Optogeneetika näitab kokkuvõttes D2i retseptoreid ekspresseerivate akumeraalsete keskmiste närvirakkude rolli kokaiiniga indutseeritud käitumusliku sensibiliseerimise (2014) puhul.

Mine:

Abstraktne

On välja pakutud pikaajalist, ravimiga indutseeritud kohandumist tuuma accumbensis (NAc), mis aitavad kaasa ravimiga seotud sõltuvust tekitavale käitumisele. Siin oleme kasutanud optogeneetilist lähenemist, et uurida dopamiini D2 retseptoreid (D2R) ekspresseerivate NAc keskmise spinni neuronite (MSN) rolli kokaiiniga indutseeritud käitumusliku sensibiliseerimise puhul. Adeno-assotsieerunud viirusvektorid, mis kodeerivad kanalodopsiin-2-i (ChR2), viidi D2R-Cre transgeensete hiirte NAc-sse. See võimaldas meil selektiivselt valgustada D2R-MSN-e NAc-s. D2R-MSN-id moodustavad kohalikke inhibeerivaid ahelaid, kuna D2R-MSN-i fotostimuleerimine tekitas naaber-MSN-des inhibeerivaid postünaptilisi voolusid (IPSC). NAc D2R-MSN fotostimuleerimine in vivo ei mõjutanud kokaiini põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise algust ega väljendumist. Kuid fotostimulatsioon ravimi katkestamise ajal nõrgendas kokaiini poolt põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise ekspressiooni. Need tulemused näitavad, et NAc D2R-MSN-idel on võõrutusest tingitud plastilisuses võtmeroll ja võivad aidata kaasa retsidiivi tekkimisele pärast narkootikumide kuritarvitamise lõpetamist.

Märksõnad: optogeneetika, keskmised närvirakud, dopamiini D2 retseptorid, kokaiin, narkomaania

Sissejuhatus

Dopamiini (DA) signalisatsioon on seotud tasuootmise ja eesmärgipärase käitumisega (Wise, 2004; Goto ja Grace, 2005; Berridge 2007). Üks tuntud dopamiinergiliste häirete patoloogiatest on narkomaania (Robinson ja Berridge, 1993, 2003). Pärast korduvat kokkupuudet sõltuvust tekitavate ainetega esineb molekulaarsel ja rakulisel tasemel adaptiivsed muutused DA-mesolimbilisel teel; need võivad põhjustada uimastisõltuvust, mis on krooniline, ägenev haigus, mille korral püsivad hoolimata nende tõsistest negatiivsetest tagajärgedest kompulsiivsed narkootikumide otsimise ja narkootikumide tarvitamise käitumised (Thomas et al., 2008; Baik, 2013). Mesolimbilise dopamiinergilise süsteemi modifikatsioonide iseloomustamine on seega narkomaania mõistmise võti.

Dopamiini D1 retseptorid (D1R) ja D2 retseptorid (D2R) on striatumi keskmistes närvirakkudes (MSN-des) kõrgelt ekspresseeritud. On välja pakutud, et pikaajaline ravimi poolt indutseeritud kohanemine ventral striatumis, mida tuntakse paremini kui tuumakleemid (NAc), aitavad kaasa nii sõltuvuse tekkimisele kui ka narkootikumide otsimise ja taandumise käitumisele (Lobo ja Nestler, 2011; Smith et al., 2013). Dopamiinergiliste rakkude kehad ventral tegmentaalsest piirkonnast pärsivad enamasti NAc-d. Üle 95% NAc rakkudest on MSN-d, mis saavad erutatavat sisendit neljast peamisest aju piirkonnast: prefrontaalsest ajukoorest, hippokampuse ventralisest subikulaadist, basolateraalsest amygdalist ja talamusest (Sesack ja Grace, 2010; Lüscher ja Malenka, 2011). MSN-sid võib NAc-s jagada kaheks peamiseks alamrühmaks: otsesed MSN-d, mis ekspresseerivad D1R-e ja projektid otse keskjoonte DA-piirkondadesse, ja kaudsed raja MSN-d, mis väljendavad D2R-i ja projektid ventral pallidum'ile (Kreitzer ja Malenka, 2008; Sesack ja Grace, 2010; Lüscher ja Malenka, 2011; Smith et al., 2013). Kuna MSN on GABAergiline, inhibeerivad MSN-i neuronite aktiveerimine nende allavoolu sihtmärke, mis on samuti GABAergic (Chevalier ja Deniau, 1990). Seetõttu stimuleerib D1R-MSN-de aktiveerimine keskmise aju DA-neuroneid, mis seejärel aitab kaasa tasustamisega seotud käitumise reguleerimisele (Lüscher ja Malenka, 2011; Bocklisch et al., 2013).

Hiljutised uuringud, mis kasutavad geneetiliselt muundatud hiiri, kes ekspresseerivad Cre-rekombinaasi rakutüüpi spetsiifilisel viisil, on näidanud D1R-MSN-de ja D2R-MSN-i erinevaid rolle kokaiini sõltuvuse käitumises. Sellised hiired võimaldavad spetsiifiliste toksiinide, optogeneetiliste sondide või DREADD (disaineriretseptorite retseptorite retseptorid) geneetilist sihtimist D1R-MSN või D2R-MSN valikuliseks manipuleerimiseks. Selline lähenemine on toonud kaasa mõningase konsensuse MSN-de rolli kohta sõltuvust tekitavates käitumistes: D1R-MSN-id edendavad ilmselt sõltuvust tekitavat käitumist, samas kui D2R-MSN-idele ei ole soovitatav mingit spetsiifilist rolli (või inhibeerivat rolli) ravimi poolt põhjustatud sõltuvust tekitava käitumise arengus. (Hikida et al., 2010; Lobo et al., 2010; Ferguson et al., 2011; Bock et al., 2013). Kokaiini kokkupuude indutseerib ilmselt sünaptilist modifikatsiooni ja geeniekspressiooni muutusi mõlemas MSN populatsioonis (Lobo et al., 2010; Lobo ja Nestler, 2011; Grueter et al., 2013). Kuigi tundub, et D1R-MSN ja D2R-MSN mängivad kokaiini vahendatud sõltuvust tekitavas käitumises vastandlikke rolle, ei ole D2R-MSNide täpne roll selge.

Varem on näidatud, et D2R knockout (KO) hiirtel on normaalne kokaiini vahendatud käitumuslik sensibiliseerimine ja kokaiini otsivad käitumised, kusjuures D2R puudumisest põhjustatud tundlikkus on väike (Baik et al., 1995; Chausmer et al., 2002; Sim et al., 2013). Kuid kokkupuude stressiga ravimi katkestamise ajal pärsib kokaiini poolt põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise ekspressiooni, samuti kokaiini otsivad ja retsidiivsed käitumised D2R KO hiirtel (Sim et al., 2013). D2R-i spetsiifiline kukkumine NAc-s ei mõjuta põhi-liikumisaktiivsust ega kokaiini poolt põhjustatud käitumuslikku sensibiliseerimist, kuid annab stressi võime inhibeerida kokaiini poolt põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise ekspressiooni (Sim et al., 2013). Need leiud viitavad tugevalt sellele, et D2Ri blokeerimine NAc-s ei takista kokaiini vahendatud käitumuslikku sensibiliseerimist. Pigem tundub, et D2R-is NAc-s on eriline roll stressist tingitud sünaptiliste modifikatsioonide reguleerimisel tühistamise ajal, mis põhjustab kokaiini otsivate ja retsidiivide käitumise suurenemist (Sim et al., 2013).

Siin oleme kasutanud optogeneetikat, et veelgi hinnata NAc D2R-MSN-i rolli kokaiini poolt põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise puhul. Aju viiludena leiame, et D2R-MSN-de fotostimuleerimine aktiveerib NAc-s paiknevad inhibeerivad ahelad, mis hõlmavad naaberriike MSN-e. NAc D2R-MSN-de fotostimuleerimine in vivo ei mõjuta kokaiinist põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise algust ega väljendumist. Kuid NAc D2R-MSN-de korduv aktiveerimine ravimi katkestamise ajal nõrgendab kokaiini põhjustatud sõltuvust. Meie tulemused näitavad, et NAc D2R-MSN-idel on võõrutusest tingitud plastilisuses võtmetähtsus ja see võib kaasa aidata retsidiivi tekkimisele pärast narkootikumide kuritarvitamise lõpetamist.

materjalid ja meetodid

Hiired

D2-Cre BAC transgeensed hiired C57Bl / 6 taustal saadi MMRRC-lt (Mutant Mouse Regional Resource Centers, B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd). Käitumiskatsetes kasutati D2-Cre hiirte kontrollidena D2-Cre transgeeni puuduvaid pesakonnakaaslasi. Hiiri hoiti kindlas patogeenivabas barjääris püsivates temperatuuride ja niiskuse tingimustes ning 12-h valguses, 12-h tume graafikus. Loomade hooldamine ja käitlemine viidi läbi kooskõlas Korea Ülikooli ja KISTi institutsionaalsete loomade hooldamise ja kasutamise komiteede poolt kinnitatud standarditega.

