Cdk5 fosforüülid Dopamiini D2 retseptor ja nõrgendab allavoolu signaali (2013)

Viide: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 fosforüülid Dopamiini D2 retseptor ja nõrgendab allavoolu signaali. PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Toimetaja: James Porter, Põhja-Dakota ülikool, Ameerika Ühendriigid

Vastatud: Mai 20, 2013; Vastu võetud: November 14, 2013; Avaldatud: Detsember 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. See on avatud juurdepääsuga artikkel, mida levitatakse vastavalt programmi tingimustele Creative Commonsi litsentsi litsents, mis võimaldab piiramatut kasutamist, levitamist ja paljundamist mis tahes andmekandjal, kui algne autor ja allikas on krediteeritud.

Rahastamine: Seda tööd toetasid Korea valitsuse (MSIP) toetused (NRF-2012R1A2A2A01012923 ja NRF-2012R1A4A1028200) ning neid toetati ka Korea koostööraamistiku (2012K2A1A2033117) ja Korea Ajuuuringute Instituudi (KBRI) hallatava rahvusvahelise koostööprogrammi raames. MSIP alusuuringute programm (2031-415). SKP oli 2004i ja 2006i riikliku skisofreenia ja depressiooni uuringute liidu (NARSAD) noorte uurijate auhind. Rahastajatel ei olnud mingit rolli uuringute kavandamisel, andmete kogumisel ja analüüsimisel, avaldamise otsusel ega käsikirja koostamisel.

Konkureeritavad huvid: Autorid on teatanud, et ei ole konkureerivaid huve.

Sissejuhatus

Dopamiini signaalimine on seotud mitmesuguste aju funktsioonidega, sealhulgas motoorse koordineerimisega, meeleolu kontrollimise ja tasustamise mehhanismidega [1]. Dopamiini signaaliülekande põhikomponenti selgroogsetel avaldavad striattaalsed kesknärvisünnonid (MSN), mis ekspresseerivad selektiivselt dopamiiniretseptorite alamhulka ja saavad dopamiinergilist sisendit peamiselt ventralisest tegmentaalsest piirkonnast (VTA) ja materia nigra'st (SN) [2]. Dopamiiniretseptorid on G-valguga seotud retseptorid (GPCR), millel on seitse transmembraanset domeeni ja mis koosnevad kahest alatüübist, D1-tüüpi ja D2-tüüpi retseptorid, mis vahendavad vastastikuseid toimeid dopamiini signalisatsioonis \ t [1]. Näiteks dopamiini D1-sarnased retseptorid (D1, D5) aktiveerivad adenülüültsüklaasi läbi G_αs ja suurendada cAMP rakusisest taset, kuid dopamiini D2-sarnased retseptorid (D2, D3, D4) inhibeerivad adenülüültsüklaasi läbi G_αi ja vähendada cAMP rakusisest taset [1], [3].

Dopamiiniretseptorite hulgas on D2i retseptor (DRD2) seotud paljude suurte psühhiaatriliste häirete, sh skisofreenia ja narkomaania patofüsioloogias. [4]nii, et paljud antipsühhootilised ravimid sihivad DRD2i vähemalt osaliselt. Samuti on teada, et DRD2 aktiivsus korreleerub hästi kuritarvitatavate ravimite käitumishäiretega loomamudelites [5]. Antidepressandid ja meeleolu stabilisaatori efektiivsus on seostatud ka muutustega DRD2i või PKA, ERK ja GSK3 vahendatud intratsellulaarse signaaliülekande rakupinna ekspressioonis [1], [4], [6]. Vaatamata DRD2i olulistele rollidele ajus, ei ole üksikasjalikud regulatiivsed mehhanismid, mis annavad DRD2i omadustele heterogeensuse ja keerukuse, täielikult arusaadavad.

Tõendamise joonte põhjal võib järeldada, et DRD2-i aktiivsuse peenhäälestusse on kaasatud mitu posttranslatsioonilist modifikatsiooni. DRD2i ulatuslik glükosüülimine ilmnes varajase foto-afiinsuse märgistamise uuringutes [7]ja disulfiidsideme moodustumist DRD2-is identifitseeriti samuti kui ligandi sidumise olulist modifikatsiooni [8]. Lisaks identifitseeriti algselt DRD2 fosforüülimissaidid vitro radioaktiivsete isotoopidega, pakkudes erinevaid kinaase vahendavate erinevate regulatsiooniteede võimalusi [9]. Tõepoolest, proteiinkinaas C (PKC) reguleerib intratsellulaarse kaltsiumi DRD2-vahendatud mobiliseerimist ja moduleerib DRD2i koostoimet tsütoskeleti valkudega [10]. Fosforüülimine GPCR kinaasiga 2 (GRK2) reguleerib DRD2i agonist-indutseeritud resensibiliseerimismustreid [11].

