Proc Natl Acad Sci USA A. 2005 veebruar 1; 102(5): 1737-1742.
Abstraktne
Kokaiin, kuritarvitamise ravim, suurendab sünaptilisi dopamiini tasemeid striatumis, blokeerides dopamiini tagasihaarde võtmist aksoni terminalides. On leitud, et tsütliin-sõltuv kinaas 5 (Cdk5) ja selle aktivaator p35, mis on seotud substraatide fosforüülimisega postmitootilistes neuronites, on kroonilise kokkupuute järel kokaiiniga üles reguleeritud. Cdk5i ja p35-i indutseerimise mõju edasiseks uurimiseks renaalse dopamiini signaaliülekandele genereerisime kaks sõltumatut transgeenset hiireliini, milles Cdk5 või p35 ekspresseeriti neuronites üleekspresseeritult. Me teatame siin, et suurenenud Cdk5 aktiivsus, mis on tingitud p35ist, kuid mitte Cdk5i üleekspressioonist, viib kokaiini vahendatud dopamiini signaaliülekande nõrgenemisele. Dopamiini ja cAMP-reguleeritud fosfoproteiini suurenenud Cdk5-vahendatud fosforüülimine, molekulmass 32 kDa (DARPP-32) Thr-75is kaasnes DARPP-32 fosforüülimisega Thr-34-is. Ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaasi kinaasi 5 suurenenud Cdk1-vahendatud fosforüülimine Thr-286is kaasnes rakuvälise signaali reguleeritud kinaasi 1 / 2 vähenenud aktivatsiooniga. Need toimed aitasid kaasa kokaiini poolt indutseeritud cAMP-vastuse elementi siduva valgu fosforüülimise nõrgenemisele ja ka c-fos indutseerimisele striatumis. Need tulemused toetavad ideed, et Cdk5 aktiivsus on seotud muutunud geeniekspressiooniga pärast kroonilist kokkupuudet kokaiiniga ja seega mõjutab pikaajaline muutus neuronite funktsioonis, mis põhineb kokaiini sõltuvusel.
Kokaiin suurendab sünaptilisi dopamiini tasemeid striatumis ja muudab geeni ekspressiooni dopaminotseptiivsetes neuronites, aktiveerides rakusiseseid teid, mis levitavad dopamiini D1 retseptori algsignaali tuuma (1). Krooniline kokkupuude kokaiiniga reguleerib mitmeid transkriptsioonifaktoreid, mille tulemuseks on pikaajalised muutused geeniekspressioonis, mis arvatakse olevat aluseks neuronite kohandumisele kokaiini sõltuvuses (2). ΔFosB, identifitseeritud sellisena transkriptsioonifaktorina (3) on tõestanud, et see suurendab loomade käitumist kokaiinile (4, 5). Seetõttu eeldatakse, et ΔFosB induktsiooniga reguleeritud sihtmärk-geenide identifitseerimine aitab paremini mõista kokaiinisõltuvuse aluseks olevat molekulaarset mehhanismi. Hiljuti on näidatud, et kokaiiniga loomade krooniline ravi reguleerib ΔFosB induktsiooni kaudu tsükliin-sõltuva kinaasi 5 (Cdk5) ja selle aktivaatori p35 ekspressiooni striatumis.6, 7).
Cdk5 on seriini / treoniini kinaaside Cdk perekonna liige. Erinevalt teistest Cdks'idest, mis on rakutsükli progresseerumise peamised reguleerijad, on Cdk5 peamiselt seotud substraatide fosforüülimisega postmitootilistes neuronites (8). Cdk5 aktiivsuse neuronaalne spetsiifilisus saavutatakse seostamisega selle aktivaatoritega, p35 või p39, mis ekspresseeruvad valdavalt postmitootilistes neuronites (8). Lisaks Cdk5i olulisele rollile aju arengus (9, 10), it on seotud ka dopamiinergilise transmissiooniga sünnijärgses ajus (11, 12). Cdk5-i aktiivsuse inhibeerimine suurendab dopamiini vabanemist striatumis, mis näitab Cdk5i presünaptilist funktsiooni dopamiini vabanemise negatiivse regulaatorina. (11). Lisaks moduleerib Cdk5 postünaptilise dopamiini signaaliülekande efektiivsust, fosforüülides dopamiini ja cAMP reguleeritud fosfoproteiini, molekulmassi 32 kDa (DARPP-32) Thr-75-is, mis muundab DARPP-32i cAMP-sõltuva kinaasi (PKA) inhibiitoriks (12).
