Jonathan P. Fadok, 1,2 Tavis MK Dickerson, 2 ja Richard D. Palmiter2 *
J Neurosci. Autori käsikiri; saadaval PMC 2010i märtsis 9.
Avaldatud lõplikus redigeeritavas vormis:
J Neurosci. 2009 September 9; 29 (36): 11089 – 11097.
doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1616-09.2009.
1i lõpetajaprogramm neurobioloogias ja käitumises, Washingtoni ülikool, Seattle, WA 98195
2 Biokeemia osakond ja Howard Hughesi meditsiiniinstituut, Washingtoni ülikool, Seattle, WA, 98195
* Kirjavahetus tuleks adresseerida: Richard D. Palmiter, HHMI ja Biokeemia osakond, Box 357370, Washingtoni Ülikool, Seattle, WA 98195. E-post: [meiliga kaitstud]
Selle artikli väljaandja lõplik redigeeritud versioon on tasuta saadaval aadressil J Neurosci
Vaadake PMC teisi artikleid, mis viitavad avaldatud artiklile.
Abstraktne
Dopamiin (DA) on seotud paljude käitumistega, kaasa arvatud motoorne funktsioon, tunnetus ja tasu töötlemine; DA-i roll hirmu töötlemisel on siiski ekslik. Et uurida DA rolli hirmuga seotud õppimisel, testiti dopamiinipuudulikke (DD) hiiri hirmu potentsiaaliga hämmastav paradigmas. DA sünteesi saab DD hiirtel taastada 3i, 4-dihüdroksü-L-fenüülalaniini (L-Dopa) manustamisega, võimaldades seeläbi hinnata hirmu töötlemist kas DA-de ammendunud või taastunud olekus. DD hiirtel puudus hirm-potentseeritud üllatus, kuid seda võib taastada L-Dopa manustamisega kohe pärast hirmu tekitamist. DA sünteesi selektiivne viiruse poolt vahendatud taastamine ventraalses tegmentaalses piirkonnas taastas täielikult hirmuõppimise DD hiirtel ja DA sünteesi taastamine DA neuronitele, mis ulatuvad basolateraalsesse amygdala, taastades lühiajalise mälu, kuid mitte pikaajalist mälu või šokitundlikkust. Samuti demonstreerime, et DA D1 retseptor (D1R) ja D2-tüüpi retseptorid on vajalikud cue-sõltuva hirmuõppimise jaoks.
Need leiud näitavad, et mitmetes retseptori alatüüpides mitmetes sihtpiirkondades toimuv DA soodustab hirmu mälu stabiliseerimist.
Märksõnad: dopamiin, hirm, hirmutav hirm, amygdala, dopamiini D1 retseptor, dopamiini D2 retseptor
Sissejuhatus
Neuromodulaator DA on oluline tasulise õppe ja narkootikumide otsimise käitumise seisukohast (Schultz, 2002; Wise, 2004) ja kogunevad tõendid näitavad, et DA võib olla oluline ka hirmuga seotud õppimiseks (Lamont ja Kokkinidis, 1998; Guarraci et al. , 1999; Greba ja Kokkinidis, 2000; Guarraci et al., 2000; Greba et al., 2001; Pezze ja Feldon, 2004; de Oliveira et al., 2006; Kesknärvisüsteemi ventraliprojekti DA neuronid hirmuõppimiseks oluliste limbiliste aju piirkondade ja nende aju piirkondade DA tasemeid suurendavad aversiivsete sündmuste ajal (Abercrombie et al., 1989; Kalivas ja Duffy, 1995; Doherty ja Gratton, 1997; Inglis ja Moghaddam; , 1999). Lisaks suurendavad mõned keskjoonte DA neuronid oma põlemiskiirusi aversiivsetele stiimulitele ja ennustavatele märkidele (Guarraci ja Kapp, 1999; Horvitz, 2000; Joshua et al., 2008). Lisaks on näidatud, et DA hõlbustab pikaajalist potentseerumist, mälu võtmetähtsust närvikorrelatsioonis hirmuõppimiseks kriitilistes piirkondades, nagu näiteks hipokampus ja amygdala (Bissiere et al., 2003; Lemon ja Manahan-Vaughan, 2006; Swant; ja Wagner, 2006).
Hoolimata edusammudest, mis on seotud DA neuronite füsioloogiaga hirmust, jääb DA ja selle sugulaste retseptorite täpne roll hirmuõppes endiselt lahendamata. On näidatud, et D1R-i sarnaste antagonistide süstimine süsteemselt või amygdala-sse blokeerib hirmuga seotud õppe omandamist või ekspressiooni; teised aga on näidanud, et need ravimid ei mõjuta (Guarraci et al., 1999; Greba ja Kokkinidis, 2000; de Oliveira jt, 2006). Lisaks on demonstreeritud, et D1R-sarnased agonistid kas hirmu paranemist suurendavad või ei mõjuta (Guarraci et al., 1999; Greba jt, 2000; Inoue jt, 2000; de Oliveira jt, 2006). Analoogseid erinevusi on leitud uuringutes, kus on kasutatud D2R-sarnaste retseptorite agoniste või antagoniste (Guarraci et al., 2000; Greba et al., 2001; Ponnusamy jt, 2005; de Oliveira et al., 2006). Need lahknevused võivad tuleneda käitumuslikust metoodikast, süstitud ravimite annusest sõltuvatest mõjudest või farmakoloogiliste ainete valikuvõimalustest. Näiteks DA-retseptori antagonistid on selektiivsuse poolest väga erinevad, kuigi mõned uuringud võivad olla D2-retseptoreid selektiivsemalt antagoniseerivad, teised võivad olla D2-, D3- ja D4-retseptoreid laialdasemalt antagoniseerivad (Missale et al., 1998).
Et selgitada DA rolli hirmuga seotud õppes, kasutasime hiiri, kellel puudus DA (DD hiired), samuti hiirtel, kellel puudus kas D1R või DA D2 retseptorid (D2R), ja testis neid hirmu võimendava hätta paradigmas. Hirm-potentseeritud üllatus on Pavloviuse hirmust tingitud paradigma, kus neutraalne stiimul kutsub esile akustilise hämmastuse vastuse, mis järgneb jalgpalli (Koch, 1999) paaristamisele. Hirm-potentseeritud üllatus on nende uuringute jaoks ideaalne paradigma, sest see ei sõltu külmumise käitumise hindamisest, mida on raske mõõta hüpoaktiivsetel DD hiirtel (Zhou ja Palmiter, 1995). Kuna DD hiiri saab uurida kas DA-de ammendunud või DA-ga täidetud seisundis, annavad nad ideaalse võimaluse uurida DA rolli õppimisel ja mälu moodustamisel. Lisaks võib DA-signaaliülekannet Cre-rekombinaasi viiruse poolt vahendatud kohaletoimetamise teel spetsiifilistesse sihtpiirkondadesse selektiivselt taastada DD-hiirte Th-alleeli reaktivatsiooniga (Hnasko et al., 2006). DA selektiivne taastamine konkreetsetesse sihtpiirkondadesse võimaldab hinnata aju piirkondi, mida reguleeritakse DA signalisatsiooniga hirmu tekitamise ajal.
Materjalid ja meetodid
Loomad ja ravi
DD hiired genereeriti, nagu kirjeldatud (Hnasko et al., 2006). Lühidalt, DD (Thfs / fs; DbhTh / +) hiirtel on kaks mittefunktsionaalset türosiini hüdroksülaasi (Th) alleeli, mis on inaktiveeritud neomütsiini resistentsuse (NeoR) geeni sisestamisega lox P saitidega Th geeni esimesesse introni. . Need hiired kannavad ka ühte puutumatut dopamiini β-hüdroksülaasi (Dbh) alleeli ja ühte Dbh alleeli Th-geeni sihipärase sisestamisega. Kontrollloomadel on vähemalt üks puutumatu Th alleel ja üks puutumata Dbh alleel. Mitte-dopamiinergiliste katehhoolamiinide tasemed DD loomadel on normaalsed ja kõigi katehhoolamiinide tasemed on kontrollloomadel normaalsed (Zhou ja Palmiter, 1995; Szczypka et al., 1999). Hiiri hoiti segatud C57BL / 6 X 129 / Sv geneetilisel taustal. Raske hüpofagia tõttu süstiti DD hiirtele päevas (ip) LN-dopaga 50 mg / kg juures 33 μl / g (Zhou ja Palmiter, 1995) mahus, alustades ligikaudu postnataalsest päevast 10. Need süstid taastavad DA-funktsiooni 8-ile 10 hr-le (Szczypka et al., 1999). D1R knockout (KO) ja D2R KO hiiri on kirjeldatud (Drago et al., 1994; Kelly et al., 1997). Mõlemat tüve hoiti C57BL / 6 taustal. Kasvupeetuse tõttu D1R KO hiirtel võõrutati nad nelja nädala jooksul ja seejärel kasvatati niiske chow'i kasvu soodustamiseks. Kõik loomad genotüübiti PCR analüüsi abil. Meestel ja emastel hiirtel teostati 2-5-i vanuste vahel käitumuslikud testid. Kõik hiired hoiti 12: 12 (valguse: pimeduse) tsükli all temperatuuri kontrollitud keskkonnas koos toiduga (5LJ5; PMI Feeds, St. Louis, MO) ja veega, mis oli saadaval ad libitum. Kõik käitumuslikud katsed viidi läbi valguse tsükli ajal. Kõiki hiiri raviti vastavalt riiklike tervishoiuinstituutide ja Washingtoni Ülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komiteele kehtestatud juhistele
Et hinnata, kas teised D2-tüüpi retseptorid on hirmuõppimise seisukohalt olulised, manustati D2R KO hiirtele 2 mg / kg (ip) D0.5-tüüpi antagonist-etiklopriidi (Sigma, St. Louis, MO). Etiklopriid lahustati 0.9% soolalahuses ja see saadi 10 μl / g lõppmahus. D2R metsikut tüüpi (WT) hiirtele süstiti vehiikulit.