Tsükliin-sõltuv kinaas 5 (Cdk5) on proliin-suunatud seriin / treoniini kinaas, millel on oma oluliste aktivaatorite aju-spetsiifilise ekspressiooni tõttu eelistatud aktiivsus, p35 ja p39 [12]. Cdk5 osaleb mitmesugustes neuronaalsetes protsessides, kaasa arvatud neuronite migreerumine ja aksoni juhtimine, ning Cdk5 ja p35 null hiirtel esineb kortikaalses kihistuses defekte. [13]. Hiljuti näidati, et WAVE1i ja epheksiini fosforüülimine Cdk5 poolt reguleerib dendriitide selgroo morfogeneesi. [14]. Lisaks reguleerib Cdk5 ka NMDA retseptori, NR2B ja NR2A vahendatud NMDA voolude pinnaekspressioonitasemeid [15], [16]. Tähelepanuväärne on see, et mitmed tõendid näitavad Cdk5i ja dopamiinisüsteemi vahelist lähedast suhet. Cdk5 fosforüülib türosiini hüdroksülaasi (TH), reguleerides selle stabiilsust ja säilitades seega dopamiinergilise homeostaasi [17]. Postünaptilistes neuronites, kui dopamiini T75 jääk ja tsükliline-AMP reguleeritud fosfoproteiin-32kD (DARPP-32) fosforüülitakse Cdk5-i poolt, võib see inhibeerida PKA aktiivsust ja seega antagoniseerida dopamiini DRD1-vahendatud PKA signaaliülekannet [18]. Huvitav on see, et kui kokaiini, mis on dopamiiniretseptorite kaudne agonist, manustatakse krooniliselt rottidel, suureneb Cdk5i mRNA ja valgu tase keskmistel närvirakkudel. [19]. Kollektiivselt näib, et Cdk5 osaleb ravimite poolt põhjustatud sünaptilistes kohandustes. Selles uuringus näitame DRD2i ja Cdk5i funktsionaalset koostoimet, mis laiendab veelgi Cdk5i rolli dopamiini signaalimisel.

Materjalid ja meetodid

Antikehad

DRD321i (D321i2) kolmanda rakusisese ahela fosfo-seriini 2-i (pS3) sisaldavate peptiidide vastu kasvatati küülikuvastaseid seerumeid. Fosfopeptiidi, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), kasutati afiinsuse puhastamiseks peptiidi konjugeeritud kolonni (20401, PIERCE) valmistamiseks. Anti-pS321 antikeha rikastati afiinsuspuhastussüsteemiga, järgides tootja juhiseid. Puhastatud fosfo-antikeha säilitati PBS-s koos 0.1% naatriumasiidi ja 0.1% želatiiniga. Cdk5 / p249 Western blot-ja immunotsütokeemias kasutati anti-hiire anti-Cdk35 antikeha (sc-820) ja anti-küüliku anti-p5 antikeha (sc-35). DRD9996-GFP immunosadestamisel ja Western blotimisel kasutati hiire anti-GFP antikeha (sc-2). Küülikuvastane anti-FLAG-i antikeha (sc-807), küülikuvastane anti-HA antikeha (sc-805), hiirevastane anti-GST antikeha (sc-138) ja hiirevastane anti-GAPDH antikeha (sc-32293). XNUMX) osteti firmalt Santa Cruz Biotechnologies.

Loomad

P35i knockout hiir oli lahke kingitus dr Katsuhiko Mikoshiba poolt Jaapanis RIKEN Brain Science Institute'is ja seda kasutati primaarse neuronikultuuri jaoks. Genotüpiseerimise praimerite komplektid olid 5'-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC ja 5'-TCCATCT GCACGAGACTAGT, nagu eelnevalt kirjeldatud [20]. ICR hiiri ja Sprague Dawley rotte kasutati aju lüsaadi valmistamiseks. Kõik loomsed protseduurid kiideti heaks Pohangi teadus- ja tehnoloogiaülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitees.

Plasmiidi konstruktsioon

Kasutati pFLAG-CMV-2 plasmiidvektoris inimese DRD1 pika isovormi EGFP-N2 plasmiidvektoris ja DRD212i kolmandat intratsellulaarset silmus (373-29 aminohappejäägid, mis sisaldavad täiendavaid aminohappejääke, mis on unikaalsed DRD2i pikale isovormile). Inimese Cdk2 sisestati pCMV-HA plasmiidi vektorisse ja inimese p5 sisestati pcDNA 35 plasmiidi vektorisse. Inimese Cdk3.1 sisestati tsütomegaloviiruse (CMV) promootori alla koos inimese p5-iga pcDNA 35 vektoris, et valmistada kahekordne ekspressioonikonstrukt (Cdk3.1 / p5) immunotsütokeemia, retseptori internaliseerumise testi jaoks, [³⁵S] -GTP_γS seondumisanalüüs, radioligandi seondumise test ja cAMP ensüümi immunoanalüüs.

In vitro Kinaasi test

IP-seotud vitro kinaasi test viidi läbi järgmiselt. Üks täis hiire aju lüüsiti 3 ml erütrotsüütide lüüsipuhvris (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) Dounce'i homogenisaatori 20 löögiga, et saada homogeniseeritud aju lüsaadid . Lüsaate inkubeeriti jääl 30 min, sonikeeriti ja tsentrifuugiti 16,000-is × g 10 min. Supernatandid immuniseeriti küüliku vastase anti-p35 antikehaga, saades aktiivse Cdk5 / p35 kompleksi. Cdk5 / p35 kompleks ja puhastatud GST sulandvalk segati adenosiini 5'-trifosfaadiga, [y-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) ja inkubeeriti kinaasipuhvris (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) 1 h jaoks toatemperatuuril [18], [21]. Puhastatud Cdk5 / p25 kompleksi (14 – 516, Millipore) kasutati ka vitro kinaasi test, nagu eespool kirjeldatud. Reaktsioonisegule lisati 2 × proovi laadimispuhver ja keedeti 100 ° C juures. Seejärel töödeldi proove SDS-PAGE-ga ja kuivatatud geeli hinnati autoradiograafia abil.

