DeltaFosB stabiilsuse reguleerimine fosforüülimise teel (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.

allikas

Psühhiaatria osakond, Põhi-neuroteaduse keskus, Texase Ülikool Loode-meditsiinikeskus, Dallas, Texas 75390-9070, USA.

Abstraktne

Transkriptsioonifaktor DeltaFosB (mida nimetatakse ka kui FosB2 või FosB [lühike vorm]) on oluline vahendaja, mis põhjustab ajus esilekutsuvat pikaajalist plastilisust mitmesuguste psühhoaktiivsete stiimulite, sealhulgas kuritarvitamise, stressi ja elektrokonvulsiivsete krampide puhul. . DeltaFosB eripära on see, et pärast esilekutsumist püsib see ajus suhteliselt pika aja jooksul, ilma täiendava stimuleerimiseta. Selle nähtava stabiilsuse aluseks olevad mehhanismid on siiski teadmata. Siin näitame, et DeltaFosB on suhteliselt stabiilne transkriptsioonifaktor, mille poolestusaeg on rakukultuuris ligikaudu 10 h. Lisaks näitame, et DeltaFosB on ajus fosfoproteiin ja et DeltaFosB-s väga konserveerunud seriinijäägi (Ser27) fosforüülimine kaitseb seda proteasoomi lagunemise eest. Pakume mitmeid tõendeid, mis viitavad sellele, et fosforüülimist vahendab kaseiini kinaas 2. Need tulemused on esimesed tõendid selle kohta, et DeltaFosB on fosforüleeritud ja näidanud, et fosforüülimine aitab kaasa selle stabiilsusele, mis on selle võime vahendada aju pikaajalisi kohandusi.

Sissejuhatus

Transkriptsioonifaktor AFosB, mida nimetatakse ka FosB2 või FosB [lühike vorm], on vahetu varase geeni C-otsaga kärbitud splice-variant. fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu ja Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Nagu täispikkuses FosB, on ΔFosB-l DNA-ga seonduv alusdomeen ja leutsiini tõmblukk, mille kaudu see dimereerub Jun-valkudega, moodustades aktivaatorvalgu-1 (AP-1) transkriptsioonifaktori kompleksid, mis reguleerivad paljude geenide ekspressiooni (Morgan ja Curran, 1995; Rylski ja Kaczmarek, 2004). Vaatamata sellele, et FosB C-otsas leitud transaktivatsiooni domeeni puudus, toimib AFosB nii tugeva transkriptsiooni aktivaatorina kui ka repressorina kultiveeritud rakkudes ja ajus (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu ja Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung ja Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).

ΔFosB indutseeritakse ajus kõrgele tasemele piirkonnaspetsiifilisel viisil pärast kroonilist, kuid mitte ägedaid kokkupuuteid mitmesuguste psühhoaktiivsete stiimulitega, kaasa arvatud stress, teatud kahjustused, antipsühhootilised ja antidepressandid, kuritarvitamise ravimid ja looduslikud hüved. (Hope et al., 1994b; Hiroi ja Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti jt, 2004; Zachariou et al., 2006). ΔFosB induktsioon on otseselt seotud mitme sellise aju funktsionaalsete toimetega. ΔFosB püsimine isegi täiendava stimuleerimise puudumisel eristab seda kõigist teistest Fos perekonna transkriptsioonifaktoritest, mida indutseeritakse kiirelt vastuseks ägedatele stiimulitele, lagunevad tagasi basaaltasemeni mõne tunni jooksul ja pärast kroonilist stimuleerimist esineb tavaliselt desensibiliseerimist (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi ja Graybiel, 1996; Perrotti jt, 2004). See muudab ΔFosB atraktiivseks kandidaadiks, et vahendada mõningaid pikaajalisi muutusi geeniekspressioonis, mis on teatud krooniliste stiimulite põhjustatud stabiilsete neuronaalsete kohanduste aluseks.

Kuna AFosB pikaajaline esinemine toimub selle mRNA edasise indutseerimise puudumisel (Chen et al., 1995), oletasime, et erinevalt täispikkast FosB-st ja kõigist teistest Fos perekonna valkudest, mis on olemuslikult ebastabiilsed, võib ΔFosB olla ebatavaliselt stabiilne transkriptsioonifaktor (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler jt, 2001; McClung jt, 2004). Veelgi enam, ägedate ja krooniliselt stimuleeritud ajukude immunoblotanalüüs näitas, et ΔFosB nihkub nähtaval M_r (molekulmass) ∼33 kDa-st ägedas seisundis kuni ∼35 – 37 kDa kroonilise ravi ajal (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Kuna puuduvad tõendid täiendavate mRNA-de olemasolu kohta, mis võiksid neid erinevaid isovorme kodeerida, siis spekuleerisime, et ΔFosB on posttranslatsiooniliselt modifitseeritud ja et see võib aidata kaasa selle ebatavalisele stabiilsusele. Praeguseks ei ole siiski teatatud ΔFosB käibe või posttranslatsiooniliste modifikatsioonide biokeemilistest analüüsidest. Käesoleva uuringu eesmärk oli teha kindlaks, kas ΔFosB on fosfoproteiin ja kas fosforüülimine mängib rolli selle stabiilsuses.

Eelmine osaJärgmine osa

Materjalid ja meetodid

Imetaja rakuliinid ja DNA konstruktid.

PC12 rakke (Clontech, Mountainview, CA) kultiveeriti l-glutamiini (L-Gln) sisaldavas kõrge glükoosisisaldusega DMEM-is ja täiendati 5% veise loote seerumiga (FBS), hobuse seerumiga 10% (mõlemad Invitrogen, Carlsbad, CA) 100 U / ml penitsilliini ja 100 μg / ml streptomütsiini (mõlemad Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). HeLa rakke (American Type Culture Collection, Manassas, VA) kultiveeriti L-Glni sisaldavas kõrge glükoosisisaldusega DMEM-is ja täiendati 10% FBS, penitsilliini ja streptomütsiiniga. Mõlemat rakuliini hoiti 37 ° C juures niiskes 5% CO₂ atmosfääri.

DNA-ga transientsete transfektsioonide jaoks külvati PC12 või HeLa rakud 6-süvendilistele plaatidele (kaetud kollageen I PC12 rakkudega), et jõuda järgmisel päeval 90-100% konfluentsuseni ja transfekteeriti seejärel Lipofectamine 2000 (Invitrogen) abil. Mõnedes katsetes (vt Joonised fig. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), Ekspresseeriti ΔFosB PC12 rakkudes ajutiselt rekombinantse herpes simplex viirusega (HSV) nakatumise kaudu.

FosB ja FosB cDNAd saadi meie enda pTetop-konstruktidest (Chen et al., 1997) ja subklooniti pcDNA3.1 vektorisse (Invitrogen). Neid pcDNA3.1-AFosB / FosB konstruktsioone kasutati imetajarakkudes ekspresseerimiseks ja saidipõhise mutageneesi malliks. Rekombinantne HSV-AFosB valmistati vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Neve et al., 1997) ja preparaadi tiiter oli N1 × 10⁸ pfu / ml.

Pulseerivad katsed.

Umbes 24 h pärast nakatamist / transfektsiooni pesti rakke (PC12 või HeLa) kuue süvendiga plaatidel kaks kuni kolm korda 2 ml PBS-ga ja inkubeeriti 37 ° C juures ∼1 h kohta 2 ml Cys / Met-vaba DMEM-s (Invitrogen), millele on lisatud 5% dialüüsitud FBS-i (Hyclone, Logan, UT) Met ja Cys intratsellulaarsete kogumite ammendamiseks. Selle "nälgimisperioodi" lõpus lisati ravimid (kui rakke töödeldi) ja rakud märgistati (impulss) 12-25 μCi-ga ³⁵S valgu märgistamise segu (PerkinElmeri, Wellesley, MA) ∼1 h-le 37 ° C juures kõigi uute sünteesitud valkude märgistamiseks. Seejärel eemaldati radiomärgis rakkude pesemisega kaks kuni kolm korda 2 ml PBS-ga ja ³⁵Järgiti S-märgistatud valke (jälitatakse), asendades söötmega "külma" (mitteradioaktiivse) söötmega, millele oli lisatud 5% FBS, ja rakud koguti erinevatel ajahetkedel. Rakkude töötlemist hoiti kogu tagaajamise vältel. Kõikide nende katsete arvud näitavad erinevate valkude sarnaseid algsummasid, et optimeerida nende käibemäärade võrdlusi.

Loomad ja krooniline elektrokonvulsiivne krampide ravi.

Täiskasvanud Sprague Dawley isased rotid (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) raviti üks kord päevas koos 7 – 9 d. ECS viidi läbi nii, nagu eelnevalt kirjeldatud (Hope et al., 1994a) kasutades Ugo Basile (Comerio VA, Itaalia) ECS-seade järgmiste seadistustega: sagedus, 100-impulss / s; impulss koos, 0.5 ms; šoki kestus, 1.0 s; ja vool, 75 mA. Pimekontrolliga loomi raviti paralleelselt, rakendades kõrvaklambri elektroode ilma elektrivooluta.

³² P metaboolne märgistamine.

Aju viilude märgistamiseks dekapiteeriti rotid, ajus kiiresti lõigati ja 300 μm eesmised koore viilud valmistati DSK mikroskeerijaga (Ted Pella, Redding, CA). Viilusid inkubeeriti plasttorude sees fosfaatpuuduliku kunstliku CSF-i (ACSF) 2 ml-s ja hoiti 30 ° C juures pideva õrna mullitamisega O-ga.₂/ CO₂ segu (Hemmings et al., 1989). Viilud (kaks viilu toru kohta) märgistati 1.3 mCi-ga 8-10 h jaoks okadaiinhappe (100 ng / ml) juuresolekul või puudumisel. Selle inkubatsiooni lõpus loputati viilud vähemalt kolm korda külma ACSF-iga ja seejärel homogeniseeriti ultraheliga 250 μl külma radioimmunosadestamise analüüsi (RIPA) puhvris [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v ) Igepal, 0.5% (w / v) naatriumdoksükolaat, 0.1% (mass / maht) SDS, 1 mm EDTA], mida on enne kasutamist kasutatud SDS-iga kuni 0.6%, proteaasi inhibiitorite kokteili imetajate rakkudele (kasutatakse 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), fosfataasi inhibiitorite kokteilid I ja II (kasutatakse 1is: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF ja 2% glütserool. Seejärel keedeti homogenaate 15 min ja puhastati tsentrifuugimisega 15,000-is g 15 min. Saadud supernatantide valgu kontsentratsiooni hinnati BCA valgu analüüsi abil (Pierce, Holmdel, NJ).

Jaoks ³²Kultiveeritud rakkude märgistamine ∼24 h pärast nakatamist / transfektsiooni, rakke pesti kaks kuni kolm korda fosfaadivaba söötmega ja inkubeeriti selles söötmes ∼1 h. Pärast seda nälga, 0.2 – 0.3 mCi of ³²PH₃PO₄ (PerkinElmeri) lisati igasse süvendisse ja rakud märgistati 4-12 h jaoks sõltuvalt katse liigist (vt joonised 1 – 7 spetsifikatsioonide jaoks). Seejärel pesti rakke kolm korda PBS-iga ja lüüsiti jääl 15 min min 50 μl täiendatud RIPA puhvriga. Lüsaadid koguti kraapimisega ja viidi läbi 10i ajad läbi 25 ga nõela lõikamiseks DNA-sse, keedeti 10 min-le ja tsentrifuugiti 15,000 rpm juures 15 – 30 min 4 ° C juures. Tühjendatud lüsaadid (supernatandid) viidi uude tuubi ja viidi läbi BCA valgu test (Pierce). Nende eksperimentide kõik joonised näitavad sarnaste koguste metsiktüüpi (WT) ja S27A AFosB valke, et optimeerida nende suhtelise fosforüülimise taseme võrdlusi.

Kemikaalid ja rakukultuuri töötlemine.

