PSMC5, 19Si proteasoomi ATPaas, reguleerib kokaiini toimet Nucleus Accumbens'is (2015)

PLoS One. 2015 mai 1110 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Abstraktne

ΔFosB on stabiilne transkriptsioonifaktor, mis akumuleerub aju premeerimisskeemide võtmekomponendis nucleus accumbens (NAc) vastusena kroonilisele kokkupuutele kokaiiniga või muude kuritarvitavate ravimitega. Kuigi teada, et ΔFosB heterodimeriseerub koos Juni pereliikmega, moodustades aktiivse transkriptsioonifaktori kompleksi, ei ole seni ajus teisi võimalikke ΔFosB sidumispartnereid avatud uuritud. Siin tuvastame pärmi kahe hübriidanalüüsi abil PSMC5 - tuntud ka kui SUG1, 19S proteasomaalse kompleksi ATPaasi sisaldav alaüksus - uudse interakteeruva valguna ΔFosB-ga. Kontrollime selliseid koostoimeid endogeense ΔFosB ja PSMC5 vahel NAc-s ja demonstreerime, et mõlemad valgud moodustavad komplekse ka teiste geeni aktivatsiooniga seotud kromatiini reguleerivate valkudega. Edasi näitame, et krooniline kokaiin suurendab NAc tuuma-, kuid mitte tsütoplasmaatilist taset PSMC5 ja et PSMC5 üleekspressioon selles ajupiirkonnas soodustab lokomotoorseid reaktsioone kokaiinile. Need leiud kirjeldavad üheskoos uudset mehhanismi, mis aitab kaasa ΔFosB toimele ja kaasab esmakordselt PSMC5 kokaiini poolt indutseeritud molekulaarsesse ja käitumuslikku plastilisusse.

Viide: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O jt. (2015) PSMC5, 19S proteasoomi ATPaas, reguleerib kokaiini toimet Nucleus Accumbensis. PLOS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Akadeemiline toimetaja: James Edgar McCutcheon, Leicesteri ülikool, ÜHENDKUNINGRIIK

Vastatud: Detsember 10, 2014; Vastu võetud: Aprill 7, 2015; Avaldatud: Võib 11 2015

Copyright: © 2015 Ohnishi et al. See on avatud juurdepääsuga artikkel, mida levitatakse vastavalt Creative Commonsi litsentsi litsents, mis võimaldab piiramatut kasutamist, levitamist ja paljundamist mis tahes andmekandjal, kui algne autor ja allikas on krediteeritud

Andmed Kättesaadavus: Kõik asjakohased andmed on paberil.

Rahastamine: Seda tööd toetasid riikliku terviseinstituudi, riikliku narkootikumide kuritarvitamise instituudi ning Ishibashi sihtasutuse ja Jaapani teaduse edendamise ühiskonna toetused (KAKENHI numbrid: 24591735, 26290064, 25116010). Rahastajatel ei olnud mingit rolli uuringute kavandamisel, andmete kogumisel ja analüüsimisel, avaldamise otsusel ega käsikirja koostamisel.

Konkureeritavad huvid: Autorid on teatanud, et ei ole konkureerivaid huve.

Sissejuhatus

ΔFosB, selle kärbitud toode FosB geen, kuulub transkriptsioonifaktorite Fos perekonda, mis hõlmab ka c-Fos, täispikk FosB, Fra-1 ja Fra-2. ΔFosB, nagu teised Fos valgud, heterodimeerub Jun perekonna valguga - c-Jun, JunB või JunD -, et moodustada aktiivne AP-1 (aktivaatorvalgu-1) transkriptsioonifaktori kompleks, mis indutseerib või represseerib spetsiifiliste sihtgeenide ekspressiooni [1,2].

On näidatud, et ΔFosB mängib uimastisõltuvuses võtmerolli [2]. Fos perekonna valkude seas koguneb see korduvalt uimastite manustamise järel tuuma accumbensis (NAc) ja muudes auhinnaga seotud aju piirkondades oma kõrge stabiilsusastme tõttu [3,4], mida vahendab C-terminaalsete degronidomeenide puudumine ja mitmete valgu kinaaside fosforüülimine [5-7]. Selline ΔFosB indutseerimine NAc-s vahendab suurenenud käitumuslikke vastuseid kuritarvitamise ravimitele. Seega suurendab AFosB üleekspressioon täiskasvanud loomade selles aju piirkonnas kas viirusvektoreid või indutseeritavaid bitransgeenseid hiiri kasutades loomade tundlikkust kokaiini ja opiaatide lokomotoorse aktiveeriva ja rahuldava toimega, samuti looma motivatsiooni ise manustada kokaiin [7-11]. Vastupidiselt põhjustab ΔFosB domineerivate negatiivsete antagonistide üleekspressioon vastupidiseid käitumuslikke fenotüüpe [10-12].