Vedelikkromatograafia (LC) -Mass-spektromeetria (MS) / MS analüüs

Rekombinantset GST-D2i3 valku analüüsiti LC-MS / MS-ga pärast IP-sidumist vitro kinaasi test. Me tegime LC-MS / MS andmete peptiidi identifitseerimise X !! Tandem (versioon Dec-01-2008) abil. Iga RAW-andmefail konverteeriti esmalt mzXML-ks, kasutades trans-proteoomilist torujuhet (TPP; versioon 4.3). Seejärel teostati MS / MS skaneerimine konverteeritud mzXML-des UniProt hiire valgu järjestuse andmebaasi (vabastamine 2010_07), kaasa arvatud GST-D2i3 järjestuse X X Tandem abil. Lubatud tolerants oli 3 Da jaoks eellasioonide ja 2 Da jaoks fragmentioonide jaoks. Kasutati ensüümi spetsiifilisust trüpsiini suhtes. Tsüsteiini (57.021 Da), metioniini (15.995 Da) oksüdeerimise, asparagiini (0.987 Da) ja seriini fosforüülimise (79.966 Da) oksüdeerimisel kasutati varieeruvaid modifikatsioonivõimalusi.

Immunosadestamine

Immunosadestamine viidi läbi rakulüsaatidel ELB lüüsipuhvris. Lüsaatidele lisati anti-GFP antikeha ja inkubeeriti 3 h juures 4 ° C juures. Immunokompleksid puhastati, kasutades valk-A agaroosi. Sademeid inkubeeriti SDN proovi laadimispuhvriga 30 min juures 37 ° C juures ja töödeldi SDS-PAGE ja Western blotidega.

GST Pull-down test

Puhastatud GST ja GST-D10i2 3 µg inkubeeriti roti aju lüsaadiga 1.5 h juures 4 ° C juures. Lisati lüüsipuhvriga tasakaalustatud glutatioon (GSH) -konjugeeritud Sepharose 30B-graanulid (4-17-0756, GE Healthcare) ja inkubeeriti täiendavate 01-i h. Helmed koguti tsentrifuugimisega 1-is ×g ja loputati lüüsipuhvriga 4 korda [22], [23]. Sadestunud aineid analüüsiti Western blot'i abil, kasutades anti-Cdk5 ja anti-p35 antikehi.

Immunotsütokeemia

Transfekteeritud HEK 293-rakke ja striatsiurseid neuroneid, mida kultiveeriti kattekilpidel, pesti üks kord fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja fikseeriti sukeldamisega külma 4% paraformaldehüüdi / PBS-i 30 min. Primaarne antikeha lahjendati blokeerivas lahuses (2% hobuse seerum ja 1% Triton X-100 PBS-is). Sekundaarse antikehana kasutati Alexafluor-647-konjugeeritud hiirevastast antikeha (A20990, Invitrogen) ja Alexafluor-568-konjugeeritud küülikuvastast antikeha (A11011, Invitrogen). Hoechsti kasutati tuuma värvimiseks. Pildid saadi konfokaalse mikroskoopia abil (Olympus, FluoView-1000).

Retseptori sisestamise test

24 h pärast transfektsiooni töödeldi rakke 1 uM kinpirooliga (Q102, Sigma) 30 min ja 90 min 37 ° C juures. Rakud suspendeeriti uuesti 2 mL külmas PBS-is ja iga reaktsiooni jaoks kasutati 200 µL alikvoote. Ravimeetodid viidi läbi toatemperatuuril 3 h juures järgmistes kontsentratsioonides; 3 nM [³H] -spiperoon (NET-565, PerkinElmer), 3 uM sulpiriid (895, TOCRIS), 10 uM haloperidool (H1512, Sigma). Hüdrofoobne [³H] -spiperooni kasutati kogu ekspresseeritud retseptorite märgistamiseks ja hüdrofiilset sulpiriidi kasutati membraanse retseptoriga seotud asendamiseks [³H] -spiperooni signaalid. Membraaniga seotud retseptori signaalid arvutati, lahutades intratsellulaarse retseptori väärtused kogu ekspresseeritud retseptori väärtusest. Rakud filtriti GF / B (Millipore) filtril ja pesti 3 korda pesupuhvriga (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtrid kuivatati ja radioaktiivsust mõõdeti vedelikstsintillatsiooniloenduriga [24].

Rakkude membraanide ettevalmistamine

Konfentseeritud rakud 100 mm kultuuritassides pesti pärast transfektsiooni jääkülma PBS-iga ja koguti 1 mL HME puhvris (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Homogeniseeritud lüsaate tsentrifuugiti 500 x g-ga 15 min ja supernatandid tsentrifuugiti seejärel 36,000 x g-ga 30 min. Analüüsides kasutati HME puhvris uuesti suspendeeritud graanuleid.

[³⁵S] -GTP_γS sidumisanalüüs

Rakumembraanifraktsioone inkubeeriti testpuhvris (1 mM HEPES (pH 102), 25 mM MgCl-ga eelnevalt 7.5 uM kinpirooliga (Q1.5, Sigma).₂100 mM NaCl, 1 mM EDTA ja 0.01 mM SKP) 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) lisati 3 nM lõppkontsentratsioonile 30 µL-s ja inkubeeriti veel 90 min. 170 µL jääkülma puhvrit (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ja reaktsiooni peatamiseks lisati 0.1 mM GTP). Membraanid filtriti GF / B filtril (Millipore) ja pesti 3 korda pesupuhvriga (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtrid kuivatati ja radioaktiivsust mõõdeti stsintillatsiooniloenduriga [25], [26].