Aparatuur
Prepulsi inhibeerimise, hämmastuse vastuste ja hirmu võimendava hämmastuse mõõtmiseks kasutati heli summutavaid hämmastavaid kamme (SR-Lab, San Diego Instruments, San Diego, CA). Ebaõnnestunud vastuste puhul võeti 65 1-msec lugemid, alustades impulsi algusest. Fotshock-i vastuse mõõtmiseks võeti 500 1-msec lugemid, alustades šoki algusest. Vastuse maksimaalset amplituudi kasutati prepulse inhibeerimise, hämmastuse vastuste, hirmu-võimendatud hämmastuse ja šokkreaktiivsuse arvutamiseks. Valge müra heli oli toodetud kõrgsagedusliku kõlariga, mis asub kambri laes. Taustheli hoiti konstantsel 65 dB tasemel. Helitasemeid mõõdeti detsibellides (A skaala), kasutades helitaseme lugejat (RadioShack, Fort Worth, TX). Kalibreerimisseadet kasutati selleks, et tagada ebaõnnestunud vastuse näitude terviklikkus (San Diego Instruments, San Diego, CA). 8-vatt-tuli paigaldati hõõrdkasti tagaseinale, et kasutada seda kiibina.
Vastureaktsiooni kõverad
Pärast 5-min-i harjumisperioodi esitati loomadele seitsme uuringu seeriat koos suurenevate helitasemetega: alates 80-st kuni 120 dB-le, kus 30-i ITI oli. See seeria esitati 10i aegadel kokku 70i uuringutes. Kõigis katsetes, välja arvatud nullkatsed, kus heli ei olnud, oli heliimpulss 40 msec.
Enne pulssi pärssimine
Loomadele anti 10-min-i harjumisperiood, mille järel esitati subjektidele 5 40-msec, 120-dB, pulseerivad uuringud. Seejärel esitati hiirtele 50i uuringud kas üksikisikust pulseerivast uuringust, ühest kolmest prepulse uuringust (5, 10 ja 15-dB üle tausta) või nullkatse, milles ei olnud akustilist stiimulit. Intertrial intervall (ITI) keskmiselt 15 sec (vahemik 5 – 25 sec). Hämmastav kohtuprotsess koosnes 40-msec-ist, 120-dB-valgest mürast. Prepulse uuringud koosnesid 20, 70 või 75-dB intensiivsuse 80-msec kestusest, mis eelnes 40-msec 120-dB impulssile 100 msec. Prepulse inhibeerimine arvutati iga eeltäidetud taseme kohta, kasutades järgmist valemit:% inhibeerimine = [(keskmine hämmastav vastus prepulse uuringus / keskmine hämmastav vastus pulsilises uuringus) × 100]. DD hiiri testiti DA-de kadunud olekus, 18 – 24 hr pärast L-Dopa süstimist.
Hirm-potentseeritud üllatus (7-päeva paradigma)
1-i päeval (baasjoon) anti 5-min-i harjumisperioodi järel hiirtele pseudo-juhuslikult järjestatud 20-uuringute seeria, mis jaotati ühtlaselt luude ja beeta tingimuste vahel. Tsueerimata uuringute jaoks esitati loomadele 40-msec, 105-dB akustiline impulss. Tsueerimiskatsete jaoks esitati loomadele 10-sec valguskiir, mis lõpetas 40-msec, 105-dB impulsi. ITI keskmiselt 120 sek (vahemik 60 kuni 180 sek).
Koolitus toimus päeval 2, 4 ja 6. Pärast 10-min-i harjumisperioodi anti hiirtele 10-i esitusviisid, mis lõppesid koos 0.2-mA, 0.5-sec footshock'iga. ITI keskmiselt 120 sek (vahemik 60 kuni 180 sek). Testiseansid toimusid 3, 5 ja 7 päevadel ja olid identsed ülalkirjeldatud baasjoonega. DD-hiired olid pärast viimase L-Dopa süstimist DA-i kadunud olekus 18-i 24-h, algtaseme, treeningu ja testimise ajal. L-Dopa süstiti pärast treeninguid, nagu on näidatud joonisel. Järgnevat valemit kasutati hirm-võimendatud hämmastuse arvutamiseks:% potentsioon = [(vastuste keskmine keskmises kiirtestides / vastuste arv keskmises katses-1) × 100].
Hirm-potentseeritud üllatus (3-päeva paradigma)
Selle paradigma 1 ja 3 päevad (algväärtus ja test) olid identsed 7-i päeva hirmu-võimendava üllatusparadigmaga. Päeval 2 (treening) said hiired 30-sec kii 10-paari 0.2-mA, 0.5-sec footshockiga. ITI keskmine oli 120 sec (vahemik 60 kuni 180 sec). DD hiired olid algtaseme, koolituse ja testimise ajal DA-de ammendunud.
Lühiajaline mälu
Baasjoone ja testiseansid olid identsed 7-i päeva paradigma jaoks kirjeldatutega. 2-i päeval anti hiirtele 5-min-i harjumisperioodi järel 30-paari 10-sek-valgus, mis lõpetati koos 0.5-sek, 0.2-mA jalaga. ITI keskmiselt 120 sek (vahemik 60 kuni 180). Pärast treeningut paigutati hiired enne testimist oma kodus puuridesse 10. Lühiajalist mälu hinnati, kasutades sama valemit, mida kasutati hirm-potentseeritud üllatuse korral.
Shock Sensitization
Igale loomale keskmistati vastused lühiajalise mälu baasjoone ja testiseansi ajal valitsevale seisundile ning šoki sensibiliseerimise arvutamiseks kasutati järgmist valemit:% sensibiliseerimine = [(keskmine üllatusvastus testimise ajal / keskmine üllatusvastus baasjoone puhul) 1) × 100].
Th geeni funktsiooni rekombinaasi poolt vahendatud retseptide taastamine
Isofluraani (1.5-5%) anesteseeritud hiired pandi stereotaksilisse seadmesse (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Th geeni funktsiooni taastamiseks ventralises tegmentaalpiirkonnas süstiti kahepoolselt rekombinantset AAV1-Cre-GFP viirust (tiitritud 1.2 x 1012 osakestega / ml) ventraalsesse keskjoonesse (koordinaadid mm: 3.5 taga Bregma, 0.5 külgmine kuni keskjooneni) , 4.5 ventral Bregma, 0.5 μl / poolkera). BLA DA spetsiifiliseks taastamiseks süstiti kahepoolselt rekombinantset CAV2-Cre viirust (tiitritud 2.1 x 1012 osakestel / ml) (koordinaadid mm-des: 1.5 tagumine Bregma, 3.25 külgmine kuni keskjooneni, 5 ventraalne Bregma; 0.5 μl / poolkera) . Avaldatud on mõlema viirusvektori üksikasjalikud kirjeldused (Hnasko et al., 2006; Zweifel et al., 2008). Viirused süstiti 10-minuti jooksul, kasutades 32-gabariidi süstla nõela (Hamilton, Reno, NV), mis oli kinnitatud mikro-infusioonipumba külge (WPI, Sarasota, FL).
Immunohistokeemia
Pärast anesteesiat 50 mg / ml naatriumpentobarbitaaliga (0.2 – 0.3 ml / loom) perfundeeriti hiired transkardiaalselt fosfaatpuhverdatud soolalahusega, millele järgnes 4% paraformaldehüüd fosfaatpuhverdatud soolalahuses. Eraldatud ajusid fikseeriti üleöö 4% paraformaldehüüdis, kaitstes fosfaatpuhverdatud soolalahuses 30% sahharoosis ja seejärel külmutati kiiresti isopentaanis. Vaba ujuvad koronaalsed lõigud (30 μm) immunoloogiti kas hiire anti-TH (1: 1000, Chemicon) või küüliku anti-TH (1: 2000, Chemicon) antikehadega. Immunofluorestsents saavutati, kasutades Cy2- või Cy3-konjugeeritud IgG sekundaarseid antikehi (1: 200, Jackson ImmunoResearch). Värvitud sektsioonid paigaldati slaididele, kaeti ja pildistati püstise lainepikkusega mikroskoobiga (Nikon).
Statistiline analüüs
Tehtud analüüsid hõlmasid korduvaid mõõtmisi ja ühesuunalist ANOVA, Fisheri post-hoc ja Student'i t-teste, nagu on märgitud tulemustes. Statistiline analüüs viidi läbi Statistica tarkvara abil (Statsoft, Tulsa, Oklahoma).
