsioonid

Roti feokromotsütoomirakke (PC12) hoiti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes F-12, millele oli lisatud 10% hobuse seerumit, 5% veise loote seerumit ja 1% penitsilliini / streptomütsiini temperatuuril 37 ° C ja 5% CO₂. Rakud transfekteeriti elektroporatsiooni teel, kasutades BTX 360 elektroporaatorit (350 V, 0 oomi ja 850 μF) 800 µl Dulbecco fosfaatpuhverdatud soolalahuses 4 mm tühimiküvettides 10 μg reporteri ja 5 μg ekspressioonikonstruktiga. DNA üldkoguste normaliseerimiseks kasutati tühja vektorplasmiidi (pCDNA). Pärast transfektsiooni kasvatati rakke märgitud aja jooksul 35 mm kollageeniga kaetud nõudel.

Lutsiferaasi testid

Kaks või kolm päeva pärast transfektsiooni pesti rakke 3 korda Dulbecco fosfaatpuhverdatud soolalahuses ja lüüsiti (kasutades 25 mM glütsüülglütsiini, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), koguti ja puhastati tsentrifuugimise teel. 30 μL lüsaati kombineeriti 140 μL lutsiferaasi analüüsipuhvriga (25 mM glütsüülglütsiin, 15 mM MgSO).₄4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM kaaliumfosfaat, 1 mM koensüüm A, pH 7.8). Luminestsentsaktiivsust mõõdeti FLx-800 mikroplaadi fluorestsentsi lugeja abil pärast 40 μL 1 mM lutsiferiini automaatset süstimist süvendi kohta. Lutsiferaasi aktiivsus normaliseeriti kogu valgusisaldusega, mis määrati BioRad valgu testiga.

Elektroforeetilise liikuvuse nihke analüüs

Bi-transgeensetest 11A hiirtest pärineva striatumi kahepoolsete kihtide tuumaekstraktid (mida hoitakse doksütsükliini või 2 või 8 nädalate puhul)McClung ja Nestler, 2003) valmistati vastavalt Huang ja Walters (1996). ³²P-märgistatud kaheahelalised oligonukleotiidi sondid valmistati, kasutades Promega Gel Shift analüüsi süsteemi protokolli (#E3300) ja sondid puhastati, kasutades Roche Quick Spin kolonne. Konsensuse CRE ja AP-1 sondide järjestused pärinevad Promega'lt (#E328A ja E320B) ja Cck CRE järjestused olid (Cck-CRE tähendus: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Sidumisreaktsioonid ja elektroforees viidi läbi, kasutades Promega Gel Shift analüüsi süsteemi protseduuri (#E3300) modifikatsioone. Märgistatud sondi 50,000 CPM kombineeriti 10 μg striataalse tuumaekstraktiga. Enne radiomärgistatud sondide sisestamist lisati külma konkurendi DNA või antikehad. Üleminekutestide puhul kasutati 2 μg CREB antikeha (Upstate Biotechnology # 06-083). Reaktsioonid elektroforeesiti 4% polüakrüülamiidi geelidel, kuivatati ja eksponeeriti kilega (kasutades intensiivistavaid ekraane 1 tund kuni 2 päeva).