Radioligandi sidumisanalüüs

Valmistatud rakumembraane inkubeeriti 0.01 nM [³H] -spiperoon (NET-565, PerkinElmer) ja kinpirooli (Q102, Sigma) suurenevad kontsentratsioonid 30 min jaoks analüüsipuhvris (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membraanid filtriti GF / B filtril (Millipore) ja pesti 3 korda pesupuhvriga (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reaktsioon lõpetati kiire filtreerimisega läbi GF / C filtrite. Jääk radioaktiivsust mõõdeti vedelikstsintillatsiooniloenduriga [27]-[29].

cAMP ensüümi immunoloogiline analüüs

Transfekteeritud HEK 293 rakke töödeldi 10 h-ga 6520 uM rolipramiga (R1, Sigma) ja seejärel töödeldi 0.1 uM forskoliiniga (F6886, Sigma) ja kinpirooli (Q102, Sigma) suurenevate kontsentratsioonidega 30 min. Primaarseid kultiveeritud striatu neuroneid töödeldi 10 uM rolipramiga 1 h jaoks ja seejärel 1 uM dopamiini 1 h jaoks [22]. Rakulüsaadid valmistati 0.1 M HCl-ga ja cAMP-tasemed tuvastati cAMP-ensüümi immunoanalüüsi komplektiga (Sapphire Bioscience), järgides tootja juhiseid.

Esmane kultiveeritud striatu neuron

Striatumi piirkond eraldati hiire embrüo ajust (E15). Eraldatud koe dissotsieeriti minimaalses olulises söötmes (MEM) (11095, Invitrogen), mis sisaldas 0.25% trüpsiini (T4549-100, Sigma) ja 0.1% DNaasi I 6 min 37 ° C juures. Rakud suspendeeriti uuesti plaadimaterjalis (MEM 0.01 M HEPES (pH 7.4) ja 10% (mah / maht) hobuse seerumiga (16050-122, GIBCO)). Neuroneid kasvatati 7-päeva jooksul vitro (DIV 7) MEM-s koos B27-i lisandiga (17504-044, Invitrogen) enne kasutamist cAMP-ensüümi immunoanalüüsidele.

Tulemused

Cdk5 fosforülaadid seriin 321 DRD2i kolmandas rakusiseses ahelas vitro

Uute Cdk5 substraatide identifitseerimiseks teostasime süstemaatilise otsingu (S / T) PX (K / H / R) abil Cdk5 tuvastamise konsensusjärjestustena [30] ja identifitseeris DRD2 kandidaat substraadina. Konsensusjärjestus, kaasa arvatud seriin 321, paikneb DRD2i (D2i3) kolmandas intratsellulaarses ahelas, kus on seotud erinevad regulatiivsed mehhanismid [3], [10], [11]. Järjestus on evolutsiooniliselt konserveeritud selgroogsetes DRD2is, mis tähendab jäägi funktsionaalset tähtsust (Joonis 1A).

Lae:   

• PPT

  PowerPointi slaid

• PNG

  suurem pilt (2.08MB)

• TIFF

  originaalpilt (4.36MB)

Joonis 1. Cdk5 fosforüülib seriini 321i DRD2i kolmandas rakusiseses ahelas in vitro.

(A) Aminohapete järjestuse joondamine, mis näitab DRD2i konserveeritud piirkondi erinevatelt liikidelt (varjutatud). Potentsiaalne Cdk5 fosforüülimiskoht on tähistatud tärniga. (B) IP-seotud vitro kinaasi test rekombinantsete GST-D2i3 ja GST-D2i3 mutantvalkudega. Kinaasireaktsioonides kasutati hiire ajuekstraktist p5-vastase immunosadestamisega Cdk35 / p35 kompleksi. Fosforüülitud valkude autoradiograaf on näidatud koos sama geeliga Coomassie briljantsinisega. Noolepea näitab GST-D2i3-ile vastavat radioaktiivset signaali ja avatud noolepea näitab p35i radioaktiivseid signaale. (C) D2i3 fosforüülitud peptiidfragmendi MS / MS spekter. Teoreetilised killustumismustrid on näidatud spektri all. Kõigist fragmentiioonidest tähistatakse tuvastatud y- ja b-ioneid spektris. Y₆ ja y₇ ioonid näitavad tugevalt seriini 321 fosforüülimist. (D) In vitro kinaasi analüüs puhastatud Cdk5 / GST-p25 kompleksiga, kasutades GST-D2i3 ja GST-D2i3 mutantseid valke. Fosforüülitud valke näidati autoradiograafis koos Coomassie briljantsinisega. Noolepea näitab, et GST-D2i3 vastab radioaktiivsele signaalile ja avatud noolepea näitab GST-p25i radioaktiivseid signaale.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Selleks, et hinnata Cdk5i suutlikkust D2i3i fosforüülimiseks, teostasime me IP-lingid vitro kinaasi testid, kasutades substraatidena aktiivset Cdk5 / p35 kompleksi, mis on rikastatud hiire aju lüsaadist p35 immunosadestamise teel puhastatud rekombinantsete GST-D2i3 (aminohappejääkide 212-373) valkudega. Me täheldasime fosforüülimise signaale puhastatud GST-D2i3 ja GST-D2i3 S297A valkudes, kuid signaal vähenes oluliselt, kasutades GST-D2i3 S321A (Joonis 1B). Seriin 321 fosforüülimise täiendavaks kontrollimiseks GST-D2i3-is teostasime IP-seotud proovide LC-MS / MS analüüsi vitro kinaasi testid, kasutades LTQ XL massispektromeetriat. Järjekindlalt saadi fosfo-peptiidid, mis vastavad fosfo-seriini 321 peptiidide massile (Joonis 1C). Arvestades, et andmete sõltuv omandamine LC-MS / MS analüüsi käigus kaldub tuvastama proovis rohkeid valke [31], need andmed viitavad sellele, et seriin 321 jääk on Cdk5 domineeriv fosforüülimiskoht D2i3 piirkonnas. Serdi 321i otsese fosforüülimise tõendamine GST-D2i3is, Cdk5, vitro viidi läbi kinaasi test, milles kasutati puhastatud Cdk5 / GST-p25 kompleksi puhastatud rekombinantsete GST-D2i3 valkudega. Me tuvastasime GST-D2i3is, mis puudus GST-D2i3 S321A-s, märkimisväärse fosforüülimissignaali.Joonis 1D). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et D2i3 S321 jääk on Cdk5-vahendatud fosforüülimise eelistatud sihtmärk.