Me ja teised oleme eelnevalt kinnitanud geelide vahetuse testide abil, et JunD ja võib-olla teised Jun perekonna valgud on AFosB peamised seondumispartnerid ajus in vivo [13-15]. Kuid siiani ei ole AFosB siduvate partnerite ajus lõplikku ja erapooletut hindamist. Siinkohal püüdsime identifitseerida ΔFosB uusi sidumispartnereid, kasutades pärmi kaksikhübriidanalüüsi [16,17]. Meie andmed näitasid, et PSMC5, tuntud ka kui SUG1, on AFosB tugev partner nii in vitro kui ka NAc-s in vivo, kus see ühendub ΔFosB-ga kokaiiniga indutseeritud transkriptsiooni aktiveerimiskompleksi osana, mis sisaldab ka CBP-d (CREB siduv valk ) ja p300 - mõlemad histooni atsetüültransferaasid (HAT) - on samuti BRG1 (kromatiini remodelleeruv valk). Edasi näitame, et krooniline kokkupuude kokaiiniga muudab PSMC5i, mis on 19S proteasoomi kompleksi ATPaasi sisaldava subühiku, tuumatasemed NAc-s ja et PSMC5 omakorda kontrollib käitumisvastuseid kokaiinile.

Materjalid ja meetodid

Pärm kahe hübriidi sõelumine

MaV203 pärmi rakud (Invitrogen Life Technologies) transfekteeriti koos pDBLeu-ga, juhtides AFosB valgu erinevaid fragmente ja hiire aju raamatukogu subklooniti pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Transformeeritud rakke kasvatati SC-söötmel, millel puudus leutsiin, trüptofaan ja histidiin ning mis sisaldasid 10 mM 3-aminotriazooli. FosB fragmentide ja kandidaatpartnerite sidumine indutseerib kolm reportergeeni (His3, Ura3ja LacZ) ja indutseerimine muudab transformandid võimalikuks kultiveeritud tingimustes ellu jääda. Positiivsed kloonid testiti uuesti värskete pDBLeu-AFosB fragmentidega, kasutades retrove-ratsioonianalüüse MaV203 rakkudes.

Rakuliinid

Hiire Neuro 2A neuroblastoomirakke (ATCC) hoiti Eagle minimaalses põhisöötmes (EMEM) (ATCC), millele oli lisatud 10% veise loote seerumit (FBS) temperatuuril 37 ° C ja 5% CO2. Roti 1A rakud olid kingitus Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Jaapan) [18] ja mida hoitakse Dulbecco MEM-is (DMEM) (Life Technologies), millele on lisatud 10% FBS 37 ° C ja 5% CO juures2. Rakkude transfektsioon plasmiidse DNA-ga viidi läbi, kasutades Effectene'i (Qiagen) vastavalt tootja juhistele.

PSMC5 ja ΔFosB konstruktid

Mitmed PSMC5i mutantsed vormid, iga FLAG-märgistatud nende N-otsas, genereeriti kasutamiseks immunosadestamise või viiruse vahendatud geeniülekande katsetes. Nende hulka kuulusid: PSMC5-K196M, PSMC5-Δcoiled-coil domeen (PSMC5-ΔCC, puuduvad aminohapped 27-68), PSMC5-NT (mis koosneb valgu N-terminaalsest fragmendist, aminohapped 1-151) ja PSMC5 -CT (mis koosneb valgu C-terminaalsest fragmendist, 172 aminohapped) (vt. \ T Joon 1). Me kasutasime ka metsiktüüpi ΔFosB N-terminaalset MYC-märgistatud vormi ja AFosB mutatsiooni oma leutsiin-tõmblukk-domeenis (aminohapete 182 mutatsioon 205-iks, mis teadaolevalt hävitab heterodimeerumise Jun perekonna valkudega [6].

thumbnail
Joonis 1. ΔFosB seondub PSMC5-iga in vitro.

 

A. FosB, ΔFosB-LZM skemaatiline skeem, milles leutsiini tõmblukk-domeen on muteeritud ΔFosB heterodimeerumise hävitamiseks Jun-valkudega, ja Δ2AFosB, millel puuduvad AFosB N-otsa esimesed 78-aminohapped. B. PSMC5, PSMC5-NT skeem, mis sisaldab PSMC151i esimesi 5 aminohappeid, PSMC5-CT, millel puuduvad PSMC235i esimesed 5 aminohapped, ja PSMC5-ACC, mis ei sisalda spiraalset spiraali domeeni (aminohapped 28 – 68) . AAA domeen vastab mitmele rakulise tegevusega seotud ATPaasidele, mis esinevad paljudes ATPaasides. C. PCDNA2.4-ΔFosB 3.1 μg (rajad 1 – 4) või ΔFosB-LZM (rada 5) transfekteeriti koos 2.4 μg FLAG-märgistatud PSMC5 või erinevate deletsioonmutantidega Neuro2a rakkudesse. Kaks päeva pärast transfektsiooni lüüsiti rakud ja allutati immunosadestamisele anti-FLAG antikehaga ja seejärel blotiti Western anti-FosB või FLAG-vastase antikehaga. Pange tähele, et ΔFosB, kuid mitte ΔFosB-LZM, seondub tugevalt PSMC5 või PSMC5-NT, kuid mitte PSMC5-CT või PSMC5-ΔCC. Joonisel näidatud andmed kopeeriti kolmes korduses kõigis kolmes eraldi katses.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Loomad

Kõigi katsete jaoks kasutati üheksa kuni 11-nädalast C57BL / 6J isaseid hiiri (Jackson Laboratory). Loomad paigutati 12-h valguse-pimedas tsüklisse, kus oli juurdepääs toidule ja veele ad libitum ja nad olid harjunud 1 nädal enne katset. Kasutati kahte kokaiiniravi. Kokaiini biokeemiliste mõjude uurimiseks manustati loomadele 7i ööpäevas kokaiini (20 mg / kg) või füsioloogilist lahust ja surmati 24 hülgamisega pärast viimast süstimist. See on standardprotokoll, mis on näidanud, et tekitab ravimile mitmeid molekulaarseid ja rakulisi vastuseid [7]. Et uurida PSMC5i mõju tuumaklundides käitumuslikele vastustele kokaiinile, kasutasime ravimi alamlävi annust (7.5 mg / kg; vt allpool toodud lokomotoorse sensibilisatsiooni kohta), lähtudes hüpoteesist, et PSMC5 suurendaks loomade tundlikkust, nagu ΔFosB, kokaiin [8]. Kõik loomkatsed kiideti heaks Siinai mäe institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitees.