Need tähelepanekud viitavad sellele, et Cdk5 ja p35 on dopamiini signaaliülekande pikaajalise aktiveerimise järelkontrollijad pärast kroonilist kokaiini ja seega ka kokaiini sõltuvust. Cdk5-i rolli täiendamiseks striataalse dopamiini signaaliülekandele genereerisime kaks transgeenset hiireliini, milles kas Cdk5 või p35 ekspresseeriti spetsiifiliselt p35 promootori kontrolli all olevates neuronites. Meie tulemused näitasid, et Cdk5-i aktiivsust reguleeriti p35-valgu suurenenud tasemega, kuid mitte Cdk5-valguga, mis viitab sellele, et p35-valgu tase on Cdk5-i aktiivsuse suhtes kiirust piirav. Pakume siin in vivo tõendid selle kohta, et suurenenud Cdk5 aktiivsus p35i üleekspressiooni tagajärjel põhjustab kokaiini vahendatud dopamiini signaaliülekande tuumale PKA ja ekstratsellulaarsete signaaliga reguleeritud kinaasi (ERK) kaskaadide inhibeerimise kaudu.
Materjalid ja meetodid
Antikehad. Polüklonaalsed antikehad Cdk5 (C-8) ja p35 (C-19) vastu osteti Santa Cruzi biotehnoloogiast. Fosforüülimisest sõltuvad ja sõltumatud antikehad ERK kinaasi (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 ja cAMP-vastuse elementi siduva valgu (CREB) vastu saadi Cell Signaling Technology'lt (Beverly, MA). Fosfo-Thr-34 DARPP 32i antikehad (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), kokku DARPP-32 (12) ja c-fos (14) kasutati kirjeldatud viisil. Aktiini antikeha osteti firmalt Sigma.
Katseloomad. Varem klooniti hiire p35 geen Cdk5r1, mis kodeerib p35 valku ja iseloomustab selle genoomset struktuuri (15). P35i (Tgp35) neuronaalse üleekspressiooniga transgeense hiire genereerimiseks 6-kb EcoRI-Eco1.2-kb promootori piirkonda sisaldav RI-fragment subklooniti pGEM9Z (-) plasmiidile ja SV45-st tuletatud 40-bp märgis sisestati KpnI ala polü (A+) signaal (Joon. 1A). Märgis sisaldas a SpeI koht loomade genotüpiseerimiseks. 6-kb fragment lõigati plasmiidist välja ja puhastati, millele järgnes transgeeni proksukleaarne süstimine transgeensete hiirte genereerimiseks. Transgeeni ekspressiooniprofiili uurimine 1.2-kb p35-promootori regulatiivse kontrolli all in vivo, kahekordset transgeenset hiirt (Tgp35; p35 - / -) genereeriti veel kaheastmelise aretusstrateegia abil, mille abil Tgp35 hiir regenereeriti endogeense p35-null taustaga. Teised selles uuringus kasutatud hiiremudelid hõlmasid p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/– ja transgeenset hiirt, kellel oli Cdk5 neuronite üleekspressioon (TgCdk5) (9, 16, 17). Nende hiirte genotüübid määrati kas Southern blot analüüsi või saba biopsiatest eraldatud genoomse DNA PCR abil. Hiired hoiti 12-h valguse / 12-h pimedas tsüklis. Kogu hooldus anti kooskõlas riiklike tervishoiuinstituutidega laboratoorsete ja katseloomade hooldamise ja kasutamise kohta.
Southern blot analüüs. Saba biopsiatelt ekstraheeritud genoomne DNA digereeriti EcoRI ja SpeI, elektroforeesitakse 0.9% agaroosgeelil ja kantakse nailonmembraanile. Membraan hübridiseeriti juhuslikult kruntitud 32P-märgistatud sond 42 ° C juures üleöö. 485-bp sond p35 knockouti (p35 - / -) ja Tgp35 hiirte genotüpiseerimiseks genereeriti PCR abil, kasutades järgmisi praimereid: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'ja 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Hübridiseeritud membraani pesti kaks korda 2 × SSC / 0.1% SDS-is 42 ° C juures 10 min ja kaks korda 0.1 × SSC / 0.1% SDS juures 65 ° C juures 20 min ja eksponeeriti röntgenkiirte filmiga.
