Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Apr; 300 (4): R876 – R884.
Avaldatud Internetis 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Abstraktne
Oleme eelnevalt teatanud, et insuliini manustamine hüpotalamuse kaarjasse tuumasse vähendab rottidel sahharoosi motivatsiooni, mida hinnatakse iseseisva manustamisega. Kuna kesknärvisüsteemi (CNS) aktivatsiooni mustrit koos sahharoosi eneseanalüüsiga ei ole hinnatud, mõõdeti käesolevas uuringus c-Fose ekspressiooni neuronaalse aktivatsiooni indeksina. Me koolitasime rottidele sahharoosipuhvreid vastavalt fikseeritud suhe (FR) või progressiivse suhte (PR) ajakavale ja c-Fose immunoreaktiivsuse kaardistamisele CNS-is, võrreldes c-Fos ekspressiooniga käideldud kontrollides. Me täheldasime c-Fose ainulaadset ekspressiooni mediaalse hüpotalamuse (kaarjas, paraventrikulaarne, retroskoopiline, dorsomediaalne ja ventromediaalne tuum) puhul seoses PR-tulemuse ilmnemisega ja c-Fose ekspressiooni külgneva hüpotalamuse ja vooderdise tuumas. stria terminalis koos FR-tulemuse algusega. c-Fos ekspressioon oli suurenenud nii FR kui PR rottide tuumas. Meie uuringus rõhutatakse nii hüpotalamuse energia homeostaasi skeemide kui ka limbiliste ahelate tähtsust toidu tasustamise ülesande täitmisel. Arvestades mediaalse hüpotalamuse rolli energia tasakaalu reguleerimisel, näitab meie uuring, et see ahel võib aidata kaasa tasustamise reguleerimisele energia homeostaasi suuremas kontekstis.
on leitud, et mesolimbiline dopamiinergiline (DA) skeem, kaasa arvatud ventral tegmental (VTA), ja projektsioonid striatumile ja koore piirkondadele, mängivad olulist rolli paljude kuritarvitatavate ravimite klasside motiveerimisel või rahuldamisel (13, 22-24, 26, 48). Meie laboratooriumi ja teiste uuringute hiljutised uuringud viitavad sellele, et see ahel mängib olulist rolli toidu motiveerivates või tasuvates aspektides. Funktsionaalseid ja anatoomilisi koostoimeid energia homeostaasi reguleerivate skeemidega pakuvad aruanded toidu tasu moduleerimise kohta loomade toitumisalase seisundi alusel (10, 14, 16, 43). Hüvitise moduleerimist, sealhulgas toidukäitumist toitumis- või metaboolse seisundi tõttu mõjutavad tugevalt närvi- ja sisesekretsioonisignaalid, sealhulgas insuliin (15), leptiin (11, 18, 21, 30, 32), ghrelin (35), melaniini kontsentreeriv hormoon (MCH) (45) ja orexin (5, 7): viimaste aastate jooksul on rohkesti näidatud retseptorite olemasolu, biokeemiline ja raku efektiivsus ning nende signaalide in vivo või käitumuslik efektiivsus kesknärvisüsteemis.
Samuti on näidatud, et laiendatud limbiline lülitus mängib rolli söötmisel ja toidu tasustamisel (2, 19, 28). Siiski on täiendavaid kesknärvisüsteemi keskusi. Eriti on teada, et külgmine hüpotalamus (LH) on toitumis- ja stimuleeriva käitumise vahendaja (4, 31). Orexinergilised neuronid ja leptiini signaaliülekanded LH-s on identifitseeritud söötmise ja toidu tasu jaoks oluliseks (5, 29, 30). Hiljuti täheldasime, et insuliin, mida manustatakse kas kolmandasse aju vatsakesse või hüpotalamuse (ARC) kaarjasse tuuma, võib vähendada sahharoosi eneseanalüüsi, kuid insuliini manustamine VTA-sse või tuumaklundidesse ei mõjutanud seda spetsiifilist tasu paradigmat (15). Seega näib, et mitmed hüpotalamuse saidid võivad mängida olulist rolli motiveeritud toidu otsimises ja omandamises ning sellega kooskõlas võib oletada, et hüpotalamuse piirkonnad aktiveeruvad olulisel määral koos toidu enda manustamisega. Selle hüpoteesi testimise alustamiseks oleme kaardistanud c-Fose ekspressiooni rottide kesknärvisüsteemis, kes on koolitatud sahharoosi eneseanalüüsi paradigmaga, pärast fikseeritud suhet (FR) koolitust või pärast progressiivseid suhteid (PR), rangemat ülesannet motivatsiooni hindamiseks (20).