Viiruse vektori valmistamine

pAAV-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE pakkus heldelt Karl Deisseroth (Stanford Univ.). AAV valmistamiseks kasvatati HEK293T rakke DMEM söötmes koos antibiootikumide ja FBS-iga. Päev enne transfekteerimist plaaditi 90-cm nõusid 10% konfluentsust ületavad neli plaati viie 15-cm nõusse ja inkubeeriti 18-22 h või 60 kuni 70% konfluentsuseni. HEK293T rakud transfekteeriti pAAV-DIO-ChR2-EYFP, pAAV-DJ ja pHelperiga, kasutades jetPEI transfektsiooni reaktiivi (QBiogene). DNA / DMEM / PEI kokteili segati ja inkubeeriti toatemperatuuril 20 min. Pärast inkubeerimist lisati igasse 15 cm tassi transfektsioonisegu. Transfekteeritud rakud koguti 48 h pärast transfektsiooni ja inkubeeriti 0.5% naatriumdoksükolaadiga (Sigma; D6750) ja 50-i ühikutega / ml bensonaasi nukleaasiga (Sigma; E1014) 37 ° C juures 1 h. Pärast tsellulaarsete prahtide eemaldamist, tsentrifuugides 3000 x g juures 15 min, filtreeriti supernatant läbi 0.45 mm PVDF filtri (Millipore). AAV-DJ osakeste puhastamine viidi läbi HiTrap hepariini afiinsuskolonnide (GE Healthcare) abil. AAV kontsentratsiooniks kasutati Amicon ultra-15 tsentrifugaalfiltreid koos 100,000 molekulmassiga. Kontsentreeritud viirus alikvooditakse ja külmutatakse säilitamiseks temperatuuril -80 ° C. Lõplikud viiruse kontsentratsioonid olid 3 ~ 6 × 1012 iga AAV viiruse osakesi milliliitri kohta.

Stereotaxic süstimine ja optilise kiu paigutamine

Loomad tuimastati 1.6 µl Zoletili ja 0.05 µl ksülasiini (Rompun, Bayer) ühe grammi kehakaalu kohta ip süstimisega ja pandi stereotaksilisse aparaati (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Viiruste süstimiseks kasutati 31-mõõtmelise süstlanõelaga 2 µl viiruse kahepoolset infundeerimist NAc-sse 0 ° nurga all (AP +1.7; ML ± 1.3; DV −4.5) kiirusega 0.1 ul / min. Nõel jäeti pärast süstimist 10 minutiks paigale, enne kui see aeglaselt välja tõmmati. Implanteeritav kiudoptiline kanüül koosnes tsirkooniumoksiidist korgist (läbimõõt 1.25 mm ja pikkus 4.5 mm) ja optilise kiu lamedast otsast (läbimõõt 200 um). Kiudoptilise kanüüli implanteerimine NAc-sse D2-MSN-de valgustamiseks viidi läbi kohe pärast viiruste süstimist. Kiudoptilise kanüüli implantatsiooni koordinaadid olid NAc suunamiseks 0 ° nurk (AP +1.7; ML ± 1.35; DV −4.2). Optilise kiu ankurdamiseks ankurdati kiudoptilise kanüüli implanteerimiskoha taha kolju kaks kruvi. Kiudoptilise kanüüli kinnitamiseks koljule paigaldati kanüüli põhja ümber kolju pinnale C&B Superbond (Sun Medical). Kui C&B Superbond oli tahkestunud, vabastati kanüül hoidikust ja hambatsement (Poly-F, Dentsply) pandi kanüüli ja kruvide ümber. Kanüülimiskoha ümbruse sisselõike sulgemiseks kasutati Vetbondi koeliimi (3 M, 7003449). Pärast implanteerimist manustati hiirtele 5 päeva järjest subkutaanset antibiootikumide (enrofloksatsiin, 12 mg / kg, q 5 h) ja analgeesia (Carprofen, 24 mg / kg, q 3 h) süstimist.

In vivo fotostimulatsioon

200 µm plaastrijuhe ühendati krooniliselt implanteeritava optilise kiu välise osaga, kasutades hülsi. Optilised kiud kinnitati FC / PC adapteri kaudu sinise laserdioodiga (473 nm, MBL-III 473-150 mW) ja valgusimpulsse genereeriti stimulaatori (BNC 575) kaudu. ChR2-i ekspresseerivate neuronite fotostimuleerimiseks oli stimulatsiooni paradigma 20 Hz sagedus, 5 ms impulsi kestus ja 2 – 5 mW kerge võimsusega. Paigalduskaabli kiirgusvõimsust mõõdeti võimsusmõõturi (PM100D) abil S121C valgusanduriga.

Käitumise analüüs

Käitumiskatsed viidi läbi isastel D2-Cre hiirtel 11 – 13 nädala vanustel, välja arvatud hiired, kellele tehti elektrofüsioloogiline analüüs, mis olid 5 – 6 nädala vanused. Vanusepõhiseid D2-Cre ja Cre-negatiivseid kontrollhiiri süstiti viirusega ja hoiti individuaalselt ning neil lubati akumuleeruda puuriga kuni käitumusliku testini. Iga manipuleerimise korral viidi hiired üle eksperimentaalsesse ruumi 60 min enne katse algust, et võimaldada harjumust ja vähendada stressi (eksperimentaalse ruumi heledus oli 70 lux). Iga katseseade puhastati eksperimentide vahel 70% etanooliga, et eemaldada võimalikud lõhnatõendid.

Kokaiini sensibiliseerimine

Kokaiini sensibiliseerimise alustamiseks harjutati hiiri 3i järjestikuste päevade jooksul soolalahusega (ip) ja süstiti seejärel soolalahusega või kokaiiniga (15 mg kg).-1, ip) 5i järjestikuste päevade puhul. Hiirtele süstiti intraperitoneaalselt (ip) kas kokaiinvesinikkloriidiga (Johnson Mattney, Edinburgh, UK), mis oli lahustatud soolalahuses (0.9% NaCl) või füsioloogilises lahuses 30 G nõelaga. Vahetult pärast iga süstimist testiti hiiri horisontaalse lokomotoorse aktiivsuse suhtes 30 min. Fotostimulatsiooni mõju mõõtmiseks sensibiliseerimise algusele ja ekspressioonile (joonis fig. \ T (Joonis 1). \ T​​​5), 5) anti hiirtele kahekordne valgustus kahepoolse fiiberoptilise plaastri juhtme abil neljale 3-minutile perioodi jooksul, mis toimusid kodus puurides. Hiire kolju peal asuva kiudoptilise kanüüli paelad eemaldati ja hiirtele anti vähemalt 30 min. Seejärel süstiti hiirtele kas kokaiini või soolalahust (coc 10d-coc 1d). Pärast sensibiliseerimise algust eemaldati kokaiin 5i päeva jooksul ilma soolalahuse süstimata. Selle taganemisperioodi jooksul fotostimulatsiooni ei rakendatud. Seejärel määrati kokaiini suhtes käitumusliku sensibiliseerimise ekspressioon ravimi annuse (14 mg kg) süstimise teel.-1, ip) pärast NAc fotostimuleerimist, nagu on kujutatud joonisel fig Joonis 5A.5A. Et mõõta fotostimulatsiooni mõju kokaiini väljaviimise ajal (joonis 1). \ T (Joonis6), 6), allutati hiirtele sama protokolli sensibiliseerimiseks, nagu on kirjeldatud eespool (joonis fig. \ t Joonis 5) 5), välja arvatud fotostimulatsioon. Pärast kokaiini sensibiliseerimise alustamist rakendati 1-i kogu päevas 14-i päevas fotosimulatsiooni iga päev 14 h jooksul. Pärast 10i eemaldamise päeva süstiti kõikidele hiirte rühmadele kokaiini doosi (XNUMX mg kg-1).