Ravimite ravi. Kokaiin (Sigma) lahustati steriilses soolalahuses. Loomad süstiti 15-i kuu jooksul kokaiiniga (3 mg / kg) või võrdse koguse soolalahusega ja surmati pärast süstimist erinevatel ajahetkedel (15, 30, 60 ja 120 min). Ajusid eemaldati kiiresti ja jahutati jääkülmas PBS-is. Seejärel lõigati striata välja ja allutati Northern- või Western-blot-analüüsile. Immunohistokeemiliseks analüüsiks saadi hiirtel 2 h striataalsed lõigud pärast süstimist.
Põhja-Bloti analüüs. RNA-st ekstraheeriti kogu RNA TRIzol reagendiga (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) ja allutati Northern blot analüüsile, nagu kirjeldatud (18). C-fos mRNA tuvastamiseks kasutati sondina hiire c-fos cDNA 189-bp fragmenti, nagu kirjeldatud (19). C-fos mRNA tasemeid kvantifitseeriti, mõõtes konkreetse riba optilist tihedust, kasutades kujutise analüüsisüsteemi nih-pilditarkvara versioon 1.62.
Western blot analüüs. Striaatsete kudede ultraheliga töödeldi 1% SDS-s ja keedeti 10 min. Valgu kontsentratsioon igas proovis määrati BCA valgu testiga (Pierce). Enne nitrotselluloosmembraanile kandmist eraldati valgu võrdsed kogused SDS / PAGE-ga. Membraanid blokeeriti 1 × PBS-is, mis sisaldas 5% kooritud piima ja 0.05% Tween 20 ja inkubeeriti koos primaarsete antikehadega üleöö 4 ° C juures. Inkubeerimine peroksidaasiga konjugeeritud hiirevastase või küüliku IgG-ga (Sigma) viidi läbi toatemperatuuril 60 min. Signaal tuvastati suurenenud kemoluminestsentsiga (Pierce) ja ribade optilised tihedused kvantifitseeriti, nagu eespool kirjeldatud.
Cdk5 kinaasi test. Striaalsed lüsaadid valmistati lüüsipuhvriga, mis sisaldas 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi / 1 μg / ml aprotiniini / 1 μg / ml leupeptiini / fosfataasi inhibiitoreid (fosfataasi inhibiitori segu I ja II, Sigma). Lüsaadid immunosadestati kas anti-Cdk5 (C-8) või anti-p35 (C-19) antikehadega. Cdk5 immunopretsipitaadid valmistati 300 μl lüsaadi (mis vastab valgu 300 μg) inkubeerimisele anti-Cdk5 antikehaga (3 μg) üleöö 4 ° C juures, millele järgnes täiendav inkubatsioon 25 μl proteiini A-agaroos helmestega (50 lüüsipuhvris sisalduv suspensioon%, Santa Cruzi biotehnoloogia 3 h juures 4 ° C juures. P35 immunopretsipitaatide valmistamiseks inkubeeriti 500 μl lüsaati (vastab valgu 1 mg sisaldusele) anti-p35 antikehaga (3 μg), nagu eespool kirjeldatud. Immunopretsipitaate pesti kaks korda lüüsipuhvriga ja kaks korda kinaasipuhvriga, mis sisaldas 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspendeeritud kinaasipuhvri 60 μl-s. Kinaasi aktiivsust mõõdeti substraadina histooni H1 abil (18).
Immunohistokeemia. Hiired tuimastati avertiini ip süstidega (250 mg / kg, Fluka) ja perfundeeriti transkardiaalselt 0.1 M naatriumfosfaatpuhvriga, pH 7.4, millele järgnes Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), mittesiduva sideaine. Eraldatud ajusid fikseeriti samal fiksaatoril üleöö 37 ° C juures. Seejärel pandi aju parafiini sisse, lõigati 5-μm paksusteks koronaalseteks osadeks ja allutati immunohistokeemiale, kasutades substraadina diaminobensidiiniga avidiin-biotiini-peroksidaasi kompleksi tehnikat (Vector Laboratories). Sektsioone inkubeeriti c-fos-vastase afiinsusega puhastatud polüklonaalse antikehaga öö läbi 4 ° C juures. Värvimise spetsiifilisust hinnati primaarse antikeha väljajätmisega.