Immunosadestamine ja Western blotting

Neuro 2A rakke transfekteeriti metsiktüüpi või mutantsete PSMC5 vormidega. Kaks päeva pärast transfekteerimist pesti rakke PBS-s, lüüsiti RIPA puhvris (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% naatriumdoksüoksüolaat, 10 mM naatriumbutüraat, proteaasi inhibiitori kokteil) . Lüsaadid jagati ja inkubeeriti kas mitteimmuunse IgG (Sigma) või anti-FLAG antikehadega (Sigma) 3 tundi 4 ° C juures. Immunosadestamine viidi läbi proteiin G bead'idega (Invitrogen), nagu on kirjeldatud [19]. Lühidalt, immunosadestatud valke töödeldi SDS-PAGE-ga ja analüüsiti Western blot-meetodil, kasutades anti-FosB / AFosB antikeha (Cell Signaling Technology), mis põhineb avaldatud protokollidel [7]. In vivo valkudega seondumise testides kasutasime pärast kroonilist kokaiiniravi hiirtel lõhustunud NAc-st puhastatud tuuma fraktsioone (20 mg / kg IP päevas 7-päevadel, hiirtel kasutati 24 hr pärast viimast süstimist). Ko-immunosadestamine tuuma fraktsioonidest viidi läbi, kasutades Nuclear Complex Co-IP komplekti (Active Motif), järgides tootja juhiseid. Kasutati järgmisi antikehi: MYC või ß-aktiin, raku signaalimise tehnoloogia (Danvers, MA), PSMC5 ja histoon H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 ja BRG1, Santa Cruzi biotehnoloogia (Santa Cruz, CA) ja FLAG M2, Sigma.

Immunohistokeemia

Immunohistokeemia viidi läbi vastavalt avaldatud protseduuridele [20]. Hiired tuimastati ja perfuseeriti intrakardiaalselt 4% paraformaldehüüdiga PBS-is. Aju külmutati 30% sahharoosiga ja seejärel külmutati ja hoiti -80 ° C juures kuni kasutamiseni. Koronaalsed lõigud (40 μm) lõigati krüostaadile ja töödeldi immunohistokeemiaks. Vabalt ujuvaid sektsioone inkubeeriti eelnevalt blokeerimispuhvris, mis sisaldas 0.3% Triton'i ja 3% normaalset eesli seerumit. AFosB tuvastati, kasutades valgu N-terminaalse osa vastu kasvatatud kitse polüklonaalset antikeha (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 tuvastati küüliku polüklonaalse antikehaga (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Pildid võeti konfokaalmikroskoobiga (60x suurendus; Zeiss).

Lokomotoorne sensibiliseerimine

Kõik hiired said 3-i päeva päevas IP-soolalahust, et neid süstida süstimise stressiga. Järgmisel päeval süstiti hiirtele IP soolalahusega või kokaiini alamläviväärtusega (7.5 mg / kg; vt allpool Loomad eespool) ja paigutati kohe uutesse liikumiskastidesse. Hiirte lokomotoorne aktiivsus registreeriti fotomeetrilise süsteemi abil, kuna ambulatoorsed kiired purunevad 30 min. Neid ravimeid korrati iga päev 3-päeva jooksul.

Viiruse poolt vahendatud geeniülekanne

Me kasutasime laialdaselt avaldatud meetodeid viiruse vahendatud geeniülekande jaoks [7,8,11,19]. Lühidalt, PSMC5i või mitmete selle mutantide ekspressiooniplasmiidid (vt ülaltoodud PSMC5 ja AFosB konstruktid) subklooniti bistristroonilisse p1005 (+) HSV plasmiidi, mis ekspresseeris GFP-d CMV promootori kontrolli all, ja PSMC5 või selle mutandid allpool toodud IE4 / 5 promootor. Ketamiini (100 mg / kg) / ksülasiini (10 mg / kg) anesteesia all paigutati hiired väikese looma stereotaksilisse seadmesse ja kraniaalne pind oli avatud. Kolmkümmend kolm mõõdetavat süstlanõela kasutati 0.5 μl HSV vektori kahepoolseks infundeerimiseks NAc-sse 10 ° nurga all (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) kiirusega 0.1 μl / min. HSV süstimist saanud loomadel lasti 2i päeva jooksul pärast eksperimenteerimist taastuda.

Statistika

Kasutati ANOVA-sid ja üliõpilase t-teste, mis olid korrigeeritud mitme võrdluse jaoks ja mille olulisus p <0.05.

Tulemused

PSMC5: ΔFosB uudne sidumispartner

Me teostasime esialgseid katseid, et identifitseerida sobivat ΔFosB fragmenti, mis toimis söödana pärmi kaksikhübriidanalüüsis ilma süsteemi automaatset aktiveerimist. Holo-AFosB indutseeris reportergeeni aktiivsust iseenesest, samuti valgu N-terminaalset 1-78 aminohappe fragmenti. N-terminaalne kärbitud ΔFosB (Joonis 1A), mida nimetatakse Δ2AFosB-ks, millel puuduvad valgu esimesed 78-aminohapped, ei olnud sellist toimet. Seetõttu kasutasime Δ2AFosB-d söödaproteiinina.