Okadaiinhape (OA; Sigma-Aldrich) lahustati etanoolis ja kasutati lõppkontsentratsioonis 100 ng / ml. 5,6-dikloro-1-β-d-ribofuranosüülbensimidasool (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) lahustati dimetüülsulfoksiidis (DMSO; Sigma-Aldrich) ja seda kasutati rakukultuuris 50 μm lõppkontsentratsioonis. Spermiin (Sigma-Aldrich) lahustati vees ja kasutati lõppkontsentratsioonis 200 μm. Calphostin-C (Biomol) lahustati DMSO-s ja kasutati 0.2 μm juures, samal ajal kui forfor 12-müristaat 13-atsetaat (PMA; Promega, Madison, WI) lahustati DMSO-s ja kasutati 0.1 μm juures. müristüülitud-autokamidi-2-ga seotud inhibeeriv peptiid (m-AIP; Biomol) lahustati vees ja kasutati lõppkontsentratsioonis 1 ja 10 μm. Laia spektriga proteiinkinaasi inhibiitorid H-7 ja H-8 (Biomol) lahustati vees ja kasutati vastavalt 150 ja 200 μm lõppkontsentratsioonil. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) ja epoksomitsiin (Peptides International, Louisville, KY) lahustati nii DMSO-s kui ka 12.5 ja 7.5 μm lõppkontsentratsioonis. Kõigis katsetes lisati rakkudele DMSO (vehiikel) vajadusel, et säilitada kogu DMSO konstantse koguse. Sest ³²Märgistamiskatsetel lisati ravimid vahetult enne etiketti ja neid hoiti ülejäänud märgistamisperioodi jooksul. Pulseerivate katsete puhul lisati Cys / Met "näljahäda" ajal ravimid, mida hoiti märgistamisperioodi vältel ja seejärel lisati tagasi söögikeskkonda. Proteasoomi inhibiitoreid viidi kogu 3-4 h-sse kogu püüdes, et kompenseerida nende peptiidide kiiret käivet.

AFosB immunosadestamine, immunoblotimine ja autoradiograafia.

Immunosadestamise korral lahjendati lüsaate 1: 5 koos tavalise RIPA-ga, et viia SDS kontsentratsioon alla 0.1%, enne kui jätkati immunosadestamist (IP). Mittespetsiifilise seondumise piiramiseks puhastati lüsaadid kõigepealt immunosadestamisega mitteimmuunse IgG ja valgu G-sefaroosiga (Sigma-Aldrich) vähemalt 4 h jooksul. Seejärel FosB immuunsadestati puhastatud lüsaatidest, kasutades kitse polüklonaalset antikeha, mis tunneb ära nii FosB kui ka ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) sisemise epitoobi 0.5-1 μg lgG-i kohta 10 μg lüsaatvalgu kohta (50 – 300 μg kogu valku) 0.5 ml kogumahus. IP-d segati õrnalt 4 ° C juures rootoril vähemalt 8 h jooksul ja seejärel lisati 15 μl valku G-Sepharose ja IP-sid segati vähemalt teise 4 h jooksul. IP-d pelletiseeriti ketramiseks 3000-is × g 3 – 5 min 4 ° C juures pestakse kolm korda 0.5 ml külma plaadi RIPA-ga ja kaks korda külma PBS-iga, mis sisaldab 0.1% Tween 20. Seejärel resuspendeeriti IP-d külma PBS-i 0.5 ml-s, kanti üle, pelletiti uues katseklaasis ja seejärel elueeriti immunosadestatud valgud 15-25i 2 × redutseeriva Laemmli valgu puhvri lisamisega. See IP-protokoll andis tulemuseks praktiliselt kogu FosB sadestumise lüsaadis. Immunosadestatud valke töödeldi SDS-PAGE-ga, laadides kogu IP-i 12.5% Tris-HCl kriteeriumi geelile (Bio-Rad, Hercules, CA), seejärel kanti PVDF või nitrotselluloosile. Pärast ülekandmist membraan kuivatati õhu käes ja ³²P- ja ³⁵S-radiomärgistatud valguribasid täheldati autoradiograafia abil, kasutades Kodaki (Rochester, NY) autoradiograafilist filmi, samuti fosforimeerimise teel, kasutades Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Üldine (fosforüülimata ja fosforüülitud) ΔFosB rakkude lüsaatides või aju homogenaatides tuvastati immunoplekeeritud valgu immunoblotimisega (kasutades sama membraani, mida kasutati selle tuvastamiseks). ³²P-märgistatud valk) või võrdsetes kogustes lüsaadi / homogenaadi valku, mis on allutatud SDS-PAGE-le ja kantud PVDF-le või nitrotselluloosile. Membraan blokeeriti esmalt, inkubeerides seda 1% (w / v) rasvata kuiva piimaga (Bio-Rad) PBS-s, millele oli lisatud 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) 1 h juures 25 ° C juures. Membraan immoblotiti seejärel üleöö 4 ° C juures, kasutades meie enda küüliku FosB-vastast polüklonaalset antikeha, mis oli genereeritud FosB / AFosB aminohapete 1-16 vastu (mida kasutati 1: 10,000). Pärast primaarset inkubeerimist pesti membraane blokeerimispuhvriga neli korda 5 min ja seejärel inkubeeriti 25 ° C juures N1 h-ga küüliku küüliku IgG-ga, mis oli konjugeeritud mädarõika peroksidaasiga (kasutatakse 1: 5000 blokeerimispuhvris, alates vektorist Laboratories, Burlingame, CA). Seejärel pesti membraanid kolm korda 10 min-ga blokeerimispuhvriga ja üks kord 5 min PBS-ga. Kogu AFosB valgu ribad visualiseeriti Kodak MR kilel parandatud kemoluminestsentsi (Pierce) abil ja / või fluorestsentsi avastamisega, kasutades ECL-Plus reagente (Amersham Biosciences) ja Storm PhosphorImagerit.

Rekombinantse AFosB üleekspressioon ja puhastamine putukarakkudest.

AfosB ekspresseeriti Sf9 putukarakkudes üle N-terminaalse heksa-His-märgistatud valguna (N-His (6) AFosB), kasutades Bac-to-Bac bakuloviiruse ekspressioonisüsteemi (Invitrogen) ja järgides tootja juhiseid. Lühidalt, AFosB cDNA (jäägid 2 – 237), millele eelneb afiinsus N-terminaalne märgis MGHHHHHHAG, subklooniti pFASTBacTM1 vektorisse, mida kasutati rekombinantse bakuloviiruse genereerimiseks. Sf9-rakud nakatati rekombinantse viirusega ja N-His (6) AFosB puhastati rakulüsaatidest mitmete kromatograafiliste etappidega, sealhulgas afiinsuskromatograafiaga, kasutades nikli kolonni (Qiagen, Valencia, CA), anioonvahetust, kasutades mono-Q kolonni (Amersham Biosciences) ja suuruse välistamine, kasutades geelfiltratsioonikolonni (Amersham Biosciences).

In vitro fosforüülimise uuringud.

In vitro fosforüülimisreaktsioonid aja kulgemiseks ja stöhhiomeetriliseks analüüsiks viidi läbi 30 μl substraati sisaldava 10 μl (N-His (6) ΔFosB või positiivse kontroll-substraadi), 250 μm ATP ja 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP, kinaasi tootja tarnitud puhver ja üks järgmistest kinaasidest: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) või p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Aja jooksul toimuvad reaktsioonid viidi läbi, eemaldades 5 μl alikvoodid reaktsioonilahusest määratud ajahetkedel ja lisades võrdse mahu 4 × redutseeriva Laemmli valgu proovipuhvri. Michaelis-Menteni kineetilised parameetrid CK2-i reaktsiooni jaoks määrati empiiriliselt määratletud lineaarsete tasakaaluoleku tingimustes. Need reaktsioonid viidi läbi 15 min puhul 10 μl mahus, mis sisaldas 2 ng / μl ensüümi, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP ja N-His (6) ΔFosB kontsentratsioonid vahemikus 2.5 – 30 μm. Kõik reaktsioonid viidi läbi 30 ° C juures veevannis. Pärast SDS-PAGE ja geeli värvimist Bio-Safe Coomassie'ga (Bio-Rad) kuivatati geel ja ³²P-fosfaadi inkorporeerimist hinnati fosforimeerimise analüüsiga (vt allpool, Andmete kvantifitseerimine, arvutused ja statistika).

Kahemõõtmeline fosfopeptiidide kaart ja fosfoaminohappe analüüs.

Mõlemad analüüsid viidi läbi nii, nagu on kirjeldatud Ploegh ja Dunn (2000). Lühidalt, kuiva geeli fragmendid, mis sisaldavad ³²P-märgistatud ΔFosB (kas vitro või metaboolselt märgistatud rakkude immunosadestamisel), lõigati, rehüdreeriti, pesti ja töödeldi trüptilise lagundamisega. Trüptilisi lagundamissaadusi sisaldav supernatant lüofiliseeriti ja lüofiliseeritud segu pesti mitu korda ja resuspendeeriti 10 μl elektroforeesipuhvris, pH 1.9. Proov (3 μl) märgiti tselluloosi õhekihikromatograafia (TLC) plaadile (Analtech, Newark, DE) ja eraldati ühes mõõdus elektroforeesi ja teise mõõtmega kasvava TLC abil. Saadud fosfopeptiidkaardid visualiseeriti autoradiograafia ja fosforimisega. Fosfoaminohappe analüüsi jaoks lõhustati uuesti 2 μl elektroforeesipuhvris resuspendeeritud trüptilisi lagundamisi 105 ° C juures HCN hüdrolüüsiga 25 min.₂ atmosfääri. Reaktsioon peatati 6-kordse lahjendamisega vees ja segu lüofiliseeriti. Lüofilisaat suspendeeriti uuesti 5 μl elektroforeesipuhvris, pH 1.9, ja märgiti tselluloos-TLC plaadile koos fosfo-Ser, -Thr ja -Tyr standarditega. Elektroforees viidi läbi üle poole TLC plaadi pikkusest, kasutades elektroforeesipuhvrit, pH 1.9, ja seejärel viidi plaat pH 3.5 puhvrisse ja viidi lõpule elektroforees. Fosfoaminohappe standardid visualiseeriti TLC plaadi pihustamisega 1% (v / v) ninhüdriini lahusega atsetoonis ja ³²P-märgistatud aminohapete proovid visualiseeriti nii autoradiograafia kui ka fosforimatsiooni abil.

siRNA-indutseeritud CK2a-deaktiveerimine.

Me kasutasime RNA interferentsi meetodit CK2i tasemete selektiivseks katkestamiseks (Di Maira jt, 2005). PC12 rakud külvati kollageeni I-ga kaetud kuue süvendiga plaatidele, et jõuda järgmisel päeval N70-80% konfluentsuseni, kui nad transfekteeriti ajutiselt 20 nm-ga (lõppkontsentratsioon) kas mittesihistava siRNA või siRNA suhtes, mis oli suunatud katalüütilise MRNA suhtes. α roti CK2 subühik, kasutades 5 μl transfektsiooni agent SilentFectini (Bio-Rad) ja järgides tootja juhiseid. Umbes 24 h hiljem transfekteeriti rakud ajutiselt ΔFosB plasmiidiga, nagu ülalpool öeldud. Umbes 24 h hiljem (N48 h pärast siRNA transfektsiooni) allutati rakkudele kas ³²P metaboolne märgistus või pulss-chase analüüs, nagu eespool kirjeldatud. Järgmised neli CK2α siRNAde kasutati sarnaste tulemustega: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3' (Dharmacon, Lafayette, CO). Negatiivse kontrollina kasutasime seda Summuti negatiivne kontroll #3 siRNA Ambionist (Austin, TX). CK2i knock-down'i ulatust jälgiti immunoblotimisega, kasutades anti-CK2 polüklonaalset antikeha (kataloog # 06-873 alates Upstate) üleöö 1: 1000 lahjenduses. β-Tubuliini kasutati laadimise kontrollina ja tuvastati monoklonaalse antikehaga (kataloog # 05-661 alates Upstate) üleöö 1: 20,000 lahjenduses.

Saidi poolt suunatud mutagenees.

Ser27i mutatsioon Ala või Asp-ga teostati, kasutades Quick Change Site-Directed Mutagenesis komplekti (Stratagene, La Jolla, CA) ja järgides tootja juhiseid. Ser27-i mutatsioonide sisestamiseks hiire AFosB valkudesse kasutati järgmisi mutageneesi praimereid. Ser27 to Ala: (pöördpraimer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. Ser27 to Asp (edasi praimeri) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. Muteeritud alused on rasvases kirjas ja Ser27 koodon on kursiivis.