Tulemused
DD hiirtel on puutumatu akustiline hämmastav reaktsioon ja normaalne prepulse inhibeerimine
Hirm-potentseeritud üllatus nõuab puutumatuid hämmastavaid vastuseid ja andurimootorit. Et teha kindlaks, kas akustilise hämmastuse vastus on muutunud DA puudumisel, mõõdeti DA-de ammendunud DD hiirte vastused (18 kuni 24 hr pärast L-Dopa) mitmele detsibellitasemele ja võrreldi kontrollidega (joonis 1A). Korduvad meetmed ANOVA ei näidanud genotüübi peamist mõju ega genotüübi ja helitaseme olulist koostoimet.
Joonis 1
DA on hirmust tingitud ehmatuse õppimisel ülioluline. A, kontroll- (n = 10, mustad ruudud) ja DD-hiirte (n = 10, avatud ruudud) akustiline ehmatusreaktsioon erinevatele heliintensiivsustele. Vastused esitatakse suvalistes ühikutes. B, Prepulsi inhibeerimist testiti 3 erineva eelimpulsi intensiivsusega kontroll- (n = 10, mustad tulbad) ja DD hiirtel (n = 10, avatud tulbad). Tärnid tähistavad p<0.05, kordusmõõtmised ANOVA. C, skeem, mis illustreerib 7-päevast hirmuga potentseeritud ehmatuse paradigmat. Algtasemel ja katsepäevadel said hiired pseudojuhuslikult 10 ilma märguandeta (40-dB ehmatusimpulssi esitlus kestusega 105 ms) ja 10 märguande katse esitlust (10-sekundiline valgusviip, mis lõppes ehmatusimpulssiga). tellida. Treeningpäevadel said hiired 10 paari 10-sekundilist valgussignaali, mis lõppesid 0.5-sekundilise 0.2-mA jalalöögiga. Õppimist hinnati testipäevadel näpunäidete katsete võimendamise protsendina, võrreldes näpunäideteta katsetega. D, DD hiirtel (n = 10, avatud tulbad), kellele anti L-Dopat 3 tundi pärast treeningut (2. ja 4. päev), ei õnnestunud õppida (test 1 ja 2). Kuid kui DD-hiirtele süstiti vahetult pärast treeningut (6. päev), ilmnes neil märkimisväärne hirmuvõimeline ehmatus (test 3). Tärnid tähistavad p<0.05, kordusmõõtmised ANOVA. E, löögireaktiivsuse mõõtmised treeningute ajal (kontroll n=10, mustad ribad; DD n=10, avatud tulbad). Vastused esitatakse suvalistes ühikutes. F, skeem, mis illustreerib 3-päevast hirmuga võimendatud ehmatuse paradigmat, mida kasutatakse kriitilise ajaperioodi määramiseks, mil DA on oluline. Kõik 30 kii-šoki paaristamist anti ühel treeningpäeval ja DD-hiiri raviti L-Dopaga kohe, 1 tund või 3 tundi pärast treeningut. G, ainult kontroll- (n = 8, kindlad mustad ribad, C) ja DD hiirtel, kellele süstiti vahetult pärast treeningut (n = 7, vertikaalsed triibud, 0 tundi), ilmnes katsepäeval hirmust tugevnenud ehmatus. See hirmust tingitud ehmatuse tase oli oluliselt kõrgem kui DD-hiirtel, kellele manustati L-Dopat 1 tund (n = 6, diagonaalsed triibud) või 3 tundi (n = 6, avatud ribad) pärast treeningut. Tärnid tähistavad p<0.05 võrreldes algtasemega, Fisher post-hoc. Kõik esitatud väärtused on keskmised ± SEMDA-vaesestatud DD ja kontrollhiiri testiti ka prepulsi inhibeerimise paradigmas, mida tavaliselt kasutatakse sensomotoorse värava defitsiidi tuvastamiseks. Prepulsi pärssimine suurenes DD-hiirtel (joonis 1B; kordusmõõtmised ANOVA, genotüüp: F1, 18 = 5.37; p < 0.05; olulist genotüüpi prepulsi taseme interaktsiooni põhjal ei tuvastatud). Need andmed näitavad, et DD-hiirtel ei ole DA-vaesestatud olekus ehmatusreaktsioonide puudujääke ega sensomotoorsete väravamehhanismide vähenemist ja need kinnitavad nende kasutamist hirmuga võimendatud ehmatuskatsetes.
Dopamiin on kriitilise aja jooksul vajalik, kui kardetakse hirmu hoogu
Et teha kindlaks, kas DA on vajalik hirmu tekitamise ülesande õppimiseks, allutati DD-le ja kontrollhiirtele 7-päevane hirmuga võimendatud ehmatuse paradigma (joonis 1C). DD-hiiri treeniti ja testiti DA-vaesestatud olekus. Kui testiti 24 tundi pärast treeningut, ilmnes kontrollhiirtel pärast ühte treeningut hirmust tugevnenud ehmatus, mida DD-hiirtel ei täheldatud (joonis 1D; kordusmõõtmised ANOVA, genotüüp, F1, 18 = 7.4590, p <0.05). Isegi pärast täiendavat treeningut ei suutnud DD-hiired väljendada hirmust tingitud ehmatust, samas kui kontrollhiired jätkasid tugeva õppimise väljendamist. Huvitav on see, et kui DD-hiirtele manustati L-Dopat vahetult pärast treeningut 6. päeval, ilmnes hirmust tugevnenud ehmatus, mis oli oluliselt suurem kui algväärtus (ühesuunaline ANOVA F1, 18=9.1999, p<0.01) ega erinenud kontrolltasemetest ( Joonis 1D). Šokireaktsioon DD- ja kontrollhiirte treeningpäevade lõikes ei erinenud oluliselt ühelgi treeningpäeval genotüüpide vahel, mis näitab, et DD-hiirte õppimise puudujääk ei olnud tingitud suušoki tajumise võimetusest (joonis 1E). Kriitilise ajaakna iseloomustamiseks DA toime puhul muutis täiendav uuring L-Dopa manustamise aega. DD-le ja kontrollhiirtele viidi läbi treening, mis koosnes 30 valgusšoki paarist (joonis 1F), seejärel süstiti L-Dopat kas kohe, 1 tund või 3 tundi pärast treeningut ning neid testiti 24 tundi hiljem. DD-hiired, kellele süstiti vahetult pärast treeningut, avaldasid testipäeval tugevat hirmu-potentseeritud ehmatust, mis sarnanes kontrollrühmade omaga, samas kui DD-hiirtel, kellele süstiti L-Dopat 1 tund või 3 tundi pärast treeningut, ei ilmnenud õppimist (joonis 1G; kordusmõõtmised ANOVA); ravi × seanss F3, 23=5.1032, p<0.01). Need andmed näitavad, et DA on vajalik piiratud aja jooksul hirmuga võimendatud ehmatusparadigmas õppimiseks. DA ei ole aga vihje-hirmu mälu väljendamiseks vajalik, kuna DD loomi testiti alati DA puudumisel. Lisaks ei kahjusta DA puudumine šokireaktiivsust.
D1R on vajalik hirm-võimendatud hämmastuse korral
Et uurida, millised DA retseptorid on hirmust tingitud ehmatuse jaoks vajalikud, analüüsisime esmalt D1R KO hiiri. D1R KO ja kontroll-, metsiktüüpi (WT) hiiri testiti mitmel ehmatuspulsi intensiivsuse tasemel, nagu on kirjeldatud DD hiirte puhul (joonis 2A). D1R KO ja WT hiirte vahel ei ilmnenud olulist erinevust ühelgi testitud helitasemel, mis näitab, et D1R KO hiirtel on terve akustiline ehmatusreaktsioon. Kooskõlas varasemate uuringutega oleme D1R KO hiirtel täheldanud puutumatut prepulsi inhibeerimist (Ralph-Williams et al., 2002). 7-päevase hirmuga võimendatud ehmatuse paradigma testimisel ei suutnud D1R KO hiired ühelgi testipäeval õppimist väljendada (joonis 2B; kordusmõõtmised ANOVA genotüüp × testipäev F3, 48 = 6.28; p < 0.01), samas kui WT hiirtel oli 2. ja 3. testipäeval märkimisväärne hirmust tugevnenud ehmatus (p<0.05 ja p<0.01, kontroll lähtetase versus test 2 ja 3, Fisher post-hoc). D1R KO hiirtel oli kõigil kolmel treeningpäeval suurem šokireaktiivsus kui WT (joonis 2C; kordusmõõtmised ANOVA, genotüüp F1, 16 = 10.18, 0.01; p < 1, 3; olulist genotüüpi × treeningpäeva ei täheldatud). Seega, kuigi D1R KO hiirtel on võrreldes WT hiirtega suurem reaktsioon jalalöögile, on neil isegi pärast 1-päevast treeningut oluliselt vähenenud hirmust tingitud ehmatus. Need andmed näitavad D2R KO loomade õppimishäireid ja viitavad D1R-le DA mõjude vahendamisel näpunäidetest sõltuva hirmu konditsioneerimise korral. Joonis 1 D9R KO hiirtel on õppimisvõime oluliselt halvenenud. A, D9R WT (n = 7, mustad ruudud) ja KO (n = 1, avatud ruudud) hiirte akustiline ehmatus. B, 1-päevase hirmuga võimendatud jahmatusparadigma tulemused D9R hiirtega. D1R WT hiirtel (n = 9, kindlad mustad tulbad), kuid mitte D3R KO hiirtel (n = 0.01, lahtised tulbad), ilmnes 1. testipäevaks hirmuvõimeline ehmatus. Tärnid tähistavad p < 9, võrreldes KO-d WT-ga, Fisher post- hoc. C, šokireaktiivsuse mõõtmised. D9R KO hiirtel (n = 0.05, avatud tulbad) on jalalöögile suurem reaktsioon kui WT-le (n = XNUMX, kindlad tulbad). Tärnid tähistavad p<XNUMX, kordusmõõtmised ANOVA. Kõik esitatud väärtused on keskmised ± SEM Ehmatusreaktsioonide ja löögireaktiivsuse korral on esitatud numbrid suvalistes ühikutes.
