PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstraktne
Kokaiini põhjustatud muutused geeniekspressioonis põhjustavad muutusi neuronaalses morfoloogias ja käitumises, mis võib alustada kokaiini sõltuvust. Me tuvastasime histooni 3 lüsiini 9i (H3K9) dimetüülimise ja lüsiindimetüültransferaasi G9a olulise rolli kokaiinist põhjustatud struktuurses ja käitumuslikus plastilisuses. Korduv kokaiini manustamine vähendas H3K9i dimetüülimise globaalset taset tuuma accumbensis. Ttema histooni metüülimise vähenemist vahendas G9a represseerimine selles aju piirkonnas, mida reguleeris kokaiini poolt indutseeritud transkriptsioonifaktor ΔFosB. Kasutades tingimuslikku mutageneesi ja viiruse poolt vahendatud geeniülekannet leidsime, et G9a alamreguleerimine suurendab dendriitide selgroo plastilisust tuumakumbaatide neuronites ja suurendab kokaiini eelistamist, luues seega histooni metüülimise olulise rolli kokaiini pikaajalistes toimingutes.
Sissejuhatus
Korduva kokaiini ekspositsiooni iseloomustavad püsivad muutused geeniekspressioonis ja muutunud neuronaalses morfoloogias tuuma accumbensis (NAc), mis on peamise ajukomponendi komponent.1-2). Kromatiini remodelleerimine on oluline aju piirkonnas esinevate ebanormaalsete transkriptsioonimuutuste puhul, mis võivad olla kokaiini sõltuvuse aluseks (3-9). Kromatiini struktuuri kokaiini reguleerimine NAc-s tuleneb osaliselt kromatiini ensümaatilise masina otsestest kokaiinist põhjustatud modifikatsioonidest, mis põhjustab histooni atsetüülimise ja fosforüülimise muutusi (4, 7-9); siiski ei ole histooni metüülimist kontrollivate ensüümide rolli veel uuritud.
Hiljutine genoomiga hõlmatud promootoranalüüs, milles kasutati kromatiini immunosadestamist, mis on ühendatud mikrokiipidega (ChIP-Chip), tuvastas replikeeriva histooni H3 lüsiini 9 (H3K9) ja 27 (H3K27) metüülimise muutunud mustreid teatud korduval kokaiiniravi ajal NAc-s.6). Seetõttu profiliseerisime arvukalt lüsiinmetüültransferaase (KMT) ja demetülaase (KDM), mis teadaolevalt kontrollivad H3K9 või H3K27 metüülimist (Joonis 1A). Ainult kaks ensüümi, G9a ja GLP, näitasid püsivat transkriptsiooni regulatsiooni 24 tundi pärast korduvat kokaiini manustamist, kui mõlema geeni ekspressioon oli oluliselt vähenenud. Kuna G9a ja GLP katalüüsivad spetsiifiliselt H3K9 (H3K9me2) dimetüülimist, on nende kokaiinireguleerimine kooskõlas selles ajapunktis täheldatud euchromatic H3K9me2 vähenenud globaalsete tasemetega.Joonis 1B). Heterokromaatilise H3K27 metüülimise globaalsed tasemed ei muutunud kokaiini korduva ekspositsiooni tõttu (Joonis S1 online-materjali toetamisel). Nende kõrge katalüütilise aktiivsuse tõttu vitro ja in vivo (10) püüdsime edasi uurida G9a represseerimise funktsionaalset tähtsust pärast korduvat kokaiini kokkupuudet NAc-s. G9a valgu tasemed, nagu tema mRNA tasemed, vähendasid oluliselt korduvat kokaiini manustamist 24 tundi (Joonis S2). Kuigi G9a mRNA ekspressioon vähenes NAc-s 35%, näitas immunohistokeemiline analüüs G15a valgu tasemete tagasihoidlikumat 9% vähenemist, mis on kooskõlas korduva kokaiini manustamise järgse H21K3me9 2% vähenemisega (Joonis 1B). G9a mRNA ekspressiooni vähendati ka selles aju piirkonnas 20% pärast kokaiini korduvat manustamist (Joonis S3).
Et teha kindlaks, kas muutused euchromatic H3K9me2-is korreleeruvad geeniekspressiooni genoomi ulatuslike muutustega NAc-s, kasutasime mikrokriisianalüüse, et uurida geeniekspressiooni profiile, mida indutseeris kokaiiniprobleemide doos loomadel, kellel on varem esinenud kokaiini ekspositsiooni või ilma selleta geenide nimekirjad Tabelid S1 – S3). Korduva kokaiini saanud loomadel ilmnes dramaatiliselt suurenenud geeniekspressioon 1 tund pärast kokaiiniprobleemi võrreldes akuutselt ravitud loomadega (Joonis 1C). See suurenenud geeniekspressioon tekkis ka vastusena kokaiiniprobleemile, mis manustati pärast 1i nädalast korduvast kokaiinist väljumist. Kooskõlas eelnevate aruannetega ilmnes väike protsent geenidest (~ 10%) pärast korduvat kokaiini manustamist desensibiliseeritud transkriptsiooni vastuseid (Joonis 1C; vaata Tabel S1) (5). Et uurida G9a vähenemise tähtsust korduva kokaiini järel täheldatud suurenenud geeniekspressioonis, said hiired GFP või G9a ekspresseerivate Herpes simplex viiruse (HSV) vektorite sisese NAc süstid ja neid töödeldi soolalahusega või korduva kokaiiniga, et määrata, kas G9a üleekspressioon oli piisav, et blokeerida korduva kokaiini poolt indutseeritud geeniekspressiooni paranemist. 12i juhuslikult valitud geenide hulgast, millel oli korduv kokaiin pärast kõrgendatud ekspressioonitasemeid, täheldasime, et G9a vähendas oluliselt nende geenide 50% suurenenud ekspressiooni (Tabel S4).