Bioinformaatika.

AFosB potentsiaalseid fosforüülimissaite ja kinaase otsiti, esitades hiire valgu järjestuse spetsiaalsetele andmebaasidele, kaasa arvatud ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost jt, 2004) ja NetPhosK (Blom et al., 2004).

Andmete kvantifitseerimine, arvutused ja statistika.

PVDF-i või nitrotselluloosmembraanis leiduva valgu kogus kvantifitseeriti Storm PhosphorImager'i ja sellega kaasneva ImageQuant tarkvara abil (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). Rakukultuuri ja aju viilu fosforüülimise uuringutes saadi väärtused, mis saadi ³²Seejärel jagati P-märgistatud valk koguväärtusega AFosB saadud väärtustega ja väljendati suhtena. In vitro fosforüülimisuuringud ³²P-märgistatud ΔFosB ühe FosB mooli kohta (stöhhiomeetria) arvutati eelnevalt kirjeldatud viisil (Sahin et al., 2004). Kõik mõõtmised tehti kasutatud instrumendi lineaarsuse vahemikus. Kineetilised parameetrid arvutati Michaelis-Menten mudeli abil V = V_max[S] / ([S]+K_M) Ja V_max = k₂[E_Summa]. Poolväärtusaeg (t_1/2ΔFosB ja FosB väärtused hinnati pulseerimisjoonte põhjal (kasutades mittelineaarset regressiooni, mis kõige paremini sobib andmepunkte) ja vastab ajale, mil ülejäänud valgu kogus on 50% originaalist. Kõikidel joonistel on esitatud tulemused esindavad vähemalt kahte kuni kolme sõltumatut katset. Kõigis graafikutes on esitatud andmed keskmised ± SEM (3 ≤ n ≤16). Erinevuste statistilist olulisust hinnati paaritu t korrigeeritud mitme võrdluse korral ja tärnid näitavad p ≤ 0.05.

Eelmine osaJärgmine osa

Tulemused

ΔFosB on ebatavaliselt stabiilne transkriptsioonifaktor

Kuigi oleme eelnevalt spekuleerinud, et ΔFosB on suhteliselt stabiilne transkriptsioonifaktor (Nestler jt, 2001) ei ole seni läbi viidud valgu käibeprofiili otsest analüüsi. Selle küsimuse lahendamiseks viidi läbi pulss-chase eksperimendid PC12-rakkudega, mida on laialdaselt kasutatud neuronitaolise rakuliinina, kus AFosB ekspresseeriti ajutiselt läbi rekombinantse herpes simplex viiruse (HSV-ΔFosB) nakkuse. Äsja sünteesitud valgud märgistati metaboolselt ³⁵S-Met / Cys ja lagunemise muster ³⁵S-märgistatud ΔFosB (³⁵S-AFosB) jälgiti immunosadestamisega raku lüsaatidest, mis saadi erinevatel ajahetkedel pärast radiomärgistatud aminohapete eemaldamist. Immunopretsipitaatide analüüs SDS-PAGE abil ja autoradiograafia näitas, et ΔFosB poolväärtusaeg PC12 rakkudes on ∼10 h (Joon. 1). Need tulemused näitavad, et ΔFosB poolväärtusaeg on suurem kui kõige indutseeritavate transkriptsioonifaktorite (vt arutelu), sealhulgas täispikk FosB, mille poolväärtusaeg rakukultuuris on ∼90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Lisaks väärib märkimist, et ΔFosB lagunemine ei sobi esimese astme eksponentsiaalse lagunemise kõveraga, vaid pigem on see kahefaasiline, alustades aeglasema lagunemiskiirusega. See viitab rohkem kui ühe ΔFosB liigi ja / või rohkem kui ühe lagunemisraja olemasolule.

Vaata suuremat versiooni:

• Sellel lehel
• Uues aknas

• Lae alla PowerPoint Slide

Joonis 1.

ΔFosB on ebatavaliselt stabiilne transkriptsioonifaktor. ΔFosB poolväärtusaeg on rakukultuuris ∼10 h. AFosB ekspresseeriti PC12-rakkudes kas nakatamise teel HSV-AFosB-ga või transientse transfektsiooniga AFosB-d sisaldava plasmiidiga ja rakkudele viidi läbi pulseerimis-katsed, nagu on kirjeldatud materjalides ja meetodites. Samaväärsed tulemused saadi sõltumata ΔFosB üleekspressiooni meetodist. Joonisel on kujutatud AFosB lagunemise ajakava (ja tüüpiline autoradiogramm). Joonistatud andmed on vähemalt viiest sõltumatust katsel saadud vähemalt 15i individuaalsete andmepunktide keskmine ± SEM. Võrdluseks on näidatud täispika FosB poolväärtusaeg.

ΔFosB on aju fosfoproteiin

Me oletame, et ΔFosB posttranslatsiooniline modifikatsioon võib aidata kaasa selle ilmsele stabiilsusele. Kuna on näidatud, et fosforüülimine moduleerib transkriptsioonifaktorite aktiivsust mitmel viisil, kaasa arvatud nende stabiilsus (vt Desterro et al., 2000; Whitmarsh ja Davis, 2000) uuriti, kas ΔFosB on fosfoproteiin. Sel eesmärgil indutseeriti AFosB ekspressioon roti ajus, kasutades kroonilist ECS-i, mis on teadaolevalt ΔFosB kõrge taseme indutseerimine, eriti frontaalses ajukoores (Hope et al., 1994a). Ühel päeval pärast viimast ECS-i töötlemist, kui ΔFosB tasemed püsivad kõrged, valmistati õhukesed eesmise koore viilud ja märgistati metaboolselt ³²P-ortofosfaat. Paralleelset viilude komplekti ei märgistatud radioaktiivselt, ja neid kasutati AFosB tasemete tuvastamiseks. Pärast immunosadestamist spetsiifilise anti-FosB / AFosB antikehaga ja immunosadestatud valkude eraldamist SDS-PAGE abil, fosforüüliti ³²P-märgistatud AFosB tuvastati autoradiograafia abil, samas kui kogu AFosB tuvastati immunoblotimisega. See analüüs näitas, et ΔFosB fosforüülitakse ajus, nagu on näidanud spetsiifiline ³²P-märgisega ∼35 kDa ribad, mis esinevad krooniliselt töödeldud aju proovides, kuid on praktiliselt märkamatult kontrollitud (vt.Joon. 2A). See on kooskõlas asjaoluga, et kroonilise stimulatsiooni puudumisel on ΔFosB basaaltasemed väga madalad. Immunosadestamise reaktsiooni spetsiifilisust illustreerib signaali puudumine mitteimmuunse IgG sadestuses.

Vaata suuremat versiooni:

• Sellel lehel
• Uues aknas

• Lae alla PowerPoint Slide

Joonis 2.

ΔFosB on aju fosfoproteiin. A, AFosB fosforüülitakse ajus. Endogeenne AFosB indutseeriti roti ajus kroonilise ECS-ravi abil, nagu on kirjeldatud materjalides ja meetodites. Frontaalsed koore viilud märgistati metaboolselt ³²PH₃PO₄ mitu tundi. Pärast viilude homogeniseerimist ΔFosB immunosadestati ja fosforüüliti ΔFosB (³²P-ΔFosB) tuvastati autoradiograafia abil (ülemine paneel). Üldine AFosB tuvastati mitte-radioaktiivsetes immunosadestustes immunoblotimisega (alumine paneel). Negatiivsete kontrollidena on näidatud häbipuhastatud looma ja mitteimmuunse IgG immunosadestamine. BBioinformaatilise analüüsi abil saadi kandidaatfosforüülimissaidid ja kinaasid, millel olid vastavate prognooside tulemused hiire ΔFosB valgu järjestusele. Kõrgeima prognoosi skooriga kandidaat-saidid on valgu järjestuses esile toodud ja tabelis loetletud. DNA-siduv (alus) domeen ja leutsiini tõmblukk on valgu järjestuses paksus kirjas. C, D, FosB fosforüülimine suureneb Ser / Thr fosfataasi inhibiitori OA poolt. C, ³²PN-FosB tasemed immunopretsipitaatides, mis olid pärit 100 ng / ml OA (graafik ja ülemine paneel) puudumisel (Ctr) või kohalolekul, märgistati autoradiograafia abil. Alumine paneel näitab immunoflotiseerimisel immunopretsipitaatides tuvastatud ΔFosB koguhulka. DPC12 rakud nakatati HSV-AFosB või HSV-LacZ-ga (vektor) ja märgistati metaboolselt ³²PH₃PO₄ 100 ng / ml OA puudumisel (Ctr) või juuresolekul. ³²P-ΔFosB tasemed immunosadestamisel tuvastati autoradiograafia abil (graafik, ülemine paneel). Alumine paneel näitab rakulüsaatides immunoblotimisel tuvastatud ΔFosB koguarvu.

Esimese sammuna selgitamaks, milline kinaas (id) ja ala (d) on seotud FosB fosforüülimisega, teostasime selle aminohappejärjestuse mitme bioinformaatilise analüüsi jaoks. See näitas, et kuigi ΔFosB ei sisalda Tyr fosforüülimiskandidaatide saite, sisaldab see mitmeid Ser / Thr kinaasi konsensuse saite, sealhulgas kolm CaMKII saiti, kolm CK2 saiti ja kaks PKC saiti, millel on väga kõrged fosforüülimise prognoosid (Joon. 2B). Kui bioinformaatika kaudu ennustatakse ΔFosB fosforüülimist ainult Ser- või Thr-jääkidega, siis peaks selle fosforüülimine olema oluliselt modifitseeritud Ser / Thr fosfataaside aktiivsusega. Selle hüpoteesi testimiseks märgistasime eesmise koore viiludega ³²P-ortofosfaat OA, Ser / Thr valgu fosfataasi inhibiitori juuresolekul või puudumisel. Nagu näidatud Joonis 2C, Põhjustas OA suure (N2.5-kordse) tõusu ³²P-ΔFosB. See põhjustas ka ΔFosB koguhulga väikese suurenemise, mis on kooskõlas eelnevate aruannetega, mis seovad OA kantserogeenset toimet selle võimele indutseerida mitmeid otseseid varaseid geene, sealhulgas Fos valke (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Netotulemus on fosforüülitud ΔFosB taseme oluline üldine kasv (∼60%).

Seejärel uurisime, kas PC12-rakkudes, mis on rohkem eksperimentaalseks manipuleerimiseks sobivad, näitas AFosB fosforüülimismustrit, mis on sarnane aju nägemisega. Me ekspresseerime ΔFosB-d PC12-rakkudes HSV-ΔFosB-ga nakatamise teel ja märgistati rakud metaboolselt ³²P-ortofosfaat OA juuresolekul või puudumisel. Valgu edukat ekspressiooni ja immunosadestamist HSV-AFosB-ga nakatunud rakkudest näitab mõlema immunoblotiga (Joon. 2Dbottom35 kDa riba alumine paneel) ja autoradiograaf (ülemine paneel), mis puudub vektoriga nakatunud rakkudes. Nagu täheldati ajus, põhjustas OA kogu ΔFosB tasemete väikest tõusu, kuid palju suurem (ligikaudu kaks korda) kasvas ³²P-ΔFosB, mille tulemuseks on AFosB fosforüülimise oluline (∼50%) netokasv. Veelgi enam, kooskõlas bioinformaatiliste prognoosidega ei põhjustanud PC12-rakkude ravi Tyr-fosfataasi inhibiitoriga olulisi muutusi. ³²P-ΔFosB tasemed (andmeid ei ole näidatud). Need tulemused näitasid üheskoos, et AFosB fosforüülitakse Ser ja / või Thr jääkidega ajus ja PC12 rakkudes ning kinnitas, et see on hea rakukultuuride süsteem, kus täiendavalt uurida ΔFosB fosforüülimis- ja lagunemisprofiile.