Cdk5 fosforülaadid seriin 321 DRD2i kolmandas rakusiseses ahelas rakkudes

Seriin 321 fosforüülimise tuvastamiseks tõstatasime antikeha, mis oli spetsiifiline fosfo-seriini 321i suhtes (pS321). Proovid IP-sidest vitro kinaasi analüüsi analüüsiti Western blottinguga, kasutades anti-pS321 antikeha. Blotid näitasid kinaasireaktsioonis eraldiseisvat riba, mis sõltus GST-D2i3-st (Joonis 2A). Selleks, et kontrollida seriini 321 potentsiaalset fosforüülimist DRD2is rakkudes, analüüsiti anti-GFP immunosadestamist HEK 5-rakkudest, mis ekspresseerivad DRD293-GFP-d ja DRD2 S2A-GFP-d koos HA-Cdk321-i ja p5-i või ilma selleta, kasutades anti-GFP ja anti-pS35 antikehad. Anti-GFP antikeha iseloomulikke määrdunud lindi signaale, mis on teadaolevalt tingitud DRD321i liigsest glükosüülimisest, täheldatakse ainult DRD2-GFP juuresolekul ja anti-pS2 antikeha tuvastas sarnased DRD321 signaalid ainult koos Cdk2 / p5 co-ekspressiooniga (Joonis 2B) [7]. Edasiseks kontrollimiseks genereeriti seriini 321 fosforüülimine Cdk5i, D2i3i (FLAG-D2i3) ja D2i3i (FLAG-D2i3 S321A) mutantse vormiga. FLAG-D2i3 ja FLAG-D2i3 S321A, mida ekspresseeriti HEK 5 rakkudes või ilma HA-Cdk35-i ja p293-i, analüüsiti SDS-geel liikuvuse muutuse testiga. FLAG-D5i2, kuid mitte FLAG-D3i2 S3A puhul täheldati märkimisväärset Cdk321-sõltuvat liikumisvahet.Joonis 2C). Samuti hindasime agonisti stimuleerimisel DRD2i fosforüülimise taset Ser321is. HEK 293 rakke, mis ekspresseerivad DRD2-GFP ja Cdk5 / p35 kompleksi, stimuleeriti kinpirooliga ja rakulüsaatidest pärinevaid anti-GFP immunosadestusi analüüsiti Western blottinguga, kasutades anti-GFP ja anti-pS321 antikehi. Leidsime, et agonisti stimuleerimine ei mõjutanud DRD5i Cdk2-vahendatud fosforüülimist Ser321is, mis tundub olevat erinev GRK- ja PKC-vahendatud fosforüülimisest (Joonis 2D) [32], [33]. Need tulemused näitavad koos, et Cdk5 võib fosforüülida DRD321i seriin 2 jääki rakukeskkonnas.

Lae:   

• PPT

  PowerPointi slaid

• PNG

  suurem pilt (1.92MB)

• TIFF

  originaalpilt (3.5MB)

Joonis 2. Cdk5 fosforüleerib seriini 321i kolmes rakusiseses DRD2-i ahelas.

Seriini 5 Cdk321-vahendatud fosforüülimist analüüsiti pS321-vastase antikehaga. (A) IP-seotud proovid vitro Kinaasi analüüsi, kasutades GST-D2i3 valke, analüüsiti Western blotting (WB) abil näidatud antikehadega. Noolepead näitavad GST-D2i3i. (B) DRD2-GFP ja DRD2 S321A-GFP ekspresseeriti HEK 5 rakkudes koos HA-Cdk35 ja p293-i või ilma. Anti-GFP immunopretsipitaate analüüsiti Western blot analüüsiga, kasutades anti-GFP ja anti-pS321 antikehi. Sulgur näitab DRD2 signaale ja avatud noolepea näitab mittespetsiifilisi signaale anti-GFP immunosadestustest. '% sisend' on IP-reaktsiooni jaoks kogu lüsaadi mahuprotsent. Nõrgad endogeensed Cdk5 signaalid tähistati tärnidega. (C) Geelide liikuvuse nihke analüüs. Näidatud viisil transfekteeritud HEK 293 rakke analüüsiti Western blot analüüsiga. (D) Transfekteeritud HEK 293 rakke töödeldi kinpirooliga ja anti-GFP immunopretsipitaate analüüsiti anti-GFP ja anti-pS321 antikehadega Western blot analüüsiga. Avatud noolepea näitab mittespetsiifilisi signaale anti-GFP immunosadestustest.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 kompleks ja DRD2 on füüsiliselt seotud