Potentsiaalsete siduvate partnerite kuvamiseks kasutasime hiire aju raamatukogu, mis oli subkloonitud pPC86i. Me tuvastasime 11i kandidaadid siduvate partnerite jaoks. Kuigi need valgud sisaldasid ΔFosB tuntud heterodimeerimispartnereid, c-Jun ja JunD (Tabel 1) oli kõige enam levinud kandidaat PSMC5. Kuigi see oli üllatav, oli see huvitav järeldus, kuna PSMC5 näidati ühe aasta taguses aruandes, et seostuda c-Fosega in vitro [21]. Puuduvad aga varasemad aruanded PSMC5i osalemise kohta kokaiini toimel. Sellegipoolest, kuna PSMC5 signaali tugevus pärmi kaksikhübriidanalüüsis on, uurime edasi võimalike ΔFosB-PSMC5 interaktsioonide uurimist.

thumbnail
Tabel 1. Pärmi kahehübriidi sõelumise tulemused Δ2AFosB-ga.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Esiteks teostasime FosB ja PSMC5 vahelise füüsilise interaktsiooni kinnitamiseks in vitro ko-immunosadestamise katseid. Leidsime, et FLAG-märgistatud PSMC5 (Joonis 1B), mis on transfekteeritud Neuro 2A rakkudesse, tõmmati efektiivselt alla \ tJoonis 1C). Teiseks, et identifitseerida piirkond PSMC5is, mis vastutab selle seondumise eest ΔFosB-ga, genereerisime mitu FLAG-märgistatud PSMC5 mutanti (Joonis 1B) ja korrati ko-immunosadestamise eksperimenti. ΔFosB tõmmati tõhusalt PSMC151i (PSMC5-NT) N-terminaalsete 5 aminohapetega, kuid mitte valgu C-terminaalse 172 aminohappefragmendiga (PSMC5-CT) (Joonis 1C). PSMC5, millel puudus tema spiraal-domeen (PSMC5-ACC), oli samuti efektiivne ΔFosB sadestamisel. Need leiud viitavad sellele, et PSMC5 seob ΔFosB-t oma keerd-spiraal-domeeni kaudu (aminohapped 27 – 68). Lisaks ei sadestanud FLAG-märgistatud PSMC5 mutantset AFosB vormi muteeritud leutsiini tõmblukuga domeeniga (ΔFosB-LZM) (Joonis 1C), mis näitab, et ΔFosB seob selle domeeni kaudu PSMC5i või tõenäolisemalt, et PSMC5i sidumiseks on vajalik ΔFosB heterodimeerumine.

PSMC5-AFosB seondumine NAc-s pärast kroonilist kokaiini manustamist

Nende leidude põhjal in vitro uuriti, kas PSMC5i tasemed NAc-s on muutunud vastuseks kroonilisele kokaiini manustamisele. Me leidsime subtsellulaarse fraktsioneerimise ja Western blot'i abil, et krooniline kokaiin suurendab PSMC5i tuuma taset selles aju piirkonnas ilma tsütoplasmaatiliste tasemete muutuseta (Joonis 2A). Seda toimet ei täheldatud pärast kokaiini ühekordseid annuseid (andmeid ei ole näidatud). Järgnevalt uurisime PSMC5i ja ΔFosB lokaliseerimist NAc-s konfokaalse immunofluorestsentsmikroskoopia abil. Me analüüsime hiiri 24 hr pärast viimast korduvat kokaiini annust, mis on ajahetk, kui ΔFosB on ainus tuvastatav FosB geeniprodukt (vt Nestler 2008). Leidsime NAc-s tugeva PSMC5-i immunoreaktiivsuse, sealhulgas tugeva tuuma signaali. ~ 85% ΔFosB + tuumadest, mis on värvitud PSMC5i jaoks (Joonis 2B). Lisaks teostasime NAc ekstraktidega koimmunosadestamise katseid ja leidsime, et pärast kroonilist kokaiiniravi tõmmati ΔFosB tõhusalt PSMC5-vastase antikehaga (Joonis 2C). Seevastu uimastiteguri NAc analüüs (pärast korduvaid soolalahuseid) ei näidanud avastatavat ΔFosB langetamist (andmeid ei ole näidatud). Need andmed on kooskõlas meie tulemustega rakukultuuris ja kinnitavad, et ΔFosB ja PSMC5 interakteeruvad NAc-s in vivo.

thumbnail
Joonis 2. PSMC5 regulatsioon hiire NAc-s.