Joonis 1 

Keskmise spinni neuronite selektiivne fotostimulatsioon tuumaklundides. (A) ChR2i selektiivne ekspressioon NAc D2R neuronites AAV-DIO-ChR2-EYFP viirusvektorite kohaletoimetamisega. skaalavardad: taustadiagramm, 1 mm: sisend, 200 µm. (B) Konfokaalsed pildid ...
Joonis 2 

D2RCre-MSN-de fotostimuleerimine juhib kohalikke inhibeerivaid ahelaid. (A) Elus NAc viilu konfokaalne pilt, mis näitab värviga täidetud neuroni, mis ei avalda ChR2i ja naaberrakku (noolepea), mis väljendasid ChR2i ja mida saab fotostimuleerida. (B) IPSC ...
Joonis 3 

NAc rakkude omadused. (A) Alexa 594iga täidetud neuronite kahe fotoni fluorestsentsi pilt. (A1) näitab neuronit ChR2 + / AP grupist, samas (A3) näitab neuroni ChR2− / IPSC grupist. (A2) ja (A4) on suure suurendusega pildid ...
Joonis 4 

D2-MSN-i in vivo optogeneetilise aktivatsiooni mõju NAc-le põhilise liikumisaktiivsuse suhtes. (A) NAC-sse AAV-DIO-ChR2-EYFP-ga süstitud D2 Cre hiirte sagittaalne vaade, millele järgnes fiiberoptilise kanüüli kahepoolne implanteerimine. 473 nm sinine valgus stimulatsioon ...
Joonis 5 

D2-MSN-i aktiveerimise mõju kokaiini suhtes sensibiliseerimisel. (A) Eksperimentaalne skeem D2-MSN-de fotostimuleerimiseks kokaiini suhtes sensibiliseerimise alguse ja ekspressiooni ajal. Sinine valgus (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) tarniti neljale ...
Joonis 6 

D2-MSN-i aktiveerimise mõju korduva kokaiiniga kokkupuute ajal. (A) Eksperimentaalne skeem D2-MSN-de fotostimuleerimiseks kokaiini kasutamisel. Sinine valgus (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) tarniti kaheksaks 3-minutiks ...

Immunofluorestsents ja konfokaalne lasermikroskoopia

Immunofluorestsentsi korral anesteseeriti hiired Zoletil'iga (Virbac, 1.6 µl / g, intraperitoneaalselt) ja 0.05 µl / g Rompun'iga (Bayer) ja perfundeeriti filtriga steriliseeritud 0.1 M PBS-ga, seejärel fikseeriti 4% paraformaldehüüd / PBS lahusega (Sigma). Seejärel eemaldati aju ja fikseeriti pärast 4 h-le jääkülma fiksaatoriga nagu eespool. Aju dehüdreeriti seejärel 30% sahharoos / 0.1 M PBS-is 2-päeva jooksul. Ajusid külmutati ja valmistati krüostaadile (Leica CM 40, Saksamaa) 1900-µm paksused järjestikused koronaalsed sektsioonid. Sektsioonid (40 µm) blokeeriti 1 h jaoks 0.1 M PBS-is, mis sisaldas 5% normaalset kitse seerumit ja 0.2% Triton X-100 ja inkubeeriti küüliku polüklonaalse D2R-iga (1: 500, Millipore, AB5084P) 4 ° C juures öö läbi. Pärast pesemist PBS-iga, mis sisaldas 0.2% Triton X-100-i, inkubeeriti proove 1 h juures toatemperatuuril Alexa Fluor 568 kitse anti-küüliku IgG-ga (1: 500; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ja 0.2 µl / ml 4, 6-diamidino-2-fenüülindool-HCI (DAPI; Sigma, St. Louis, MO, USA) PBS-is, mis sisaldab 1% normaalset kitse seerumit ja 0.2% Triton X-100. Negatiivse kontrollina inkubeeriti proove ainult DAPI ja sekundaarse antikehaga. Sektsioone uuriti C1 Plan Apo × 40 / 1.4 veekonfokaalses laserskaneerimissüsteemis (LSM 700, Zeiss, Berliin, Saksamaa).

Elektrofüsioloogia ja fotostimulatsioon tuumaklundide viiludes

ChR4-EYFP optimaalse ekspressiooni saavutamiseks kasutati hiiri katsete jaoks 2 nädalat pärast viiruse süstimist. Seejärel tuimastati hiired ja dekapiteeriti ägeda aju viilude valmistamiseks. Aju eemaldati kiiresti ja paigutati kohe jääkülma lõikamislahusesse, mis sisaldas (mM) 250-i sahharoosi, 26 NaHCO-d.3, 10 D-glükoos, 3 Myo-inositool, 2.5 KCl, 2 Na-püruvaat, 1.25 NaH2PO4, 0.5 askorbiinhape, 1 künureenhape ja 7 MgCl2 mis mullitati 95% O-ga2/ 5% CO2 (pH = 7.4). NAc-d sisaldavad koronaalsed aju viilud (paksus 250 µm) valmistati vibratomeeriga (Leica VT 1200 S) ja inkubeeriti seejärel gaasistatud kunstliku tserebrospinaalvedelikuga (ACSF), mis sisaldas (mM): 11 D-glükoosi, 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO42.5 KCl, 1.25 MgCl2 ja 2.5 CaCl2 34 ° C juures 1 h enne salvestamist. Seejärel viidi viilud üle sukelduva salvestuskambrisse, milles O2küllastunud ACSF-i lahust pidevalt superfuseeriti. NAc ja VTA rakud visualiseeriti 2-fotonmikroskoobiga (Olympus FV1000 MPE, Tokyo, Jaapan), mis oli varustatud 25Xi veekümblusobjektiivi ja infrapuna DIC-optikaga. Kogu raku plaastrite salvestused saadi NAc rakkudest Multiclamp 700B võimendi ja Digidata 1440A digisaatoriga (Molecular Devices, LLC). Andmeid analüüsiti pCLAMP 10.2 tarkvara abil ja analüüsiti edasi, kasutades Clampfit 10.2 tarkvara (Molecular Devices, LLC). 3 – 5 MΩ vaheline vastupanuvõimelised elektroodid täideti sisemise lahusega, mis sisaldas (mM): 130 K-glükonaati, 2 NaCl, 2 MgCl2, 20 HEPES, 4 Na2ATP, 0.4 Na3GTP, 0.5 EGTA ja 10 Na2- fosfokreatiin, mille pH reguleeriti 7.3 N KOH abil väärtusele 1. Bicuculline (10 uM) kanti vannis aju viilule, et blokeerida GABA retseptorid katsete alamhulkades.

Chr2-EYFP-d ekspresseerivad NAc-rakud valgustati LED-valgusallikaga (460 ± 27 nm, UHP-Mic-LED-460, Prizmatix). LED-i sinine valgus filtreeriti edasi ja nõrgendati ergastusfiltriga (470 – 495 nm) varustatud filtrikuutusega; vilgub valgus (10 ms kestus, 0.0366 – 0.354 mW / mm2) anti 25X-i objektiivi kaudu 5-40 Hz sagedustele. Eksperimentide alamhulgas mõõdeti Chr2-i ekspresseerivates rakkudes fotovoolusid vastuseks 2-i kestuse valgusele.

Statistiline analüüs

Andmed esitatakse keskmisega ± sem ja neid analüüsiti kaheosalise üliõpilase abil t-test või kahesuunalise variatsioonianalüüsiga, millele järgneb Bonferroni post hoc test. A Pväärtust <0.05 peeti statistiliselt oluliseks.

Tulemused

Keskmise spinni neuronite selektiivne fotostimulatsioon tuumaklundides

NAc D2R-MSN-de rolli määramiseks kokaiini vahendatud sõltuvust tekitavates käitumistes kasutasime NAc D2R neuronite stimuleerimiseks optogeneetilist lähenemist. D2R-MSN-de aktiivsuse selektiivseks reguleerimiseks NAc-s valgust kasutades süstiti AAV-DIO-ChR2-EYFP-d kodeerivaid viirusvektoreid D2R-Cre BAC transgeensete hiirte NAc-sse. 4 nädalat pärast viiruse süstimist täheldati NAc-s ChR2-EYFP tugevat ekspressiooni (joonis fig. (Joonis1A) .1A). ChR2 ekspressiooni spetsiifilisus D2R-MSN-des kinnitati immunofluorestsentsi konfokaalse analüüsiga: YFP-märgistatud ChR2 ekspressioon lokaliseeriti koos D2R-ga NAc-s (joonis fig. (Joonis1B), 1B), mis näitab, et ChR2 ekspresseeriti D2R-i ekspresseerivates neuronites NAc-s.