Et kindlaks teha ülesvoolu transkriptsioonilised sündmused, mis vahendavad korduvat kokaiini poolt indutseeritud G9a ekspressiooni repressiooni, uurisime αFosB võimalikku rolli, mis on väga stabiilse varase geeni stabiilse sidumise produkt fosB. ΔFosB koguneb NAc-sse pärast korduvat kokaiiniga kokkupuudet, kus see on seotud suurenenud kokaiini tasuga (11). ΔFosB võib toimida kas transkriptsiooni aktivaatorina või repressorina sõltuvalt kaasatud geenist (3, 5, 6, 12). Bitransgeensete NSE-tTA × tetOP-ΔFosB hiired, kus ΔFosB ekspressiooni võib indutseerida selektiivselt täiskasvanud loomade NAc ja dorsaalses striatumis (13), uurisime ΔFosB väljenduse mõju kokaiini reguleerimisele H3K9me2i ja KMT-des NAc-s. ΔFosB üleekspressioon oli piisav nii H3K9me2i (Joonis 1D) ja G9a väljend (Joonis 1E), mis jäljendab korduva kokaiini mõju. Seevastu AFosB ei vähendanud GLP ekspressiooni selles aju piirkonnas ja tal ei olnud mõju SUV39H1ile ja EZH2ile, mis on peamised trimetüülivad ensüümid H3K9 ja H3K27 jaoks.Joonis S4). Nende andmete kinnitamiseks, kasutades sõltumatut AFosB üleekspressioonisüsteemi, said metsikut tüüpi täiskasvanud hiired Adeno-seotud viiruse (AAV) vektorite kahepoolseid intra-NAc süstimisi, mis ekspresseerisid kas GFP või ΔFosB. ΔFosB viiruse poolt vahendatud üleekspressioon vähendas G9a ekspressiooni taset selles aju piirkonnas (Joonis 1E).
Selline G9a selgesõnaline ja spetsiifiline regulatsioon ajendas meid uurima, kas G9a ekspressiooni muutmine spetsiifiliselt NAc neuronites reguleerib käitumisreaktsioone kokaiiniga. Metsikut tüüpi hiired said GFP või G9a ekspresseerivate HSV vektorite intra-NAc süste ja neid analüüsiti seejärel erapooletu kokaiiniga konditsioneeritud kohtade eelistuse paradigmaga, mis annab ravimi tasu kaudse mõõtmise. G9a viiruse üleekspressioon NAc neuronites kinnitati käitumiskatsete järel (Joonis 2A). G9a üleekspressioon vähendas oluliselt kokaiini eelistamist võrreldes loomadega, kes GFP-d üleekspresseerisid (Joonis 2B) ja kasvanud H3K9me2 tasemed NAc-s (Joonis 2C). G9a (G9aH1093K) katalüütiliselt surnud mutandi üleekspressioon (14) ei mõjutanud kokaiini eelistusi (Joonis 2B) ja ei mõjutanud H3K9me2 taset selles aju piirkonnas (Joonis 2C).
Täiendavalt uurida G9a rolli kokaiini käitumishäiretes ja täpsemalt imiteerida korduvat kokaiini põhjustatud G9a ekspressiooni repressiooni NAc-s, täiskasvanud G9a-sfl / fl hiired (14) said Cre-rekombinaasi või GFP-d ekspresseerivate AAV-vektorite intravenoossete NAc-süstide. G9a AAV-Cre knockdown NAc-s, mis kinnitati immunohistokeemiliselt (Joonis S5) suurendas märkimisväärselt kokaiini mõju konditsioneerimiskatsetele ja vähendas H3K9me2 taset NAc-s (Joonis 2D, E). G9a ja GLP kaubanduslikult kättesaadav farmakoloogiline inhibiitor, BIX01294 (15-16) kasutati selleks, et teha kindlaks, kas ensüümi inhibeerimine mõjutab sarnaselt käitumisreaktsioone kokaiiniga. Tõepoolest, G9a ja GLP farmakoloogiline pärssimine suurendas oluliselt kokaiini eelistamist ja vähendas H3K9me2i NAc-s (Joonis 2F, G).
Kokaiini korduv manustamine suurendab dendriitrakkude tihedust NAc keskmiste närviliste neuronite korral (17) protsess, mis on seotud nende neuronite glutamatergiliste sünapside funktsionaalsete muutustega (18-19) ja sensibiliseeritud käitumuslikud reaktsioonid ravimile (\ t17, 20). Seega oletasime, et G9a aktiivsuse vähenemine korduval kokaiinil NAc-s võib vahendada kokaiini võimet reguleerida NAc neuronite dendriitrakkude tihedust. Kasutades kromatiini immunosadestamist (ChIP) anti-G9a antikehaga, tuvastasime NAc-s mitu oletatavat G9a geeni sihtmärki, millest igaüks on eelnevalt seotud kokaiiniga indutseeritud dendriitilise plastilisusega (Joonis 3A) (20-26). Me leidsime, et korduv kokaiini manustamine vähendas märkimisväärselt G9a seondumist, samuti H3K9me2i tasemeid nendes geenipromootorites (Joonis 3B). Seevastu akuutne kokaiini manustamine värbas G9a kiiresti samadele geeni promootoritele, mis on kooskõlas suurenenud G9a ekspressiooniga, mida täheldati NAc 1-tund pärast ägeda kokaiini annuse manustamist (Joonis S6). Kuigi G9a seondumine spetsiifilistes geeni promootorites korreleerub selle ekspressiooni muutustega, jääb ebaselgeks, kas selliseid sündmusi vahendavad G9a muutunud globaalsed tasemed NAc-s ja / või erinevused G9a värbamisel ägeda vs korduv kokaiini manustamine.