Uurisime võimalikku füüsilist koostoimet Cdk5 / p35 kompleksi ja DRD2 vahel, kuna teadaolevalt on paljud Cdk5 substraadid füüsiliselt seotud Cdk5 / p35 kompleksiga [23], [34], [35]. Esiteks viidi läbi GST rippmenüü. Puhastatud rekombinantset GST-D2i3 valku inkubeeriti roti aju lüsaadiga ja GST pull-down sademeid analüüsiti Western blot-analüüsi jaoks. Nagu näidatud Joonis 3A, endogeensed Cdk5 ja p35 identifitseeriti rippmenüüdes, näidates füüsilist interaktsiooni DRD2i ja Cdk5 / p35 kompleksi vahel (Joonis 3A). Lisaks detekteeriti anti-GFP immunosadestustes HA-Cdk5 ja p35 HEK 293 rakulüsaatidest, mis ekspresseerisid DRD2-GFP ja Cdk5 / p35 (Joonis 3B). Lisaks teostasime immunotsütokeemilisi analüüse ja täheldasime, et DRD2-GFP, HA-Cdk5 ja p35 näitavad HEK 293 rakkude membraanilises piirkonnas olulisi kaas-lokaliseerimise signaale (Joonis 3C, ülemine paneel). Uuriti ka DRD2i ja Cdk5 / p35i koospaiknemist neuronaalses kontekstis. Järjekindlalt näitas DRD2-GFP ka endogeense Cdk5i ja p35-i olulist koospaiknemist kultiveeritud striatu neuronites (DIV7), toetades täiendavalt funktsionaalseid sidemeid DRD2i ja Cdk5 / p35i vahel (Joonis 3C, põhjapaneelid). Tulemused näitavad, et DRD2 ja Cdk5 / p35 võivad moodustada kompleksi ja seega toetada seisukohta, et DRD2 on Cdk5i füsioloogiline substraat.

Lae:   

• PPT

  PowerPointi slaid

• PNG

  suurem pilt (3.91MB)

• TIFF

  originaalpilt (5.35MB)

Joonis 3. Cdk5 / p35 võib moodustada DRD2iga kompleksi.

(A) GST väljatõmmisanalüüs, kasutades puhastatud rekombinantset GST-D2i3 valku roti ajuekstraktiga. GST-i väljatõmmatavad sademed allutati Western blot analüüsidele. "Bead" näitab rippuvat sadet ilma GST valkudeta. (B) DRD2 ja Cdk5 / p35 kompleksi immunosadestamine. Transfekteeritud rakkude lüsaatidest pärinev anti-GFP IP allutati Western blot analüüsidele. Sulgur näitab DRD2 signaale ja avatud noolepea näitab mittespetsiifilisi signaale anti-GFP immunosadestustest. Parempoolses osas on näidatud ka sisendite üleekspositsioon. (C) DRD2i ja Cdk5 / p35i immunotsütokeemilised analüüsid. DRD293-GFP ja Cdk2 / p5 ekspresseerivad HEK 35 rakud värviti anti-Cdk5 ja anti-p35 antikehadega (ülemine paneel). DRD2-GFP ekspresseeriti kultiveeritud striatu neuronites üksi ja värviti anti-Cdk5 ja anti-p35 antikehadega (alumine paneel). Hoechsti kasutati tuuma värvimiseks. Skaala riba on 5 µm. Kõik pildid saadi konfokaalmikroskoopia abil (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

DRD5i Cdk2-vahendatud fosforüülimine vähendab retseptori aktiivsust

On teatatud, et fosforüülimine moduleerib GPCR-i kriitilisi omadusi, nagu G-valgu sidumine, retseptori internaliseerumine, rakusisese lokaliseerimise ja seost modulaatorvalkudega [9], [11], [24]. gonisti poolt indutseeritud retseptori internaliseerimine on signaalitransduktsiooni kriitiline regulatiivne protsess. Uurisime DRD5i internaliseerimise Cdk2-vahendatud moduleerimist. DRD293-GFP ja DRD2 S2A-GFP ekspresseerivaid HEK 321 rakke Cdk5 / p35 või ilma selleta inkubeeriti 1 uM kinpirooliga, et indutseerida agonist-stimuleeritud DRD2 sisestamist (Joonis 4A). [³DRD2-GFP ekspresseerivate rakkude H] -spiperooni signaalid redutseeriti oluliselt 30 min-kvinpirooliga töötlemisel ja taastati 90 min. Huvitav, [³H] -spiperooni signaalid DRD2-GFP ja Cdk5 / p35 ekspresseerivatel rakkudel vähenesid ka 30 min quinpirole-ravi korral, kuid neid ei saadud 90 min min.Joonis 4A, teine ​​lõik). Teiselt poolt, [³DRD2 S321A-GFP ekspresseerivate rakkude H] -spiperooni signaalid redutseeriti 30 min ja taastati 90 min juures, sõltumata Cdk5 / p35-i ekspressioonist. Varasemad uuringud on näidanud, et internaliseeritud DRD2 taaskasutab pika ajaga agonisti stimuleerimisel tagasi plasma membraani. [11]. Ttundub, et DRD5i Cdk2-vahendatud fosforüülimine osaleb agonisti poolt indutseeritud DRD2-i internaliseerumisega seotud resensibiliseerimisprotsessides.

Lae:   

• PPT

  PowerPointi slaid

• PNG

  suurem pilt (387KB)

• TIFF

  originaalpilt (1.31MB)

Joonis 4. Cdk5-vahendatud fosforüülimine nõrgendab DRD2-i pinnaekspressiooni ja allavoolu signaalimist.