D2R KO hiirtel on hirm-potentseeritud ehmatus, kuid see nõuab teisi D2-tüüpi retseptoreid
Et uurida, kas D2-sarnased retseptorid on vajalikud hirm-potentseeritud üllatuseks, allutati D2R KO ja WT hiirtele hämmastav vastus ja hirm-võimendatud hämmastuskatsed. WT ja D2R KO hiirtel on kõigil testitud dB tasemetel samaväärsed vastureaktsioonid, mis viitavad sellele, et D2R KO hiirtel on puutumatu hämmastav vastus (joonis 3A). Sarnaselt D1R KO hiirtele oleme täheldanud, et D2R KO hiirtel on intaktsed prepulse inhibeerimised (Ralph-Williams et al., 2002). Kui testiti 7-i päeva hirmu-potentseeritud üllatusparadigmaga, näitasid nii WT kui ka D2R KO hiired kõikide 3i testipäevadel (joonis 3B) samaväärsel tasemel hirmu võimendavat hämmastust ja šokireaktiivsus ei erinenud rühmade vahel (joonis 3C). Need andmed näitavad, et D2R ei ole hirmu ja potentseeritud hämmastuse õppimiseks vajalik.
Joonis 3
D2R KO hiirtel on ehmatus puutumata, mis on võimendatud hirmust. A, D2R WT (n = 8, mustad ruudud) ja KO hiirte (n = 8, avatud ruudud) akustiline ehmatusreaktsioon. B, 7-päevase hirmuga võimendatud jahmatusparadigma tulemused D2R hiirtega. Nii WT (n = 8, kindlad tulbad) kui ka KO (n = 8, avatud tulbad) hiirtel esines märkimisväärne hirmust tingitud ehmatus. C, löögireaktiivsuse mõõtmised treeningu ajal (WT, n=8, kindlad tulbad; KO, n=8, lahtised tulbad). D, WT ja D2R KO hiired (mõlemad n = 11) allutati 3-päevasele hirmuga potentseeritud ehmatuse paradigmale. D2R KO hiirtele manustati enne treenimist etiklopriidi (0.5, 0.01 mg/kg) ja nad ei avaldanud testimisel hirmust tingitud ehmatust. Tärnid tähistavad p<2, KO versus WT, Fisher post-hoc. Kõik esitatud väärtused on keskmised ± SEM Ehmatusreaktsiooni ja šokireaktsiooni korral on vastused esitatud suvalistes ühikutes. Varasemad uuringud on näidanud, et D2000-sarnaste antagonistide manustamine kas süsteemselt või otse mandelkehasse vähendab konditsioneeritud hirmu (Guarraci et al., 2001; Greba jt, 2005; Ponnusamy jt, 2). Nende ja meie tulemuste lahknevuse uurimiseks manustati D2R KO hiirtele D0.5R-sarnast antagonisti etiklopriidi (3, 24 mg / kg; manustati ip) enne treenimist 2-päevase hirmuga potentseeritud ehmatuse paradigma järgi. Kui testiti 3 tundi pärast koolitust, ilmnes vehiikuliga süstitud WT hiirtel tugev hirmuvõimeline ehmatus, samas kui etiklopriidiga süstitud D1R KO hiirtel ei ilmnenud õppimist (joonis 20D; kordusmõõtmised ANOVA genotüüp × päev F7.5698, 0.05 = 1, p <2) . Need tulemused viitavad sellele, et lisaks D2R-le on hirmust tingitud ehmatuse jaoks oluline ka DXNUMX-laadse DA-retseptorite perekonna liige, kuid mitte DXNUMXR.
DD ja D1R KO hiirtel on lühiajaline mälu kahjustatud
DA on vaja ühe tunni jooksul pärast treeningut, et õppida hirmust võimendatud ehmatust. Nendes katsetes testiti hirmuga võimendatud ehmatuse pikaajalist mälu 24 tundi pärast treeningut. Asusime katsetama, kas DA on vajalik ka lühiajalise mälu jaoks. DD loomadele ja kontrollgruppidele tehti 2-päevane paradigma, mis testis lühiajalist mälu 10 minutit pärast treeningut (joonis 4A). Testipäeval hinnati šoki sensibiliseerimist ja lühiajalist mälu. Lühiajaline mälu määratleti kui ehmatusreaktsioonide sõltuvust märgist, samas kui šoki sensibiliseerimine on kontekstist sõltuv akustilise ehmatusreaktsiooni võimendamine pärast lööki, mis on sõltumatu löögist (McNish et al., 1997; Richardson, 2000; Risbrough et. al., 2008). DD hiirtel oli oluliselt vähem šoki sensibiliseerimist kui kontrollidel (joonis 4B, p <0.05; Studenti t-test). Samamoodi näitasid kontrollhiired tugevat lühiajalist mälu, mis puudus DD hiirtel (joonis 4B, p <0.05, DD versus kontroll, Student'i t-test). Need andmed viitavad sellele, et DA on vajalik hirmust võimendatud ehmatuse lühi- ja pikaajaliseks mäluks. Pealegi on DA vajalik kontekstist sõltuva hirmu õppimiseks, mida testib šoki sensibiliseerimine. Need andmed kinnitavad ka eelmist järeldust, et DA on vajalik kriitilisel perioodil hirmu konditsioneerimise mälujälje stabiliseerimiseks. Joonis 4 Lühiajaline mälu ja šokitundlikkus sõltuvad DA-st. A, Käitumisparadigma kujundus. 1. päeval saadi esialgsed ehmatusreaktsioonid. 2. päeval said hiired kõik 30 löögi-šoki paari ja pandi seejärel enne testimist 10 minutiks oma kodukotta tagasi. B, kontrollhiirtel (n = 10, mustad ribad) on DD-ga võrreldes oluliselt suurem šoki sensibiliseerimine ja hirmuga võimendatud ehmatus (n = 10, avatud ribad). Tärnid tähistavad p <0.05; Üliõpilase t-test. C, WT (n = 7, mustad ribad) ja D1R KO (n = 7, avatud ribad) hiirtel on puutumata šoki sensibiliseerimine. Ainult WT-l on lühiajalise mälutesti ajal hirmust võimendatud ehmatus. Tärnid tähistavad p <0.05, KO versus WT; Üliõpilase t-test. D, WT (n = 8, mustad ribad) hiirtel on šoki sensibiliseerimine oluliselt suurem kui D2R KO-l (n = 8, avatud ribad). WT ja D2R KO hiirtel on hirmuga võimendatud tasemed sarnased. Tärnid tähistavad p <0.05, KO versus WT; Üliõpilase t-test. Kõik teatatud väärtused on keskmised ± SEMT Et uurida, millised retseptori alatüübid vahendavad DA rolli lühiajalises mälus ja šoki sensibiliseerimises, testiti D1R ja D2R KO hiiri samas paradigmas kui DD hiirtel. D1R KO hiirtel oli lühiajalise mälu tase märkimisväärselt madalam kui WT hiirtel (joonis 4C, p <0.05; Studenti t-test); D1R KO ja kontrollhiirte šoki sensibiliseerimise tasemete vahel ei olnud siiski olulist erinevust, mis viitas kontekstist sõltuva õppimise puutumatusele. D2R KO hiirtel oli šoki sensibiliseerimise tase tunduvalt madalam kui WT-l (joonis 4D, p <0.05; Studenti t-test), kuid WT ja KO hiirte lühiajalise mälu taseme vahel ei olnud olulist erinevust.