Kuigi sellist lähenemist on kasutatud teistes uuringutes (nt Lobo et al., 2010) on viiruse süstimise protseduuride üksikasjad laboris erinevad, mistõttu on oluline dokumenteerida optogeneetiline kontroll meie spetsiifilistes katsetingimustes. Me hindasime ChR2i funktsionaalset ekspressiooni, tehes kogu rakkude plaastrite salvestused MSN-idest NAc viiludesse. MSN-id identifitseeriti: (1) suhteliselt hüperpolariseeritud puhke membraanipotentsiaal (RMP), mis on tavaliselt negatiivsem kui -80 mV; (2) AP põletamise tavaline muster vastuseks rakendatud vooluimpulssidele; (3) pikk latentsus esimese AP põlemisel vooluimpulsi ajal; (4) hüperpolarisatsiooni poolt põhjustatud pinge “sag” puudumine hüperpolarisatsiooni aktiveeritud katioonvoolu poolt (Ih); ja (5) suhteliselt väikesed nende rakkude kehad (Chang ja Kitai, 1985; O'Donnell ja Grace, 1993; Le Moine ja Bloch, 1996; Taverna et al., 2008). Sinine valgus (470 nm) rakendati kogu vaateväli (0.78 mm)2) samal ajal, kui MSN-id pinget kinnitavad -69 mV hoidmispotentsiaaliga. Mõned MSN-id väljendasid ChR2-i, mis ilmnesid YFP fluorestsentsina oma somates (nooled joonistel 1C1, C3). Sellised neuronid näitasid olulisi fotovoolusid, heledamad valguse stiimulid, mis kutsusid esile suuremaid fotovoolu (joonis (Joonis1D) .1D). Suhted valguse maksimaalse amplituudi ja valguse intensiivsuse vahel (joonis 1). \ T (Joonis1E) 1E) 0.054 ± 0.0023 mW / mm poole maksimaalne valgustundlikkus2 ja 1.16i maksimaalne maksimaalne amplituud ± 0.16 nA (keskmine ± sem, n =

Praeguste klambrite tingimustes, mis väljendavad ChR2-i väljuvaid AP-sid, reageerivad nad valgusimpulsside rongidele usaldusväärselt (10 ms kestus; Joonis 1F) .1F). Nendel tingimustel on valgustugevus suurem kui 0.1 mW / mm2 olid piisavad AP-de tekitamiseks (joonis 1) (Joonis1G, 1G, n = 5). AP-sid esilekutsuti usaldusväärselt fotostimulatsiooni sagedustel kuni 20 Hz-ni, samas kui 40 Hz-s valgusindutseeritud vastused summeerisid, et tekitada püsiv depolarisatsioon, mis oli AP-de äratundmisel vähem efektiivne (joonised 1F, G).

D2R-MSN-de fotostimuleerimine juhib kohalikke inhibeerivaid ahelaid

Et uurida D2R-MSN-i aktiivsuse tagajärgi NAc kohalikele ahelatele, fotostimuleerime Chr2i ekspresseeriva presünaptilise MSN-i, mõõtes samal ajal postsünaptilisi vastuseid ChR2-negatiivsetes MSN-des (joonis (Joonis2A) .2A). Joonisel fig Joonis2A2A ei ekspresseeri ChR2-i, nagu näitab EYFP fluorestsentsi puudumine, samuti lühikese latentsusega fotovoolude puudumine, nagu on näidatud joonisel fig. Joonis1D.1D. Ent kui postünaptilisi MSN-e hoiti kui -69 mV potentsiaali, vilgub 10 ms kestvusvalgus pärast 9.0 ± 0.42 ms latentsust tekitatud väljapoole suunatud voolu (joonis (Joonis2B, 2B, n = 15). Nende vastuste laadi määramiseks varieerus postinaptiline membraanipotentsiaal −99 mV –39 mV, kui kasutati valgustugevust (joonis fig. (Joonis2C) .2C). Valgusega indutseeritud vastused varieerusid membraanipotentsiaaliga (joonis (Joonis2D, 2D, n = 6) ja pöörates nende polaarsuse −81 ± 3.4 mV ümber. Arvestades, et kloriidi ioonide tasakaalupotentsiaal on -80 mV meie ioonsetes tingimustes, võivad valguse poolt põhjustatud välised voolud olla tingitud postsünaptilise GABA poolt vahendatud kloriidi voolust.A retseptorid. Selle võimaluse testimiseks GABAA välisele lahusele lisati retseptori antagonisti bitsukulliin (10 uM). See ravim blokeeris täielikult valgust põhjustatud reaktsioonid (joonis fig (Joonis2B), 2B), kinnitades, et valgusindutseeritud vastused olid GABAergilised inhibeerivad postünaptilised voolud (IPSC).

Nende vastuste põhjal fotostimulatsioonile võib MSN-d, mida me salvestasime, klassifitseerida üheks 4-rühmast: (1) rakud, mis ekspresseerivad vastusena fotostimulatsioonile (ChR2 + / AP) piisava hulga ChR2-i tulekahju AP-deks, mis olid eespool kirjeldatud; (2) rakud, mis ekspresseerivad väikest kogust ChR2-i, mis näitasid vastuseks valgusele alamlävi depolarisatsiooni (ChR2 + / No AP); (3) vaiksed rakud, millel polnud ChR2i ekspressiooni, kuid said valgust indutseeritud IPSC-sid Chr2-i ekspresseerivatest presünaptilistest MSN-dest (ChR2− / IPSC); ja (4) ChR2-negatiivsed rakud, millel ei olnud IPSC-sid vastuseks teiste MSN-de fotostimuleerimisele (ChR2− / No IPSC). Kõigi nende kategooriate rakkude suhteline osakaal on näidatud joonisel fig Joonis2E2E (n = 53). Üldiselt väljendas peaaegu pool rakkudest (45.3%) ChR2i (rühmade (1) ja (2) summa). Ükski meie salvestatud MSN-idest ei vastanud fotostimulatsioonile nii fotovoolu kui ka IPSC-dega; see näitab, et D2R-positiivsed MSN-id ei innerveeri teisi sama rakupopulatsiooni liikmeid NAc-s.

See valgusallikate klassifikatsioon näitab, et ChR2 + / No AP rakkude (rühm 2) ja ChR2− / No IPSC rakkude (rühm 4) fotostimulatsioon ei genereeri elektrilisi signaale, mis võiksid kaasa aidata ahela aktiivsusele. Seega, et määratleda fotostimulatsiooni mõju ahela funktsioonile, iseloomustasime üksikasjalikult ChR2 + / AP MSN-ide (grupp 1) omadusi, mis genereerivad AP-d, kui NAc on fotostimuleeritud, ja ChR2− / IPSC rakud (rühm 3), mis on postünaptilised ChR2 + / AP MSN-idele, sest nad saavad valgust indutseeritud IPSC-sid. Chr2 + / AP ja ChR2− / IPSC rakud NAc-s olid mõlemad identifitseeritud spiny-neuronitena (joonis fig. (Joonis3A) .3A). Nende kahe rühma neuronite morfoloogilistes või elektrofüsioloogilistes omadustes olulisi erinevusi ei esinenud. Näiteks nende kahe rühma neuronite suurus oli sama suur (joonis fig. \ T (Joonis3B) .3B). Lisaks on nende RMP-d (-83.0 ± 1.7 vs. -85.0 ± 1.8 mV; keskmine ± sem; n = 10, joonis Joonis 3C) 3C) ja sisendresistentsid (113 ± 15 vs 133 ± 13 MΩ, n = 6, joonis Joonis 3D) 3D) ei olnud ka erinevad (p > 0.05 kahe sabaga üliõpilase oma t-test), samas kui nende AP süütamismustrid vastuseks vooluimpulssidele (joonised 3E, F) olid sarnased (p > 0.05 kahe sabaga üliõpilase oma t-test, n = 6). Kokkuvõtteks võib öelda, et D2R-MSN-de fotostimuleerimine NAc-s aktiveerib kohalikke inhibeerivaid ahelaid, millel on postsünaptilised neuronid, mis on D2R-MSN-iga väga sarnased, kuid ei avalda D2R-i.