Tulemused
P35-i neuronaalse üleekspressiooniga transgeensete hiirte genereerimine. P35 suurenenud neuronaalse ekspressiooni saavutamiseks kasutatud transgeen sisaldas kloonitud hiire p6 geeni 35-kb fragmenti, mis sisaldas 1.2-kb promootorit ja kogu p35i kodeerivat järjestust (Joon. 1 A). Hiirte genotüübid määrati Southern blot analüüsiga, kasutades sondi, mis oli mõeldud p35 - / - ja Tgp35 hiirte eristamiseks metsiktüüpi hiirtest (Joon. 1 A ja B). Transgeeni ekspressiooni kontrollimiseks 1.2-kb p35-promootori poolt genereeriti kaksik-transgeensed hiired (Tgp35; p35-/ -), milles p35-i ekspressiooni juhiti ainult transgeenist. P35i ekspressiooni Tgp35-is, p35-/ - hiirtel täheldati ainult ajus (Joon. 1C), kus ruumilise ekspressiooni muster oli sarnane metsiktüüpi hiirtega (Joon. 1D). On näidatud, et p35i puudumine põhjustab hiirte ajukoores ja hipokampuses ebanormaalset kihtide struktuuri.10). Siiski näitasid Tgp35, p35 - / - hiired p35 - / - aju fenotüübi täielikku päästmist (Joon. 1E). Need andmed näitasid, et 1.2-kb p35-promootor kontrollis endogeensest p35-geenist sarnase ekspressiooniprofiiliga pGNUMX-i transgeeni ekspressiooni.
P35i valgu tase on Cdk5 aktiivsuse ülesreguleerimise suhtes määrav. Uurisime p35i ja Cdk5i kodeerivate geenide geeniannuse efekte valgu ekspressioonil striat ekstraktides p35 - / -, p35 +/–, metsiktüüpi, Tgp35, Cdk5 +/– ja TgCdk5 hiirtel 3 kuu vanuses. P35i ja Cdk5 valgu tasemed korreleerusid vastavalt geeniannustega (Joon. 2 A ja B). Tgp35 hiirtel täheldati p1.6 valgu taseme suurenemist fold35-korda võrreldes metsiktüüpi hiirtega, samas kui P5 valgu erinevad tasemed ei mõjutanud Cdk35 valgu taset. TgCdk5 hiirtel täheldati Cdk1.9 valgu taseme suurenemist fold5-korda võrreldes metsiktüüpi hiirtega, samas kui CXK35 valgu erinevad tasemed ei mõjutanud p5 valgu taset. P35-valgu erinevate koguste mõju uurimiseks Cdk5-i aktiivsusele immuniseeriti Cdk5 anti-Cdk5 antikeha ja kinaasi aktiivsuse määramisel striaaltekstidest. Samamoodi uuriti Cdk5 valgu erinevate koguste mõju kinaasi aktiivsusele, p35 immuunsadestati striaaltekstidest koos p35-vastase antikehaga ja mõõdeti kinaasi aktiivsus. Cdk5 aktiivsus korreleerus hästi p35 valgu tasemega, kuid mitte Cdk5 valgu tasemega (Joon. 2 C ja D). Need tulemused näitasid, et p35 valgu kogus on Cdk5 aktiivsuse kiirust piirav tegur. Seetõttu kasutasime Tgp35 hiiri, et uurida Cdk5 aktiivsuse suurenenud toimeid striatraalsele dopamiini signaalile.