Lähtudes G9a reguleerimisest mitmetes plastiilsusega seotud geenides NAc-s, uurisime otseselt, kas G9a ekspressiooni säilitamine selles ajupiirkonnas pärast korduvat kokaiiniravi oli piisav kokaiiniga indutseeritud dendriitrakkude moodustumise blokeerimiseks. Kasutades varem kokaiiniravi protokolli, mis demonstreerib dendriitide selgroo induktsiooni NAc-s (20), uurisime selgroo tihedust loomadel, keda süstiti kas HSV-GFP või HSV-G9a. Vastavalt eelmistele järeldustele täheldasime kokaiiniravi järgselt märkimisväärset dendriitrakkude tiheduse suurenemist NAc-s, mis on täielikult G9a üleekspressiooniga blokeeritud (Joonis 3C). Ainuüksi G9a üleekspressioon ei olnud piisav NAc dendriitilise selgroo tiheduse vähendamiseks kokaiini puudumisel. Nende andmete täiendamiseks G9afl / fl hiirtele manustati HSV-Cre-s intravenoosselt NAc-siseseid süstlaid ja selgroo tihedus määrati ja võrreldi loomadega, kes said HSV-GFP-d kokaiini puudumisel. G9a ekspressiooni vähenemine suurendas oluliselt selgroo tihedust NAc keskmise spinni neuronitel (Joonis 3C).
Arvestades tõendeid selle kohta, et G9a vähenemine NAc-s pärast korduvat kokaiini vahendatakse ΔFosB poolt, uurisime järgnevalt, kas see transkriptsioonifaktor on samuti kaasatud NAc dendriitrakkude reguleerimisse. Kuigi ΔFosB ei ole eelnevalt põhjuslikult seotud sellise dendriitilise plastilisusega, on mitmed selle eesmärgid, sealhulgas Cdk5 ja NFkB alamühikud, olnud nii seotud (20-23), ja FosB püsiv ekspressioon NAc neuronites korreleerub suurenenud dendriitrakkude tihedusega pärast korduvat kokaiiniravi (27). Esiteks leidsime, et ΔFosB indutseerimine bitransgeensetes hiirtes kokaiini puudumisel, mis vähendas G9a ja H3K9me2 ekspressiooni (Joonis 1D, E), vähenes G9a seondumine arvukate plastilisusega seotud geenidega, millest paljud on näidanud ka ΔFosB enda otseseid sihtmärke (Joonis 3D) (3, 6). Järgnevalt näitasime, et ΔFosB viiruse üleekspressioon NAc-s suurendas oluliselt dendriitide selgroo tihedust põhitingimustes, sarnane korduva kokaiini manustamisega (Joonis 3E). Vastupidi, ΔJunD, domineeriva negatiivse mutantse valgu, mis antagoniseerib ΔFosB transkriptsioonilist aktiivsust, üleekspressioon NAc-s blokeeris korduva kokaiini võimet suurendada dendriitrakkude moodustumist NAc-s (Joonis 3C).
Meie tähelepanek, et ΔFosB reguleerib G9a ekspressiooni NAc-s ja et ΔFosB ja G9a reguleerivad mõningaid samu sihtgeene, viisid meid uurima teisi interaktsioone ΔFosB ja G9a vahel. Pärast ägeda kokaiini suurenemist, kui G9a tasemed suurenesid, seondus G9a fosB geen oli suurenenud, samal ajal kui korduva kokaiini järel, kui G9a ekspressioon oli pärsitud, G9a seondub fosB vähenenud geen (Joonis 3A). Sellist vähenenud G9a seondumist pärast korduvat kokaiini ei täheldatud c-fos, kus G9a seondumist suurendab korduv kokaiin (Joonis S7). See on kooskõlas sellega, et erinevalt fosB, c-fos kroonilise psühhostimulandi kokkupuute tõttu represseeritakse, mitte põhjustatud \ t5). AFosB üleekspressioon bitransgeensetes hiirtes oli piisav, et oluliselt vähendada G9a seondumist \ t fosb geen (Joonis 3D). Lisaks oli G9a üleekspressioon piisav, et vähendada korduva kokaiini manustamise järgselt suurenenud AFosB ekspressiooni (Tabel S4). Need andmed viitavad autoregulatsiooni ahelale, mille kohaselt G9a piirab algul AFosB indutseerimist ägeda kokaiini manustamisega. Kuid kuna ΔFosB koguneb korduva ravimi eksponeerimisega, surub see G9a tagasi ja võimendab seeläbi oma edasist induktsiooni.
Kokkuvõttes oleme näidanud, et histooni lüsiini metüülimine NAc-s on kriitiliselt seotud neuronite geeniekspressiooni reguleerimisega kokaiinile reageerimisel. G9a ja H3K9me2 represseerimine pärast korduvat kokaiini manustamist soodustab kokaiini eelistust, osaliselt paljude geenide transkriptsioonilise aktivatsiooni kaudu, mis teadaolevalt reguleerivad dendriitilise plastiilsuse kõrvalekalduvaid vorme. Selliste mehhanismide kaudu reguleeritavate geenide parem mõistmine parandab meie teadmisi narkomaania keerulisest bioloogilisest alusest ja võib aidata kaasa sõltuvushäirete tõhusamate ravide väljatöötamisele.
Materjalid ja meetodid
Loomad ja ravi
Kui ei ole teisiti öeldud, hoiti hiiri 4 kuni 5 puuri kohta koloonias, kus oli 12 tunni valgus / tume tsükkel (tuled 7: 00 AM kuni 7: 00 PM) konstantsel temperatuuril (23 ° C) koos ad libitum juurdepääs veele ja toidule. IACUC kiitis heaks kõik loomkatsete protokollid nii UT Southwestern Medical Centeris kui ka Sinai Mount Mount Schoolis.