CK2, kuid mitte PKC või CaMKII fosforüülib ΔFosB vitro

Nagu ülalpool kirjeldatud, näitas AFosB aminohappejärjestuse analüüs kõrge CK2, PKC ja CaMKII fosforüülimissaitide prognooside skoori. Selleks, et määrata, milline neist kinaasidest võib FosB-d fosforüülida, viidi läbi seeria vitro fosforüülimisreaktsioonid, kasutades puhastatud kinaase ja puhastatud rekombinantset AFosB. Nagu näidatud Joonis 3Akolmest kandidaat-kinaasist fosforüülis ainult CK2 FosB olulisel viisil. Lisaks testiti mitmeid teisi kinaase (nt GSK3 ja p70S6K), kuid need ei suutnud oluliselt FosB-i fosforüülida (andmeid ei ole näidatud). CK2-i reaktsiooni täiendav iseloomustus ajakava analüüsiga näitas, et see kinaas võib katalüseerida ∼0.5-mooli fosfaadi lisamist ühe mooli ΔFosB (Joon. 3B). Asjaolu, et CK2 võib fosforüülida ΔFosB-d vitro märkimisväärse stöhhiomeetriaga (∼50%) viitab füsioloogiliselt asjakohasele reaktsioonile. Seejärel uurisime selle reaktsiooni kineetikat, inkubeerides CK2i suurenenud koguse puhastatud ΔFosB juuresolekul ja tuvastasime, et CK2 fosforüülib ΔFosB-ga V_max 5.8 pmol · min^-1 · Μg^-1 ensüümi, a K_M 18.4 μm ja a k_kass 0.2 / s (Joon. 3C). Nende kineetiliste parameetrite väärtused toetavad veelgi selle reaktsiooni füsioloogilist tähtsust. Näiteks K_M CK2 DARPP32i jaoks, mis on üks tuntumaid substraate, on 3.4 μm ja k_kass on ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); the K_M ATP jaoks on vahemikus ∼10 – 40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002) ja kaseiini puhul vahemikus ∼10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Need andmed näitavad koos, et ΔFosB on CK2i heauskseks substraadiks vitro.

Vaata suuremat versiooni:

• Sellel lehel
• Uues aknas

• Lae alla PowerPoint Slide

Joonis 3.

CK2, kuid mitte PKC või CaMKII fosforüülib ΔFosB vitro. Autoradiograaf (ülemine paneel) näitab fosforüülitud produkti ja Coomassie värvitud geel (alumine paneel) näitab reaktsioonis sisalduvat AFosB-d. APuhastati rekombinantset AFosB-d vitro fosforüülimine erinevate kandidaatide kinaaside poolt (millest kolm on näidatud). B, Ajakava ja stöhhiomeetrilised analüüsid näitavad, et CK2 võib fosforüülida ΔFosB vitro stöhhiomeetriaga ∼50%. CCK2 reaktsiooni kineetiline analüüs näitas, et ΔFosB on heausksus vitro substraat. Reaktsiooni lineaarsust näidatakse kahekordse vastastikuse graafikuga (põhjas), kuid kineetilised parameetrid saadi Michaelis-Menten kõverast (ülalt).

CK2 moduleerib ΔFosB fosforüülimist ja stabiilsust tervetes rakkudes

ΔFosB CK2-vahendatud fosforüülimise füsioloogilise tähtsuse hindamiseks viidi läbi võrdlev fosfopeptiidide kaardistamine, kasutades vitro fosforüülitud ja PC12-raku fosforüülitud AFosB. Pärast SDS-PAGE ja geeli elueerimist ³²P-ΔFosB (alates vitro reaktsioonidest või immuunsadestamisest ³²P-märgistatud rakud), lõigati valk trüpsiiniga ja saadud fosfopeptiidid allutati kahemõõtmelisele eraldamisele. See analüüs näitas, et CK2-i reaktsiooni peamine fosfopeptiid muutus ühega kahest peamisest FFBB-st fosforüülitud PC12-rakkudest (Joon. 4A), samas kui PKC või CaMKII (andmed ei ole näidatud) tulemusel saadud fosfopeptiidid ei reageerinud. PC12-rakkudest oli kaardil olemas teine ​​ΔFosB-fosfopeptiid, kuid mis tahes kinaasi võimetuse tõttu testiti sarnast fosfopeptiidi. vitroPraegu ei tea me, kas see teine ​​fosfopeptiid sisaldab teist fosfopeptiidi erinevast fosforüülimiskohast või kas see kujutab endast selget trüptilist peptiidi, mis sisaldab sama fosforüülimissaiti.

Vaata suuremat versiooni:

• Sellel lehel
• Uues aknas

• Lae alla PowerPoint Slide

Joonis 4.

CK2 moduleerib ΔFosB fosforüülimist ja stabiilsust tervetes rakkudes. A, CK2, kuid PKC ei näi fosforüülimist rakkudes. CK2i või PKC-ga fosforüülitud ΔFosB kahemõõtmelised fosfopeptiidkaardid vitro või intaktsete PC12 rakkude poolt. Nooled näitavad CK2-fosforüülitud peptiidi, aga mitte PKC-fosforüleeritud, üksteise ülekannet ühe PC12 rakkudest saadud FosB fosfopeptiidiga. BIncreasedFosB fosforüülimist PC12 rakkudes suurendatakse rakkude töötlemisel tugeva CK2 aktivaatori spermiiniga (SP) ja vähendatakse ravi CK2 inhibiitoriga DRB. Seevastu ei mõjutanud PCFNUMX rakkudes FosB fosforüülimist ravi kas PKC aktivaatoriga (PMA) ega PKC-spetsiifilise inhibiitoriga calphostin-C (Calph). Kuvatakse representatiivne autoradiogramm (ülemine paneel) ja immunoblot (alumine paneel). C – FCK2 aktiivsuse mõju ΔFosB stabiilsusele. Joonistel on kujutatud AFosB lagunemise ajakava (ja tüüpiline autoradiogramm). AXFosB-d transientselt ekspresseerivad PC12-rakud viidi läbi pulseeriva katse abil, mis viidi läbi CK2 inhibiitori DRB puudumisel või juuresolekul.C), CK2 aktivaatori spermiin (D) või laia spektriga kinaasi inhibiitor H-8 (E), mida kasutati DRB mittespetsiifiliste mõjude kontrollimiseks. FCK2 katalüütilise allüksuse koputamise mõju ΔFosB stabiilsusele. PC12-rakke transfekteeriti kas mittesihistava siRNA-ga (Ctr) või siRNA-ga, mis oli suunatud roti CK2a-le ja 24-ile h, mis oli hiljem transfekteeritud AFosB plasmiidiga. Ülemine paneel kujutab tervete rakkude lüsaatide immunoblotte, mis näitavad CK2 siRNA toimet CK2 ja ΔFosB valgu tasemetele. Vastavat β-tubuliini immunobloti näidatakse laadimiskontrollina.

CK2i kui FosB kinaasi füsioloogilise tähtsuse täiendavaks käsitlemiseks käsitlesime FosB-ekspresseerivaid PC12-rakke kahe ravimiga, mis moduleerivad CK2-i aktiivsust. Nagu näidatud Joonis 4B, Vähenes AFosB fosforüülimine PC12 rakkude töötlemisel raku läbilaskva CK2 inhibiitoriga DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995) ja suurenenud töötlemisel polüamiin spermiiniga, mis on teadaolevalt tugev CK2 aktivaator (Cochet ja Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Seevastu PC12 rakkude töötlemine PKC inhibiitoriga calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) või PKC aktivaator PMA (Schmidt ja Hecker, 1975; Beh et al., 1989) ei põhjustanud ΔFosB fosforüülimises olulisi muutusi. PMA puhul on vähene (ja mitte märkimisväärne) kasv ³²P-ΔFosB-d võib arvutada selle ravimi poolt põhjustatud ΔFosB taseme suurenemise tõttu; tegelikult on teatatud, et forboliestrid indutseerivad mitme Fos perekonna valgu, sealhulgas FosB ekspressiooni (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Lisaks rakkude töötlemine spetsiifilise raku läbilaskva CaMKII inhibiitoriga m-AIP (Ishida ja Fujisawa, 1995; Stevens jt, 1999) ei põhjustanud ka FosB fosforüülimise vähenemist (andmeid ei ole näidatud). Üheskoos on need tulemused kooskõlas meie vitro tulemused ja näitavad, et intaktsetes rakkudes ΔFosB on tõenäoliselt fosforüleeritud CK2i, kuid mitte PKC või CaMKII poolt. Asjaolu, et CK2 inhibeerimine ei takista täielikult FosB fosforüülimist, näitab täiendavaid fosforüülimissaite olemasolu valgus.

Järgnevalt uurisime, kas CK2 mängib rolli AFosB käibes ja seega ka selle stabiilsuses. Selleks teostasime pulseerimis-katseid, kasutades FosB-ekspresseerivaid PC12-rakke, mida oli töödeldud kas fosforüülimise uuringus kasutatud CK2 inhibiitoriga või CK2-i aktivaatoriga. Nagu näidatud Joonis 4Crakkude töötlemine CK2 inhibiitoriga DRB avaldas olulist mõju ΔFosB käibekiirusele, mida tõendab selle lagunemiskõvera kuju muutus kahefaasilisest kõverani, mis on lähemal eksponentsiaalse lagunemise kõverale. Seevastu põhjustas CK2 aktivaatori spermiini olemasolu ΔFosB lagunemiskiiruse olulist vähenemist, mis viis valgu akumuleerumiseni tagaajamise esimestel tundidel (Joon. 4D).

Nagu paljude kinaasi aktivaatorite ja inhibiitorite puhul, võivad spermiinil ja DRB-l olla metaboolne toime väljaspool CK2 aktiivsuse moduleerimist. On tõestatud, et DRB inhibeerib transkriptsioonifaktor IIH (TFIIH) seotud kinaasi (Yankulov jt, 1995), mille tulemuseks on RNA polümeraasi II vahendatud transkriptsiooni inhibeerimine. Kuna see efekt võib kujutada endast ΔFosB stabiilsust, analüüsime laia spektriga kinaasi inhibiitori H-8 toimet (Hidaka ja Kobayashi, 1992) ΔFosB käibest kontsentratsioonis (200 μm), mis teadaolevalt inhibeerib TFIIH-ga seotud kinaasi, kuid mitte CK2 (Yankulov jt, 1995). Nagu näidatud Joonis 4Eravi H-8iga ei mõjutanud ΔFosB käivet. Sarnased tulemused saadi H-7-iga, teise laia spektriga kinaasi inhibiitoriga, mida kasutati kontsentratsioonis, mis inhibeerib TFIIH-ga seotud kinaasi, kuid mitte CK2-i (andmeid ei ole näidatud). Need andmed toetavad täiendavalt tõlgendust, et DRB põhjustatud ΔFosB stabiilsuse vähenemine on tõenäoliselt tingitud CK2i inhibeerimisest.

CK2i rolli edasiseks kindlakstegemiseks ΔFosB käibes uurisime CK2i koputamise tagajärgi siRNA kaudu. Me teostasime need katsed PC12 rakkudega, mis transfekteeriti kõigepealt kontrolliga (nontargeting) siRNA-ga või siRNA-ga, mis on suunatud roti CK2 (CK2α) katalüütilise allüksuse mRNA-le ja hiljem osFosB-ga transfekteeritud 24-le. Nagu näidatud Joonis 4Ftransfektsioon CK2a siRNA-ga efektiivselt ja spetsiifiliselt CK2a valgu tasemeid langetamata, mõjutamata ΔFosB tasemeid (ülemine paneel). Pulss-chase analüüs näitas, et CK2-i koputamine põhjustas ΔFosB-i kiiruse olulise suurenemise, mida näitab valgu kiirem lagunemine. Asjaolu, et CK2-i aktiivsuse inhibeerimine (kas DRB-ravi või siRNA-ga) suurendab AFosB käivet ja annab tulemuseks kaheastmelise kõvera aeglase kiirusega komponendi kadumise, samas kui CK2-i aktiveerimine suurendab kõvera aeglast faasi, annab tugeva tuge idee, et CK2 mängib rolli ΔFosB stabiilsuse reguleerimisel.