 

A. Igapäevaselt soolalahuse või kokaiiniga (20 mg / kg) 7 päeva jooksul töödeldud hiirte NAc tuuma- ja tsütosoolfraktsioonide Western blot analüüsimine loomadega analüüsiti 24 tundi pärast viimast süsti. Kokaiin suurendab PSMC5 tuuma-, kuid mitte tsütosoolitaset. Laadimise kontrollina kasutati histooni H3 ja ß-aktiini, mida kokaiin ei mõjutanud. Andmed on keskmised ± SEM (n = 8–10 rühma kohta, * p <0.05). B. Endogeense PSMC5 (roheline) ja ΔFosB (sinine) koos lokaliseerimine kokaiiniga krooniliselt ravitud hiirte NAc-des nagu AC Hiire NAc tuumalüsaadid pärast kroonilist kokaiiniga töötlemist immunosadestati anti-PSMC5 antikeha või hiire IgG-ga kontrollina ja seejärel blokeeriti Western anti-FosB / ΔFosB antikehadega. Joonis näitab PSMC5-AFosB interaktsioone NAc-s in vivo. B ja C andmeid korrati kolmes eksemplaris igas kolmes eraldi katses.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 suurendab ΔFosB ekspressiooni in vitro

Kuna PSMC5 on proteasoomi kompleksi tuntud liige, testisime, kas see reguleerib ΔFosB tasemeid, kasutades Rat 1A rakke. PSMC5i üleekspressioon ei mõjutanud ΔFosB basaaltasemeid, kuid põhjustas rakkude seerumi stimuleerimisel ΔFosB induktsiooni väikese, kuid olulise suurenemise.Joonis 3A). Sarnane suundumus täheldati täispikkuses FosB-s, kuid mõju ei saavutanud statistilist olulisust. Vastupidi, endogeense PSMC5 ekspressiooni pärssimine roti 1A rakkudes, mis saavutati PSMC5-i sihtivate siRNA-de kasutamisega, ei mõjutanud basaal-FosB tasemeid, kuid inhibeeris tugevalt ΔFosB induktsiooni seerumi stimulatsiooni abil (Joonis 3B). Sarnaseid toimeid täheldati täispikkuses FosB. Need andmed viitavad sellele, et PSMC5 ei soodusta AFosB proteasoomi degradatsiooni, nagu võib eeldada proteasoomi tuum-subühikuna, vaid see on vajalik maksimaalse akumuleerumise jaoks. FosB geeniproduktid in vitro, võib-olla valkude stabiliseerimise teel.

thumbnail
Joonis 3. FosB / AFosB ekspressiooni PSMC5 regulatsioon roti 1A rakkudes.

 

A. Roti 1A rakud transfekteeriti 4 μg PSMC5 või kontroll-DNA-ga. PSMC5 üleekspressioonil ei olnud mingit mõju FosB või ΔFosB valgu basaalse ekspressiooni tasemele, mis määrati Western blot-meetodil, kuid see põhjustas seerumi stimulatsiooni kaudu väikest, kuid olulist kasvu ΔFosB induktsiooni suurenemisel (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Roti 1A rakud transfekteeriti 5 pmol kas kahest siRNA-st või segatud RNA-st (kontroll). Mõlemad siRNA-d vähendasid efektiivselt PSMC5 valgu taset võrreldes kontrolltingimustega (siRNA # 1, 23 ± 5% kontrollist; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). PSMC5 knockdown'il ei olnud mingit mõju FosB või ΔFosB põhitasemele, kuid see nõrgendas nii FosB kui ka ΔFosB induktsiooni seerumi stimulatsiooni abil (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 (p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB ja PSMC5 moodustavad CBc, p300 ja BRG1-ga komplekse NAc-s

Selleks, et paremini mõista transkriptsioonimehhanisme, mille abil PSMC5 võib mõjutada AFosB funktsiooni, uuriti võimalikke täiendavaid sidumispartnereid kahe valgu jaoks NAc-s kroonilise kokaiiniga töödeldud tingimustes. On üks aruanne, et PSMC5 seondub CBP-ga - HAT-ga - ja suurendab histooni H3 atsetüülimist MHC-II proksimaalses promootoris HeLa rakkudes [22]. Lisaks vähendasid CBP-s puudulikud hiired kokaiini suhtes käitumise tundlikkust ja histooni atsetüülimise vähenemist. FosB promootor [23]. Nii testiti, kas PSMC5 võib seonduda AFosB-ga kui kompleksi, mis sisaldab ka CBP-d ja võib-olla ka teisi transkriptsiooniaktiveerijaid, osana.

Kõigepealt näitasime, et ΔFosB tõmbas tõhusalt Neuro300A rakkudes nii CBP kui ka p2i, mis on sellega seotud HAT.Joonis 4A). Vastupidiselt sellele ei näidanud αFosB leutsiini tõmblukk mutant, nagu oodatud, seda aktiivsust. Samamoodi tõmbas PSMC5 tõhusalt CBP ja p300 (Joonis 4B). Huvitav on see, et seda efekti täheldati ka PSMC5-ΔCC jaoks, mis ei tõmba AFosB-d, mis näitab, et PSMC5 interakteerub CBP ja p300-iga teiste valgu domeenide kaudu ja sõltumatult selle seondumisest ΔFosB-ga.

thumbnail
Joonis 4. AFosB ja PSMC5 toimivad in vitro ja in vivo koos CBP, p300 ja BRG1-iga.