Lühiajalise mälu võimaldamiseks piisab DA-de taastamisest basolateraalsele amygdale
Basolateraalne amygdala on kriitilise tähtsusega cue-sõltuva hirmu mälu omandamiseks (Maren, 2003; Maren ja Quirk, 2004; Sigurdsson jt, 2007). Lisaks on tõendeid, mis näitavad, et DA-l on oluline roll basolateraalse amygdala funktsiooni hõlbustamisel (Rosenkranz ja Grace, 2002; Bissiere jt, 2003; Marowsky et al., 2005). Selleks, et uurida, kas DA on basolateraalses amygdalas vajalik hirmu võimendamiseks, DD ja kontrollhiired süstiti kahepoolselt CAV2-Cre vektoriga basolateraalsesse amygdala (joonis 5A). Seda vektorit transporditakse tagasi süstekohalt DA neuronitesse, kus ta taastab Th geeni aktiivsuse (Hnasko et al., 2006). Immunohistokeemia näitas, et TH esines CAV2-Cre-ga süstitud DD hiirte basolateraalses amygdalas (joonis 5J), kuid puudus dorsaalses striatumis ja tuumakinnisuses (joonis 5G). TH taastati esmajoones vähesele arvule neuronitele ventraalse tegmentaala taudaalsetes osades (joonis 5D). Süstitud DD hiirtel oli 10-positiivsete rakkude arvu 30-μm-sektsioonis tavaliselt vähem, mis on kooskõlas kirjanduses avaldatud väikeste amygdala-projitseerivate DA-neuronite arvuga (Ford et al., 2006; Lammel et al. , 2008, Margolis et al., 2008).
Joonis 5
Endogeense TH ekspressiooni regioonispetsiifiline taastamine DD hiirtel. A, skemaatiline illustreerimine basolateraalsete amygdala (BLA) päästekatsete koordinaatidele. DD (n = 7) ja kontroll (n = 7) hiired süstiti kahepoolselt BLA-sse CAV2-Cre vektoritega (0.5 uL / poolkera). B, skemaatiline illustreerimine ventral tegmental area (VTA) päästekatsete süstimiskoordinaadid. AAV1-Cre-GFP süstiti kahepoolselt (0.5 uL / poolkera) DD (n = 7) VTA-sse ja kontrollhiirtesse (n = 10). Arvud kohandatud Paxinos ja Franklin, 2001. C – E, TH-i värvimise võrdlus koronaalses viilus (4 × suurendus), mis näitab viirusega süstitud WT-kontrolli, BLA-süstitud DD ja VTA-süstitud DD ventraalset keskjooni. C, TH immuunhistokeemia kontroll-keskjoones demonstreerib DA neuronite esinemist VTA ja substia nigra pars compacta (SNpc; tähistatud noolega). D, BLA-ga päästetud DD hiirtel oli VTA-s väike arv TH-positiivseid neuroneid. Inset on kastitud piirkonna 40 × suurendus, mis näitab TH-i väljendust somas ja protsessides. E, VTA-päästetud DD-hiirtel oli TH-i ekspressioon peamiselt VTA-s. Pange tähele, et SN-i värvimine puudub (näidatud noolega). F-H, koronaalne lõik (4 × suurendus) WT viirusesse süstitud kontrollist, BLA-päästetud ja VTA-päästetud DD hiirtest, näidates TH-i ekspressiooni dorsaalses striatumis ja tuuma accumbensis. F, WT viirusega süstitud kontrollidel on TH ekspressioon kogu seljaosa (näidatud noolega) ja ventraalse striatumi kaudu. G, BLA-päästetud DD-hiirte striatumis puudub TH-ekspressioon. H, VTA-ga päästetud DD-hiirtel on TH-i ekspressioon tuumas accumbensis, vaid vähene värvimine dorsaalses striatumis (näidatud noolega). I – K, koronaalne lõik (10 × suurendus), mis näitab TH-i ekspressiooni viirusega süstitud WT kontrolli, BLA-päästetud ja VTA-päästetud DD-hiirte BLA-s.
Basolateraalse amügdalaga süstitud hiired allutati 3-päevasele hirmuga võimendatud ehmatusparadigmale. Lühiajalist mälu ja šokitundlikkust hinnati 10 minutit pärast treeningut ning pikaajalist mälu hirmust tingitud ehmatuse suhtes hinnati 24 tundi pärast treeningut (joonis 6A). Huvitav on see, et basolateraalsete amygdalaga süstitud DD-hiirte puhul taastati ainult lühiajaline mälu. Lühiajalise mälu tasemed olid samad, mis kontrollidel, kuid pikaajalise mälu (p<0.05; Studenti t-test) ja šokitundlikkuse (p<0.05; Studenti t-test) tasemed olid kontrollidest oluliselt madalamad. Treeningu ajal olid šokireaktiivsuse tasemed rühmade vahel samad (kontroll: 1613 ± 333 versus BLA-ga päästetud DD: 1758 ± 260). Need andmed viitavad sellele, et DA projektsioonid basolateraalsesse mandelkehasse, mis pärinevad peamiselt ventraalse tegmentaalse piirkonna kaudaalsest aspektist, on piisavad lühiajalise hirmumälu omandamiseks, kuid DA projektsioonid teistele kortikaalsetele või limbilistele ajupiirkondadele on tõenäoliselt olulised. kontekstuaalne õppimine ja hirmumälujälje pikaajaline stabiliseerimine.Joonis 6 Basolateraalse amügdala (BLA) abil päästetud DD hiired on taastanud lühiajalise mälu, samas kui ventraalse tegmentaalse piirkonna (VTA) abil päästetud DD hiired on täielikult taastanud õppimise. A, viirusega süstitud WT kontroll (n = 7) ja BLA-ga päästetud DD hiired (n = 7) allutati 3-päevasele hirmuga võimendatud ehmatuse paradigmale. Vasakul on BLA-ga päästetud hiirtel šokitundlikkus oluliselt madalam. Keskmine lühiajaline mälu (STM) taastati BLA-st päästetud hiirtel kontrolltasemele. Õige, pikaajaline mälu (LTM), mida hinnati 24 tundi pärast treeningut, puudub BLA-ga päästetud hiirtel. B, WT kontrolli (n = 10) ja VTA-ga päästetud DD hiirte (n = 7) tulemused 3-päevase hirmuga võimendatud ehmatuse paradigmas. Vasakul ei erinenud VTA-ga päästetud DD hiirte šokitundlikkus oluliselt kontrollist. Keskmisel ja paremal, STM-i ja LTM-mälu tasemed olid samad, mis VTA-päästehiirtel. Tärnid tähistavad p<0.05, päästmine versus kontroll, Studenti t-test. Kõik esitatud väärtused on keskmised ± SEM
Õppimiseks piisab TH-i taastamisest ventral tegmentaala DA neuronitele
Ventralisest keskjoonest tulenevad kaks peamist DA-ahelat; mesostriaalne ahel, mis tuleneb peamiselt sisemisest pars compacta'st ja mesokortikolimbilisest ahelast, mis pärineb peamiselt ventralisest tegmentaalsest piirkonnast. Mesokortikolimbilise ahela projektid ulatuvad laialdaselt aju tuumadele, mis on teada, et need on olulised kihisõltuva hirmu konditsioneerimise jaoks, sealhulgas basolateraalne amygdala (Bjorklund ja Dunnett, 2007; Lammel jt, 2008). Uurida, kas pikaajalise mälu ja šoki sensibiliseerimiseks on vaja mezokortikolimbilise DA täielikumat taastamist; DD ja kontrollhiired süstiti kahepoolselt AAV1-Cre-GFP vektoriga ventralisse tegmentaalsesse piirkonda endogeense Th geeni spetsiifiliseks aktiveerimiseks (joonis 5B).
Immunohistokeemiat kasutati, et tuvastada, millised DA-neuronid ja millised sihtmärgid olid TH-ekspressiooni taastanud. TH-i värvimine puudub päästetud DD hiirtel (Hnasko et al., 2006). Immunohistokeemia näitas, et TH-i taastamine ventraalses tegmentaalpiirkonnas süstitud DD hiirtel oli väga spetsiifiline ventral tegmentaala ja selle sihtmärkide suhtes (joonis 5E, H, K). Dorsaalses striatumis oli vähe TH-i värvimist, mis oli peamine sihtmärk DA-neuronitest, mis pärinevad firmaga nigra pars compacta (joonis 5H), samal ajal kui tuumad akumleraatidel ja basolateraalsel amygdalal oli tugev TH-ekspressioon (joonis 5H, K).
Ventral tegmental -piirkonnas süstitud hiirtele viidi sama 3-päeva hirmu-võimendav üllatusparadigma nagu basolateraalne amygdala süstitud hiir (joonis 6B). Põrutundlikkus, lühiajaline mälu ja pikaajaline mälu taastati kontrolltasemeks ventraalses tegmentaalses piirkonnas süstitud DD hiirtel. Amortisatsioonireaktiivsus treeningute ajal oli rühmade vahel sama (kontroll: 1653 ± 268 versus VTA-päästetud DD: 1602 ± 198). Need andmed viitavad sellele, et ventral tegmentaalsest piirkonnast pärinevad DA-projektsioonid on piisavad lühiajalise ja pikaajalise cued-hirmu mälu ning kontekstist sõltuva šokitundlikkuse tekitamiseks.