DOKPP-32i kokaiin-indutseeritud fosforüülimine Thr-34-is on Tgp35 hiirtel nõrgenenud. DARPP-32i funktsioon sõltub selle fosforüülimise olekust mitmes kohas (20). PKA fosforüülib DARPP-32i Thr-34-is, samas kui Cdk5 fosforüülib DARPP-32-i Thr-75-is. Seega uurisime DARPP-32 fosforüülimise olekut metsiktüüpi ja Tgp35 hiirte striatsiooniekstraktides. Fosfo-Thr-75 DARPP-32 tase oli suurem Tgp35 hiirtel (Joon. 3A; 1.6 ± 0.2 korda üle metsiktüüpi hiirte väärtuse). Järgnevalt hindasime suurenenud Cdk5-i aktiivsuse mõju striaadi dopamiini signalisatsioonile. Uurisime kokaiiniga indutseeritud PKA aktivatsiooni Tgp35 hiirtel, analüüsides DARPP-32 fosforüülimise olekut Thr-34-is. Fosfo-Thr-34 DARPP-32i taset suurendati metsiktüüpi hiirtel 15 min pärast kokaiini süstimist (Joon. 3B; 1.8 ± 0.2 korda suurem kui basaaltasemel). Kokaiini mõju DARPP-34i Thr-32-i fosforüülimisele nõrgenes Tgp35 hiirtel (1.2 ± 0.3-kord põhitaseme kohal). Need tulemused näitasid, et Cdk5 aktiivsuse suurenemine nõrgendas kokaiini poolt indutseeritud PKA aktivatsiooni tõenäoliselt DARPP-32 fosforüülimise kaudu Thr-75-is (6, 12). Samuti on võimalik, et presünaptilise Cdk5 aktiivsuse suurenemine põhjustab dopamiini vabanemise vähenemist ja see aitab kaasa kokaiini vähenenud toimele. Eriti ei mõjutanud ühekordne kokaiini süstimine p35i ja Cdk5 valgu taset, samuti kinaasi aktiivsust (Joon. 3 C ja D). See on vastupidine eelmisele uuringule, milles on näidatud, et krooniline kokkupuude kokaiiniga reguleerib p35i ja Cdk5i ekspressiooni (6).
Cdk5i aktiivsuse ülesreguleerimine Vähendab kokaiiniga indutseeritud ERK1 / 2 aktiveerimist. Hiljutised tõendid näitavad, et dopamiini retseptori aktiveerimine striatumis aktiveerib ka teisi signalisatsioonikaskaase, sealhulgas ERK rada (21, 22), millel on oluline roll kokaiini käitumisele reageerimisel (\ t23). Seetõttu uurisime, kas Cdk5 aktiivsus võib mõjutada ERK raja kokaiinist põhjustatud aktivatsiooni. ERK raja aktiveerumist täheldati pärast kokaiini süstimist metsiktüüpi hiirte striattaalsetes ekstraktides, mis ilmnes MEK1 / 2i suurenenud fosforüülimisega Ser-217-is ja Ser-221-is (1.5 ± 0.2-kord basaaltasemest kõrgemal) ja ERK1 / 2 Thr-202is ja Tyr-204is (ERK2 fosforüülimine: 1.5 ± 0.2 korda suurem kui põhitasemel) (Joon. 4 A ja B). Kuid kokaiini poolt indutseeritud MEK1 / 2 aktivatsioon (1.2 ± 0.2 korda üle baasitaseme) ja ERK1 / 2 (ERK2 fosforüülimine: 1.2 ± 0.2 korda üle baasitaseme) nõrgenes Tgp35 hiirtel (Joon. 4 A ja B). Veelgi enam, fosfo-ERK1 / 2 põhitasemed olid madalamad Tgp35 hiirtel (0.8 ± 0.2 korda alla metsiktüüpi hiirte väärtuse), samas kui see suundumus ei olnud statistiliselt oluline. Viimane tulemus võib olla tingitud MEK5-i Cdk1-sõltuvast fosforüülimisest Thr-286-is, mille tulemuseks oli katalüütilise aktiivsuse vähenemine (24). Selle võimaluse hindamiseks uurisime MEK1i fosforüülimise olekut Thr-286is ja leidsime, et Tgp286 hiirte striatseeritud ekstraktides esinesid suuremad fosfo-Thr-1 MEK35i tasemed.Joon. 4C; 1.3 ± 0.1 korda üle metsiktüüpi hiirte väärtuse). Peale selle ei muutunud Thr-1-i MEK286i fosforüülimise olek ühekordse kokaiini süstimise tõttu, mis on kooskõlas järeldusega, et ravi ei mõjutanud Cdk5i aktiivsust (Joon. 3D).