 

A. Neuro2A rakud transfekteeriti 2.4 μg MYC-märgistatud AFosB või MYC-märgistatud AFosB-LZM-ga. Rakuekstraktid immunosadestati anti-CBP või anti-p300 antikehaga ja sademed Western blotiti sama antikehaga või anti-MYC antikehaga. Nii CBP kui ka p300 suhtlevad ΔFosB-ga ja sellised interaktsioonid nõuavad tervet leutsiini tõmblukku. B. Neuro2A rakke transfekteeriti 2.4 μg FLAG-märgistatud PSMC5 või FLAG-märgistatud PSMC5-ACC-ga. Rakuekstraktid immunosadestati anti-CBP või anti-p300 antikehaga ja sademed Western blotiti sama antikehaga või anti-FLAG antikehaga. Nii CBP kui ka p300 suhtlevad PSMC5iga ja sellised interaktsioonid ei vaja CC domeeni. C. Hiire NAc tuuma lüsaadid pärast kroonilist kokaiinitöötlust allutati immunosadestamisele anti-CBP või anti-p300 antikehaga. Saadud sademete Western-blotimine anti-FosB / AFosB antikehaga näitas endogeenseid interaktsioone ΔFosB ja CBP / p300 vahel. D. Samade tuuma lüsaatide alikvoodid allutati immunosadestamisele anti-BRG1 või anti-PSMC5 antikehaga, millele järgnes sadestuste Western blotimine anti-FosB / AFosB või anti-BRG1 antikehaga. Tulemused näitavad endogeenseid interaktsioone ΔFosB ja BRG1i ning BRG1i ja PSMC5i vahel. E. AFosB-st koosneva transkriptsioonilise aktiveerimiskompleksi skemaatiline illustratsioon: JunD heterodimeerid, mis interakteeruvad CBP / p300i, BRG1i ja PSMC5iga.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Et kinnitada, et need interaktsioonid toimuvad ka in vivo, manustasime kokaiini krooniliselt AFosB ja tuuma PSMC5 taseme indutseerimiseks, seejärel immunosadestati NAc ekstraktid anti-CBP või anti-p300 antikehadega. Kooskõlas meie rakukultuuri andmetega tõmbas CBP või p300 immunosadestamine efektiivselt ΔFosB (Joonis 4C). Testisime, kas BRG1, SWI-SNF kromatiini remodelleerimiskompleksi põhiosa, võib samuti seonduda ΔFosB ja PSMC5iga, tuginedes meie varasemale järeldusele, et BRG1 võetakse tööle teatud ΔFosB sihtmärk-geenidele koos nende aktiveerimisega NAc-s pärast kroonilist kokaiini [24]. Leidsime, et BRG1 immuunsadestamine tõmbas ΔFosB NAc ekstraktides maha ja PSMC5i immunosadestamine sarnaselt endogeensesse endogeensesse BRG1i (Joonis 4D). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et ΔFosB-PSMC5 moodustavad NAc-s kompleksid, mis hõlmavad ka CBP / p300 ja BRG1 (Joonis 4E).

PSMC5i üleekspressioon suurendab lokomotoorseid reaktsioone kokaiinile

PSMC5i silmapaistev seondumine ΔFosB-ga NAc-s ajendas meid uurima, kas PSMC5i taseme suurendamine selles aju piirkonnas reguleerib käitumisreaktsioone kokaiiniga. Me genereerisime Herpes Simplex viiruse (HSV) vektori, mis üleekspresseerib kas metsiktüüpi PSMC5i või ühte selle mutante ja valideeris vektorid NAc-s in vivo (Joonis 5A). PSMC5 viiruse vahendatud ekspressioon domineerib raku tuumas (Joonis 5B). Metsik-tüüpi PSMC5-i üleekspresseerivad hiired ei näidanud muutunud vastuseid kokaiini algannustele, kuid neil oli suurenenud lokomotoorne aktivatsioon vastuseks korduvatele kokaiini doosidele võrreldes GFP-d ekspresseerivate kontrollhiirtega. Seevastu ei avaldanud seda toimet PSMC5-i mutantset vormi üleekspresseerivatel hiirtel, kellel puudus spiraal-spiraal-domeen (PSMC5-ACC).Joonis 5B). Huvitav on see, et PSMC5-K196M-i üleekspressioon, millel puudub metsiktüüpi valgu ATPaasi aktiivsus, võimendas ka kokaiini lokomotoorseid vastuseid.

thumbnail
Joonis 5. PSMC5i üleekspressioon NAc-s suurendab lokomotoorseid reaktsioone kokaiinile.

 

A. HSV vahendatud transgeeni ekspressioon mediaalses NAc-s. AC, eesmine komissuur. Joonisel on märgitud NAc tuuma ja kestade alampiirkonnad. B. PSMC60 immunohistokeemilise värvimise tüüpilised suuremad suurendused (5x) NAc neuronites pärast HSV-PSMC5 süstimist, mis näitab, et valk on valdavalt tuum, nagu on märgitud DAPI värvimisega. C. Hiired said kahepoolseid HSV süste NAc-sse, millele järgnesid kokaiini alammäärade (7.5 mg / kg) igapäevased IP-süstid. Liikumishäired ilmnevad vastusena ravimi esimesele ja viimasele 3-päevasele annusele. PSMC5 või PSMC5-K196M üleekspresseerimine suurendab liikumisvastust korduvale kokaiinile, mida ei ole täheldatud PSMC5-ΔCC korral. Transgeenide olulist mõju lokomotoorsetele reaktsioonidele kokaiini algannustele ei olnud. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 Dunnetti postthoc-testi järgi.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Arutelu