CK2 fosforüülib ΔFosB Ser27is

Et alustada CK2i fosforüülitud AFosB koha (de) tuvastamist, viidi läbi CK2 poolt fosforüülitud rekombinantse ΔFosB fosfo-aminohapete analüüs. vitro ja FFBB fosforüülitud PC12 rakkudes. Need katsed näitasid, et mõlemal juhul oli ainsaks avastatud fosfo-aminohappeks fosfo-Ser (Joon. 5A). See leid koos CK2i stöhhiomeetriaga vitro fosforüülimise reaktsioon (∼50%) (Joon. 3B) ja ainult ühe olulise koha olemasolu CK2 fosfopeptiidi kaardil (Joon. 4A) näitab, et ΔFosB CK2 fosforüülimine piirdub tõenäoliselt ühe seriinijäägiga. See järeldus on kooskõlas fosforüülimise konsensuskohtade analüüsiga (Joon. 2B), mis ennustasid CK27i jaoks ainult ühte kandidaat seriini, st Ser2i. Taksonoomiline analüüs näitas, et Ser27 on Fos pereliikmete evolutsiooni kaudu väga konserveerunud (Joon. 5B), mis viitab sellele, et tal võib olla oluline füsioloogiline funktsioon.

Vaata suuremat versiooni:

• Sellel lehel
• Uues aknas

• Lae alla PowerPoint Slide

Joonis 5.

CK2 fosforüülid ΔFosB Ser27is. ACK2-fosforüülitud fosforaminohappe analüüs (vitro) ja PC12 raku fosforüülitud AFosB, mis näitab, et mõlemal juhul fosforüüliti peamine jääk on seriin. BFosB / ΔFosB aminohappejärjestuse ristliikide analüüs näitas Ser27i kõrget säilimist Fos pereliikmete seas inimesest kuni seebitahvani (tumedat esiletõstmist). Siiski ei säilitata CK3i konsensuskohas vajalikku happelist jääki positsioonis + 2 (valguse esiletõstmine). C, HeLa rakud transfekteeriti transientselt kas metsikut tüüpi AFosB (WT) või AFosB-ga, mis sisaldas punktmutatsiooni, et asendada Ser27 Ala-ga (S27A). Rakud märgistati metaboolselt ³²PH₃PO₄ CK2-i aktiveerimiseks ja töödeldakse kandjaga või spermiiniga (SP). Näidatud on esindatud autoradiogramm (ülemine paneel) ja immunoblot (alumine paneel) saadud FosB immunosadestustest. Näidatud on transfekteeritud rakkude (vektori) immunosadestamine.

Et määrata, kas Ser27 on fosforüülitud AFosB-s, muteerisime selle jäägi Ala-le ja analüüsime selle mõju fosforüülimise olekule. Selleks kasutasime WL või S27A mutandi ΔFosB transientseks ekspresseerimiseks HeLa rakke (mida saab transfekteerida kõrgema efektiivsusega). Umbes 24 h pärast transfektsiooni märgistati rakud metaboolselt ³²Valmistati P-ortofosfaat ja terve raku lüsaadid. Pärast immunosadestamist ja SDS-PAGE, ³²P-AFosB tuvastati autoradiograafia ja kogu AFosB abil immunoblotimisega. Nagu näidatud Joonis 5C (alumine paneel), vektorit transfekteeritud rakkudes ei tuvastatud ΔFosB, samas kui kas WT või S27A mutandiga ΔFosB transfekteeritud rakud ekspresseerisid valku edukalt. Leidsime, et S27A mutatsioon põhjustas olulise (N30%) vähenemise ³²P-ΔFosB tasemed (Joon. 5C, ülemine paneel ja graafik), mis näitab, et elusrakkudes fosforüülitakse ΔFosB Ser27is. Püüdes kindlaks teha, kas rakkudes Ser27 on CK2 tõepoolest fosforüülitud, võrdlesime CK2 aktivaatori spermiini võimet moduleerida WT ja S27A ΔFosB fosforüülimist. Nagu me varem PC12 rakkudes täheldasime (Joon. 4B), HeLa rakkude ravi spermiiniga suurendas oluliselt WT valgu fosforüülimist. Asjaolu, et S27A mutatsioon vähendab seda toimet märkimisväärselt (Joon. 5C) toetab tõlgendust, et Ser27 ΔFosB-s on füsioloogiline substraat CK2i jaoks.

Ser27 fosforüülimine reguleerib ΔFosB stabiilsust

Kui CK2 on CK2-i aktiveerimisel CKXNUMX-i blokeerimisel ja suurendamisel kindlaks tehtud, et ΔFosB stabiilsus on vähenenudJoon. 4) ja et CK2 fosforüülib ΔFosB Ser27is (Joon. 5), ennustasime, et selle saidi fosforüülimise vältimine peaks valku destabiliseerima. HeLa-rakkudega, mis ekspresseerisid ajutiselt kas WT või S27A mutanti ΔFosB, läbiviidud impulsi-chase katsed näitasid, et nagu ennustati, põhjustas S27A mutatsioon ΔFosB lagunemiskiiruse olulise suurenemise ja samaaegse valgu poolväärtusaja vähenemise (Joon. 6A). Seejärel uurisime, kas see regulatiivne mehhanism esineb ka neuronitaolises PC12 rakuliinis. Need katsed näitasid, et nagu nägime HeLa rakkudes, põhjustab S27A punktmutatsioon ΔFosB poolväärtusaja olulise vähenemise PC12 rakkudes (alates ∼11 kuni ∼4 h).Joon. 6B). Asjaolu, et see destabiliseerimine on sarnane CK2i inhibeerimise või kukkumise põhjustatud \ tJoon. 4) annab täiendava toetuse ideele, et Ser2i CK27-vahendatud fosforüülimine reguleerib ΔFosB stabiilsust. Täiendavad tõendid Ser27-i fosforüülimise regulatiivse rolli kohta AFosB valgu ringluses saadi, kasutades fosfomimeetilist Ser27-i Asp-mutatsiooni (S27D). S27D mutatsiooni peetakse fosfomimeetiliseks, sest see asetab suure negatiivselt laetud (karboksüül) rühma aminohappesse 27 ja seeläbi osaliselt jäljendab Ser27i fosforüülimist. Nagu näidatud Joonis 6C, põhjustas S27D mutatsioon S27A mutatsiooni vastupidise toime ja andis valgu oluliselt stabiilsemaks kui WT valk. Sarnaselt mõjule, mis saadi pärast CK2i aktiveerimist (Joon. 4D), põhjustas S27D mutatsioon akumuleerumise ja seega suurendas AFosB tasemeid tagaajamise esimese tunni jooksul.

Vaata suuremat versiooni:

• Sellel lehel
• Uues aknas

• Lae alla PowerPoint Slide

Joonis 6.

Ser27 fosforüülimine reguleerib ΔFosB stabiilsust. A, C, Pulse-chase analüüs, mis näitab Ser27-i fosforüülimise mõju ΔFosB käibe kiirusele. Näidatud on metsikut tüüpi AFosB (WT), Ser27-i ja Ala-mutandi (S27A) ja fosfomimeetiliste Ser27-i kuni Asp-mutantide (S27D) lagunemisprofiil ja hinnanguline poolväärtusaeg. Samad leiud saadi HeLa rakkudes (A) ja PC12 rakud (B, C).

Ser27-i fosforüülimine stabiliseerib ΔFosB-d, takistades selle proteaomaalset lagunemist

Et hakata selgitama mehhanismi, mille abil Ser27 fosforüülimine stabiliseerib AFosB, uurisime proteasoomi inhibiitorite MG132 võimet (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) ja epoksomitsiin (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) moduleerida WT ja S27A mutandi ΔFosB lagunemiskiirust. Pulseerimis-katsed viidi läbi, kasutades PC12-rakke, mis olid nakatatud kas WT või S27A AFosB ekspresseeriva rekombinantse HSV-ga ja töödeldi kas DMSO-ga või ühe proteasoomi inhibiitoriga. Need katsed näitasid, et kuigi WT valgu lagunemiskiirus on mõlema proteasoomi inhibiitori olemasolu suhtes suhteliselt tundlik (Joon. 7A), on S27A mutandi tundlikkus nende ravimite suhtes \ tJoon. 7B). See näitab, et erinevalt WT valgust on S27A mutant proteasoomi degradatsiooni sihtmärk. Tõepoolest, rakkude töötlemine kas MG132i või epoksomitsiiniga muutis täielikult S27A mutatsiooni mõju ΔFosB lagunemiskiirusele, mida tõendab S27A mutandi poolväärtusaeg ∼4-st ∼9 h-ni MG132-i ja 12 h epoksomitsiini puhul (Joon. 7B). Need tulemused näitavad, et ΔFosB fosforüülimine Ser27is kaitseb valku proteasoomi lagunemise eest ja on seetõttu hädavajalik selle ebatavalise stabiilsuse jaoks.

Vaata suuremat versiooni:

• Sellel lehel
• Uues aknas

• Lae alla PowerPoint Slide

Joonis 7.

Ser27-i fosforüülimine stabiliseerib ΔFosB-d, takistades selle proteaomaalset lagunemist. A, B, Pulss-chase analüüs HSV-ga nakatunud PC12-rakkudega, mis näitab metsiktüüpi ΔFosB lagunemisprofiili ja hinnangulist poolväärtusaega (A) või S27A ΔFosB (B) kahe proteasoomi inhibiitori [MG132 ja epoksomitsiin (Epoxo)] puudumisel või esinemisel. Pange tähele, et kumbki ravim ei mõjuta oluliselt metsikut tüüpi AFosB käivet, samas kui rakkude töötlemine kas proteasoomi inhibiitoriga põhjustas S27A ΔFosB stabiliseerumise. C, Ser27 fosforüülimise rolli mudel AFosB võimes vahendada pikaajalist aju plastilisust. Pärast indutseerimist stabiliseeritakse AFosB osa ajus C2-vahendatud fosforüülimisega. Selle tulemuseks on selle kogunemine, mis omakorda põhjustab geeniekspressiooni pikaajalisi muutusi. Need stabiilsed muutused geeniekspressioonis aitavad kaasa stabiilse käitumise kohandamisele. Seevastu S27i defosforüülimine Ser / Thr fosfataaside PP27 ja / või PP1A poolt põhjustab valgu destabiliseerimist ja selle töötlemist proteasoomi masinaga.

Eelmine osaJärgmine osa

Arutelu

Käesolevas uuringus näitame, et ΔFosB poolväärtusaeg on culture10 h rakukultuuris, mis muudab selle stabiilseks võrreldes täispikkusega FosB ja enamiku teiste indutseeritavate transkriptsioonifaktoritega, mille poolväärtusaeg rakukultuuris võib olla sama lühike mõni minut ja harva ületab 3 h (Hann ja Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts ja Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Lisaks leiame, et ΔFosB fosforüülitakse ajus ja et selle fosforüülimine on tundlik PP1 / PP2A inhibiitori okadaiinhappe suhtes. Meie rakukultuuriuuringud näitavad, et ΔFosB stabiilsust moduleerib CK2, kusjuures kõrgem CK2 aktiivsus stabiliseerib valku. Lõpuks näitavad meie tulemused, et CK2 fosforüleerib AFosB-d väga konserveerunud N-terminaalsel seriinil (S27) ja näitab, et S27-i fosforüülimine kaitseb ΔFosB-d proteasoomi lagunemise eest. Seepärast pakume välja mudeli, mille kohaselt CK27i ΔFosB fosforüülimine S2is on ΔFosB käibe kriitiline regulatsioonimehhanism (Joon. 7C). FosBB selline fosforüülimise vahendatud stabiliseerimine on funktsionaalselt oluline, kuna on näidatud, et ΔFosB suurenenud tase aju piirkondades reguleerib otseselt arvukaid neuronaalseid geene in vivo ja avaldada tugevat käitumuslikku toimet mitmete neuropsühhiaatriliste häirete loomamudelitel (vt Sissejuhatus).

Kuigi fosforüülimine on kiire ja pöörduv viis teatud transkriptsioonifaktorite, nagu CREB (cAMP vastuselementi siduv valk) transkriptsiooni aktiivsuse reguleerimiseks (Bohmann, 1990), transkriptsioonifaktorite lagunemise moduleerimine annab veelgi võimsama (kergemini pöörduva) regulatsiooni vormi (Desterro et al., 2000). Transkriptsioonifaktorid, mille funktsionaalne aktiivsus on nende lagunemise tasemel reguleeritud, hõlmavad NFkB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999) ja c-Fos (Ferrara et al., 2003), teiste hulgas. Paljudel juhtudel on fosforüülimine transkriptsiooniteguri stabiilsuse peamine regulaator, nagu on näidatud c-Fose puhul (Okazaki ja Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Fosiga seotud antigeen-1 (Fra-1) (Vial ja Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000) ja p53 (Buschmann et al., 2001). Meie uuringud lisavad ΔFosB-d sellesse transkriptsioonifaktorite loetellu, mille funktsionaalset aktiivsust reguleeritakse selle fosforüülitud sõltuvuse poolest.