Kokaiiniuuringute puhul kasutati [immunohistokeemitry, western blotting, kvantitatiivne PCR (qPCR), mikrokriisi analüüs ja kromatiini immunosadestamine (ChIP)], 8-10-nädala vanuseid isaseid C57BL / 6J hiiri. Loomadele manustati iga päev kas "soolalahust" (7-i soolalahus, ip), "äge" kokaiin (6-i soolalahus + üks ravi 20 mg / kg kokaiin-HCl, ip) või "korduv" kokaiin (7-ravi 20 mg / kg kokaiin-HCl, ip). Hiired surmati kas 1 tunnis või 24 tundi pärast lõplikku ravi. Microarray uuringute puhul töödeldi loomi iga päev kas "soolalahusega" (15-i soolalahus, ip), "äge" kokaiin (14-ravi soolalahusega + 1-ravi 20 mg / kg kokaiini-HCl, ip), "korduv + äge" kokaiin ( 7-ravi soolalahus + 8-ravi 20 mg / kg kokaiin-HCl, ip) või „korduv äravõtmine + äge” kokaiin (7-ravi 20 mg / kg kokaiini-HCl + 7-ravi soolalahus + 1-ravi 20 mg / kg kokaiin-HCl, ip) ja surmati 1 tundi pärast lõplikku ravi. Käitumiskatsetes hoiti hiiri ükshaaval pärast operatsiooni ja neid töödeldi 10 mg / kg kokaiin-HCl-ga, ip, nagu allpool kirjeldatud. Dendriitide selgroo analüüsi ja microarray valideerimise järel pärast HSV-GFP ja HSV-G9a-GFP infektsiooni raviti hiirtele "soolalahusega" (5 ravi soolalahus, ip) või "korduv kokaiin" (5 ravi 20 mg / kg kokaiin-HCl, ip. ) 3i päevade jooksul, kuna see süstimisprotokoll on eelnevalt näidanud, et see suurendab selgroo tihedust tuuma accumbens (NAc) neuronitel Herpes simplex viiruse (HSV) transgeeniekspressiooni aja jooksul.Täiendav ref S1). Dendriitrakkude analüüsiks kasutatud hiired surmati 4 tundi pärast viimast ravi.
GCNUMXa transkripti lokaliseeritud deletsiooni indutseerimiseks, mis piirdus NAc neuronitega, kasutasime mutantseid hiiri, kes olid homoksigootsed floxed G9a alleeli suhtes, mida on üksikasjalikult kirjeldatud mujal (S2). Cre-indutseeritud rekombinatsioon tekitab 22-i ekson-25-i kaadrilisele splaissimisele, mille tulemuseks on muteerunud transkripti nonsenss-vahendatud lagunemine. Me kasutasime G9a floxed hiiri, mis olid täielikult tagasi C57BL / 6J hiirtele. Hiiri steriliseeriti NAc-sse Adeno-seotud viiruse (AAV) vektoritega (serotüüp 2), mis ekspresseerisid GFP või Cre-GFP 7i ja 10 nädalate vahel. Cre-vahendatud rekombinatsiooni efektiivsuse kontrollimiseks kasutati immunohistokeemilist analüüsi (vt. \ T Täiendav joonis S5). Me kasutasime AAV-ga süstitud loomi 21 päeva pärast operatsiooni, sest rekombinatsioon G9a floxed hiirtel oli stabiilne ja maksimaalne sellel ajahetkel, kooskõlas avaldatud aruannetega (S3-S4). G9a ja AJunD üleekspressioonikatsed viidi läbi sarnaselt, kasutades HSV viiruse vektoreid, mis ekspresseerisid kas GFP, metsiktüüpi G9a-GFP, katalüütiliselt surnud G9aH1093K-GFP või ΔJunD-GFP (vt S2 üksikasjad G9a konstruktsioonide väljatöötamise kohta). HSV üleekspresseerivaid hiiri kasutati 3 päeva pärast operatsiooni, kuna üleekspressioon oli sellel ajahetkel maksimaalne, nagu täheldati immunohistokeemia abil. HSV ekspressiooni lühiajalise iseloomu ja AAV ekspressiooni oluliselt stabiilsema olemuse tõttu kasutati HSV vektoreid kiiret lühiajalist transgeeni ekspressiooni nõudvates katsetes, samas kui AAV vektoreid kasutati katses, mis nõudis transgeeni ekspressiooni pikendatud perioode. Mõlemad vektorid on ulatuslikes varasemates uuringutes näidanud, et nad nakatavad ainult neuronaalsete rakkude keha süstitud aju piirkonnas ilma afferentsete või efferentsete neuronite nakatamiseta.
Farmakoloogilise G9a / GLP inhibiitori, BIX01294i (25 ng / μl) käitumuslike katsete puhul implanteeriti hiired NAc-sse kahe subkutaanse minipumbaga, samuti kahepoolse juhtkanüüliga. Minipumbad aktiveeriti 12 tundi enne implanteerimist, alustades kas kandja (0.25 hüdroksüpropüül-P-tsüklodekstriini) või ravimi pidevat manustamist (5 μl / tunnis) 14i päevadel, mille jooksul tehti käitumuslikud hinnangud.