Käesoleva uuringu tulemused näitavad uut mehhanismi, mille abil ΔFosB vahendab oma mõju aju ja uue mehhanismi kokaiinitegevuses. Kasutades erapooletut lähenemist, pärmi kaksikhübriidanalüüsi, tuvastasime PSMC5 uue ΔFosB sidumispartnerina. Me leidsime selle leidmise in vitro ja NAc-s nii kultiveeritud rakkudes in vivo, demonstreerides tugevat PSMC5-AFosB seondumist. Oluline on see, et PSMC5i tuumatasemed indutseeritakse NAc-s kroonilise kokaiini manustamisega. Näitasime veel, et PSMC5-AFosB seostumine toimub koos teiste teiste transkriptsiooniliste aktivaatorvalkudega, nimelt CBP ja p300 (kaks HAT) ja BRG1 (SWI-SNF kromatiini remodelleerumiskomplekside põhikomponent). Üheskoos toetavad meie tulemused hüpoteesi, et PSMC5 on osa transkriptsiooni aktiveerimiskompleksist, mis värvatakse kroonilise kokaiini manustamise käigus vähemalt teatavatele ΔFosB-indutseeritud geenidele (Joonis 4E). Selle hüpoteesiga kooskõlas on täiendav järeldus, et PSMC5i üleekspressioon NAc-s, nagu ka ΔFosB enda üleekspressioon, soodustab käitumise vastuseid kokaiinile. Tulevaste uuringute puhul oleks huvitav jälgida neid in vivo tähelepanekuid PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 interaktsioonide iseloomustamisega in vitro reporteranalüüside abil.

PSMC5i kaasamine kokaiini toimingusse on täiesti uudne. Algselt identifitseeriti proteaasi sisaldava suure ATPaasi perekonna liikmena, et PSMC5 on aastate jooksul näidanud, et neil on interaktsioon mitme transkriptsioonifaktoriga, kaasa arvatud c-Fos, p53, tuumhormooni retseptorid ja basaal transkriptsioonikompleksi koostisosad [25] siiski on aastate jooksul tehtud vähe funktsionaalseid uuringuid [26]. Selle parimaks eesmärgiks on edendada MYC transkriptsioonifaktorite aktiivsust kultiveeritud rakkudes [27]. PSMC5i mõju transkriptsioonimehhanismidele on näidanud, et ubikvitineerumisproteasoomi aktiivsus võib olla geeni transkriptsiooni regulatsioonis potentsiaalne, kuid PSMC5i kaasamine sellesse regulatsiooni on siiani katsetamata [28,29].

Väga vähe on teada PSMC5 funktsioonist ajus. Varasem uuring näitas PSMC5 mRNA laialdast ekspressiooni ajus [30], kuid selle funktsionaalne aktiivsus on uurimata. Meie tulemused viitavad nüüd selle huvitava valgu edasistele uurimistele, et paremini mõista selle rolli geeni transkriptsiooni reguleerimisel ja selle seos ubikvitineerumise proteasoomi funktsiooniga ajus. PSMC5i seondumist ΔFosB-ga vahendab PSMC5-i spiraal-spiraal-domeen. Peale selle ei nõua PSMC5 võimet soodustada kokaiinile lokomotoorseid reaktsioone, nõudes samal ajal spiraal-spiraal-domeeni, aga see ei nõua proteiinile omast ATPaasi aktiivsust. Need tulemused suurendavad võimalust, et vähemalt meie süsteemis võib PSMC5i põhitegevus olla vahendatud selle seondumisega ΔFosB ja teiste transkriptsiooniliste regulatiivsete valkudega, mitte selle proteasoomiga seotud aktiivsuse kaudu. Selle ja alternatiivsete võimaluste otseseks katsetamiseks on vaja täiendavat tööd. Hüpotees, et PSMC5i viiruse poolt vahendatud üleekspressioon suurendas kokaiini lokomotoorseid vastuseid AFosB-ga interaktsioonide kaudu, on usutav, vaatamata 3-i päeva kokaiiniravi režiimile, kuna on teada, et AFosB märgatavad tasemed kogunevad ajus selle aja jooksul [3].

Antud järeldused kinnitavad veelkord erapooletu, avatud tähtajaga eksperimentaalsete lähenemisviiside kasulikkust aju reguleerimise molekulaarse aluse uurimisel. Meie esmane tähelepanu PSMC5ile põhines ainult selle silmapaistvale seostumisele ΔFosB-ga pärmi kahekordses hübriidanalüüsis, kuid see tundub olevat oluline osa transkriptsioonilistest muutustest, mis värbatakse NAc-s korduva kokaiini manustamisega. Praeguste uurimiste keskmeks on parem arusaam PSMC5i tuumatasemete kokaiiniga indutseeritud mehhanismidest ja omakorda sellest, et PSMC5 aitab kaasa kokaiini poolt indutseeritud transkriptsiooni aktivatsioonikompleksidele. Vahepeal näitas meie pärmi kaksikhübriidtesti mitmeid täiendavaid ΔFosB siduvaid partnereid (Tabel 1), mis nõuab ka kokaiinimudelite otsest uurimist. Üheskoos aitab see töö kaasa arusaamisele keerukatest molekulaarsetest mehhanismidest, mille kaudu kokaiin muudab NAc funktsiooni.

Tunnustused

Seda tööd toetasid riikliku narkootikumide kuritarvitamise instituudi ning Ishibashi sihtasutuse ja Jaapani teaduse edendamise ühingu toetused (KAKENHI numbrid: 24591735, 26290064, 25116010).