Immunoblottimine

PC12 rakkude jaoks pesti transfekteeritud rakkude 35 mm plaate jääkülmas Dulbecco fosfaatpuhverdatud soolalahuses ja lüsaadid valmistati jääkülmas RIPA lüüsipuhvris (50 mM Tris, pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoksükolaat, 1%). % Triton X-100, 0.1% naatriumdodetsüülsulfaati) sisaldavad proteaasi inhibiitorid. Pärast ultraheliga töötlemist, puhastamist ja Bradfordi valgu analüüsi olid lüsaadid täielikult denatureeritud ja 50 μg igast proovist elektroforeesiti 10% SDS polüakrüülamiidi geelidel. Valgud viidi PVDF-i membraanile, blokeeriti 1 tund 3% rasvata kuivpiimas Tris-puhverdatud soolalahuses, mis sisaldas 0.1% Tween-20 (TBS-T piim), ja sondeeriti üleöö temperatuuril 4 ° C primaarsete antikehadega (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, kasutatud 1: 1,000 8795; GAPDH-Sigma # G1, kasutatud 80,000: 1 5,000), lahjendatud TBS-T piimas. Pärast mitmekordset pesemist TBS-T-s prooviti blotte ühe tunni jooksul toatemperatuuril, kasutades leeliselise fosfataasiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi (Sigma), lahjendatud 170: 6432 TBS-T piimas. Pärast mitmekordset pesemist Tris-puhverdatud soolalahuses viidi värvireaktsioon läbi vastavalt BioRad (# XNUMX-XNUMX) juhistele. Membraanid kuivatati üleöö, skaneeriti lameskanneril ja densitomeetria viidi läbi ImageJ abil (vt allpool).

Striatsiooniekstraktide puhul viidi läbi Western blot analüüsid, nagu varem avaldatud (Hope et al., 1994). Kuded eemaldati dekapiteeritud hiirtelt, asetati jääle ja lõigati aju maatriksile paksusega 1 mm. Seejärel võeti koe löögid ja külmutati -80 ° C juures kuni kasutamiseni. Kude töödeldi ultraheliga jääl modifitseeritud puhastuspõhises puhvris, mis sisaldas nii fosfataasi kui ka proteaasi inhibiitoreid (Roche, Sigma). Pärast ultraheliga töötlemist denatureeriti proovid keevas vees ja tsentrifuugiti 15,000xg juures 15 minuti jooksul; seejärel koguti ja töödeldi supernatanti; valgu kontsentratsiooni kogused määrati seejärel, kasutades Bradfordi analüüsi (Bio-Rad). Proove viidi läbi 10% akrüülamiidi / bisakrüülamiidi geelil, kanti PVDF membraanile, blokeeriti 5% piimas ja inkubeeriti primaarsete antikehadega (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Seejärel visualiseeriti blotid kemoluminestsentssüsteemi (Pierce) abil. Kõik proovid normaliseeriti GAPDH-ga (Fitzgerald, Concord, MA). Standardkõverad viidi läbi, et tagada testi lineaarses vahemikus.

Densitomeetria analüüs

PC12 immunoblotide puhul viidi densitomeetria analüüs läbi, kasutades ImageJ-i koos rodbardi kalibreerimisega. Igast mõõtmisest lahutati keskmine taustsignaal ja iga proovi jaoks arvutati CREB ja GAPDH signaali suhe. Striatali immunoblotide ja EMSA analüüsi puhul kasutati Scion Image 1.62c-i koos tausta lahutamisega.

Kromatiini immunosadestamine (ChIP)

ChIP testid viidi läbi vastavalt meetoditele Tsankova et al. (2004) ja Kumar et al. (2005). Lühidalt, doksütsükliinil või väljaspool seda hoitud 11A hiirte kahepoolsed striataalproovid seoti 1% formaldehüüdiga ja ristsildamine kustutati glütsiiniga (lõppkontsentratsioon 0.125 M). Need proovid pärinesid tervetest aju viiludest, mis võeti ajukoore tasemelt koos koorega. Kromatiin lõigati ultraheliga ultraheliga umbes 0.2 kuni 1 kb fragmentideni, puhastati proteiin G helmestega (Thermo Scientific # 22852) ja sisendproovid külmutati temperatuuril -80 ° C. Iga sademete jaoks kasutati 60–100 μg kromatiini. Kasutati 5-10 μg igat primaarset antikeha (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, atsetüülitud H3: Upstate Biotechnology # 06-599, metüleeritud H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruzi biotehnoloogia # SC-7202x). Antikeha-kromatiini kompleksid immunosadestati proteiin G pluss helmestega vastavalt valmistamise juhistele (Thermo Scientific # 22852). Pärast sisestatud ja sadestatud proovide ristsildamist tehti igale proovile kvantitatiivne PCR (qPCR). Kõigi nende antikehade kasutamine ChIP jaoks on ulatuslikult kinnitatud (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Valguga seondumise tase iga huvipakkuva geeni promootori puhul määrati, mõõtes seostatud DNA kogust qPCR-ga (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). SYBR Green (Applied Biosystems, CA) juuresolekul amplifitseeriti sisend või kogu DNA (mitteimmunosadestatud) ja immunosadestatud DNA kolmekordselt. Iga proovi Ct väärtused saadi, kasutades Sequence Detector 1.1 tarkvara. Malli DNA suhteline kvantifitseerimine viidi läbi kasutades ΔΔCt meetodit (Tsankova et al., 2004). Kasutatud praimerid: BDNF promootor 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 promootor: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck promootor: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodünorfiini promootor: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statistiline analüüs