(A) DRD2 pinnaekspressioon mõõdetuna [³H] -spiperooni sidumise test. Transfekteeritud HEK293 rakke stimuleeriti näidatud ajaks 1 uM kinpirooliga ja koguti, millele järgnes 3 nM [³H] -spiperoonravi 3 tundi. Mõõdeti radioaktiivsust ja arvutati pinnasignaalid. Vearibad tähistavad keskmist ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ühesuunaline ANOVA koos Dunnetti post hoc testiga: võrrelge kõiki veerge kontrollkolonniga). (B) [³⁵S] -GTP_γS seondumisanalüüs. Rakumembraanid valmistati näidatud viisil transfekteeritud rakkudest. Membraanipreparaate inkubeeriti 1 uM kinpirooliga, millele järgnes 3 nM [³⁵S] -GTP_γS 90 minutit. Vearibad tähistavad keskmist ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ühesuunaline ANOVA koos Bonferroni post hoc testiga: võrrelge kõiki veerupaare). (C) Kininooliga konkureeriv [³H] -spiperooni sidumise test. Transfekteeritud rakkude membraanpreparaate inkubeeriti 0.01 nM [³H] -spiperoon ja kininooli suurenevad kontsentratsioonid 30 min. Mittelineaarne regressioon saadi GraphPad abil. Vearibad näitavad keskmist ± SE (n = 3). (D) cAMP ensüümi immuunanalüüsid transfekteeritud HEK 293 rakkudes. Transfekteeritud rakke töödeldi 10 tund 1 uM rolipraamiga ja seejärel töödeldi 0.1 minuti jooksul 30 uM forskoliini ja kininooli suureneva kontsentratsiooniga. Mittelineaarne regressioon saadi GraphPad abil. Vearibad tähistavad keskmist ± SE (n = 4; ** p <0.01; kahesaba t-testid). (E) Metsikutest ja p35i knockouti embrüotest (DIV 7) pärinevaid kultiveeritud striatu neuroneid töödeldi 10 uM rolipramiga 1 h jaoks, millele järgnes 1 uM dopamiin 1 h jaoks. Veariba esindab keskmist ± SE (n = 4; **p<0.01; kahe sabaga t-testid).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Lisaks hindasime Cdk2-vahendatud fosforüülimisega seotud agonisti poolt stimuleeritud G-valgu sidumise võimalikku muutust DRD5-iga, kasutades [³⁵S] -GTP_γS seondumisanalüüs [25], [26]. DRD2-GFP ja DRD2 S321A-GFP koos Cdk5 / p35-i või ilma selleta ekspresseeriti HEK 293 rakkudes. Membraanid valmistati ja stimuleeriti 1 uM kinpirooliga ja neid täiendavalt lubati [³⁵S] -GTP_γS inkorporeerimine. DRD2-GFP ja Cdk5 / p35 ekspresseeriv rakumembraan näitasid oluliselt kahjustunud [³⁵S] -GTP_γS seondumine kõigi teiste rakumembraanidega (Joonis 4B). Need tulemused näitavad, et Cdk5-vahendatud fosforüülimine reguleerib agonisti poolt stimuleeritud G-valgu seondumist DRD2-is.

Lisaks konkureerivad kinopiroolid [³H] -spiperooni sidumisanalüüsid viidi läbi, et uurida võimalikke muutusi agonist-afiinsuses DRD2i poolt Cdk5-vahendatud fosforüülimise teel. [³Mõõdeti kinopirooli suureneva kontsentratsiooni töötlemisel transfekteeritud membraanipreparaadile H] -piperooni. Kvinpirooli ja [³H] -spiperoon DRD2-GFP ja DRD2 S321A-GFP-s tegi sarnase logK_i väärtused (-9.789 DRD2-GFP jaoks; -9.691 DRD2 S321A-GFP puhul), mis näitab, et Cdk2-vahendatud fosforüülimine DRD5is ei mõjuta oluliselt ligandi ja DRD2i afiinsust (Joonis 4C).

Cdk5-vahendatud fosforüülimine Reguleerib DRD2-cAMP signalisatsiooni rada

Järgnevalt uurisime, kas Cdk2i DRD5i modifitseerimine mõjutab allavoolu signaaliülekande radasid. Me jälgisime forskoliini poolt stimuleeritud cAMP tootmise inhibeerimist adenülüültsüklaasi poolt rakkudes, mis ekspresseerisid DRD2-GFP ja DRD2 S2A-GFP, kasutades cAMP ensüümi immunoanalüüsi. DRD321-i ekspresseerivad rakud näitasid annusest sõltuval viisil vähenenud cAMP taset vastuseks kinpiroolile. Tähelepanuväärselt vähendas Cdk2 / p5 koosekspressioon oluliselt cAMP moodustumise maksimaalset inhibeerimist (Joonis 4D, vasak paneel). Teisest küljest, DRD2 S321A-GFP ekspresseerivates rakkudes inhibeeriti cAMP formatsiooni efektiivselt vastusena kinpirooli ravile, sõltumata Cdk5 / p35 ekspressioonist (Joonis 4D, parem paneel). Need tulemused näitavad, et DRD5i Cdk2-vahendatud fosforüülimine nõrgendab DRD2 inhibeerivat aktiivsust allavoolu cAMP signaaliülekanderajal. Et veelgi enam füsioloogiliselt tähtsamates tingimustes nähtusi kinnitada, kasutasime esmaseid kultiveeritud neuroneid, mis olid p35-i puudulikest embrüotest, mis on oluline Cdk5-i aktivaator. Primaarseid kultiveeritud striatu neuroneid töödeldi 1 uM dopamiiniga ja analüüsiti cAMP ensüümi immunoanalüüsiga. P35-i knockout-hiirte neuronitel esines dopamiiniga stimuleerimisel vähenenud cAMP-tasemeid võrreldes metsiktüüpi neuronitega.Joonis 4E). TKokkuvõttes järeldasime, et DRD5i Cdk2-vahendatud fosforüülimine vähendab DRD2i poolt avaldatud cAMP-raja inhibeerivat tooni.