Arutelu
Need tulemused näitavad, et hirm-võimendatud hämmastuse abil mõõdetud hirmuhaigustuse korral on DA vajalik. DD hiirtel ei esinenud hirm-võimendatud hämmastust, kui DA ei taastunud kohe pärast treeningut. DD hiirtel on ka lühiajaline mälu ja šoki sensibiliseerimine. Tähtis on see, et DA-depleteeritud DD hiirtel ei olnud prepulsi inhibeerimine madalam, mis näitab, et DA-i puudumisel ei vähendata sensorimotori väravat. Varasemad uuringud on näidanud, et DA-transmissiooni võimendavad psühhostimulandid võivad alandada prepulsi inhibeerimist (Schwarzkopf et al., 1992; Bubser ja Koch, 1994; Ralph jt, 1999; Swerdlow jt, 2006; Doherty et al., 2007; Doherty et al., 1993; teised on näidanud, et dopamiini retseptorite farmakoloogiline inhibeerimine suurendab prepulsi inhibeerimist (Schwarzkopf et al., 1997; Depoortere et al., 1976). Kooskõlas nende tulemustega oli DD hiirtel väike, kuid märkimisväärne prepulsi inhibeerimise suurenemine kontrollhiirte üle. Varasemad uuringud on samuti näidanud, et DA-retseptorite farmakoloogiline inhibeerimine võib vähendada akustilist hämmastust (Davis ja Aghajanian, 1993; Schwarzkopf jt, 1993). Dopamiini kadunud DD hiirtel ei olnud oluliselt muutunud akustilise hämmastuse vastuseid; siiski esines suundumus vähendada ravivastuseid võrreldes kontrollidega, eriti suure stimulatsiooni intensiivsusega, mis on kooskõlas eelmiste aruannetega (Schwarzkopf et al., XNUMX).
Siin esitatavad andmed näitavad selgelt, et DA ei ole oluline kiip-sõltuva hirmu mälu leidmiseks või avaldamiseks, sest DD hiired ei nõua DA-lt testiseansi ajal, et väljendada hirmu-potentseeritud hämmastust, mis oli varem saadud L-Dopa süstimisega vahetult pärast koolitus. Peale selle väidavad meie eksperimendid, et DA on vaja treeningu ajal algse stiimuli töötlemiseks, sest DD-hiired olid dopamiini kadunud kõigi treeningute ajal. Selle asemel näitavad meie andmed, et DA on vajalik mälujälje varaseks stabiliseerimiseks, sest DD hiired ei väljenda lühiajalist mälu ja pikaajaline mälu on nähtav ainult siis, kui L-Dopa manustatakse kohe, kuid mitte 1 hr pärast. koolitus. Arvatavasti DD-hiirte süstimine L-Dopaga kohe pärast treeningut stabiliseerib mälu jälje, võimaldades neil siseneda pikaajalisse vormi. Hirmuäratavuse seisukohalt otsustava tähtsusega aju piirkondades, mis võimaldavad sellist hirmu mälu stabiliseerimist, võivad AER-i piirkondades püsivad ärritavad stiimulid põhjustada pikaajalist tõusu (Abercrombie et al., 1989; Kalivas ja Duffy, 1995; Doherty ja Gratton, 1997; Inglis ja Moghaddam, 1999; 2003). Kooskõlas meie andmetega on teised näidanud, et DA-funktsiooni treeningujärgsed manipulatsioonid muudavad hirmuga seotud mälu (Bernaerts ja Tirelli, 2004; Lalumiere jt, 2005; LaLumiere jt, XNUMX).
Meie tulemused näitavad, et hirm-potentseeritud üllatuseks on vajalikud mitmed DA-retseptori alatüübid. D1R KO hiirtel puudub hirm-potentseeritud hämmastuse jaoks lühiajaline ja pikaajaline mälu, mis viitab selle retseptori alatüübi olulisele rollile DA mõjude vahendamisel kihisõltuva hirmuõppes. Huvitav on, et kontekstist sõltuv hirmuõpe oli D1R KO hiirtel terved. Need andmed kinnitavad teisi uuringuid, mis näitavad, et D1R-i sarnased antagonistid nõrgendavad kii-tingitud hirmuõpet, mõjutamata šoki sensibiliseerimist, ning näitavad, et nende eksperimentide farmakoloogilised manipulatsioonid olid spetsiifilised D1R-i suhtes (Lamont ja Kokkinidis, 1998; Guarraci et al., 1999) . Need andmed on samuti kooskõlas uuringutega, mis demonstreerivad D1R-i kriitilist rolli teistes cue-sõltuvates õppimisparadigmades (Smith et al., 1998; Eyny ja Horvitz, 2003).
D2R KO-l oli terve hirm-potentseeritud üllatus, kuid puudus šokitundlikkus. Greba et al. (2001) on näidanud, et D2R-i intra-amygdalarne antagonism põhjustas šoki sensibiliseerimise halvenemist ja hirm-potentseeritud hämmastust, ilma et see mõjutaks algtaseme hämmastust või vastuseid jalatsile. D2R-i aktiveerimine viib BLA-sse pikaajalise võimenduse esilekutsumiseni, mis eeldatavasti oleks elulise tähtsusega hirm-potentsiaalse hirmumälu jaoks (Bissiere et al., 2003). Meie andmed näitavad, et D2R ei ole vajalik cue-sõltuva hirmu õppimise jaoks, vaid et see DA-retseptori alatüüp on kontekstist sõltuva šoki sensibiliseerimise jaoks oluline. D2R KO hiirte süstimine süstemaatiliselt D2-i sarnase antagonisti etiklopriidiga enne treeningut takistas hirm-võimendatud hämmastust; seetõttu on tõenäoline, et teised D2R-sarnased retseptorid, mis on samuti inhibeeritud etiklopriidiga, on kriitilise tähtsusega hirm-potentseeritud hämmastuses (Sigala et al., 1997; Bernaerts ja Tirelli, 2003; Laviolette et al., 2005; Swant ja Wagner; , 2006). Seega võib D2-i sarnaste antagonistide poolt eelnevalt läbiviidud uuringutes põhjustatud cue-sõltuva õppe kahjustusi seostada nende ravimitega, mis pärsivad teisi D2R-i pereliikmeid.
Endogeensete TH-de selektiivne taastamine ventraalsesse tegmentaalsesse piirkonda viis DD hiirtel õppimise taastamiseni. Immunohistokeemia näitas, et TH taastati tähtsateks limbilisteks tuumadeks, nagu tuumad akumeenid ja basolateraalne amygdala, kuid mitte seljaga. Lisaks oli TH-i suhtes väga vähe neuroneid sisuliste pars compacta puhul. Need andmed näitavad, et ventral tegmental area neuronitest pärinev DA on oluline cued- ja kontekstuaalsete hirmude raviks.
Hiired, kellel oli selektiivne DA taastumine basolateraalsesse amygdala, väljendasid lühiajalist mälu, kuid mitte pikaajalist mälu või šokitundlikkust. Varasemad uuringud on näidanud, et DA hõlbustab amygdala funktsiooni GABAergilise inhibeeriva tooni muutuste kaudu ja seda toimet vahendavad kas D1R või D2R (Bissiere et al., 2003; Kroner jt, 2005; Marowsky jt, 2005; Marowsky et al., 1995). Siin esitatud andmed näitavad, et DA basolateraalses amygdalas on kriitilise tähtsusega lühiajalise mälu omandamiseks hirm-potentseeritud hämmastuse eest, kuid see ei ole piisav mälu pikaajaliseks stabiilsuseks. Lühiajalise mälu taastamist vahendab väike hulk basalateraalseid amygdala projitseerivaid DA-neuroneid, mis pärinevad ventral tegmentaalsest piirkonnast. Endogeensete TH-de laialdasem taastamine ventraalses tegmentaalpiirkonnas päästetud DD-hiirtes tõi kaasa tervet lühi- ja pikaajalist mälu; seetõttu on tõenäoline, et TH taastatakse teistele mesokortikolimbilistele ahelatele, et luua pikaajaline mälu hirmu tekitatud hämmastuse eest. Varasemad uuringud viitavad sellele, et tuumad accumbens ja prefrontaalsed ajukoored võivad olla ka DA tähtsad sihtmärgid hirmu tekitamise ajal (Kalivas ja Duffy, 2000; Murphy et al., 2003; Pezze et al., 2005; LaLumiere et al., 2005; al., 2007, Floresco ja Tse, XNUMX). Seetõttu on võimalik, et pikaajalise mälu moodustamiseks on vaja DA signaaliülekannet kas tuuma accumbensis või prefrontaalses ajukoores.
Kokkuvõttes kasutasime meie uuringus geneetiliste hiiremudelite, farmakoloogia ja piirkonna spetsiifilise päästmise kombinatsiooni, et näidata, et DA on vajalik hirm-võimendatud hämmastuseks, mis on sõltuv hirmust tingitud hirmu tekitamise ülesanne. Need leiud rõhutavad selle neurotransmitteri olulist rolli väljaspool tasu töötlemist. Peale selle näitab meie uuring, et DA-d mõjutavad mitut DA-retseptorit samaaegselt mitmetes aju piirkondades, sõltuvalt hoopis sõltuvast hirmust. Hiljutised uuringud on näidanud, et ventral tegmentaala DA neuronid varieeruvad oluliselt oma molekulaarsetes ja füsioloogilistes omadustes vastavalt sihtmärgile (Ford et al., 2006; Margolis et al., 2006; Bjorklund ja Dunnett, 2007; Lammel et al., 2008; Margolis et al., 2008). Läbiviidud katsed, milles Th-geen oli aktiveeritud selektiivselt DA-neuronites, mis ulatuvad basolateraalsesse amygdala, näitavad, et nad on väikesed, valitud ventral tegmental area neuronite populatsioonid, mitte aga teiste aju piirkondade suhtes väljaulatuvate DA-neuronite tagatised. Meie andmed koos uuringutega, mis näitavad DA neuronide populatsioonide heterogeensust, rõhutavad vajadust mõista iga sellise diskreetse DA ahela rolli. Teadmiste laiendamine DA paljude käitumuslike ja füsioloogiliste funktsioonide kohta, mis hõlmab hirmuõpet, võib viia parema arusaamiseni levinud hirmuga seotud häiretest, nagu traumajärgne stressihäire, obsessiiv-kompulsiivne häire ja generaliseerunud ärevushäire.