Kõik andmed esitatakse kui keskmised ± keskmise viga. Statistiline erinevus määrati üliõpilase kahe sabaga t-testiga (p <0.05). Kui tehti mitu võrdlust, korrigeeriti p-väärtused Bonferroni paranduse abil.

Tänusõnad

Tahaksime tänada Will Renthalit ja Arvind Kumari kasulike arutelude eest. Samuti sooviksime tänada NIDA-d nende katsete rahastamise eest.

Allmärkused

Kirjastaja vastutusest loobumine: See on PDF-fail, mis on avaldamata avaldatud käsikirjast. Teenusena meie klientidele pakume seda käsikirja varajast versiooni. Käsikiri läbib kopeerimise, trükkimise ja selle tulemuste läbivaatamise enne selle lõplikku avaldamist. Pange tähele, et tootmisprotsessi käigus võidakse avastada vigu, mis võivad mõjutada sisu ja kõik ajakirja suhtes kehtivad õiguslikud lahtiütlused.

Klassifikatsioonitingimused:

Jaotis: Närvisüsteemi rakkude ja molekulaarbioloogia #1

viited

Andersson M, Konradi C, Cenci MA. cAMP vastuse elementi siduv valk on vajalik dopamiinist sõltuva geeniekspressiooni jaoks terves, kuid mitte dopamiini denerveeritud striatumis. J Neurosci. 2001: 21: 9930 – 43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. CREB aktiivsus tuuma accumbens shellis kontrollib emotsionaalsetele stiimulitele käitumuslike reaktsioonide värbamist. Proc Natl Acad Sci US A. 2002, 99: 11435 – 40. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Kokaiiniravi suurendab ärkveloleku, vabalt liikuvate rottide rakusisene koletsüstokiniin (CCK), mis on kokaiini suhtes tundlikult tundlikel rottidel suurem. J Neurochem. 2002: 81: 1021 – 7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptoonid stimuleerivad soole koletsüstokiniini geeni transkriptsiooni tsükliliste adenosiinmonofosfaadi vastuselementide sidumisfaktorite kaudu. Endokrinoloogia. 2001: 142: 721 – 9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Kroonilise kokkupuute mõju kokaiinile reguleerib neuronaalne valk Cdk5. Loodus. 2001: 410: 376 – 80. [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Transkriptsioonifaktori CREB rakutüüpi spetsiifiline seondumine cAMP-vastuse elemendiga. Proc Natl Acad Sci US A. 2004, 101: 13572 – 7. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Delta FosB ja FosB-sarnaste valkude reguleerimine elektrokonvulsiivsete krampide ja kokaiiniga töötlemise teel. Mol Pharmacol. 1995: 48: 880 – 9. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgeensed loomad, kellel on indutseeritav, suunatud geeniekspressioon ajus. Mol Pharmacol. 1998: 54: 495 – 503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Tsükliin-sõltuva kinaasi 5 induktsioon hippokampuses krooniliste elektrokonvulsiivsete krampide poolt: ΔFosB roll. J Neurosci. 2000: 20: 8965 – 71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Paljude erinevate kohtumiste sulgemine: Fos-Jun interaktsioonid, mis vahendavad transkriptsiooni regulatiivset spetsiifilisust. Onkogeen. 2001: 20: 2438 – 52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Neuronaalne kohanemine amfetamiini ja dopamiiniga: prodünorfiini geeni regulatsiooni molekulaarsed mehhanismid roti striatumis. Neuron. 1995: 14: 813 – 23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. CCK geeni transkriptsiooni kontroll PACAP-i poolt STC-1 rakkudes. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000: 279: G605 – 12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Koletsüstokiniini mRNA sisalduse dopaminergiline regulatsioon roti striatumis. Brain Res Mol Brain Res. 1992: 12: 77 – 83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Id transkriptsioonifaktorite perekond ja vaskulaarse kahjustuse moodustumine. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004: 24: 2014 – 20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Tsüklilise AMP- ja kaltsium-sõltuva proteiinkinaasi ühine nõue koletsüstokiniini geeni transkriptsiooniliseks aktiveerimiseks valgu hüdrolüsaatide abil. J Biol Chem. 2002: 277: 22407 – 13. [PubMed]
Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. ATF2i, ATF3i ja ATF4i aktiveerivate transkriptsioonifaktorite (ATFX) aktiveerimine ja nende emotsionaalse käitumise reguleerimine. J Neurosci. 2008: 28: 2025 – 32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Dopamiini ja koletsüstokiniini ülevool rottide tuumas accumbensis vastuseks ägeda ravimi manustamisele. Synapse. 2000: 38: 238 – 42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogeeniga aktiveeritud valgukinaas ja valgukinaas A signaalirajad stimuleerivad koletsüstokiniini transkriptsiooni tsüklilise adenosiini 3 ', 5'-monofosfaadi vastuse elementi siduva valgu aktiveerimise kaudu. Mol endokrinool. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Neuronaalse koletsüstokiniini geeni transkriptsiooni reguleerimine. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001: 234: 61 – 7. [PubMed]
Hansen TV. Koletsüstokiniini geeni transkriptsioon: promootorelemendid, transkriptsioonifaktorid ja signalisatsioonirajad. Peptiidid. 2001: 22: 1201 – 11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl ja forskoliin reguleerivad koletsüstokiniini geeni ekspressiooni sünergistlikult CREB ja ko-aktivaatori CBP koordinaatide aktiveerimise kaudu. J Neurochem. 2004: 89: 15 – 23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Roti koletsüstokiniini geeni ekspressiooniks vajalik transkriptsiooni võimendaja sisaldab järjestust, mis on identne inimese c-fos geeni -296 elemendiga. J Biol Chem. 1990: 265: 15455 – 63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB geeni oluline roll krooniliste elektrokonvulsiivsete krampide molekulaarses, rakulises ja käitumuslikus tegevuses. J Neurosci 1998. 1998: 18: 6952 – 62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Tõendid dopamiini ja CCK kooseksisteerimise kohta meso-limbilistes neuronites. Loodus. 1980: 285: 476 – 8. [PubMed]
Lootus BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Kroonilise elektrokonvulsiivse krambihoogu (ECS) ravi tulemuseks on pikaajaline AP-1 kompleksi ekspressioon muutunud koostisega ja omadustega ajus. J Neurosci. 1994: 14: 4318 – 28. [PubMed]
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Pikaajalise AP-1i kompleksi indutseerimine, mis koosneb muutunud Fos-tüüpi valkudest ajus kroonilise kokaiini ja teiste krooniliste ravimitega. Neuron. 1994: 13: 1235 – 44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. AP-1i transkriptsioonifaktori DNA seondumisaktiivsuse dopamiinergiline regulatsioon roti striatumis. Neuroteadus. 1996: 75: 757 – 75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. CREB reguloni määratlemine: transkriptsioonifaktorite reguleerivate piirkondade genoomiline analüüs. Cell. 2004: 119: 1041 – 54. [PubMed]
Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Mis lülitab CREB sisse? Cell Signal. 2004: 16: 1211 – 27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. CCK (A) ja CCK (B) antagonistide vastandlik toime konditsioneeritud aktiivsuse arengule rottidel. Behav Pharmacol. 1996: 7: 505 – 512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Tõendid CCK (A) retseptorite kaasamise kohta kokaiini tekitatud konditsioneeritud aktiivsuse omandamises rottidel. Brain Res. 1997: 763: 93 – 102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Transkriptsioonifaktori deltaFosB ekspressioon ajus kontrollib kokaiini tundlikkust. Loodus. 