Autori panused

Kujundanud ja kujundanud katsed: YHO YNO EJN. Tehtud katsed: YHO YNO PJK RN. Analüüsiti andmeid: YHO YNO EJN. Toetatud reaktiivid / materjalid / analüüsivahendid: TN MO ANY RN TT. Kirjutas raamatu: YHO EJN.

viited

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Vahetult varased geenid: kümme aastat hiljem. Trendid Neurosci 18: 66 – 67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Sõltuvuse transkriptsioonimehhanismid: deltaFosB roll. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245 – 3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. pmid: 18640924
  3. Vaata artiklit
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Vaata artiklit
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Vaata artiklit
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Vaata artiklit
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Vaata artiklit
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Vaata artiklit
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Vaata artiklit
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Vaata artiklit
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Vaata artiklit
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Vaata artiklit
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Vaata artiklit
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Vaata artiklit
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Vaata artiklit
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Vaata artiklit
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Vaata artiklit
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Vaata artiklit
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Vaata artiklit
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Vaata artiklit
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Vaata artiklit
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Vaata artiklit
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Vaata artiklit
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Vaata artiklit
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Vaata artiklit
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Vaata artiklit
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Vaata artiklit
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Vaata artiklit
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Vaata artiklit
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Vaata artiklit
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Vaata artiklit
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y jt. (1994) Pikaajalise AP-1i kompleksi indutseerimine, mis koosneb muutunud Fos-tüüpi valkudest ajus kroonilise kokaiini ja teiste krooniliste ravimitega. Neuron 13: 1235 – 1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB mutantsed hiired: Fosiga seotud valkude kroonilise kokaiini induktsiooni kadumine ja suurenenud tundlikkus kokaiini psühhomotoorse ja rahuldava toime suhtes. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) ΔFosB stabiilsuse reguleerimine fosforüülimise teel. J Neurosci 26: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A jt. (2007) Konserveeritud C-terminaalse degroni domeeni puudumine aitab kaasa AFosB unikaalsele stabiilsusele. Eur J Neurosci 25: 3009 – 3019. pmid: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) Käitumuslik ja struktuurne vastus kroonilisele kokaiinile eeldab ettepoole suunatud ahelat, mis hõlmab AFosB-d ja CaMKII-d tuuma accumbens-kestas. J Neurosci 33: 4295 – 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. pmid: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM jt. (1999) Transkriptsioonifaktori ΔFosB ekspressioon ajus kontrollib tundlikkust kokaiini suhtes. Loodus 401: 272 – 276. pmid: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB suurendab kokaiini stimuleerimist. J Neurosci 23: 2488 – 2493. pmid: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Geeniekspressiooni ja kokaiini tasu reguleerimine CREB ja DFosB poolt. Nat Neurosci 11: 1208 – 1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: ΔFosB oluline osa morfiini toimel tuumasõlmedes. Nature Neurosci 9: 205 – 211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P et al. (2003) c-Jun-i domineeriva negatiivse mutandi indutseeritav aju-piirkonna spetsiifiline ekspressioon transgeensetes hiirtes vähendab tundlikkust kokaiini suhtes. Brain Res 970: 73 – 86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Delta FosB ja FosB-sarnaste valkude reguleerimine elektrokonvulsiivsete krampide ja kokaiiniga töötlemise teel. Mol Pharmacol 48: 880 – 889. pmid: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) FosB geeni oluline roll elektrokonvulsiivsete krampide molekulaarses, rakulises ja käitumuslikus toimes. J Neurosci 18: 6952 – 6962. pmid: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonismiga kaasneb D-FosB-sarnase valgu püsiv ekspressioon dopamiinergilistes radades. Mol Brain Res 53: 41 – 52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Eukarüootse transkriptsiooni inhibiitori muundamine aktivaatoriks. Cell 55: 443 – 446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, väljad S (1991) Kahe hübriidsüsteem: meetod huvipakkuva valgu interaktsiooniga valkude geenide tuvastamiseks ja kloonimiseks. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Vaiksete rott-1A rakkude proliferatiivne aktivatsioon delta FosB poolt. Mol Cell Biol 13: 4157 – 4166. pmid: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Polü (ADP-ribosüül) atiooni oluline roll kokaiini toimel. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. pmid: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S et al. (2008) osFosB indutseerimise eritunnused ajus kuritarvitamise ravimitega. Synapse 62: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. pmid: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Imetaja Sug1 ja c-Fos tuuma 26S proteasoomis. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Atsetüülimise regulatsioon peamise histokompatibilisuse kompleksi II proksimaalse promootoriga 19S proteasoomi ATPaasi Sug1 poolt. Mol Cell Biol 28: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. pmid: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-siduv valk kontrollib reaktsiooni kokaiinile atsetüülides histoneid fosB promootoril hiire striatumis. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT jt. (2005) Kromatiini remodelleerumine on peamine mehhanism, mis põhineb kokaiini tekitatud plastilisusel striatumis. Neuron 48: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Transkriptsiooniregulaatorite kaks funktsiooni: müüt või tegelikkus. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) 26S proteasoomi regulatiivne allüksuse interaktsioon, keeruline probleem. Trendid Biochem Sci 25: 83 – 88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) ubikvitiini / proteasoomi süsteemi mõju myc-reguleeritud transkriptsioonile. Cell Cycle 2 – 5: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitiin ja proteasoomid transkriptsioonis. Annu Rev Biochem 81: 177 – 201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. pmid: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteasoom: kasuliku vahend transkriptsiooni jaoks? Curr Op Genet Dev 16: 197 – 202. pmid: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Fülogeneetiliselt konserveerunud Sug1 CAD perekonnaliikme identifitseerimine, mis ekspresseerub hiire närvisüsteemis erinevalt. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5