NAc D2R-MSN-i optogeneetiline stimuleerimine kokaiini poolt põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise korral

Järgnevalt uurisime käitumise tagajärgi in vivo NAc D2R-MSNide fotostimuleerimine. Kuna D2R-MSN-i fotostimulatsioon dorsaalses striatumis vähendab liikuvust (Kravitz et al., 2010), alustasime iseloomustades akumuleeruvate D2R-MSN aktiveerimise mõju basaalse lokomotoorse aktiivsuse suhtes. Selleks süstiti D2R-Cre hiiri kahepoolselt DIO-AAV-ChR2-EYFP viirusega NAc-sse (D2-Cre (+) NAc-ChR2). D2R-MSN-d fotostimuleeriti seejärel sinise valgusega (473 nm, 5 ms impulsi kestus, 20 Hz), mis saadeti NAc-le läbi optilise kiud. Fotostimuleid rakendati nelja 3-min-kestusega perioodi jooksul 50 min-seansi ajal, kui hiiri hoiti liikumisaktiivsuse salvestuskambris (joonis fig. (Joonis4A) .4A). Paralleelselt süstiti mitte-Cre WT-ga pesakonna hiirtele sarnaselt viirusega ja said sarnast sinise valguse valgustust. D2-Cre (+) NAc-ChR2 hiirtel oli võrreldav või veidi kõrgenenud põhilise liikumisaktiivsuse tase võrreldes kontrolliga D2R-Cre (-) NAc-ChR2 hiirtega (joonised 4B, C). D2R-MSN-de fotostimuleerimine D2-Cre (+) NAc-ChR2 hiirtel põhjustas olulise vähenemise liikumisaktiivsuses, mis taastus pärast valguse stimuleerimise peatamist (joonis fig. (Joonis4B) .4B). Selliseid toimeid ei täheldatud kontrolli D2R-Cre (-) NAc-ChR2 hiirtel (joonised 4B, C), mis näitab, et fotostimulatsiooni mõju on põhjustatud pigem ChR2i aktiveerimisest kui võimalikest mittespetsiifilistest mõjudest nagu ajukoe kuumutamine. Seetõttu näitasid meie andmed, et D2R-MSN-de fotostimulatsioon NAc-s põhjustas liikumisaktiivsuse vähenemise.

Need tulemused kinnitasid meie võimet kontrollida D2R-MSN-de aktiivsust NAc-s in vivo. Järgnevalt kasutasime seda võimet uurida D2R-MSN aktiivsuse mõju käitumuslikule sensibiliseerimisele kokaiini korduvale manustamisele. Käitumise sensibiliseerimine viitab protsessile, mis võimaldab esmast kokkupuudet psühhostimulantidega, näiteks kokaiiniga, et suurendada järgmiste ravimite ekspositsiooni võimet stimuleerida liikuvust. Seda protsessi saab lahutada initsiatsiooni- ja ekspressioonifaasiks: initsiatsioon kirjeldab otseseid neuronaalseid sündmusi, mis tekitavad käitumuslikku sensibiliseerimist (Vanderschuren ja Kalivas, 2000; Sim et al., 2013), samas kui ekspressioon on teadaolevalt käitumisplastilisuse pikaajaline vorm, mis säilib ka pärast ravimi väljavõtmist (Vanderschuren ja Kalivas, 2000; Sim et al., 2013). Seetõttu uurisime kokaiini poolt esilekutsutud käitumuslikku sensibiliseerimist kokaiini korduvate intraperitoneaalsete (ip) süstide ajal, kasutades samal ajal optogeneetikat D2R-MSN-de aktiivsuse kontrollimiseks NAc-s igas nendes faasides.

Pärast 3-i päeva füsioloogilise lahuse manustamist süstiti 15-i järjestikuste päevade jooksul hiirtele kokaiini (5 mg / kg) ja 30-i jaoks registreeriti lokomotoorne vastus iga süsti järel (joonis fig. (Joonis5A) .5A). Fotostimulid toimetati 30 min seansside ajal enne kokaiini süstimist, 3 min valgustamisperioodide vaheldumisi 5 min perioodidega, kus valgus oli välja lülitatud (joonis (Joonis5A) .5A). Arvestades, et D2R-MSN-de fotostimulatsioon NAc-s vähendab põhi-liikumisaktiivsust (joonis fig. (Joonis4), 4), toimetati fotostimulid vahetult enne kokaiini manustamist, et vältida võimalikku sekkumist käitumisreaktsioonidesse kokaiini süstimisel.

Nii kontroll D2-Cre (-) NAc-ChR2 hiirtel kui ka D2-Cre (+) NAc-ChR2 hiirtel täheldati korduvat kokaiini süstimist mõjutades märgatavalt liikumisaktiivsust (joonis fig. (Joonis5B), 5B), mis näitab sensibiliseerimise algust. D2R-MSN-de fotostimuleerimine NAc-s ei mõjutanud käitumusliku sensibiliseerimise algatamist, sest kokaiini poolt põhjustatud käitumuslik sensibiliseerimine oli sarnane D2-Cre (+) NAc-ChR2 hiirtel ja kontroll D2-Cre (-) NAc-ChR2 hiirtel.

Pärast käitumusliku sensibiliseerimise indutseerimist, kordades selliseid kokaiinisüsti (15 mg / kg) 5i päevadel, eemaldati ravim 14-päevadel ja tundlikkuse suurenemise astet uuriti hiirte väiksema doosiga (10 mg) / kg). Sensibiliseerimise ekspressioon on käitumisplastilisuse pikaajaline vorm, mis säilib ka pärast ravimi võtmist (Steketee ja Kalivas, 2011; Sim et al., 2013). D2R-MSN-de rolli uurimiseks sensibiliseerimise ekspressioonis fotostimuleeriti NAc vahetult enne kokaiini manustamist (joonis fig. (Joonis5A) 5A) ja sensibiliseerimist mõõdeti kokaiini süstimisega indutseeritud lokomotoorse aktiivsuse kogusena.

Mõlemas kokaiiniga töödeldud hiirte rühmas - D2-Cre (-) NAc-ChR2 hiired (D2-Cre (-) :: coc-coc) ja D2-Cre (+) NAc-ChR2 (D2-Cre (+): : coc-coc) - esines tundlikuks muutumine (joonis 1) (Joonis5C) .5C). Ka kokaiiniga stimuleeritud liikumisharjumuste muutumise aeg oli sarnane kahe grupi vahel (joonis 1) (Joonis5C), 5C) kahe grupi vahel ei täheldatud olulist erinevust. Kokkuvõttes näitavad need kaks fotostimulatsiooni eksperimenti, et D2R-MSN-de aktiveerimine NAc-s ei mõjuta kokaiini poolt põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise algatamist või ekspressiooni.

NAc D2R-MSN-de fotostimuleerimine ravimi võtmise ajal

Krooniline stress ravimi katkestamisel pärast korduvat kokaiini kokkupuudet põhjustab selektiivse D2R-sõltuva kohanemismehhanismi värbamise, mis kontrollib kokaiini otsimise ja taastekke käitumise stressi poolt põhjustatud suurenemist koos sünaptilise plastilisuse muutustega NAc-s (Sim et al., 2013). See näitab, et ravimite ärajätmisega seotud mehhanismid erinevad ravimitest tingitud sensibiliseerimisega seotud mehhanismidest. Seetõttu uurisime järgnevalt, kas D2R-MSN-i fotostimuleerimine NAc-s kokaiini äraviimise ajal mõjutab kokaiinist põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise ekspressiooni.

Pärast korduva kokaiini süstimist esilekutsutud käitumusliku sensibiliseerimise indutseerimist jaotati D2-Cre (-) ja D2-Cre (+) hiired 14-i päevaseks väljalülitusperioodiks kaheks rühmaks: ühele rühmale tehti iga päev sinise valguse stimulatsioon. NAc 1 h jaoks (3 min × 8 korda), samas kui teine ​​rühm ei olnud (joonis (Joonis6A) .6A). D2R-MSN-de korduv fotostimuleerimine NAc-s kokaiini ärajätmise ajal ei mõjutanud sensibiliseerimise ekspressiooni D2-Cre (-) :: coc-coc hiirtel (joonis (Joonis6B) .6B). Seevastu D2-Cre (+) :: coc-coc hiirtel nõrgendas sensibiliseerimise ekspressiooni oluliselt korduv fotostimulatsioon ravimi võtmise ajal (joonis fig. (Joonis6B), 6B), kuigi kokaiinist tingitud liikumishäire stimuleerimise aeg ei mõjutanud (joonis fig. \ t (Joonis6C) .6C). Seega vähendab NAc D2R-MSN-i fotostimulatsioon ravimi katkestamise ajal kokaiini poolt põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise ekspressiooni (kokaiin × fotostimulatsiooni interaktsioon) F(1,18) = 11.08, P = 0.0037, joonis Joonis 6B) .6B). Need andmed näitavad, et D2R-NAc MSN-de aktiveerimine ravimi katkestamise perioodil mõjutab kokaiini otsivat ja retsidiivset käitumist.

Arutelu

Märkimisväärsed tõendid näitavad, et kokaiini poolt põhjustatud käitumuslik sensibiliseerimine on seotud suurenenud dopaminergilise ülekandega mesokortikolimbilises süsteemis, mis hõlmab ventraalset tegmentaalset piirkonda, prefrontaalset ajukoort ja tuuma accumbensit (NAc). Eriti iseloomustab käitumusliku sensibiliseerimise ekspressioonifaasi püsivat ravimi hüperreaktiivsust pärast ravimi lõpetamist, mis on seotud kohanemismehhanismide kaskaadiga (Kalivas ja Duffy, 1990; Robinson ja Berridge, 1993; Kalivas et al., 1998), mis võiksid aidata kaasa narkootikumide sunniviisilisele iha (Robinson ja Berridge, 1993; Kalivas et al., 1998; Steketee ja Kalivas, 2011). On oletatud, et kokaiini indutseeritud muutused molekulaarses, rakulises ja käitumuslikus plastilisuses NAc-s, koos DA-retseptori signaaliülekandega MSN-des, võivad reguleerida ravimiga vahendatud sõltuvust käitumist (Lobo et al., 2010; Schmidt ja Pierce, 2010; Ferguson et al., 2011; Pascoli et al., 2011; Bocklisch et al., 2013; Grueter et al., 2013).