Dopamiini paljundamine tuumale signaalimise nõrgenemine on suurenenud Cdk5 aktiivsus. Kokaiini poolt indutseeritud mitmete signaaliülekandekaskaadide aktiveerimine, mis hõlmab PKA ja ERK, viib transkriptsioonifaktori CREB aktiveerumiseni tuumas läbi fosforüülimise Ser-133is (22, 25). Et uurida, kas Cdk5-vahendatud inhibeeriv toime PKA ja ERK aktiveerimiskaskaadidele võib läheneda tuuma CREB fosforüülimisele, uurisime CREB fosforüülimise olekut Ser-133-is metsiktüüpi ja Tgp35 hiirte striatseeritud ekstraktides. Fosfo-CREB põhitasemel oli Tgp35 hiirtel madalam (0.7 ± 0.1 korda metsiktüüpi hiirte väärtusest) (Joon. 5). Vastuseks kokaiini süstimisele suurenes fosforo-CREB tase metsiktüüpi hiirtel (1.5 ± 0.1 korda üle baasitaseme), kuid see reaktsioon kokaiinile nõrgenes Tgp35 hiirtel (1.2 ± 0.1- põhitaseme kohal) (Joon. 5).
CREB fosforüülimine Ser-133is suurendab selle transkriptsioonilist aktiivsust cAMP vastuselemendi kaudu teatud geenide promootori piirkonnas, kaasa arvatud c-fos geen (26). Seetõttu uurisime c-fos indutseerimist metsiktüüpi ja Tgp35 hiirte striatumis pärast kokaiini süstimist. Metsik-tüüpi hiirtel suurenes c-fos mRNA tase tippväärtusele (1.8 ± 0.2 korda üle baasitaseme) 30 min pärast kokaiini süstimist ja seejärel naaseti 120-i baas tasemele min pärast süstimist (Joon. 6 A ja B). Kuid c-fos mRNA tasemed olid Tgp30 hiirtel ≈35% madalamad kui metsiktüüpi hiirtel kuni 30 minutini pärast süstimist (Joon. 6 A ja B). C-fos väiksemat induktsiooni Tgp35 hiirtel kinnitas veelgi immunohistokeemia (Joon. 6 C-F). Kokaiini manustamine suurendas c-fos immuunreaktiivsust, tugevalt striatumi dorsomediaalses-dorsocentralises osas ja nõrgalt külgmistes osades nii metsikut tüüpi kui ka Tgp35 hiirtel. Kuid kokaiiniga indutseeritud c-fos-immunopositiivsete rakkude arvu suurenemine oli Tgp35 hiirte striatumis nõrgenenud (Joon. 6G). Üheskoos näitasid need tulemused, et Tgp35-i hiirtel pärssisid kokaiini vahendatud striataalse dopamiini signaaliülekande tuuma tuuma suurenemine, mis on tõenäoliselt suurenenud Cdk5 aktiivsuse tulemus.
Arutelu
Cdk5 ja selle aktivaator p35 on identifitseeritud kui sihtgeenid, mida reguleeritakse kroonilise kokaiiniga kokku (6). Me esitame siin tõendeid selle kohta, et Cdk5i aktiivsuse suurenemine p35-i ülesreguleerimise tulemusena, mitte Cdk5-i ülesreguleerimine, viib kokaiini vahendatud dopamiini signaalimise nõrgenemisele striataalsetes neuronites. Selleks, et uurida kas Cdk5i või p35-i ülesreguleeritud ekspressiooni tagajärgi striaadi dopamiini signalisatsioonile, analüüsiti kahte transgeenset hiireliini, TgCdk5 ja Tgp35 hiiri. Leidsime, et Cdk5-i aktiivsust reguleeriti vastavalt p35-valgu suurenenud tasemele, kuid Cdk5-valgu suurenenud tase ei mõjutanud seda. Meie eelmine aruanne on näidanud ka seda, et Cdk5 aktiivsus hiire aju TgCdk5 puhul oli madalam kui metsiktüüpi hiire ajus, kui aktiivsust mõõdeti Cdk5 immunopretsipitaatide abil (17), mis viitab sellele, et Cdk5i üleekspressioon põhjustab monomeerse Cdk5i suurenenud taseme, kui p35-i taset ei suurendata. Need tulemused näitasid, et p35 valgu tase on Cdk5 aktiivsuse kiirust piirav tegur.