MATERJALID JA MEETODID
Teemad.
Katsealusteks olid isased Albino rotid (325–425 g) Simonsenist (Gilroy, CA). Rotte hoiti chow ad libitum. Neid hoiti 12: 12-tunnises hämaras-pimedas tsüklis, mille tuled põlesid kell 6, ning neid treeniti ja testiti ajavahemikus 7–XNUMX söögijärgses ja postabsorptsioonitingimustes. Kõik rottidele tehtud protseduurid järgisid riikliku tervishoiuinstituudi loomade hooldamise juhiseid ning need kiideti heaks VA Puget Sound Health Care Systemi teadus- ja arenduskomitee loomade hooldamise ja kasutamise allkomitee poolt.
Sahharoos ise-manustamine.
Menetlused põhinesid meie avaldatud metoodikal (15) ja viidi läbi toidetud rottidel. Katse hõlmas kolme faasi: automaatne kujundamine, et alustada koolitust, FR koolitus ja progressiivsed suhted (PR), kasutades Richardsoni ja Roberti PR algoritmi (38). PR-algoritm vajab 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX jne) hoob vajutab seansi jooksul tasu eest (38). Rotid õpetati ise manustama 5% sahharoosi (0.5 ml tasu), mis viidi vedeliku tilgutisse. Medantiinide (Georgia, VT) süsteemiga kontrollitud operantkastidel oli kaks hooba, kuid ainult üks hoob (aktiivne, sissetõmmatav hoob) aktiveeris infusioonipumba. Samuti registreeriti teise hoova nupud (inaktiivne, statsionaarne hoob). Nagu me varem märkisime, oli mitteaktiivse hoova presside arv väga madal (vähem kui 10i pressid / seanss). Sahharoosilahus viidi suukaudseks tarbimiseks mõeldud vedeliku tilgutisse (Med Associates, St. Albans, VT). Esialgne koolitus viidi läbi 1-h sessioonide ajal pideva tugevdusgraafikuga (FR1: iga hoova survet tugevdati). Iga seanss algas aktiivse hoova sisestamisega ja valguse valgustusega, mis oli kogu seansi vältel püsinud. 5-i toon (2900 Hz, 20 dB taustast kõrgemal) ja valgus (7.5 W valge valgus aktiivhoova kohal) diskreetse ühendi kii koos iga tasu kohaletoimetamisega koos 20-i ajaga, mis algas sahharoosi kohaletoimetamisega. FR koolitus viidi läbi 10i päevadel; stabiilne reageerimine saavutatakse viiendal istungjärgul. PR-koolitus viidi läbi 3i päeva maksimaalse võimaliku 10 h / päeva kohta. PR-seansid lõppesid pärast 30 min-i aktiivse hoova vajutamise reageerimist, millisel hetkel tuli maja tuli automaatselt välja ja aktiivhoob tõmbus tagasi; rotid võeti kambritest välja ja viidi tagasi oma kodus puuridesse. "Peatamisaeg" on esitatud Tabel 2 tähistab aega, mil süsteem välja lülitati; seetõttu oleks viimane aktiivse hoova vajutamine toimunud 30 min enne peatamisaega. Käitumisandmed (Tabel 2) esindavad keskmist istungid 6-10 FR koolituseks ja. \ t istungid 1-9 PR-koolituse jaoks. Kontrollkäiguga rotid võeti korpuse ruumist ja paigutati puhtasse operatsioonikambrisse, kus oli majavalgusti, 60 min, protseduuriruumis, et simuleerida sahharoosi ise manustavate rottide käitlemis- ja ruumikogemusi. Neile ei antud operantkarpides midagi süüa ega juua ja neil ei olnud juurdepääsu hoovadele.