Hiljutised uuringud, mis kasutavad geneetiliselt muundatud hiiri, kes tingimata ekspresseerivad Cre rekombinaasi, on näidanud D1R-MSN-de või D2R-MSN-i rolli kokaiini sõltuvust tekitavates käitumistes. NAc D1R-MSN-i optogeneetiline aktiveerimine pärast korduvat kokaiini manustamist 6-i päeva pärast suurendab lokomotoorset aktiivsust, samal ajal kui D2R-MSN-de aktivatsioonil ei ole mingit mõju (Lobo et al., 2010). Need andmed näitavad, et korduv kokkupuude kokaiiniga suurendab NAc D1R-MSN-i väljundit. D1R-i ekspresseerivate MSN-ide inhibeerimine teetanuse toksiiniga (Hikida et al., 2010) vähendab kokaiiniga konditsioneeritud kohtade eelistust (CPP), samas ei täheldatud kokaiini CPP muutusi pärast sünaptilise ülekande kaotamist D2R-MSN-des (Hikida et al., 2010). D1R-MSN-i optogeneetiline aktiveerimine dorsaalses striatumis põhjustab püsivat tugevdamist, samas kui D2-retseptori ekspresseerivad neuronid stimuleerivad mööduvat karistust (Kravitz et al., 2012). Hiljutine uuring on samuti teatanud, et D2R-MSN-i inhibeerimine kemikogeneetilise lähenemisviisi abil suurendab kokaiini saamise motivatsiooni, samas kui D2R-MSN-i optogeneetiline aktivatsioon pärsib kokaiini eneseanalüüsi (Bock et al., 2013). Teisest küljest, Bocklisch et al. (2013) teatas, et NAc projekti D1R-MSN-d VTA-le, täpsemalt GABAergilistele neuronitele VTA-s, samas kui D2R-MSN-d ei projitseeri otse VTA-le. See ahel tähendab, et D1R-MSN-i optogeneetiline aktiveerimine inhibeerib DA-neuroneid, mis lõpuks suurendavad kokaiini poolt põhjustatud sõltuvust (Bocklisch et al., 2013).

Vaatamata nende kahe MSN-i populatsiooni näilisele lihtsale korraldusele, asjaolu, et MSN-id saavad mitu sisendit ja millel on erinevad väljundid teistest aju piirkondadest või teistest aju piirkondadest, samuti MSN-ide ja teiste interneuronite klasside vaheliste kohalike ahelate moodustamine, sellest tulenev D1R-i väljund MSN-id ja D2R-MSN-d võivad anda keerulisi ja erinevaid molekulaarseid, rakulisi ja käitumuslikke tagajärgi.

Varem on näidatud, et D2R aitab kaasa ravimi katkestamise ajal esilekutsutud sünaptilistele modifikatsioonidele ja need võimendavad retsidiivi kokaiini otsimisel, mõjutamata esialgset ravimi omandamist või ravimite otsimist (Sim et al., 2013). Meie praegused andmed näitavad, et D2R-MSN-de fotostimulatsioon NAc-s kutsub esile basaalse lokomotoorse aktiivsuse vähenemise. Lobo et al. (2010) ei tuvastanud liikumise muutust, kui kumbki MSN alatüüp aktiveeriti, kuid nad uurisid ainult täielikku lokomotoorset aktiivsust, selle asemel et uurida põhilise liikumisaktiivsuse kiiret reageerimist fotostimulatsioonile. Kravitz et al. (2010) leidis ka, et D2R-MSN-i optogeneetiline aktiveerimine dorsaalses striatumis vähendab ka liikumisaktiivsust. Seega on meie andmed esimesed, mis demonstreerivad, et NAc D2R-MSN-i fotostimulatsioon inhibeerib basaal-lokomotoorse aktiivsuse ja esimesena süstemaatiliselt uurima basaal-lokomotoorse aktiivsuse aja kulgemist nende neuronite fotostimulatsiooni ajal.

Käesolevas uuringus täheldasime, et D2R-MSN-de optogeneetiline aktiveerimine NAc-s ei mõjutanud käitumusliku sensibiliseerimise algatamist või ekspressiooni. D2R-MSN-de fotostimulatsioon ravimi katkestamise ajal põhjustas kokaiini poolt põhjustatud sensibiliseerimise ekspressiooni. Seetõttu näitavad meie andmed, et D2R-MSN-id värbavad teatud signaali spetsiaalselt ärajäämisperioodi jooksul, mis muudab geeniekspressiooni või teisi signaaliülekande vorme ja põhjustab seeläbi sünaptilise plastilisuse muutusi, mis põhjustab kokaiinist põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise muutusi. Ei ole teada, kuidas need MSN-id kasutavad rakutüüpi spetsiifilisi kohandusi, mis võivad tekitada sõltuvusega seotud käitumises nende erinevad tagajärjed. Grueter et al. (2013) soovitas, et NAc-s diferentseerib ΔFosB diferentseeritult sünaptilisi omadusi ja tasust sõltuvat käitumist rakutüübi ja allpiirkonnaga seotud moel. Hiljuti Chandra et al. (2013) teatas, et D2R-MSN-de korduv ChR1-i aktivatsioon, kuid mitte D2R-MSN, põhjustas Tiam1-i geeni, valgu, mis osales aktin tsütoskeleti ümberkorraldamises, allakäigu, sarnaselt kokaiini toimega. Seega, et mõista mehhanisme, mis annavad ravimile põhjustatud käitumise püsivat mõju, on oluline piiritleda rakkude selektiivset molekulaarsete sündmuste indutseerimist nendes MSN-des, mis kontrollivad sünaptilist kohanemist korduva ravimi ekspositsiooniga.

Seoses korduva ravimi ekspositsiooniga on soovitatav, et võõrutus on oluline roll, sest mõned muutused ilmnevad alles mõne nädala jooksul pärast kokaiini lõplikku kokkupuudet. See viitab sellele, et abstinensus on plastiilsuse arengu oluline vahendaja (Robinson ja Berridge, 2003; Boudreau ja Wolf 2005; Boudreau et al., 2007; Kourrich et al., 2007). Need tähelepanekud tõstavad esile võimaluse, et loobumine ise võib olla põhjuseks muutustele NAc-s, mis on D2R-sõltuva signaalimise kontrolli all. Meie tulemus, mis näitab, et D2R-MSN-de aktiveerimine NAc-s ravimi ärajätmise ajal mõjutab kokaiini poolt põhjustatud käitumuslikku sensibiliseerimist, annab sellele ideele tugeva toetuse.

Varem on näidatud, et korduv kokkupuude stressiga ravimi katkestamise ajal pärsib kokaiini poolt põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise ekspressiooni, samuti kokaiini otsivad ja retsidiivsed käitumised D2R KO hiirtel (Sim et al., 2013). Seetõttu on huvitav, et D2R-MSN-i fotostimulatsioon ravimi katkestamise ajal nõrgendab ka sensibiliseerimise ekspressiooni. D2R KO hiirte NAc-s muudetakse strutseeritud sünaptilist plastilisust glutamategilise sünapsi korral (Sim et al., 2013). Kuigi ei ole veel teada, kas D2R MSN-de fotostimulatsioon või krooniline stress tühistamisperioodi jooksul tekitab sarnaseid muutusi sünaptilises plastilisuses, toetavad meie praegused leiud hüpoteesi, et NAc D2R-MSN-idel on võtmetähtsus võõrutusest tingitud plastilisuses ja võib aidata kaasa pärast uimastite kuritarvitamise lõpetamist. Edasine uurimine on vajalik selleks, et välja selgitada funktsionaalsed närvipiirkonnad, milles D2R MSN-id osalevad ravimi võtmise ajal, ning analüüsida ja võrrelda D2R-MSN-i fotostimulatsiooni ja kroonilise stressi tagajärgi sünaptilisele plastilisusele selles konkreetses ahelas.