ΔFosB üleekspressioonikatse [western blotting, qPCR ja ChIP] puhul on isasbitransgeensed NSE-tTA × tetOP-ΔFosB hiiri kasutati (10-nädalased), kusjuures tetratsükliini derivaadi doksitsükliini (8-nädalad doxitsükliini ärajäämisest) puudumisel ilmnesid loomad ΔFosB-le tugeva striaadi piiratud konstitutiivse ekspressiooni (S5). FosB üleekspressioon nendes hiirtes kinnitati qPCR abil. Tulemuste kinnitamiseks NSE-tTA × tetOP-ΔFosB hiired, metsiktüüpi 8-nädala vanused C57BL / 6J isased hiired olid sterotaksiliselt süstitud NAc-sse koos AAV vektoritega, mis ekspresseerisid kas GFP või AFosB-GFP. Sel juhul kasutati AAV vektoreid, et tagada maksimaalne AFosB ekspressioon 8 nädalatel pärast operatsiooni, võimaldades otseselt võrrelda viiruslikult nakatunud ja bitransgeenseid AFosB üleekspresseerivaid hiiri. Viiruse üleekspressioon kinnitati, kasutades qPCR-i 8-nädalat pärast operatsiooni (15-gabariidi NAc löögid lõigati süstekohta). AAV-GFP ja AAV-ΔFosB-GFP üleekspresseerivaid hiiri, keda ei kasutatud qPCR-le, raviti soolalahusega (14-i soolalahus, ip) või korduval kokaiinil (14-ravi 30 mg / kg kokaiin-HCl, ip) alates 6-nädalast pärast seda kirurgia. 4 päeva pärast lõpptöötlemist fikseeriti aju 4% paraformaldehüüdiga, lõigati vibraadile ja kasutati dendriitrakkude analüüsi jaoks.
Western blot analüüs
14-gabariidi NAc löögid võeti 1 mm koronaalsetest sektsioonidest, mis saadi hiire aju matriitsiga roostevabast terasest ja mida töödeldi 1 M HEPES lüüsipuhvris (1% SDS), mis sisaldas proteaasi ja fosfataasi inhibiitoreid. 10-30 μg kogu valgu proove elektroforeesiti 18% SDS geelidel. Valgud kanti PVDF membraanidele ja inkubeeriti kas anti-H3K9me2 (hiire monoklonaalne, 1: 500), anti-β-tubuliini (hiire monoklonaalne, 1: 60,000), anti-total histooni H3 (küüliku polüklonaalne, 1: 5,000), anti-GFP (kasutatakse võrdse viiruse ekspressiooni kontrollimiseks mulgustatud koes) (küüliku polüklonaalne, 1: 1000), anti-H3K27me3 (küüliku polüklonaalne, 1: 500) või anti-aktiini antikehad (hiire monoklonaalne, 1: 60,000) üleöö. 4 ° C (kõik membraanid blokeeriti 5% piimas või 5% veise seerumi albumiinis). Seejärel inkubeeriti membraane peroksidaasiga märgistatud sekundaarsete antikehadega (1: 15,000-1: 60,000 sõltuvalt kasutatavast primaarsest antikehast) ja ribad visualiseeriti kasutades SuperSignal West Dura substraati. Ansamblid kvantifitseeriti NIH Image J tarkvaraga ja H3K9me2 ribad normaliseeriti kas aktiiniks või β-tubuliiniks ja kogu histooniks H3, et kontrollida võrdset laadimist. Korduv kokaiin ei mõjutanud aktiini taset (Joonis S8) või kogu histooni 3 (Joonis S1) NAc-s. Lisaks ei mõjutanud HSV-G9a-GFP ja HSV-G9aH1093K-GFP infektsioon β-tubuliini kogutaset NAc-s (Joonis S8).
Immunohistokeemia
Hiiri rahustati kloraalhüdraadi surmava annusega ja perfundeeriti 4% paraformaldehüüdiga enne, kui neid analüüsiti ühe või kahe immunohistokeemia abil, nagu eelnevalt kirjeldatud (S6). Lühidalt, inkubeeritavaid ajusid inkubeeriti toatemperatuuril üleöö 30% sahharoosis enne lõikamist 35 μm juures (dendriitrakkude analüüsi ajusid lõigati vibratsioonil 100 μm sektsioonides 30% sahharoosi puudumisel). Vabalt ujuvaid NAc sektsioone pesti 1X PBS-iga, blokeeriti (3% normaalne eesli seerum, 0.1% tritonX, 1X PBS) ja inkubeeriti hiljem anti-GFP (kana polüklonaalne, 1: 8000) ja / või anti-G9a (küüliku polüklonaalne) , 1: 500) antikehad blokeerivas lahuses. Dendriitrakkude suhtes analüüsitud sektsioone inkubeeriti küüliku polüklonaalse anti-GFP antikehaga 1: 200. Pärast öö läbi kestnud inkubeerimist loputati 3X PBS-ga 10-minuti jooksul 1-i korda 2-i korda 3-i korda, millele järgnes 1X PBS-i blokeerimislahuses inkubeerimine Cy2i ja / või Cy1 fluorestsentsiga seotud sekundaarsete antikehadega 1 tundi. Morfoloogiliste uuringute jaoks kasutatud sektsioone inkubeeriti sekundaarse antikehaga toatemperatuuril üleöö. Tuuma koosvärvimine saavutati DAPI (50,000: 10) sisaldavate XNUMXX PBS-i osakeste inkubeerimisel XNUMX minuti jooksul. Sektsioonid pesti uuesti, millele järgnes etanooli dehüdraatimine ja paigaldamine DPX-ga. Kõik sektsioonid kujutati konfokaalse mikroskoopia abil.
RNA isoleerimine ja qPCR
Kahepoolsed 14-mõõtmelised NAc-stantsid homogeniseeriti Trizolis ja töödeldi vastavalt tootja juhistele. RNA puhastati RNAesy Micro kolonnidega ja spektroskoopia kinnitas, et RNA 260/280 ja 260/230 ratsioonid olid> 1.8. Seejärel transkribeeriti RNA, kasutades Bio-Rad iScripti komplekti. cDNA kvantifitseeriti qPCR abil, kasutades SYBR Green. Iga reaktsioon viidi läbi kahes või kolmes eksemplaris ja analüüsiti vastavalt eelnevalt kirjeldatud ΔΔCt meetodile, kasutades normaliseerimiskontrollina glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH) (S7). Vaata täiendav tabel S5 mRNA praimerjärjestuste jaoks.