Tunnustused
Seda uurimist toetasid osaliselt rahvatervise teenistus, National Research Service Award, T32 GM07270, riiklikust meditsiiniteaduste instituudist ja NIH riiklikest meditsiiniteaduste instituutidest Grant 4 R25 GM 058501-05. Täname Ilene Bernsteini, Lisa Beutleri, Charles Chavkinit ja Larry Zweifeli abistavate kommentaaride eest käsikirjas, Albert Quintana histoloogias abi ja Valerie Wall hiire kolooniate hooldamiseks. Täname ka Dr. Miguel Chillonit (CBATEGi vektoritootmisüksus Barcelona ülikoolis Autonoma's) CAV2i ja Matthew ajal AAV1i viiruse eest.
viited
1. Abercrombie ED, Keefe KA, DiFrischia DS, Zigmond MJ. Rõhu diferentsiaalne mõju in vivo dopamiini vabanemisele striatumis, tuumakinnisuses ja keskmises frontaalses ajukoores. J Neurochem. 1989: 52: 1655 – 1658. [PubMed]
2. Bernaerts P, Tirelli E. Dopamiini D4 retseptori agonisti PD168,077 57 hõlbustav toime inhibeeriva vältimise õpitud vastuse mälu konsolideerimisele C6BL/2003J hiirtel. Behav Brain Res. 142;41:52–XNUMX. [PubMed]
3. Bissiere S, Humeau Y, Luthi A. Dopamiin väravad LTP induktsiooni külgsuunalise amygdala juures, pärssides ettepoole suunatud inhibeerimist. Nat Neurosci. 2003: 6: 587 – 592. [PubMed]
4. Bjorklund A, Dunnett SB. Dopamiini neuronite süsteemid ajus: uuendus. Trends Neurosci. 2007: 30: 194 – 202. [PubMed]
5. Bubser M, Koch M. Rottide akustilise ehmatusvastuse prepulsi pärssimist vähendavad 6-hüdroksüdopamiini kahjustused mediaalses prefrontaalses ajukoores. Psychopharmacology (Berl) 1994;113:487–492. [PubMed]
6. Davis M, Aghajanian GK. Apomorfiini ja haloperidooli mõju akustilisele ehmatusreaktsioonile rottidel. Psychopharmacology (Berl) 1976;47:217–223. [PubMed]
7. de Oliveira AR, Reimer AE, Brandao ML. Dopamiini D2 retseptori mehhanismid tingitud hirmu ekspressioonis. Pharmacol Biochem Behav. 2006: 84: 102 – 111. [PubMed]
8. Depoortere R, Perrault G, Sanger DJ. Ehmatusrefleksi prepulsi pärssimise võimendamine rottidel: protseduuri farmakoloogiline hindamine antipsühhootilise aktiivsuse tuvastamise mudelina. Psychopharmacology (Berl) 1997;132:366–374. [PubMed]
9. Doherty JM, Masten VL, Powell SB, Ralph RJ, Klamer D, Low MJ, Geyer MA. Dopamiini D1, D2 ja D3 retseptori alatüüpide panus kokaiini häirivale mõjule prepulsi pärssimisele hiirtel. Neuropsühhofarmakoloogia. 2007;12:12.
10. Doherty MD, Gratton A. NMDA retseptorid nucleus accumbensis moduleerivad stressist põhjustatud dopamiini vabanemist nucleus accumbensis ja ventraalses tegmentaalses piirkonnas. Sünaps. 1997;26:225–234. [PubMed]
11. Drago J, Gerfen CR, Lachowicz JE, Steiner H, Hollon TR, Love PE, Ooi GT, Grinberg A, Lee EJ, Huang SP jt. Muutunud striataalne funktsioon mutantsel hiirel, kellel puuduvad D1A dopamiini retseptorid. Proc Natl Acad Sci US A. 1994;91:12564–12568. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
12. Eyny YS, Horvitz JC. D1- ja D2-retseptorite vastandlikud rollid isuäratavas seisundis. J Neurosci. 2003;23:1584–1587. [PubMed]
13. Floresco SB, Tse MT. Inhibeeriva ja ergastava ülekande dopamiinergiline regulatsioon basolateraalses amygdala-prefrontaalses kortikaalses rajas. J Neurosci. 2007;27:2045–2057. [PubMed]
14. Ford CP, Mark GP, Williams JT. Mesolimbiliste dopamiini neuronite omadused ja opioidide inhibeerimine varieeruvad vastavalt sihtkohtale. J Neurosci. 2006: 26: 2788 – 2797. [PubMed]
15. Greba Q, Kokkinidis L. Dopamiini D1 retseptori antagonisti SCH 23390 perifeerne ja intraamügdalaarne manustamine blokeerib hirmust tingitud ehmatuse, kuid mitte šokireaktiivsust ega akustilise ehmatuse šokitundlikkust. Neurosci käitumine. 2000;114:262–272. [PubMed]
16. Greba Q, Munro LJ, Kokkinidis L. Ventraalse tegmentaalse piirkonna kolinergiliste muskariiniretseptorite kaasamine klassikaliselt konditsioneeritud hirmu väljendusesse, mõõdetuna hirmuga võimendatud ehmatusega. Brain Res. 2000;870:135–141. [PubMed]
17. Greba Q, Gifkins A, Kokkinidis L. Amügdaloidi dopamiini D2 retseptorite pärssimine kahjustab emotsionaalset õppimist, mida mõõdetakse hirmust tingitud ehmatusega. Brain Res. 2001;899:218–226. [PubMed]
18. Guarraci FA, Kapp BS. Ventral tegmentaala dopamiinergiliste neuronite elektrofüsioloogiline iseloomustus diferentseeritud pavlovia hirmu puhul, mis ilmutab ärkvel küülikus. Behav Brain Res. 1999: 99: 169 – 179. [PubMed]
19. Guarraci FA, Frohardt RJ, Kapp BS. Amügdaloid D1 dopamiini retseptori osalus Pavlovi hirmu konditsioneerimises. Brain Res. 1999;827:28–40. [PubMed]
20. Guarraci FA, Frohardt RJ, Falls WA, Kapp BS. D2 dopamiini retseptori antagonisti intra-amügdaloidsete infusioonide mõju Pavlovi hirmu konditsioneerimisele. Neurosci käitumine. 2000;114:647–651. [PubMed]
21. Hnasko TS, Perez FA, Scouras AD, Stoll EA, Gale SD, Luquet S, Phillips PE, Kremer EJ, Palmiter RD. Cre rekombinaasi poolt vahendatud nigrostriataalse dopamiini taastamine dopamiinipuudulikel hiirtel muudab hüpofaagia ja bradükineesia. Proc Natl Acad Sci US A. 2006;103:8858–8863. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
22. Horvitz JC. Mesolimbokortikaalsed ja nigrostriataalsed dopamiini vastused olulistele mittetasuvatele sündmustele. Neuroteadus. 2000;96:651–656. [PubMed]
23. Inglis FM, Moghaddam B. Amygdala dopamiinergiline innervatsioon on stressi suhtes väga tundlik. J Neurochem. 1999: 72: 1088 – 1094. [PubMed]
24. Inoue T, Izumi T, Maki Y, Muraki I, Koyama T. Dopamiini D(1/5) antagonisti SCH 23390 mõju konditsioneeritud hirmu omandamisele. Pharmacol Biochem Behav. 2000;66:573–578. [PubMed]
25. Joshua M, Adler A, Mitelman R, Vaadia E, Bergman H. Midbrain dopamiinergilised neuronid ja striatu kolinergilised interneuronid kodeerivad erinevust tõenäosuslike klassikaliste konditsioneerimiskatsete erinevates epohhites esinevate tasu ja aversiivsete sündmuste vahel. J Neurosci. 2008: 28: 11673 – 11684. [PubMed]
26. Kalivas PW, Duffy P. Dopamiini ülekande selektiivne aktiveerimine tuumakesta kestas stressi tõttu. Brain Res. 1995: 675: 325 – 328. [PubMed]
27. Kelly MA, Rubinstein M, Asa SL, Zhang G, Saez C, Bunzow JR, Allen RG, Hnasko R, Ben-Jonathan N, Grandy DK, Low MJ. Hüpofüüsi laktotroofne hüperplaasia ja krooniline hüperprolaktineemia dopamiini D2 retseptori puudulikkusega hiirtel. Neuron. 1997;19:103–113. [PubMed]
28. Koch M. Hämmastuse neurobioloogia. Prog Neurobiol. 1999: 59: 107 – 128. [PubMed]
29. Kroner S, Rosenkranz JA, Grace AA, Barrionuevo G. Dopamiin moduleerib basolateraalsete amygdala neuronite erutatavust in vitro. J Neurophysiol. 2005: 93: 1598 – 1610. [PubMed]
30. Lalumiere RT, Nguyen LT, McGaugh JL. Treeningujärgsed dopamiini intrabasolateraalsed amygdala infusioonid moduleerivad inhibeeriva vältimise mälu konsolideerimist: noradrenergiliste ja kolinergiliste süsteemide kaasamine. Eur J Neurosci. 2004;20:2804–2810. [PubMed]