Teine võimalik D2R-i ekspresseerivate MSN-i roll võiks olla DcNUMXR-MSN-de väljundi pärssimine NAc-lt. Varasemad uuringud näitavad, et kuigi MSN-id projekteerivad pikki aksoneid kaugemate sihtmärkide suunas, esineb aksoni tagatiste ja külgnevate nihkeprojektsioon neuronite dendriitpuude vahel ulatuslikku kattumist (Grofová, 1975; Preston et al., 1980; Wilson ja Groves, 1980). See võib viidata MSN-i võimalikule kohalikule sünaptilisele ühendusele NAc-s. Intratsellulaarsed salvestused närviprojektsiooni neuronite paaridest on tuvastanud funktsionaalsed inhibeerivad ühendused roti striatumi MSN-de vahel (Czubayko ja Plenz, 2002; Tunstall et al., 2002; Koos et al., 2004; Gustafson et al., 2006). Samuti on teatatud, et struktuumis MSN-de korduvate tagatiste aksonite poolt moodustatud sünapsid ei ole juhuslikud, D2R-MSN-d teevad nii teiste D2R-MSN-idega kui ka D1R-MSN-iga sünaptilisi ühendusi, samas kui D1R-MSN-id moodustavad peaaegu eranditult sünaptilised ühendused teiste D1R-MSNs (Taverna et al., 2008). Kuigi on teatatud ka GABAergilisest sidumisest kohalike korduvate aksonaalsete kollageenide vahel, mis esinevad akumulaarsete MSN-de vahel (Taverna et al., 2004) ei ole veel selge, kas D2R-MSN-id moodustavad juhuslikult kohalikke mikroskeeme või soodustavad NA-s mikroskeeme eelistatud ühendusega, nagu nad teevad striatumis. Meie andmed näitavad, et D2R-MSN-d, mis ekspresseerivad Chr2-i ekspresseerivas NAc-s, teevad sünaptilisi sidemeid naaberlike MSN-dega, mis ekspresseerivad D1R-i, ja et D2R-MSN-d avaldavad D1-MSN-dele inhibeerivat kontakti, et moduleerida D1R-vahendatud sõltuvustavade edendamist.

Kokkuvõttes oleme näidanud, et NAc D2R-MSN-i optogeneetiline aktiveerimine muudab kokaiinisõltuvuse ajal esilekutsutud plastilisust. Arvestades, et D2R-sõltuva signaaliülekande aktiivsus väljamakseperioodi jooksul näib olevat kokaiinist põhjustatud käitumusliku sensibiliseerimise väljendamise peamine regulaator, pakume, et D2R-MSN-d on oluline vahend pikaajalise kohanemise jaoks ravimite otsimise ja retsidiivi korral. D2R-sõltuva signaalimise molekulaarsete substraatide identifitseerimine koos korduva ravimi ekspositsioonil kasutatava NAc D2R-MSN-i spetsiifilise ahela identifitseerimisega peaks andma uusi raviotstarbelise sekkumise sihtmärke ravimi retsidiivis.

Huvide konflikti avaldus

Autorid kinnitavad, et uuring viidi läbi ilma kaubandus- või finantssuhete puudumisel, mida võiks tõlgendada võimaliku huvide konfliktina.

Tunnustused

Seda tööd toetas Korea Riiklik Teadusfond (NRF), mida rahastas Teadusministeerium, IKT ja tuleviku planeerimine ajuuuringute programmi abil (Ja-Hyun Baikile, Grant No 2013M3C7A1056101) ja Bio- ja meditsiinitehnoloogiale. Teadusministeeriumi, info- ja sidetehnoloogia ning tuleviku planeerimise rahastatud Korea Rahvusliku Teadusfondi (NRF) arendusprogramm (Ja-Hyun Baikile, Grant No 2013M3A9D5072550) ja Maailma Klassi Instituudi (WCI) programmile (NRF) (George J. Augustinele) WCI 2009-003), samuti Korea Ülikooli stipendium (Ja-Hyun Baikile) ja CRP stipendium Singapuri Rahvuslikust Teadusfondist (George J. Augustinele).