DNA microarray analüüs
Microarray uuringus kasutati nelja rühma (sõltumatud bioloogilised replikatsioonid 3-i kohta), mis moodustasid kokku 12-i mikroarsed. 1 tund pärast viimast kokaiini süstimist dekapiteeriti loomad kiiresti ja aju eemaldati ja asetati jääle. NAc-d eemaldati, kasutades 15-gabariidi nõelatüki ja külmutati kiiresti kuivjääl, kuni RNA ekstraheeriti. Kahepoolsed löögid ühendati neljast loomast replikaadi kohta, kokku 12 hiired rühma kohta. RNA isoleerimine, mikrokiibi töötlemine ja andmete analüüs viidi läbi nii, nagu eelnevalt kirjeldatud (S8). Lühidalt, RNA eraldati ja puhastati vastavalt ülalkirjeldatule ning selle kvaliteeti kontrolliti Agilenti Bioanalyzer abil. Pöördtranskriptsioon, amplifitseerimine, märgistamine ja hübridiseerimine Illumina MouseWG-6 v2.0 massiividega viidi läbi, kasutades standardprotseduure TÜ Southwesterni mikrokiibisüdamiku abil. Toorandmed lahutati taustast ja kvantiil normaliseeriti, kasutades tarkvara Beadstudio. Normaliseeritud andmeid analüüsiti GeneSpringi tarkvara abil ja genereeriti genereerimisnumbrid, kasutades olulisuse kriteeriume 1.3-kordse muutuse väljalõige koos mittekindla p-väärtuse piirväärtusega p <0.05.
Me säilitame nende andmete suhtes suurel määral usaldust mitmel põhjusel. Esiteks käideldi, töödeldi ja surmati kõik loomad samal ajal samadel tingimustel. Samuti teostati kogu RNA ja massiivi töötlemine samal ajal. Teiseks, me tegime kolmekordseid massiive ja koondasime mitu looma massiivi proovi kohta, minimeerides seega individuaalse varieeruvuse ja suureneva statistilise võimsuse erinevusi (S9). Kolmandaks on meie uuringus kasutatud andmete analüüsi kriteeriumid soovitanud MicroArray kvaliteedikontrolli projekt, kuna need kriteeriumid on valideeritud, et tagada kõrgetasemeline reprodutseeritavus ning inter- ja intraplatformne reprodutseeritavus (S10-S11).
Viirusvektorite konstrueerimine
Viiruse vektorisse sisestamise suuruse piirangute tõttu subklooniti kas metsiktüüpi G9a (G9a) või katalüütiliselt surnud G9a (G9aH1093K) kodeerivad järjestused GFP ekspresseeriva bistristroonse p1005 + HSV plasmiidi inimese otsese varajase tsütomegaloviiruse promootori (CMV) kontrolli all (G9a sisestamise suurus oli ~ 3.96 kb, mis ületab AAV-2 vektorite maksimaalse sisestamise suuruse). IE4 / 5 promootor juhib G9a väljendit. Fragmendid subklooniti bistristroonilisse p1005 + HSV plasmiidi, kasutades nüriotseid ligeerimisi Klenow'iga töödeldud PmeI ja EcoRI-ga lõigatud G9a-ga (pcDNA3.1-st) ja CIP-ga töödeldud p1005 + pärast EcoRI lagundamist. HSV-AJunD-GFP tootmiseks genereeriti EcoRI restriktsioonisaitidega külgneva AJunD kodeeriv järjestus PCR abil, kasutades praimeroligonukleotiide, mis sisaldasid EcoRI saiti. Seejärel ligeeriti PCR produkt p1005 + vektori EcoRI saiti. Cre rekombinaasi lokaalne ekspressioon NAc neuronites saavutati viiruse poolt vahendatud geeni kohaletoimetamisega, kasutades AAV vektorit, nagu kirjeldatud (S12). GFP või GFP ja Cre-i N-terminaalne liitumine subklooniti rekombinantsesse AAV-2 vektorisse, mis sisaldas CMV promootorit splaissimisdoonori aktseptori järjestusega ja polüadenüülimissignaaliga. Kõik vektori insertsioonid kinnitati dideoksü-sekveneerimisega. Viirusvektoreid toodeti, kasutades kolmekordset transfektsiooni, abistaja-vaba meetodit, nagu eelnevalt kirjeldatud (S13). Puhastatud viirust hoiti temperatuuril -80 ° C. Viiruse kvaliteeti hinnati nakkusliku tiitriga, mida hinnati HEK293 rakkudes. Samamoodi valmistati AAV-AFosB-GFP viirused. HSV-Cre jaoks kasutati Cre ekspressiooni IRES promootor, mitte IE4 / 5 promootor, et vähendada Cre ekspressiooni ja vältida neuronaalset toksilisust (vt S14 viiruse konstrueerimiseks). Kõigil juhtudel valideeriti viiruse üleekspressioon, mõlemad vitro ja in vivo qPCR-i kaudu ja viirused kinnitati immunohistokeemiliselt, et nad näitaksid pärast operatsiooni NAc-piiratud ekspressiooni.