Viimasel päeval pandi rotid kambritesse vastavalt treeningpäevadele ja neid hoiti kambrites 90 minutit, pärast mida nad eemaldati anesteesia, perfusiooni ja järgneva immunohistokeemia jaoks. Kontrollrottid toodi samamoodi protseduuriruumi ja hoiti 90 minuti jooksul puhaste operantide kambris vastavalt treeningpäevadele, seejärel anesteseeriti ja perfuseeriti. Kohe pärast seda viimast 90-minutist seanssi tuimastati rotid sügavalt isofluraani sissehingamise teel ja perfusiooniti 0.9% NaCl-ga, millele järgnes külm 4% paraformaldehüüdi lahus. Anesteesia ja eutanaasia ajastamine põhines teadaoleval c-Fos-valgu maksimaalse ekspressiooni ajakulul 90–120 minutit pärast sündmust. Seega peegeldaks c-Fos-i ekspressioon kesknärvisüsteemi aktiveerumist käitumisülesande alguses, selle asemel, et see oleks loomade ülesande kogemise ja sahharoosi sissevõtmise tulemus. Ajud eemaldati ja fikseeriti mitu päeva paraformaldehüüdis; seejärel pandi need seejärel 20% sahharoos-PBS-i, misjärel need pandi 30% sahharoos-PBS-i lahusesse. Ajud jaotati immunohistokeemia jaoks krüostaadil (Leica CM 3050S krüostaat).
c-Fose immunohistokeemia ja kvantifitseerimine.
Me kasutasime oma väljakujunenud metoodikat immunoreaktiivse c-Fos valgu kvantitatiivseks määramiseks ajuosades (12). C-Fos ekspressiooni jaoks viidi läbi kogu aju esialgne kvalitatiivne ekraan. Slaidile monteeritud 12-μm tervet aju koronaalseid sektsioone pesti 3 korda PBS-is (Oxoid, Hampshire, UK). Seejärel blokeeriti sektsioonid 1 h toatemperatuuril PBS-is, mis sisaldas 5% normaalset kitse või eesli seerumit. Seejärel pesti sektsioone mitu korda PBS-is ja inkubeeriti öö läbi 4 ° C juures primaarsetes antikehades, mis valmistati PBS-is. Sektsioone pesti kolm korda PBS-s ja seejärel inkubeeriti pimedas toatemperatuuril sekundaarse antikeha lahuses, mis oli valmistatud PBS-is 1 h-s. Seejärel pesti sektsioone uuesti PBS-is ja paigaldati ning kaeti libisemisega Vectashieldi kõva komplektiga kinnitusvahendisse (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Sektsioonide digitaalsed pildid saadi Nikon Eclipse E-800 fluorestsentsmikroskoobiga, mis on ühendatud Optiphot kaameraga ja kasutades Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) tarkvara.
Seejärel keskendusime piiratud arvule aladele, kus ilmnes ilmne erinevus tingimuste, kvantifitseerimise ja neuronaalsete fenotüüpide vahel. Konkreetsemalt keskendusime tuumade accumbens tuumale ja koorele (NAc); stria terminalis (aBNST, pBNST) eesmine ja tagumine voodi tuum; mediaalsed hüpotalamuse piirkonnad [ventromediaalne tuum (VMH), dorsomediaalne hüpotalamus (DMH), paraventrikulaarne tuum (PVN), retrokeemiline piirkond (RCh) ja ARC]; külgmine hüpotalamus (LH), kaasa arvatud selja- ja vatsakese piirkonnad ning periforniline (peF) piirkond; VTA; aju varras [üksiktrakti madalam oliiviõli, hüpoglossal (nXII) tuum, külgmine retikulaarne tuum ja C1 / A1 adrenaliini / noradrenaliini tuumad]. Atlas-sobitatud 12-μm-sektsioone hinnati c-Fos-i ekspressiooni ja kvantitatiivseks määramiseks sobitatud sektsioonides ja piirkondades, lähtudes Paxinos ja Watsoni atlasest (34). Palun vaata Tabel 1 spetsiifiliste stereotaksiliste koordinaatide jaoks. Analüüside põhieesmärk oli võrrelda iga käitumisülesannet vastavate kontrollidega (PR vs. PRC; FR vs. FRC). Võimalike erinevuste optimeerimiseks käitumise ja kontrollitingimuste alusel valiti analüüsiks PR ja FR rühmade tipptegijad. Seega analüüsiti rottidele 4 / 12 PR ja 3 / 12 FR: Neil rottidel oli aktiivse hoova pressinumber (esmane käitumuslik tulemusnäitaja), mis oli suurem kui üks standardhälve, mis oli suurem kui nende vastavate käitumisrühmade keskmine. Analüüsiti ka kontrollrottide (5 PRC ja 3 FRC rotid, kes esinesid protseduuriruumis samaaegselt FR või PR rottidega) alamkohti. FR protseduuri (“FRext”) abil võeti täiendav kolme rottide rühm, et jäljendada PR-protseduuri lisatud kestust (st kokku 20-päeva, kui PR-rottide võtmine läbi FR ja seejärel PR), et hinnata, kas: FR ja PR erinevused tulenesid käitumisülesandest või menetluse kestusest. FRext'i ajusid ei analüüsitud ja skriinitud süstemaatiliselt, kuid huvipakkuvaid piirkondi analüüsiti teiste nelja rühmaga, et võimaldada võrdlevat kvantitatiivset määramist, nagu on näidatud konkreetselt tulemustes.