CK2 on üldlevinud ja konstitutiivselt aktiivne Ser / Thr kinaas, millel on seni tuvastatud> 300 väidetavat substraati ja mis on seotud paljude bioloogiliste protsessidega, sealhulgas rakusurma ja ellujäämisega (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), rakulise stressi vastused (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003) ja DNA parandamine ja kromatiini remodelleerimine (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Rohkem kui üks kolmandik CK2i oletatavatest substraatidest on geeniekspressiooni reguleerimises osalevad valgud (Meggio ja Pinna, 2003). Tegelikult on näidatud, et CK2 on tuntud tuuma kinaas (Krek et al., 1992) (läbivaatamiseks vt Yu et al., 2001) ja suhelda mitme transkriptsioonifaktori bZIP-domeenidega (Yamaguchi jt, 1998). On näidatud, et CK2-vahendatud fosforüülimine moduleerib paljude valkude, kaasa arvatud IkB, lagunemist (kas seda suurendavat või vähendavat).Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres ja Pulido, 2001), objektiivi connexin (Yin et al., 2000) kromatiiniga seotud valk HMG1 (Wisniewski et al., 1999) ja mitmed transkriptsioonifaktorid, nagu HMGB (Stemmer jt, 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997) ja c-Myc (Channavajhala ja Seldin, 2002). CK2 on kõige rohkem ajus (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990) ja selle aktiivsus on seotud paljude ajufunktsiooni aspektidega, sealhulgas neuronaalse ellujäämisega (Boehning et al., 2003), diferentseerimine (Nuthall et al., 2004) ioonikanali funktsioon (Jones ja Yakel, 2003; Bildl et al., 2004) ning pikaajaline potentsiaal ja neuronaalne plastilisus (\ tDiaz-Nido jt, 1992; Lieberman ja Mody, 1999; Reikhardt jt, 2003).

Hoolimata sellest kasvavast tõendusmaterjalist CK2i rolli kohta neuronaalse funktsiooni regulatsioonis, on vähe teada, mis kontrollib selle aktiivsust. Arvatakse, et CK2 on konstitutiivselt aktiivne, reguleerides selle võimet fosforüülida spetsiifilisi substraate, tuginedes peamiselt selle rakusisese lokaliseerumise muutustele (nt tsütosool vs tuum).Ahmed ja Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). See teave tekitab olulise küsimuse selle kohta, milliseid signaale on vaja ΔFosB akumulatsiooni tekitamiseks ajus pärast kroonilist stimulatsiooni (Joon. 7C). Üks nõue on korduv aktiveerimine fosB geen ja AFosB mRNA induktsioon (Chen et al., 1995). Meie andmed näitavad, et ΔFosB CK2 fosforüülimine on selle stabiilsuse seisukohast kriitiline, mis viitab sellele, et ΔFosB pikaajalisele mõjule võib olla vajalik teine ​​signaal geeniekspressioonile, nimelt signaalile, mis stimuleerib valgu fosforüülimist CK2i poolt. See võib hõlmata CK2i aktiveerimist mõne tundmatu mehhanismiga või selle translokatsiooni tuuma. Alternatiivselt võib FosB CK2-i fosforüülimine olla konstitutiivne, nii et kui FosB-valk transleeritakse vastuseks igale stiimulile, saab osa sellest fosforüülimisest ja seeläbi stabiliseerub, nii et korduva stimulatsiooni korral akumuleerub see mõjutatud neuronites kõrgele tasemele.

Meie tulemused näitavad, et CK2 ja S27 ei ole tõenäoliselt ainsad kinaasid ja saidid, mis vastutavad FosB fosforüülimise eest, sest ei CK2i inhibeerimine ega mutatsioon S27A ei suutnud täielikult vältida FosB fosforüülimist. Samamoodi väidab asjaolu, et S27A mutatsioon põhjustab fosfo-AFosB 30% vähenemise, väidab, et S27 on valgu peamine fosforüülimiskoht. Oleme siiski uurinud teisi oletatavaid kinaase ja fosforüülimissaite AFosB-s. Lõpuks on oluline analüüsida ka S27i ja teiste fosforüülimissaitide fosforüülimist AFosB-s ajus. in vivo pärast erinevaid kroonilise stimulatsiooni tüüpe, näiteks massispektromeetria või fosfospetsiifiliste antikehade abil.

Nagu eelpool mainitud, on XFosB-s S27 väga konserveerunud kogu evolutsiooni ja teiste Fos-i perekondlike valkude vahel. Siiski ei ole CK2i konsensuskoht: nagu näidatud Joonis 5Bainult FosB / AFosB (ja Zebrafish xenolog), kuid mitte c-Fos või Fra-2, on happelise jäägiga + 3-is, mis on CK2 fosforüülimise võtmefaktor.Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Seega võib CK2 fosforüülimise puudumine S27-is selgitada, miks teised Fos'i perekonna valgud ei ole nii stabiilsed kui ΔFosB. Siiski ei selgita see, miks täispikk FosB, millel on sama CK2i konsensuskoht, nagu FosB, ei ole sarnaselt stabiliseeritud. Me ei tea, kas täispikk FosB fosforüülitakse CK2i poolt sellel konserveerunud jäägil. FosB ainsad aruanded (Skinner et al., 1997) ja c-Fos (Okazaki ja Sagata, 1995; Chen et al., 1996) fosforüülimine kirjeldab nende valkude C-terminaalse piirkonna saite, mis puuduvad ΔFosB-s. Täispika FosB ja teiste Fos perekonna valkude potentsiaalne fosforüülimine CK2i poolt nõuab otsest uurimist. Kuid isegi juhul, kui need on fosforüülitud, sisaldavad teised Fose perekonna valgud C-otsas motiive, mis on suunatud valkude kiireks lagunemiseks (Papavassiliou jt, 1992; Jariel-Encontre jt, 1997; Acquaviva et al., 2002). Näiteks on näidatud, et kõigi Fos perekonna valkude C-otsas olevad but21-jäägid, mis puuduvad ΔFosB-s, toimivad c-Fose destabiliseeriva domeenina (Acquaviva et al., 2001). Leidsime, et kuigi see järjestus destabiliseerib sarnaselt täispikkust FosB (Carle et al., 2004), selle domeeni puudumine ΔFosB-s ei võta täielikult arvesse selle stabiliseerimist. Pigem tundub, et selle C-terminuse domeeni ja Ser27-i fosforüülimise puudumine moodustab täielikult arvesse umbes viiekordset erinevust stabiilsuse vahel FosB ja FosB vahel.

Kuigi Fos perekonna valkude lagunemine on keeruline ja ei ole täielikult arusaadav, tundub proteasoomi lagunemine olevat kõige olulisem tee (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Siin esitatud andmed, milles proteasoomi inhibiitorid ei muuda oluliselt FosB lagunemise kiirust, väidavad, et erinevalt teistest Fos perekonna valkudest väldib FosB 26S proteasoomi ja see mängib keskset rolli selle stabiliseerimisel. Seetõttu pakume välja skeemi, mille kohaselt AFosB suurenenud stabiilsus on tingitud kahe peamise teguri kombinatsioonist: (1) C-terminaalse destabiliseeriva domeeni ja (2) puudumine S27i fosforüülimise poolt CK2 poolt.

Kokkuvõttes annab käesolev uuring mehhaanilise ülevaate sellest, miks ΔFosB, vahetu varase geeni produkt fosB, erinevalt kõigist teistest Fose pereliikmetest on suhteliselt pikk eluiga valk. Kuigi arvatakse, et teised Fos'i perekonna valgud vahendavad kiiret, kuid mööduvat stimulatsiooni-transkriptsiooni sidumist (Morgan ja Curran, 1995ΔFosB suhteline stabiilsus annab talle võime vahendada kroonilise stimulatsiooni põhjustatud pikemaajalisi transkriptsiooni muutusi. See toetab seisukohta, et ΔFosB toimib ajus püsiva molekulaarse lülitina, muutes järk-järgult ägedaid vastuseid kroonilisteks kohandusteks. Ser27-i fosforüülimise kui AFosB stabiilsuse keskmehhanismi identifitseerimine avab uusi võimalusi, et arendada vahendeid FosB funktsiooni reguleerimiseks ja seeläbi moduleerida selle pikaajalist mõju närvi- ja käitumuslikule plastilisusele.

Eelmine osaJärgmine osa

Allmärkused

• Saadud november 21, 2005.
• Läbivaatamine sai veebruariks 21, 2006.
• Aktsepteeritud aprill 2, 2006.

• Seda tööd toetas riiklik skisofreenia ja depressiooni uurimise allianss PGU-le, riiklikule narkootikumide kuritarvitamise instituudile (NIDA) PGU-le antavale riiklikule uurimisasutusele ja riikliku vaimse tervise instituudi ja NIDA toetustele EJNile tänada dr. James Bibbit tema abiga vitro fosforüülimisanalüüsid, dr Ming-Hu Han tema abistamiseks metaboolseks märgistamiseks kasutatavate aju viilude valmistamisel ja dr Rachael Neve tema abi saamiseks rekombinantsete HSV-de pakendamisel.
• G. Rudenko praegune aadress: Michigani ülikooli bioteaduste instituut ja farmakoloogia osakond, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
• Kirjavahetus peaks olema adresseeritud Eric J. Nestlerile, 5323 Harry Hines Boulevardile, Dallasile, TX 75390-9070ile. E-post: [meiliga kaitstud]

Eelmine osa

viited

1. ↵

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) C-terminaalse tripeptiidmotiivi identifitseerimine, mis on seotud c-Fos-proto-onkoproteiini kiire proteasoomi lagunemise kontrollimisega G (0) -S-faasi ülemineku ajal. onkogeense 20:7563–7572.

CrossRefMedline'le

2. ↵

Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Fos'i perekonna valkude mitmed lagunemisteed. Ann NY Acad Sci 973:426–434.

Medline'le

3. ↵

Ahmed K, Tawfic S (1994) Valgu kinaasi CK2 intratsellulaarse reguleerimise mehhanism: stimuleeritud vahendatud subnukleaarse seose roll. Cell Mol Biol Res 40:539–545.

Medline'le

4. ↵

Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Täiustatud puhastusprotseduur ja kaseiini kinaasi II omadused ajust. Neurochem Res 13:829–836.

CrossRefMedline'le

5. ↵

Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Striatuse DeltaFosB-sarnase immunoreaktiivsuse ja prodünorfiini mRNA tasemed pärast kroonilise dopaminomimeetilise ravi lõpetamist. Eur J Neurosci 17:661–666.

CrossRefMedline'le

6. ↵

Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Genoomiga hõlmatud ekspressiooniekraanid näitavad proteiinkinaasi CK2 globaalset rolli kromatiini remodelleerimisel. J Cell Sci 116:1563–1577.

Abstraktne / TASUTA tekst

7. ↵

Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Kaks PKC isosüümi, mis leiti HL-60 rakkudes, näitavad erinevust aktiveerimisel phorbolestri TPA poolt. FEBS Lett 249:264–266.

Medline'le

8. ↵

Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Valgu kinaas CK2 on kokku pandud väikeste juhtivusega Ca (2 +) - aktiveeritud K + kanalitega ja reguleerib kanali väravat. Neuron 43:847–858.

CrossRefMedline'le

9. ↵

Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Fosiga seotud antigeeni pikaajaline ekspressioon ja delta FosB mööduv ekspressioon, mis on seotud krampidega rottide hipokampuses ja striatumis. J Neurochem 68:272–279.

Medline'le

10. ↵

Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Proteiinide translatsioonijärgse glükosüleerimise ja aminohappejärjestuse fosforüülimise ennustamine. Proteoomika 4:1633–1649.

CrossRefMedline'le

11. ↵

Boehning D, Kuu C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Heme hapnikugaasi-2 CK2 fosforüülimise poolt aktiveeritud süsinikmonooksiidi neurotransmissioon. Neuron 40:129–137.

CrossRefMedline'le

12. ↵

Bohmann D (1990) Transkriptsioonifaktori fosforüülimine: seos signaaliülekande ja geeniekspressiooni regulatsiooni vahel. Vähirakud 2:337–344.