Stereotaxic operatsioon
Ketamiini (100 mg / kg) / ksülasiini (10 mg / kg) anesteesia all paigutati hiired väikese looma stereotaksilisse seadmesse ja kraniaalne pind oli avatud. Kolmkümmend kolm mõõdetavat süstlanõela kasutati 0.5 μl viiruse kahepoolseks infundeerimiseks NAc-sse 10 ° nurga all (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) kiirusega 0.1 μl / min. HSV süstimist saanud loomadel lasti 2i päeva jooksul pärast operatsiooni taastuda, samas kui AAV-vektoreid omavate käitumiskatsete jaoks kasutatavatel hiirtel lasti 20-i päevade jooksul enne kohapealse konditsioneerimise taastumist. Need ajad on kooskõlas kahe vektori maksimaalse viiruse poolt vahendatud transgeeniekspressiooni perioodidega. BIX01294i infusioonide puhul paigutati iga kaks minipumpu subkutaanselt hiire seljale. Kaneelide paigutused saavutati, kui puuriti kaks väikest kraniaalset auk NAc kohal ja kanüüli kohaletoimetamine bregmist (AP + 1.5; ML + 1.0; DV-5.4). Hiirtel lasti 4-i operatsioonil taastuda 5-päevaks, enne kui hakati kokaiinile kohale konditsioneerimise protseduuri alustama, nagu allpool kirjeldatud.
Eeldatav kohtade eelistamine
Koha konditsioneerimise protseduur viidi läbi nii, nagu eelnevalt kirjeldatud, järgmiste muudatustega (S7). Lühidalt, 3 päeva pärast HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP või HSV-GFP NAc-siseseid infusioone pandi hiired konditsioneerimiskambritesse, mis koosnesid kolmest erinevast keskkonnast. Uuringust jäeti välja hiired, kes eelistasid mõlemat konditsioneerimiskambrit oluliselt eelistada (<10% kõigist loomadest). Seejärel tasakaalustati konditsioneerimisrühmi, et kohaneda võimalike kambrite eelarvamustega. Järgnevatel päevadel süstiti loomadele soolalahust ja pandi 30 minutiks ühte kambrisse pärastlõunal, seejärel süstiti kokaiini (10 mg / kg, ip) ja suleti 30 minutit teise kambrisse õhtul 2 päeva (kaks soolalahus ja kaks kokaiinipaari). Katsepäeval pandi hiired 20 minutiks töötlemata aparaati tagasi ja testiti, et hinnata, kumba poolt nad eelistavad. Liikumisvastust kokaiinile hinnati uimastiravi efektiivsuse tagamiseks kokaiiniga seotud kambrites kiirte purunemise kaudu. AAV ja BIX01294 CPP katsete jaoks kasutati veidi muudetud protokolli. Loomadele süstiti jällegi kas soolalahust või kokaiini (10 mg / kg, ip) ja suleti 30-minutiliste seansside ajal spetsiifilistesse kambritesse, kuid nende asemel hoiti neid 4 päeva jooksul ainult üks kord päevas, millele järgnes test 5. päeval (loomi konditsioneeriti õhtul ja konditsioneerimisravi vaheldusid). Kõigi rühmade puhul hinnati soolalahuse reaktsioonina algtaseme liikumist, et tagada, et viirus- või inhibiitorravi ei mõjuta liikumist.
Kokaiini intravenoosne manustamine
Saadi isased noorukid Long-Evans rotid, kes kaalusid katse alguses 230 – 250 g. Neid hoiti niiskuse ja temperatuuri kontrollitud keskkonnas pööratud 12 tunni valgus / pimedas tsüklis (tuled kustuvad 9is: 00 am) koos ad libitum juurdepääs toidule ja veele. Rottidel lasti oma uues keskkonnas aklimatiseeruda ja neid töödeldi iga päev 1i nädala jooksul enne katse algust. Kõik protseduurid viidi läbi vastavalt Tervise Instituudi laborite loomade hooldamise ja kasutamise juhendile ning olid heaks kiidetud Siinai mäe loomade hooldamise ja kasutamise komitees. Enesehooldusvahendid olid varustatud liikumisvastase käitumise mõõtmiseks infrapunakiirtega. Eneseanalüüs viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatule (S15-S16) isofluraani (2.4–2.7%) anesteesia korral parempoolsesse kaenaveeni implanteeritud kateetritega. Kateetreid loputati 0.1 ml soolalahusega, mis sisaldas 10 U hepariini ja ampitsilliini (50 mg / kg). Pärast nädalast operatsioonist taastumist algas valguse / pimeduse tsükli pimedas faasis enesehalduse koolitus. Loomadel lubati 3-tunnine igapäevane juurdepääs kokaiinile (0.75 mg / kg / infusioon) fikseeritud suhtega 1 (FR1) tugevduskava alusel, kus ühe aktiivse kangipressiga saadi üks ravim. Rotid stabiliseerisid kokaiini tarbimist 1 päeva pärast (6 järjestikuse päeva jooksul oli ravivastuse määr varieerunud vähem kui 15%, tugevdatud kangil reageeris vähemalt 3%). 75 tundi pärast viimast isemajandusseanssi lõigati rotid kiiresti peast, aju eemaldati kiiresti ja töödeldi RNA isoleerimiseks ja qPCR-ks.