viited

  1. Baik JH (2013). Dopamiini signaalimine tasust sõltuvates käitumistes. Ees. Neuronahelad 7: 152 10.3389 / fncir.2013.00152 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  2. Baik JH, Picetti R., Saiardi A., Thiriet G., Dierich A., Depaulis A., et al. (1995). Parkinsoni-taolised lokomotoorsed kahjustused hiirtel, kellel puuduvad dopamiini D2 retseptorid. Loodus 377, 424 – 428 10.1038 / 377424a0 [PubMed] [Cross Ref]
  3. Berridge KC (2007). Arutelu dopamiini rolli üle tasus: stiimulite tähtsus. Psühhofarmakoloogia (Berl) 191, 391 – 431 10.1007 / s00213-006-0578-x [PubMed] [Cross Ref]
  4. Bock R., Shin JH, Kaplan AR, Dobi A., Markey E., Kramer PF jt. (2013). Kaudse kaudse raja tugevdamine soodustab vastupidavust kompulsiivsele kokaiinitarbimisele. Nat. Neurosci. 16, 632 – 638 10.1038 / nn.3369 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  5. Bocklisch C., Pascoli V., Wong JC, House DR, Yvon C., de Roo M., et al. (2013). Kokaiin inhibeerib dopamiini neuroneid, suurendades GABA ülekannet ventral tegmentaalses piirkonnas. Teadus 341, 1521 – 1525 10.1126 / science.1237059 [PubMed] [Cross Ref]
  6. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M., Wolf ME (2007). Rakupinna AMPA retseptorid suurenevad rottide tuumas accumbensis kokaiini ärajätmise ajal, kuid pärast kokaiiniprobleemi sisestamist, mis on seotud mitogeeni aktiveeritud proteiinkinaaside aktiveerumisega. J. Neurosci. 27, 10621 – 10635 10.1523 / jneurosci.2163-07.2007 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  7. Boudreau AC, Wolf ME (2005). Kokaiiniga seotud käitumuslik sensibiliseerimine on seotud suurenenud AMPA retseptori pinna ekspressiooniga tuuma accumbensis. J. Neurosci. 25, 9144 – 9151 10.1523 / jneurosci.2252-05.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  8. Chandra R., Lenz JD, Gancarz AM, Chaudhury D., Schroeder GL, Han MH, et al. (2013). D1R-i sisaldavate tuumavastaste neuronite optogeneetiline inhibeerimine muudab kokaiini vahendatud Tiam1-i reguleerimist. Ees. Mol. Neurosci. 6: 13 10.3389 / fnmol.2013.00013 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  9. Chang HT, Kitai ST (1985). Tuumade akumuleeruvad neuronid: intratsellulaarne märgistusuuring. Brain Res. 347, 112 – 116 10.1016 / 0006-8993 (85) 90894-7 [PubMed] [Cross Ref]
  10. Chausmer AL, Elmer GI, Rubinstein M., Low MJ, Grandy DK, Katz JL (2002). Kokaiini põhjustatud liikumisaktiivsus ja kokaiini diskrimineerimine dopamiini D2 retseptori mutanthiirtel. Psühhofarmakoloogia (Berl) 163, 54 – 61 10.1007 / s00213-002-1142-y [PubMed] [Cross Ref]
  11. Chevalier G., Deniau JM (1990). Inhibeerimine kui põhiprotsess striaagi funktsioonide avaldamisel. Trends Neurosci. 13, 277 – 280 10.1016 / 0166-2236 (90) 90109-n [PubMed] [Cross Ref]
  12. Czubayko U., Plenz D. (2002). Kiire sünaptiline ülekanne striaalsete nimmeprojektsioon neuronite vahel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 15764 – 15769 10.1073 / pnas.242428599 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  13. Ferguson SM, Eskenazi D., Ishikawa M., Wanat MJ, Phillips PE, Dong Y., et al. (2011). Transientne neuronaalne inhibeerimine näitab kaudse ja otsese tundlikkuse vastandlikke rolle. Nat. Neurosci. 14, 22 – 24 10.1038 / nn.2703 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  14. Goto Y., Grace AA (2005). Nukleiinse ja kortikaalse aju dopamiinergiline moduleerimine sihtmärkidega käitumises. Nat. Neurosci. 8, 805 – 812 10.1038 / nn1471 [PubMed] [Cross Ref]
  15. Grofová I. (1975). Materiaalse nigra suhtes väljaulatuvate striaalsete ja pallidaalsete neuronite identifitseerimine. Eksperimentaalne uuring mädarõika peroksidaasi retrograafilise aksonaalse transpordi abil. Brain Res. 91, 286 – 291 10.1016 / 0006-8993 (75) 90550-8 [PubMed] [Cross Ref]
  16. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC (2013). ΔFosB moduleerib diferentseeritult otsese ja kaudse tee funktsiooni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 1923 – 1928 10.1073 / pnas.1221742110 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  17. Gustafson N., Gireesh-Dharmaraj E., Czubayko U., Blackwell KT, Plenz D. (2006). Tagasiside ja etteantud sünaptilise ülekande võrdlev pinge ja voolu-klambri analüüs striatuse mikroprotsessis in vitro. J. Neurophysiol. 95, 737 – 752 10.1152 / jn.00802.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  18. Hikida T., Kimura K., Wada N., Funabiki K., Nakanishi S. (2010). Sünaptilise edastamise erilised rollid otseses ja kaudses striaalses tees tasu ja aversiivseks käitumiseks. Neuron 66, 896 – 907 10.1016 / j.neuron.2010.05.011 [PubMed] [Cross Ref]
  19. Kalivas PW, Duffy P. (1990). Ägeda ja igapäevase kokaiiniravi mõju ekstratsellulaarsele dopamiinile tuumaklundis. Synapse 5, 48 – 58 10.1002 / syn.890050104 [PubMed] [Cross Ref]
  20. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J., Sorg BA (1998). Kokaiinisõltuvuse iha ja relapsi sensibiliseerimise roll. J. Psychopharmacol. 12, 49 – 53 10.1177 / 026988119801200107 [PubMed] [Cross Ref]
  21. Koos T., Tepper JM, Wilson CJ (2004). Neopraatias asuvate näriliste ja kiirete neuronite poolt tekitatud IPSC-de võrdlus. J. Neurosci. 24, 7916 – 7922 10.1523 / jneurosci.2163-04.2004 [PubMed] [Cross Ref]
  22. Kourrich S., Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ (2007). Kokaiini kogemus kontrollib kahesuunalist sünaptilist plastilisust tuuma accumbensis. J. Neurosci. 27, 7921 – 7928 10.1523 / jneurosci.1859-07.2007 [PubMed] [Cross Ref]
  23. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K., Thwin MT, Deisseroth K., et al. (2010). Parkinsoni mootori käitumise reguleerimine basaalganglioni ahelate optogeneetilise juhtimise abil. Loodus 466, 622 – 626 10.1038 / nature09159 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  24. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC (2012). Eraldi rollid otsese ja kaudse striatali striatali neuronite tugevdamisel. Nat. Neurosci. 15, 816 – 818 10.1038 / nn.3100 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  25. Kreitzer AC, Malenka RC (2008). Striatuse plastilisus ja basaalganglioni funktsioon. Loodus 60, 543 – 554 10.1016 / j.neuron.2008.11.005 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  26. Le Moine C., Bloch B. (1996). D3i dopamiiniretseptori ekspressioon tuuma accumbens'i peptiidergilistes neuronites: võrdlus D1 ja D2 dopamiini retseptoritega. Neuroteadus 73, 131 – 143 10.1016 / 0306-4522 (96) 00029-2 [PubMed] [Cross Ref]
  27. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D., Friedman AK, Sun H., Damez-Werno D., et al. (2010). BDNF signaaliülekande rakutüübi spetsiifiline kadumine jäljendab kokaiini tasu optogeneetilist kontrolli. Teadus 330, 385 – 390 10.1126 / science.1188472 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  28. Lobo MK, Nestler EJ (2011). Striatali tasakaalustav toime narkomaania puhul: otseste ja kaudsete keskmiste närviliste neuronite erinevad rollid. Ees. Neuroanat. 5: 41 10.3389 / fnana.2011.00041 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  29. Lüscher C., Malenka RC (2011). Narkootikumide põhjustatud sünaptiline plastilisus sõltuvuses: molekulaarsetest muutustest kuni ringluse ümberkujundamiseni. Neuron 69, 650 – 663 10.1016 / j.neuron.2011.01.017 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  30. O'Donnell P., Grace AA (1993). In vitro registreeritud akumeeni südamiku ja koore neuronite füsioloogilised ja morfoloogilised omadused. Synapse 13, 135 – 160 10.1002 / syn.890130206 [PubMed] [Cross Ref]
  31. Pascoli V., Turiault M., Lüscher C. (2011). Kokaiinist põhjustatud sünaptilise võimenduse tühistamine taastab ravimi poolt põhjustatud adaptiivse käitumise. Loodus 481, 71 – 75 10.1038 / nature10709 [PubMed] [Cross Ref]
  32. Preston RJ, Bishop GA, Kitai ST (1980). Rottide neostriatumist pärinev keskpinnane närvirakkude projektsioon: rakusisese mädarõika peroksidaasi uuring. Brain Res. 183, 253 – 263 10.1016 / 0006-8993 (80) 90462-x [PubMed] [Cross Ref]
  33. Robinson TE, Berridge KC (1993). Narkootikumide iha alus: sõltuvuse stimuleeriv-sensibiliseeriv teooria. Brain Res. Brain Res. 18, 247 – 291 10.1016 / 0165-0173 (93) 90013-p [PubMed] [Cross Ref]
  34. Robinson TE, Berridge KC (2003). Sõltuvus. Annu. Psychol. 54, 25 – 53 10.1146 / annurev.psych.54.101601.145237 [PubMed] [Cross Ref]
  35. Schmidt HD, Pierce RC (2010). Kokaiini poolt põhjustatud neuroadaptatsioonid glutamaadi ülekandes: potentsiaalsed terapeutilised sihtmärgid iha ja sõltuvuse osas. Ann. NY Acad. Sci. 1187, 35 – 75 10.1111 / j.1749-6632.2009.05144.x [PubMed] [Cross Ref]
  36. Sesack SR, Grace AA (2010). Cortico-basal ganglioni tasuvõrk: mikroprotsess. Neuropsühharmakoloogia 35, 27 – 47 10.1038 / npp.2009.93 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  37. Sim HR, Choi TY, Lee HJ, Kang EY, Yoon S., Han PL jt. (2013). Dopamiini D2 retseptorite roll stressi poolt põhjustatud sõltuvust tekitava käitumise plastilisuses. Nat. Commun. 4: 1579 10.1038 / ncomms2598 [PubMed] [Cross Ref]
  38. Smith RJ, Lobo MK, Spencer S., Kalivas PW (2013). Kokaiini indutseeritud kohandused D1 ja D2 akumuleerivad väljaulatuvaid neuroneid (dikotoomia ei pruugi olla otseste ja kaudsete radade sünonüüm). Curr. Opin. Neurobiol. 23, 546 – 552 10.1016 / j.conb.2013.01.026 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  39. Steketee JD, Kalivas PW (2011). Narkootikumid: käitumuslik sensibiliseerimine ja uimastite otsimise käitumine. Pharmacol. 63, 348 – 365 10.1124 / pr.109.001933 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  40. Taverna S., Ilijic E., Surmeier DJ (2008). Parkinsoni tõve mudelites katkestatakse striaaltihedate närvirakkude korduvad tagatised. J. Neurosci. 28, 5504 – 5512 10.1523 / JNEUROSCI.5493-07.2008 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  41. Taverna S., van Dongen YC, Groenewegen HJ, Pennartz CM (2004). Otsesed füsioloogilised tõendid sünaptilise ühenduvuse kohta keskmise suurusega närvirakkude vahel roti tuumas accumbensis in situ. J. Neurophysiol. 91, 1111 – 1121 10.1152 / jn.00892.2003 [PubMed] [Cross Ref]
  42. Thomas MJ, Kalivas PW, Shaham Y. (2008). Neuroplastsus mesolimbilise dopamiini süsteemi ja kokaiini sõltuvuse osas. Br. J. Pharmacol. 154, 327 – 342 10.1038 / bjp.2008.77 [PMC tasuta artikkel] [PubMed] [Cross Ref]
  43. Tunstall MJ, Oorschot DE, Kean A., Wickens JR (2002). Inhibeerivad interaktsioonid rottide striatumis paiknevate spiny projection neuronite vahel. J. Neurophysiol. 88, 1263 – 1269 10.1152 / jn.00886.2001 [PubMed] [Cross Ref]
  44. Vanderschuren LJ, Kalivas PW (2000). Dopamiinergilise ja glutamatergilise ülekande muutused käitumusliku sensibiliseerimise indutseerimisel ja ekspressioonil: prekliiniliste uuringute kriitiline ülevaade. Psühhofarmakoloogia (Berl) 151, 99 – 120 10.1007 / s002130000493 [PubMed] [Cross Ref]
  45. Wilson CJ, Groves PM (1980). Roti neostriatumi ühise närvilise neuroni peenstruktuur ja sünaptiline ühendus: uuring, mis kasutab mädarõika peroksidaasi intratsellulaarset süstimist. J. Comp. Neurool. 194, 599 – 615 10.1002 / cne.901940308 [PubMed] [Cross Ref]
  • Wise RA (2004). Dopamiin, õppimine ja motivatsioon. Nat. Neurosci. 5, 483 – 494 10.1038 / nrn1406 [PubMed] [Cross Ref]