Arutelu

Me tuvastasime DRD2i kui Cdk5i uut substraati. Fosforüülimine näib DRD2i pinnaekspressiooni allapoole reguleerivat, mõjutades DRD2-i saatust pärast retseptori internaliseerumist, vähendades sellega DRD2 G-i._i-campling ja cAMP-rada. Kuna fosforüülimise jääk S321 eksisteerib nii DRD2i pikkades kui ka lühikeses isovormis, võib selles uuringus pakutud mehhanism olla DRD2-vahendatud signaalimise üldine reguleerimisviis.

DRD2-i keskmistes närvirakkudes ei peeta mitte ainult oluliseks dopamiiniretseptori alatüübiks, vaid ka selle tundlikkuseks keskkonnamuutustele reageerimise kättesaadavuse muutustele. DRD2i agonisti poolt põhjustatud desensibiliseerimist ja resensibiliseerimist on põhjalikult uuritud [11], [24]. Eelkõige on mitmed uuringud näidanud, et kroonilise psühhostimulandi mõju, nagu kokaiin ja amfetamiin, mis tõstavad striatsiidi sünapsis dopamiini ekstratsellulaarset taset, kaasnevad DRD2i dünaamiliste muutustega postünaptiliselt. [36]. Tõepoolest, teadaolevalt on kroonilised kokaiinitarbijad vähendanud DRD2i tasemeid striatumi piirkonnas ja DRD2i kättesaadavus tuuma accumbensis (NAcc) näitab negatiivset seost ravimite otsimise ja tugevdamise käitumisega hiirtel ja primaatidel. [37]-[39]. Need tulemused näitavad, et DRD2i funktsionaalsus on väga vastuvõtlik adaptiivse või kompenseeriva regulatsiooni suhtes, reageerides erinevatele stiimulitele, kaasa arvatud krooniline ravimi ekspositsioon. Meie tulemused näitavad, et S321 jääki DRD2i kolmandas rakusiseses ahelas saab fosforüülida Cdk5 abil, mille tulemuseks on DRD2 inhibeeriva toime vähenemine cAMP rajale. See interaktsioon pakub välja uue regulatiivse mehhanismi, mis on seotud Cdk5iga dopaminotseptilistes neuronites, mis võivad olla seotud DRD2i pinna kättesaadavuse dünaamilise olemusega.

Tuleb märkida, et Cdk5 on teadaolevalt peamine komponent neuronaalse keskkonna adaptiivsete muutuste vahendamisel. Näiteks on dendriitrakkude struktuursed ja funktsionaalsed muutused limbilise ahela neuronites üks korduva psühhostimulandi kokkupuute tagajärgi [40]. Nende muutustega kaasnevad mitmed molekulaarsed muutused, kaasa arvatud cAMP vastuse elementi siduva valgu (CREB) ja ΔFosB induktsioon, transkriptsioonifaktorid, millel on püsiv ülesreguleerimine vastuseks kroonilisele kokaiini manustamisele [41], [42]. Oluline on, et Cdk5 on ΔFosB sihtmärk [19], ja paljud kriitilised komponendid, mis on seotud dendriitide selgroo dünaamikaga, nagu PSD-95, p21-aktiveeritud kinaas (PAK), β-kateniin ja spinofiliin, esitati Cdk5 substraatidena [43]-[46]. Cdk5-i aktiivsuse geneetilised või farmakoloogilised manipulatsioonid põhjustavad dendriitrakkude morfoloogia ja kokaiini käitumuslike reaktsioonide muutusi, mis tähendab Cdk5i kriitilist rolli mesolimbiliste dopamiini ahelate molekulaarsetes ja morfoloogilistes muutustes [47], [48]. Meie tulemused, mis näitavad, et DRD2 on uus Cdk5-i sihtmärk, annab täiendava ülevaate dopamiinisüsteemi adaptiivsetest muutustest vastuseks kroonilistele ravimi ekspositsioonidele, kuna Cdk5-i järgnev ΔFosB-vahendatud ülesreguleerimine võib indutseerida DRD2i fosforüülimise toonilise suurenemise . Lisaks on teada, et DRD2 mõjutab arvukalt rakulisi protsesse, sealhulgas cAMP ja MAP kinaasi radade reguleerimist ja allavoolu transkriptsioonilisi sündmusi [42], [49]. Seega võivad selle uuringu tulemused mitte ainult kujutada DRD2i otsest reguleerimist Cdk5i poolt, vaid annavad ka uue ülevaate dopamiinisüsteemi adaptiivsetest vastustest kroonilisele ravimi eksponeerimisele.

Autori panused

Kujundanud ja kujundanud katsed: JJ YUP DH SKP. Tehtud katsed: JJ YUP DKK YK. Analüüsiti andmeid: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Toetatud reaktiivid / materjalid / analüüsivahendid: YHS. Kirjutas raamatu: JJ SKP.