31. LaLumiere RT, Nawar EM, McGaugh JL. Mälu konsolideerimise modifitseerimine basolateraalse amygdala või tuuma accumbens kestaga nõuab samaaegset dopamiini retseptori aktivatsiooni mõlemas aju piirkonnas. Õpi Mem. 2005: 12: 296 – 301. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
32. Lammel S, Hetzel A, Hackel O, Jones I, Liss B, Roeper J. Mesoprefrontaalsete neuronite ainulaadsed omadused kahekordse mesokortikolimbilise dopamiinisüsteemi raames. Neuron. 2008;57:760–773. [PubMed]
33. Lamont EW, Kokkinidis L. Dopamiini D1 retseptori antagonisti SCH 23390 infusioon mandelkehasse blokeerib hirmu ekspressiooni tugevdatud ehmatuse paradigmas. Brain Res. 1998;795:128–136. [PubMed]
34. Laviolette SR, Lipski WJ, Grace AA. Mediaalses prefrontaalses ajukoores paiknev neuronite alampopulatsioon kodeerib emotsionaalset õppimist purske- ja sageduskoodidega dopamiini D4 retseptorist sõltuva basolateraalse amygdala sisendi kaudu. J Neurosci. 2005;25:6066–6075. [PubMed]
35. Lemon N, Manahan-Vaughan D. Dopamiini D1/D5 retseptorid võimaldavad uudse teabe hankimist hipokampuse pikaajalise võimendamise ja pikaajalise depressiooni kaudu. J Neurosci. 2006;26:7723–7729. [PubMed]
36. Maren S. Amügdala, sünaptiline plastilisus ja hirmumälu. Ann NY Acad Sci. 2003;985:106–113. [PubMed]
37. Maren S, Quirk GJ. Hirmumälu neuronaalne signaalimine. Nat Rev Neurosci. 2004; 5:844–852. [PubMed]
38. Margolis EB, Mitchell JM, Ishikawa J, Hjelmstad GO, väljad HL. Keskmise aju dopamiini neuronid: projektsioonieesmärk määrab toimepotentsiaali kestuse ja dopamiini D (2) retseptori inhibeerimise. J Neurosci. 2008: 28: 8908 – 8913. [PubMed]
39. Margolis EB, Lock H, Chefer VI, Shippenberg TS, Hjelmstad GO, Fields HL. Kapa opioidid kontrollivad selektiivselt prefrontaalsesse ajukooresse projitseerivaid dopamiinergilisi neuroneid. Proc Natl Acad Sci US A. 2006;103:2938–2942. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
40. Marowsky A, Yanagawa Y, Obata K, Vogt KE. Spetsiaalne interneuroonide alaklass vahendab dopamiinergilist amygdala funktsiooni soodustamist. Neuron. 2005: 48: 1025 – 1037. [PubMed]
41. McNish KA, Gewirtz JC, Davis M. Tõendid kontekstuaalsest hirmust pärast hipokampuse kahjustusi: külmumise katkemine, kuid mitte hirmust tingitud ehmatus. J Neurosci. 1997;17:9353–9360. [PubMed]
42. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG. Dopamiini retseptorid: struktuurist funktsioonini. Physiol Rev. 1998;78:189–225. [PubMed]
43. Murphy CA, Pezze M, Feldon J, Heidbreder C. Dopamiini diferentsiaalne osalus tuuma accumbensi kestas ja tuumas latentse inhibeerimise ekspressioonis aversiivselt konditsioneeritud stiimulile. Neuroteadus. 2000;97:469–477. [PubMed]
44. Pezze MA, Feldon J. Mesolimbic dopaminergilised teed hirmuärastamisel. Prog Neurobiol. 2004: 74: 301 – 320. [PubMed]
45. Pezze MA, Bast T, Feldon J. Dopamiini ülekande tähtsus roti mediaalses prefrontaalses ajukoores konditsioneeritud hirmu korral. Tserebi ajukoor. 2003;13:371–380. [PubMed]
46. Ponnusamy R, Nissim HA, Barad M. D2-i sarnaste dopamiiniretseptorite süsteemne blokeerimine hõlbustab konditsioneeritud hirmu väljasuremist hiirtel. Õpi Mem. 2005: 12: 399 – 406. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
47. Ralph RJ, Varty GB, Kelly MA, Wang YM, Caron MG, Rubinstein M, Grandy DK, Low MJ, Geyer MA. Dopamiini D2, kuid mitte D3 või D4 retseptori alatüüp on hiirtel amfetamiini poolt toodetud prepulsi inhibeerimise katkestamiseks hädavajalik. J Neurosci. 1999;19:4627–4633. [PubMed]
48. Ralph-Williams RJ, Lehmann-Masten V, Otero-Corchon V, Low MJ, Geyer MA. Otsese ja kaudse dopamiini agonistide erinev mõju prepulsi inhibeerimisele: uuring D1 ja D2 retseptori knock-out hiirtel. J Neurosci. 2002;22:9604–9611. [PubMed]
49. Richardson R. Ehmatuse šokitundlikkus: õpitud või tundmatu hirm? Behav Brain Res. 2000;110:109–117. [PubMed]
50. Risbrough VB, Geyer MA, Hauger RL, Coste S, Stenzel-Poore M, Wurst W, Holsboer F. CRF(1) ja CRF(2) retseptorid on vajalikud potentseeritud ehmatuse ja kontekstipõhise, kuid mitte diskreetse vihje jaoks. Neuropsühhofarmakoloogia. 2008;19:19.
51. Rosenkranz JA, Grace AA. Dopamiini poolt vahendatud lõhna tekitatud amygdala potentsiaali modulatsioon pavlovia konditsioneerimise ajal. Loodus. 2002: 417: 282 – 287. [PubMed]
52. Schultz W. Ametlikuks saamine dopamiini ja tasuga. Neuron. 2002;36:241–263. [PubMed]
53. Schwarzkopf SB, Mitra T, Bruno JP. Sensoorsed väravad rottidel, kelle dopamiinisisaldus vastsündinutel on ammendunud: potentsiaalne tähtsus skisofreeniapatsientide leidudele. Biol Psühhiaatria. 1992;31:759–773. [PubMed]
54. Schwarzkopf SB, Bruno JP, Mitra T. Haloperidooli ja SCH 23390 mõju akustilisele ehmatuse ja impulsieelsele pärssimisele põhi- ja stimuleeritud tingimustes. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 1993;17:1023–1036. [PubMed]
55. Sigala S, Missale C, Spano P. Dopamiini D2 ja D3 retseptorite vastupidine mõju roti õppimisele ja mälule. Eur J Pharmacol. 1997;336:107–112. [PubMed]
56. Sigurdsson T, Doyere V, Cain CK, LeDoux JE. Pikaajaline võimendamine mandelkehas: hirmu õppimise ja mälu rakuline mehhanism. Neurofarmakoloogia. 2007;52:215–227. [PubMed]
57. Smith DR, Striplin CD, Geller AM, Mailman RB, Drago J, Lawler CP, Gallagher M. D1A dopamiini retseptorite puudumisel hiirte käitumise hindamine. Neuroteadus. 1998;86:135–146. [PubMed]
58. Swant J, Wagner JJ. Dopamiini transporteri blokaad suurendab LTP-d roti hipokampuse CA1 piirkonnas D3 dopamiini retseptori aktiveerimise kaudu. Õppige Mem. 2006;13:161–167. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
59. Swerdlow NR, Shoemaker JM, Kuczenski R, Bongiovanni MJ, Neary AC, Tochen LS, Saint Marie RL. Eesaju D1 funktsioon ja sensomotoorne väravastamine rottidel: D1 blokaadi mõju, otsmikukahjustused ja dopamiini denervatsioon. Neurosci Lett. 2006;402:40–45. [PubMed]
60. Szczypka MS, Rainey MA, Kim DS, Alaynick WA, Marck BT, Matsumoto AM, Palmiter RD. Söötmiskäitumine dopamiini puudulikkusega hiirtel. Proc Natl Acad Sci US A. 1999;96:12138–12143. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
61. Tark RA. Dopamiin, õppimine ja motivatsioon. Nat Rev Neurosci. 2004; 5:483–494. [PubMed]
62. Zhou QY, Palmiter RD. Dopamiini puudulikud hiired on tõsiselt hüpoaktiivsed, adipsilised ja afagilised. Cell. 1995: 83: 1197 – 1209. [PubMed]
63. Zweifel LS, Argilli E, Bonci A, Palmiter RD. NMDA retseptorite roll dopamiini neuronites plastilisuse ja sõltuvust tekitava käitumise jaoks. Neuron. 2008;59:486–496. [PMC tasuta artikkel] [PubMed]
;