Medline'le

13. ↵

Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) P2i juuni NH53-terminaalse kinaasi fosforüülimine Thr-81-is on oluline p53-i stabiliseerimise ja transkriptsioonilise aktiivsuse jaoks vastuseks stressile. Mol Cell Biol 21:2743–2754.

Abstraktne / TASUTA tekst

14. ↵

Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Konserveeritud Fosi perekonna C-terminaalse domeeni puudumine aitab kaasa deltaFosB ainulaadsele stabiilsusele. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.

15. ↵

Channavajhala P, Seldin DC (2002) Proteiinikinaasi CK2 ja c-Myc funktsionaalne koostoime lümfomageneesis. onkogeense 21:5280–5288.

CrossRefMedline'le

16. ↵

Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Delta FosB ja FosB-sarnaste valkude reguleerimine elektrokonvulsiivsete krampide ja kokaiiniga töötlemise teel. Mol Pharmacol 48:880–889.

Abstraktne

17. ↵

Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Kroonilised Fos-ga seotud antigeenid: AFosB stabiilsed variandid, mis on ajus esile kutsutud kroonilise raviga. J Neurosci 17:4933–4941.

Abstraktne / TASUTA tekst

18. ↵

Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) C-Fose fosforüülimine C-otsas suurendab selle transformeerivat aktiivsust. onkogeense 12:1493–1502.

Medline'le

19. ↵

Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Valgu fosfataas 1 / 2A inhibiitor okadaiinhape suurendab CREB ja Elk-1 fosforüülimist ja c-fos ekspressiooni roti striatumis in vivo. J Neurochem 89:383–390.

CrossRefMedline'le

20. ↵

Cochet C, Chambaz EM (1983) Polüamiin-vahendatud valgu fosforüülimised: intratsellulaarse polüamiini toime võimalik sihtmärk. Mol Cell Endocrinol 30:247–266.

CrossRefMedline'le

21. ↵

Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Veise kopsukoest kõrgelt puhastatud G-tüüpi kaseiini kinaasi katalüütilised ja molekulaarsed omadused. Biochim Biophys Acta 743:1–12.

Medline'le

22. ↵

Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) DeltaFosB striatsiooniline rakutüübi spetsiifiline üleekspressioon suurendab kokaiini stimuleerimist. J Neurosci 23:2488–2493.

Abstraktne / TASUTA tekst

23. ↵

Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Kokaiini manustamine suurendab roti striatumis preprodünorfiini, kuid mitte c-fos, mRNA-d. NeuroReport 4:543–546.

Medline'le

24. ↵

Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Transkriptsioonifaktorite reguleerimine valgu lagunemise teel. Cell Mol Life Sci 57:1207–1219.

CrossRefMedline'le

25. ↵

Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Tsütoplasmaatilise kaseiini kinaasi II tüüpi aktiivsuse suurenemine kaasneb neuriidi väljakasvuga pärast DNA sünteesi inhibeerimist NIA-103 neuroblastoomi rakkudes. J Neurochem 58:1820–1828.

Medline'le

26. ↵

Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Valgu kinaas CK2 fosforüleerib ja reguleerib Akt / PKB-d. Rakkude surm erineb 12:668–677.

CrossRefMedline'le

27. ↵

Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Mõlemad fosB geeni, FosB ja selle lühikese vormi FosB / SF tooted on fibroblastides transkriptsioonilised aktivaatorid. Mol Cell Biol 11:5470–5478.

Abstraktne / TASUTA tekst

28. ↵

Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) C-Fos-valgu proteasoomi degradatsiooni eest vastutavad struktuursed determinantid erinevad vastavalt ekspressioonitingimustele. onkogeense 22:1461–1474.

CrossRefMedline'le

29. ↵

Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) C-Jun ubikvitinaadi fosforüülimisest sõltuv sihtimine Jun N-kinaasiga. onkogeense 13:1531–1535.

Medline'le

30. ↵

Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminaalse kinaasi sihtmärgiks on nende transkriptsioonifaktorite ubikvitineerimine. J Biol Chem 272:32163–32168.

Abstraktne / TASUTA tekst

31. ↵

Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) ATF2 transkriptsioonifaktori stabiilsust reguleerib fosforüülimine ja defosforüülimine. J Biol Chem 275:12560–12564.

Abstraktne / TASUTA tekst

32. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) DARPP-32i, dopamiini ja cAMP-reguleeritud fosfoproteiini fosforüülimine kaseiini kinaasi II poolt. J Biol Chem 264:21748–21759.

Abstraktne / TASUTA tekst

33. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Kasiinokinaasiga II identse DARPP-32i seriinikinaasi imetaja ajus. J Neurochem 55:1772–1783.

Medline'le

34. ↵

Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoksomitsiin, uus mikroobse päritoluga kasvajavastane aine. J Antibiot (Tokyo) 45:1746–1752.

Medline'le

35. ↵

Hann SR, Eisenman RN (1984) Inimese c-myc onkogeeni poolt kodeeritud valgud: diferentsiaalne ekspressioon neoplastilistes rakkudes. Mol Cell Biol 4:2486–2497.

Abstraktne / TASUTA tekst

36. ↵

Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, tsükliline AMP-reguleeritud fosfoproteiin (Mr = 21,000), mis on rikastatud dopamiini-innerveeritud aju piirkondades. Tsüklilise AMP-ga fosforüülitud ala aminohappejärjestus intaktsetes rakkudes ja selle fosforüülimise kineetilised uuringud in vitro. J Biol Chem 264:7726–7733.

37. ↵

Hidaka H, ​​Kobayashi R (1992) Valgu kinaasi inhibiitorite farmakoloogia. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377–397.

CrossRefMedline'le

38. ↵

Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Hes7i valgu ebastabiilsus on somiidi segmendi kella jaoks otsustava tähtsusega. Nat Genet 36:750–754.

CrossRefMedline'le

39. ↵

Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atüüpilised ja tüüpilised neuroleptilised ravid tekitavad striatumis transkriptsioonifaktori ekspressiooni erinevaid programme. J Comp Neurol 374:70–83.

CrossRefMedline'le

40. ↵

Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Kroonilise kokaiini poolt reguleeritakse varase geeniekspressiooni ja AP-1i seondumist roti tuumas. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764–5768.

Abstraktne / TASUTA tekst

41. ↵

Lootus BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Kroonilise elektrokonvulsiivse krambihoogu (ECS) ravi tulemuseks on pikaajaline AP-1 kompleksi ekspressioon muutunud koostisega ja omadustega ajus. J Neurosci 14:4318–4328.

Abstraktne

42. ↵

Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Pikaajalise AP-1i kompleksi indutseerimine, mis koosneb muutunud Fos-tüüpi valkudest ajus kroonilise kokaiini ja teiste krooniliste ravimitega. Neuron 13:1235–1244.

CrossRefMedline'le

43. ↵

Ishida A, Fujisawa H (1995) Calmodulin-sõltuva proteiinkinaasi II stabiliseerimine läbi autoinhibeeriva domeeni. J Biol Chem 270:2163–2170.

Abstraktne / TASUTA tekst

44. ↵

Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Komplekssed mehhanismid c-fos ja c-jun lagunemiseks. Mol Biol Rep 24:51–56.

CrossRefMedline'le

45. ↵

Jones S, Yakel JL (2003) Kaseiini kinaas ii (proteiinkinaas ck2) reguleerib serotoniini 5-ht (3) retseptori kanali funktsiooni ng108-15 rakkudes. Neuroscience 119:629–634.

CrossRefMedline'le

46. ↵

Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 on C-terminaalne IkappaB kinaas, mis vastutab UV-vastuse ajal NF-kappaB aktiveerimise eest. Mol Cell 12:829–839.

CrossRefMedline'le

47. ↵

Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Transkriptsioonifaktori deltaFosB ekspressioon ajus kontrollib kokaiini tundlikkust. loodus 401:272–276.

CrossRefMedline'le

48. ↵

Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Proteasoomi pärssimine looduslike saaduste epoksomitsiin ja dihüdroeponemütsiin poolt: arusaamad spetsiifilisusest ja tõhususest. Bioorg Med Chem. Lett 9:3335–3340.

CrossRefMedline'le

49. ↵

Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Kalpostiin C (UCN-1028C), uus mikroobne ühend, on väga tugev ja spetsiifiline proteiinkinaasi C inhibiitor. Biochem Biophys Res Commun 159:548–553.

CrossRefMedline'le

50. ↵

Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Kaseiini kinaas II on valdavalt tuumaensüüm. J Cell Biol 116:43–55.

Abstraktne / TASUTA tekst

51. ↵

Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Valgu kinaas CK2 fosforüülib suure liikuvusega grupi domeeni valgu SSRP1, mis kutsub esile UV-kahjustatud DNA äratundmise. J Biol Chem 278:12710–12715.

Abstraktne / TASUTA tekst

52. ↵

Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Kromatiini remodelleerumine on peamine mehhanism, mis põhineb kokaiini tekitatud plastilisusel striatumis. Neuron 48:303–314.

CrossRefMedline'le

53. ↵

Lieberman DN, Mody I (1999) Kaseiini kinaas-II reguleerib hipokampuse neuronite NMDA kanali funktsiooni. Nat Neurosci 2:125–132.

CrossRefMedline'le

54. ↵

Litchfield DW (2003) Valgu kinaas CK2: struktuur, regulatsioon ja roll elu ja surma rakulistes otsustes. Biochem J 369:1–15.

CrossRefMedline'le

55. ↵

Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) C-Fos-valgu lagunemine N-metüül- \ td-aspartiinhape hiire hippokampuse tuumafraktsioonides. Brain Res 905:34–43.

Medline'le

56. ↵

Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Püsivalt suurenenud 37 kDa fos-seotud antigeeni ja AP-1-sarnase DNA-ga seondumise aktiivsuse puudumine kakahappega töödeldud fosB null hiirte ajus. J Neurosci 17:5407–5415.

Abstraktne / TASUTA tekst

57. ↵

Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Kaseiini kinaasi-2i (TS) koha spetsiifilisus roti maksa tsütosoolist. Uuring mudeli peptiidi substraatidega. Eur J Biochem 160:239–244.

58. ↵

McClung CA, Nestler EJ (2003) Geeniekspressiooni ja kokaiini tasu reguleerimine CREB ja DeltaFosB poolt. Nat Neurosci 6:1208–1215.

CrossRefMedline'le

59. ↵

McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: molekulaarne lüliti aju pikaajaliseks kohanemiseks. Brain Res Mol Brain Res 132:146–154.

Medline'le

60. ↵

Meggio F, Pinna LA (2003) Üks tuhat ja üks valgu kinaasi CK2 substraat? FASEB J 17:349–368.

Abstraktne / TASUTA tekst

61. ↵

Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Kaseiinifraktsioonide fosforüülimine roti maksa fosfotiinkinaasi abil. FEBS Lett 75:192–196.

Medline'le

62. ↵

Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) 2-tüüpi kaseiini kinaasi TS-i autofosforüülimine nii alfa- kui ka beeta-subühikutel. Erinevate efektorite mõju. FEBS Lett 160:203–208.

CrossRefMedline'le

63. ↵

Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Ribofuranosüülbensimidasooli derivaadid kaseiini kinaasi-2 ja kaseiini kinaasi-1 inhibiitoritena. Eur J Biochem 187:89–94.

Medline'le

64. ↵

Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Valgu kinaasi CK2 substraadi spetsiifilisus. Cell Mol Biol Res 40:401–409.

Medline'le

65. ↵

Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Tsüklooksügenaas-2 geeni transkriptsiooniline indutseerimine fosfataasi aktiivsuse okadaiinhappe inhibeerimisega inimese kondrotsüütides: AP-1i ja CRE tuuma siduvate valkude kaas stimulatsioon. J Cell Biochem 69:392–413.

CrossRefMedline'le

66. ↵

Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Võrgu tasemel muutused indutseeritavate Fos-Jun valkude ekspressioonis striatumis kroonilise kokaiiniravi ajal. Neuron 17:147–156.

CrossRefMedline'le

67. ↵

Morgan JI, Curran T (1995) Vahetult varased geenid: kümme aastat hiljem. Trendid Neurosci 18:66–67.

CrossRefMedline'le

68. ↵

Nakabeppu Y, Nathans D (1991) FosB looduslikult esinev kärbitud vorm, mis inhibeerib Fos / Jun transkriptsioonilist aktiivsust. Rakk 64:751–759.