Kromatiini immunosadestamine (ChIP)
Värsked NAc löögid olid ristsidestatud formaldehüüdideks ja valmistati ChIP-iks, nagu eelnevalt kirjeldatud (S17-S18) väikeste muudatustega. Lühidalt, 4 14-i gabariidi NAc löögid looma kohta (proovi kohta koondatud 5 loomad) koguti, ristseotud 1% formaldehüüdiga ja karastati 2 M glütsiiniga enne külmutamist -80 ° C juures. 1-päev enne ultraheliuuringut valmistati lamba anti-küülik / hiir (sõltuvalt sadestusantikehast) IgG magnethelmestest, inkubeerides sobivaid magnethelmesid kas anti-G9a (küüliku polüklonaalne ChIP-klass) või anti-H3K9me2-ga (hiire monoklonaalne ChIP-klass) antikehad üleöö 4 ° C juures pidevas pöörlemises plokklahuses. Kudude ultrahelitöötlus ja kromatiini lõikamine viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatule (S17). Pärast ultrahelitöötlust viidi kromatiini võrdsed kontsentratsioonid uude tuubidesse ja ~ 5% lõpptoodetest salvestati, et toimida sisendkontrollidena. Pärast konjugeeritud helmeste / antikehade segude põhjalikku pesemist ja resuspendeerimist lisati igale kromatiini proovile võrdsed kogused antikeha / bead'ide segusid (~ 7.5 μg antikeha / proov) ja inkubeeriti 16 tundi 4 ° C juures konstantsel pöörlemisel. Proove pesti edasi ja pöörati ristsidemega 65 ° C juures üleöö enne DNA puhastamist, kasutades PCR puhastuskomplekti. Pärast DNA puhastamist allutati proovidele qPCR ja need normaliseeriti vastavalt nende eelnevalt kirjeldatud "sisend" kontrollidele.S17). Samuti teostati hiire polüklonaalse anti-IgG antikeha abil hiire IgG immunosadestamine, et kontrollida signaali võimendamise sobivat rikastamist. Adeniinfosforibosüültransferaasi (APRT) kasutati negatiivse kontrollina kokaiini ja ΔFosB üleekspressiooni katsetes. Vaata Täiendav tabel S5 promootori praimerjärjestuste jaoks.
Dendriitrakkude analüüs
G9a rolli uurimiseks neuronaalse morfoloogia reguleerimisel in vivo kasutasime eelnevalt kirjeldatud meetodeid järgmiste modifikatsioonidega (S1). Kolm päeva pärast HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-AJunD-GFP (kõik viirused kasutati metsiktüüpi C57Bl / 6J hiirtel) või HSV-Cre-GFP (kasutatakse G9a-s)fl / fl hiirtel), kui viiruse ekspressioon oli maksimaalne, hiired perfundeeriti, ajud krüoprotekteeriti ja seejärel lõigati 100 μm juures vibraadil. Seejärel immuniseeriti sektsioonid, kasutades ülalkirjeldatud GFP vastast antikeha (vt Immunohistokeemia). G9a üleekspressiooni ja väljatõrjumise mõju selgitamiseks selgroolude arvule, samuti ΔJunD üleekspressiooni mõjule mõõdeti ligikaudu 1 – 2 neuriidide spinide arvu neuroni kohta, mis võrdus vähemalt 299 μm sekundaarse dendriidiga GFP-d ekspresseerivast NAc söötmest nina neuronid (MSN). Arvestades, et MSN-d erinevad morfoloogiliselt teistest NAc neuronaalsetest populatsioonidest, samuti varasematest aruannetest, mis näitavad, et HSV nakatab peamiselt DARPP-32 ekspresseerivaid neuroneid selles aju piirkonnas (S19), oleme kindlad, et MSN-sid hinnati ainult nendes uuringutes. Iga looma puhul uurisime 6 – 8 neuroneid 3 – 4 loomadel rühmas (7 rühmad), mille järel saadi statistiline analüüs iga looma kohta. AFosB üleekspressiooni mõju uurimiseks NAc selgroo tihedusele uuriti sarnaselt ülalkirjeldatule, välja arvatud see, et AAV vektoreid kasutati GFP või ΔFosB-GFP ekspresseerimiseks pikema aja jooksul (8 nädalat). Kõik HSV-pildid salvestati konfokaalmikroskoobiga, millel oli 100X-i õliimmersioon-eesmärk (AAV-pildid võeti 63X-i õliimmersiooniobjektiga). Pildid saadi 1i suvalise üksuse ja 1024 × 1024 kaadri suurusega. Dendriitide pikkust mõõdeti NIH Image J tarkvara abil ja esmase katsefirma poolt loendati selgroo numbrid pimedaks, kuna slaidid kodeeriti enne eksperimentaalset skaneerimist. Arvutati keskmine dentriidi spinade arv 10 μm kohta.
Statistiline analüüs
Ühe- ja kahesuunalised ANOVA-d viidi läbi, et määrata kindlaks olulisus konditsioneeritud kohtade eelistuste ja dendriitide selgroo analüüsi jaoks, milles oli rohkem kui kaks rühma. Üliõpilaste t teste kasutati teiste võrdluste jaoks, sealhulgas qPCR, western blotting, dendriitraku selgroog, milles võrreldi HSV-GFP-d HSV-Cre-ga G9a-sfl / fl hiirtel, mikroarray analüüsid (vt eespool) ja kromatiini immunosadestamise katsed. Kavandatud õpilase t-teste kasutati pärast dendriitilise selgroo tiheduse kahepoolset ANOVA analüüsi pärast ΔFosB üleekspressiooni, kinnitades uimastiravi ja viiruse olulisi peamisi mõjusid. Kõik jooniselementides sisalduvad väärtused tähistavad keskmist ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). XNUMX üksikasjalikud statistilised analüüsid Joonised fig. 1-3 põhitekstis on esitatud: Üksikasjalik joonis, mis sisaldab statistikat.
Allmärkused
Kinnitan, et ükski käsikirjas sisalduv materjal ei kuulu Histooni metüültransferaasi G9a oluline roll kokaiini poolt indutseeritud plastilisuses on varem avaldatud või mujal, ka Internetis.
Kõik loomade kasutamisega seotud tööd viidi läbi kooskõlas institutsionaalsete ja IACUCi suunistega nii Texase Ülikooli Southwestern Medical Centeris kui ka Sinai Mount Mount'i meditsiinikoolis.
Viited ja märkused
;