Kvantitatiivseks määramiseks (40 × suurendusega) valiti atlasega sobitatud piirkonnad. Soovitud ala kujutise pildistamiseks kasutati tarkvara ImagePro Plus (Media Cybernetics). Loendamiseks määratleti ala ja positiivse rakkude arvu lävi määrati. Sama ala ja taust (künnis) kasutati vastavate katserühmade sektsioonide jaoks ja positiivsete rakkude (kvantitatiivne) tarkvara loendamine viidi läbi kõikides katserühmades samas sessioonis, et vältida seansi muutusi taustaseadetes. Statistilise analüüsi jaoks võeti loend üksikust rottist ainult siis, kui iga ala ulatuses (nagu on määratletud. \ T Tabel 1) olid kättesaadavad; andmeid konkreetse piirkonna kohta ei võetud rottilt, kui selles piirkonnas oli puudulik kahepoolne esindatus.
Kvalitatiivne topeltmärgistatud immunofluorestsentsanalüüs.
Rottidelt, kus kvantifitseeriti c-Fos, võeti aju lõigud topeltmärgistatud immunohistokeemia jaoks. Kuna me ei tahtnud häirida loomade käitumist, ei töödeldud neid peptiidneurotransmitterite visualiseerimise optimeerimiseks kolhitsiiniga. Seetõttu oli isehaldamise ülesandega seoses aktiveeritud neuronifenotüüpide visualiseerimine piiratud. Aktiveeritud neuronite fenotüüpide hindamise alustamiseks paljudes kesknärvisüsteemide kohtades võeti digitaalsed pildid (mis on saadud ülaltoodud jaotises kirjeldatud viisil) suurendusega 20 ×, 40 × või 60 × (nagu jooniselegendites näidatud) . Glutamaatdekarboksülaasi (GAD), türosiinhüdroksülaasi (TH), CRF, neuropeptiidi Y (NPY), Agoutiga seotud peptiidi (AgRP) ja trüptofaanhüdroksülaasi kahevärvimisprotseduur oli võrreldav selle c-Fos-immunoreaktiivsuse analüüsiga. oma, välja arvatud see, et c-Fos-Ab ja ühe teise primaarse antikeha segu kasutati üleöö inkubeerimiseks temperatuuril 4 ° C; samuti olid mõlemad sekundaarsed antikehad samas lahuses ja inkubeeriti 1 tund pimedas toatemperatuuril. Oreksiini testis kasutati enne blokeerimisetappi 20-minutist 50-protsendilist etanoolipesu. Esmaste antikehade sobiva lahjenduse määramiseks viidi läbi esialgsed optimeerimisanalüüsid. Primaarseteks antikehadeks olid küüliku anti-c-Fos (1: 500) (sc-52) ja hiire anti-c-Fos (1: 800) (mõlemad firmalt Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); hiire anti-GAD (1: 1,000), hiire türosiinivastane hüdroksülaas (1: 500) ja lamba anti-trüptofaani hüdroksülaas (kõik firmalt Chemicon, Temecula, CA); küüliku anti-CRF (1: 500) (kingitus dr Wylie Vale, Salki Instituut, CA); küüliku anti-NPY (1: 1,000 1), küüliku anti-AGRP (1,000: 1 5,000) ja kitse anti-oreksiin A (3: 488 1) - kõik firmad Phoenix Pharmaceuticalilt (St. Joseph, MO). Sekundaarseteks antikehadeks olid Cy500-konjugeeritud kitse küülikuvastane või hiirevastane (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Alexa Fluor 1 kitse hiire- või küüliku- või