CrossRefMedline'le

69. ↵

Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: püsiv molekulaarne lüliti sõltuvusele. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042–11046.

Abstraktne / TASUTA tekst

70. ↵

Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Glutamaadi retseptori allüksuse 1 sisestamine motoorsetesse neuronitesse in vitro ja in vivo, kasutades rekombinantset herpes simplex viirust. Neuroscience 79:435–447.

CrossRefMedline'le

71. ↵

Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Groucho / TLE239i seriini 1 fosforüülimine proteiinkinaasi CK2 poolt on oluline neuronite diferentseerumise inhibeerimiseks. Mol Cell Biol 24:8395–8407.

Abstraktne / TASUTA tekst

72. ↵

Okazaki K, Sagata N (1995) Mos / MAP kinaasi rada stabiliseerib c-Fose fosforüülimise teel ja suurendab selle transformeerivat aktiivsust NIH 3T3 rakkudes. EMBO J 14:5048–5059.

Medline'le

73. ↵

Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Ubikvitiin-proteasoomi rada on vajalik NF-kappa B1 prekursorvalgu töötlemiseks ja NF-kappa B aktiveerimiseks. Rakk 78:773–785.

CrossRefMedline'le

74. ↵

Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) C-Fos, kuid mitte v-Fos, sihtmärgiline lagunemine fosforüülimisest sõltuva signaaliga c-Jun-is. teadus 258:1941–1944.

Abstraktne / TASUTA tekst

75. ↵

Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) C-Jun-i domineeriva negatiivse mutandi indutseeritav aju-piirkonna spetsiifiline ekspressioon transgeensetes hiirtes vähendab tundlikkust kokaiini suhtes. Brain Res 970:73–86.

CrossRefMedline'le

76. ↵

Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) DeltaFosB indutseerimine tasuvusega seotud aju struktuurides pärast kroonilist stressi. J Neurosci 24:10594–10602.

Abstraktne / TASUTA tekst

77. ↵

Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Aju transkriptsioonifaktori ekspressioon: ägeda ja kroonilise amfetamiini ja süstimisstressi mõju. Brain Res Mol Brain Res 20:91–100.

Medline'le

78. ↵

Ploegh HL, Dunn BM (2000) Post-translatsiooniline modifikatsioon: fosforüülimine ja fosfataasid. In: Praegused proteiiniteaduse protokollid (Dunn BM, ed.) Lk. 13.01–13.02. New York: Wiley ja Sons.

79. ↵

Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Kõrgelt puhastatud fosvitiin / kaseiini kinaasi II katalüütilised ja molekulaarsed omadused inimese epiteelirakkudest kultuuris (HeLa) ja seoses ekto-proteiinkinaasiga. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215–227.

Medline'le

80. ↵

Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) „Valgu kinaasi CK2-HMG14” süsteemi staatus vanusega seotud amneesias rottidel. Neurosci Behav Physiol 33:799–804.

Medline'le

81. ↵

Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Helix-loop-helix / Per-ARNT-Sim homoloogilise domeeni dioksiiniretseptori lagunemine ubikvitiini / proteasoomi raja kaudu. J Biol Chem 274:36351–36356.

Abstraktne / TASUTA tekst

82. ↵

Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Predictproteiini server. Nucleic Acids Res 32:W321–W326.

Abstraktne / TASUTA tekst

83. ↵

Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 sihtmärgid ajus. Front Biosci 9:8–23.

CrossRefMedline'le

84. ↵

Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Rekombinantse hiire adenosiini kinaasi molekulaarne iseloomustus ja hindamine kui valgu fosforüülimise sihtmärk. Eur J Biochem 271:3547–3555.

Medline'le

85. ↵

Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Kas on olemas mitmed proteolüütilised teed, mis soodustavad c-Fos, c-Jun ja p53 valgu lagunemist in vivo? Mol Biol Rep 26:45–51.

CrossRefMedline'le

86. ↵

Schmidt R, Hecker E (1975) Forboli estrite autoksüdeerimine tavalistes ladustamistingimustes. Cancer Res 35:1375–1377.

TASUTA täistekst

87. ↵

Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) IkappaBalpha konstitutiivne fosforüülimine kaseiini kinaasiga II toimub eelistatult seriin 293: vaba IkappaBalpha lagunemise nõue. Mol Cell Biol 16:3554–3559.

Abstraktne / TASUTA tekst

88. ↵

Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras suurendab Myc valgu stabiilsust. Mol Cell 3:169–179.

CrossRefMedline'le

89. ↵

Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Vitamiini tsükliline nukleotiidist sõltumatu fosforüülimine kaseiini kinaasi II abil, mis on puhastatud Rhodnius prolixus ootsüütidest. Putukate Biochem Mol Biol 32:847–857.

CrossRefMedline'le

90. ↵

Skinner M, Qu S, Moore C, tarkus R (1997) Transkriptsiooniline aktiveerimine ja transformatsioon FosB valgu abil nõuavad karboksüül-terminaalse aktivatsiooni domeeni fosforüülimist. Mol Cell Biol 17:2372–2380.

Abstraktne / TASUTA tekst

91. ↵

Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Valgu kinaas CK2 fosforüülib diferentseeritult maisi kromosomaalsete suure liikuvusega B-grupi (HMGB) valke, mis moduleerivad nende stabiilsust ja DNA interaktsioone. J Biol Chem 277:1092–1098.

Abstraktne / TASUTA tekst

92. ↵

Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Tsükli, tsükliin B2 kinaasi, kui uue kaltsiumi / kalmoduliinist sõltuva proteiinkinaasi II identifitseerimine ja selle roll Xenopus laevis ootsüütide küpsemise ajal. Exp Cell Res 252:303–318.

CrossRefMedline'le

93. ↵

Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) C-fos ja c-jun geeni ekspressiooni reguleerimine lipopolüsahhariidiga ja tsütokiinid primaarsetes kultiveeritud astrotsüütides: PKA ja PKC rada. Arch Pharm Res 27:396–401.

Medline'le

94. ↵

Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Ribosoomi happeliste valkude diferentsiaalne fosforüülimine pärmirakkudest kahe endogeense proteiinkinaasi: kaseiini kinaasi-2 ja 60S kinaasi poolt. Acta Biochim Pol 42:357–362.

Medline'le

95. ↵

Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) ja kalpostiiniga seotud ühendid, mis on valgu kinaasi C spetsiifiliste ja tugevate inhibiitorite uus klass. Adv Teine Messenger Phosphoprotein Res 24:497–501.

Medline'le

96. ↵

Torres J, Pulido R (2001) Kasvaja supressor PTEN fosforüülitakse valgu kinaasi CK2 poolt oma C-otsas. Mõju PTEN stabiilsusele proteasoomi vahendatud lagunemisele. J Biol Chem 276:993–998.

Abstraktne / TASUTA tekst

97. ↵

Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Kalpain- ja proteasoomi aktiivsuse diferentsiaalne inhibeerimine di- leutsiini ja tri-leutsiini peptidüülaldehüüdide poolt. J Biochem (Tokyo) 119:572–576.

Abstraktne / TASUTA tekst

98. ↵

Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) C-Fos'e degradatsiooni proteaasiga 26S kiirendab c-Jun ja mitmed proteiinkinaasid. Mol Cell Biol 15:5682–5687.

Abstraktne / TASUTA tekst

99. ↵

Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Valgu kinaas CK2 kui rakkude ellujäämise regulaator: mõju vähiravile. Curr Cancer Drug Targets 4:77–84.

CrossRefMedline'le

100. ↵

Vial E, Marshall CJ (2003) Suurenenud ERK-MAP kinaasi aktiivsus kaitseb FOS-i perekonnaliiget FRA-1-i proteasoomi lagunemise vastu käärsoole kartsinoomi rakkudes. J Cell Sci 116:4957–4963.

Abstraktne / TASUTA tekst

101. ↵

Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB reguleerib rataste liikumist. J Neurosci 22:8133–8138.

Abstraktne / TASUTA tekst

102. ↵

Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Transkriptsioonifaktori funktsiooni reguleerimine fosforüülimise teel. Cell Mol Life Sci 57:1172–1183.

CrossRefMedline'le

103. ↵

Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Myf-2 aktiivsuse jaoks on olulised kaks oletatavat proteiinkinaasi CK5 fosforüülimissaiti. Biol Chem 378:1445–1456.

Medline'le

104. ↵

Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) 1 kõrge liikuvusega rühmade happeliste sabade konstitutiivne fosforüülimine kaseiini kinaasi II poolt muudab nende konformatsiooni, stabiilsust ja DNA sidumisspetsiifilisust. J Biol Chem 274:20116–20122.

Abstraktne / TASUTA tekst

105. ↵

Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Kaseiini kinaas II interakteerub mitme transkriptsioonifaktori bZIP domeenidega. Nucleic Acids Res 26:3854–3861.

Abstraktne / TASUTA tekst

106. ↵

Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) A170-i stressvalgu fosforüülimine kaseiini kinaasi II-sarnase aktiivsusega makrofaagides. Biochem Biophys Res Commun 241:157–163.

CrossRefMedline'le

107. ↵

Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Transkriptsiooniline pikenemise inhibiitor 5,6-dikloro-1-beetad-ribofuranosüülbensimidasool inhibeerib transkriptsioonifaktori IIH-ga seotud proteiinkinaasi. J Biol Chem 270:23922–23925.

Abstraktne / TASUTA tekst

108. ↵

Yen J, tarkus RM, Tratner I, Verma IM (1991) FosB alternatiivne splaissitud vorm on transkriptsiooni aktiveerimise ja transformatsiooni negatiivne regulaator Fos valkude poolt. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077–5081.

Abstraktne / TASUTA tekst

109. ↵

Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Kaseiini kinaas II fosforüleerib läätsekonfineeni 45.6 ja osaleb selle lagunemises. J Biol Chem 275:6850–6856.

Abstraktne / TASUTA tekst

110. ↵

Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) AP-1-i transkriptsioonifaktori komponentide indutseerimine T-raku aktiveerimisel interleukiin 1i ja forboli estritega. Rakkude kasv erineb 3:677–684.

Abstraktne

111. ↵

Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) CK2i signaalimise tagajärjed tuuma maatriksile. Mol Cell Biochem 227:67–71.

CrossRefMedline'le

112. ↵

Yu S, Davis AT, Guo C, roheline JE, Ahmed K (1999) Proteiinikinaasi CK2 diferentsiaalne sihtimine tuuma maatriksile pärast selle subühikute mööduvat üleekspressiooni. J Cell Biochem 74:127–134.

CrossRefMedline'le

113. ↵

Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: ΔFosB oluline osa morfiini toimel tuumasõlmedes. Nat Neurosci 9:205–211.

CrossRefMedline'le

Artiklid, mis viitavad sellele artiklile

• Käitumuslik ja struktuurne vastus kroonilisele kokaiinile Nõuab, et Nucleus Accumbens Shellis oleks {Delta} FosB ja kaltsiumi / kalmoduliini-sõltuva valgu kinaasi II sisaldav ettepoole suunatud silmus Ajakiri Neuroscience, 6 märts 2013 33(10):4295-4307
  • Abstraktne
  • Full Text
  • Täistekst (PDF)
• {Delta} FosB-i striaalne üleekspressioon reprodutseerib kroonilise levodopa indutseeritud tahtmatud liikumised Ajakiri Neuroscience, 26 mai 2010, 30(21):7335-7343
• Abstraktne
• Full Text
• Täistekst (PDF)
• Abstraktne
• Full Text
• Täistekst (PDF)
• Abstraktne
• Full Text
• Täistekst (PDF)
• Abstraktne
• Full Text
• Täistekst (PDF)
• Sõltuvuse transkriptsioonimehhanismid: {Delta} FosB roll Kuningliku ühiskonna filosoofilised teod B: bioloogilised teadused, 12 oktoober 2008, 363(1507):3245-3255
• Kestev haavatavus metamfetamiini otsiva käitumise taastamiseks gliaalrakuliinist pärinevate neurotroofsete faktorite mutanthiirtel FASEB Teataja, 1 juuli 2007, 21(9):1994-2004
• Aktiveerija proteiin-1 transkriptsioonifaktor hingamisteede epiteeli kantserogeneesis Molekulaarravi uuringud, 1 veebruar 2007, 5(2):109-120