Tgp35 hiirtel esines pärast C-hepatiidi akuutset süstimist nii CREB fosforüülimise kui ka c-fos indutseerimiseta striatumis, mis viitab sellele, et suurenenud Cdk5 aktiivsus inhibeeris striatumi reaktsiooni kokaiinile. Kokaiini poolt vahendatud dopamiini signaalimise nõrgenemine Tgp35 hiirtel saavutati tõenäoliselt mitmete signaaliülekandekaskaadide Cdk5 vahendatud inhibeerimise kaudu, mis hõlmas DARPP-32, PKA ja ERK. Kokaiini manustamine suurendas DARPP-32i PKA fosforüülimist Thr-34is metsiktüüpi hiirtel, samas kui see reaktsioon nõrgenes Tgp35 hiirtel. On näidatud, et DARPP-32-i PKA fosforüülimine Thr-34-is inhibeerib proteiinfosfataasi 1 (PP1), ensüümi, mis vastutab CREB-i Ser-133i defosforüülimise, aktiivsust (27). Seega ei avaldata PP1 aktiivsust TGp32 hiirtel DARPP-1 / PP35 raja kaudu.
Kokaiiniga indutseeritud ERK1 / 2 aktivatsioon nõrgenes ka Tgp35 hiirtel. On mitmeid erinevaid mehhanisme, mille abil Cdk5 võib inhibeerida ERK1 / 2i kokaiiniga indutseeritud aktivatsiooni. Esiteks, DARPP-5-i Cdk32-sõltuv fosforüülimine Thr-75-is võib inhibeerida PKA-d, mis põhjustab mis tahes PKA-vahendatud MEK1 / 2-i aktiveerimise, mis on vajalik ERK1 / 2-i aktiveerimiseks. Hiljutises uuringus on samuti leitud, et DARPP-32i fosforüülimine Thr-34-is on vajalik ERK1 / 2i kokaiini vahendatud aktiveerimiseks mitmel viisil, mis hõlmab MEK-i aktivatsiooni kaudset reguleerimist, samuti striatsiini rikastatud fosfataasi, türosiini reguleerimist fosfataas, mis toimib otse ERK1 / 2i (28). Selle võimaluse toetuseks on leitud järeldus, et MEK1 / 2i kokaiiniga indutseeritud fosforüülimine Ser-217is ja Ser-221is tühistati Tgp35 hiirtel. Teine tõenäoline tee on MEK5-i Cdk1-sõltuva fosforüülimise kaudu Thr-286-is, mille tulemuseks on selle katalüütilise aktiivsuse vähenemine ja ERK1 / 2 aktiivsuse inhibeerimine (24).
On näidatud, et Cdk5-i aktiivsuse inhibeerimine striatumis tugevdab kroonilise kokaiiniravi käitumist loomadel (6). Kooskõlas hüpoteesiga, et Cdk5-i aktiivsuse ülereguleerimine võib kaasa aidata neuronaalsele kohanemisele korduva kokaiini manustamise mõju leevendamiseks (6) leiti, et DARPP-5i ja MEK32i Cdk1-vahendatud fosforüülimine aitas kaasa kokaiini poolt indutseeritud ERK1 / 2 aktivatsiooni nõrgenemisele, mille tulemuseks oli vähem CREB fosforüülimise ja c-fos indutseerimine striatumis. Meie leiud toetavad ideed, et suurenenud Cdk5 aktiivsus p35i ülesreguleerimise tulemusena võib pärast kroonilist kokkupuudet kokaiiniga muuta striatumis geeni ekspressiooni. See võib toimuda transkriptsioonifaktorite nagu CREB ja c-fos aktiivsuse muutuste tõttu. Seega võib Cdk5-i aktivaator p35 oma kiirusepiirava toime tõttu Cdk5-i aktiivsusele kaasa aidata kokaiinisõltuvuse aluseks olevate neuronaalsete funktsioonide pikaajalistele muutustele.
Tunnustused
Täname dr. Mary Jo Danton, Philip Grant ja Sashi Kesavapany käsikirja kriitiliseks lugemiseks. Seda tööd toetasid riiklikud tervishoiuinstituudid Z01DE00664-05 (ABK-le), USA rahvatervise teenistuse toetus DA10044 ning stipendiumid Simons Foundationist, Peter J. Sharpi fondist ja Picoweri fondist (PG-le).
märkused
Lühendid: Cdk5, tsükliin-sõltuv kinaas 5; ERK, rakuväline signaali reguleeritud kinaas; DARPP-32, dopamiin ja cAMP-reguleeritud fosfoproteiin, molekulmass 32 kDa; PKA, cAMP-sõltuv kinaas; MEK, ERK kinaas; CREB, cAMP-vastuse elementi siduv valk.
viited
;