1999: 401: 272 – 6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Kromatiini remodelleerumine on peamine mehhanism, mis põhineb kokaiini tekitatud plastilisusel striatumis. Neuron. 2005: 48: 303 – 14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Kokaiini poolt põhjustatud CREB fosforüülimine kokaiinitundlike rottide tuumas on võimalik ekstratsellulaarse signaaliga seotud kinaasi, kuid mitte proteiinkinaasi A. J Neurochem'i aktiveerimise abil. 2005: 95: 1481 – 94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Geeniekspressiooni ja kokaiini tasu reguleerimine CREB ja DeltaFosB poolt. Nat Neurosci. 2003: 6: 1208 – 15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekulaarne lüliti aju pikaajaliseks kohanemiseks. Brain Res Mol Brain Res. 2004: 132: 146 – 54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: Pikaajalise neuraalse ja käitumusliku plastilisuse molekulaarne vahendaja. Brain Res. 1999: 835: 10 – 17. [PubMed]
Nestler EJ. Kas on olemas üldine molekulaarne tee sõltuvuse jaoks? Nat Neurosci. 2005: 8: 1445 – 9. [PubMed]
Nestler EJ. Sõltuvuse transkriptsioonimehhanismid: DeltaFosB roll. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008: 363: 3245 – 55. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB indutseerimise eritunnused ajus kuritarvitatavate ravimitega. Synapse. 2008: 62: 358 – 69. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY. Kromatiini struktuuri genoomi hõlmavad vaated. Annu Rev Biochem. 2009: 78: 245 – 71. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB vahendab c-fos geeni epigeneetilist desensibiliseerimist pärast kroonilist amfetamiini ekspositsiooni. J Neurosci. 2008: 28: 7344 – 9. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Kokaiini kromatiini reguleerimise genoomiga hõlmav analüüs näitab sirtuiinide rolli. Neuron. 2009: 62: 335 – 48. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Mesolimbilise dopamiini funktsiooni koletsüstokiniini moduleerimine: motiveeritud käitumise reguleerimine. Pharmacol Toxicol. 2002: 91: 404 – 13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negatiivne koostalitlusvõime koletsüstokiniini geeni promootori e-kasti ja cAMP / TPA vastavate elementide vahel. FEBS Lett. 1999: 448: 15 – 8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. CRE-vahendatud transkriptsiooni piirkondlik ja rakuline kaardistamine naltreksooni sadestunud morfiini ärajätmise ajal. J Neurosci. 2002: 22: 3663 – 3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. CRE-vahendatud transkriptsiooni reguleerimine hiire ajus amfetamiiniga. Synapse. 2003: 48: 10 – 7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membraanide depolarisatsioon ja kaltsium indutseerivad c-fos transkriptsiooni transkriptsioonifaktori CREB fosforüülimise teel. Neuron. 1990: 4: 571 – 82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Histooni modifikatsioonid geeni promootori piirkondades roti hipokampuses pärast akuutseid ja kroonilisi elektrokonvulsiivseid krampe. J Neurosci. 2004: 24: 5603 – 10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. DeltaFosB transkriptsiooni aktiivsuse reguleerimine fosforüülimisega Ser27. Eur J Neurosci. 2007: 25: 224 – 30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Nucleus accumbens dopamiin-CCK interaktsioonid psühhostimuleeriva tasu ja sellega seotud käitumiste puhul. Neurosci Biobehav Rev. 1992: 18: 207 – 14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: ΔFosB oluline osa morfiini toimel tuumasõlmedes. Nature Neurosci. 2006: 9: 205 – 11. [PubMed]