eeslilamba-vastane IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) ; kõik sekundaarsed antikehad lahjendati 2,500: 488 juures. c-Fos / MCH kahekordne immunovärvimine testiti järjestikku; esiteks MCH (1: 500 primaarne antikeha, Millipore) puhul Alexa-5-kitse küülikuvastase (1: 500) sekundaarse antikehaga. Slaidid blokeeriti uuesti 3% normaalse kitseseerumiga ja värviti sekundaarse antikehana anti-c-Fos (20: 50) ja cyXNUMX-kitse küülikuvastased. Enne blokeerimisetappi kasutati XNUMX-minutilist XNUMX% etanoolipesu.
Statistilised analüüsid.
Grupiandmed on tekstis, tabelites ja arvudes esitatud kui keskmised ± SE. Tähendus on määratletud kui P ≤ 0.05. Statistilisi võrdlusi tehakse katserühmade (FR vs PR) või katserühmade ja vastavate kontrollrühmade (PR vs PRC; FR vs FRC) vahel, kasutades paardumata üliõpilaste t-test. Pearsoni korrelatsioonikordajad aktiivsete kangi vajutuste ja c-Fos-i ekspressiooni vahel erinevates ajupiirkondades, samuti c-Fos-i ekspressiooni korrelatsioon erinevate ajupiirkondade vahel ühesugustes katsetingimustes arvutati StatPlus: mac LE statistilise analüüsi programmi abil Mac OS-i versioonile 2009 by AnalystSoft. Testisime lineaarseid seoseid (Pearsoni R c) Fos ekspressiooni vahel erinevates kesknärvisüsteemides. Uurisime ka seoseid c-Fos ekspressiooni vahel erinevates aktiveeritud kesknärvisüsteemi piirkondades ja käitumises. Nende korrelatsioonide jaoks kasutati rottide FR ja PR andmeid, mille puhul tehti c-Fose kvantitatiivne määramine.
TULEMUSED
c-Fose kvantifitseerimine.
Nagu me varem märkisime, oli aktiivse hoova presside arv oluliselt suurem PR ja FR jõudluse korral (Tabel 2) ja sahharoositasude arv oli FR-tulemuste ajal suurem. PR rottide seansi pikkus oli umbes 90 min (peatusaeg - 30). Tabel 3 loetleb c-Fose immunoreaktiivsed rakkude arv kõikides kesknärvisüsteemi piirkondades, kus kvantifitseerimine viidi läbi. FR ja PR rottide c-Fos ekspressiooni muster on kokkuvõtlikult esitatud Joon. 1. Mediaalse hüpotalamuse (MHkuniARC, PVN, RCh, DMH ja VMH kompositsioon, mis on seotud PR-hoobaga, mis vajutas sahharoosi, kuid üldise aktiveerumisega rottidel, kes tegelevad FR-hoobaga, sahharoosi kasutamisel, võrreldes vastavate kontrollidega. PR rottide mediaalse hüpotalamuse sees toimus see aktiveerimine PVN, ARC ja VMH (Joon. 2). FR-hoova vajutamine, kuid mitte PR-hoova vajutamine, oli seotud olulise aktivatsiooniga LH-s (põhineb peamiselt perifornilise piirkonna aktivatsioonil). Nii aktiivhoova kui ka hüpotalamuse c-Fos ekspressioon olid FRext ja FR rühmade vahel võrreldavad (MHkuni, 946 ± 26 ja 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 ja 186 ± 10; LHkuni, 468 ± 79 ja 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 ja 173 ± 15), mis viitab sellele, et FR ja PR rühmade ekspressioonimustri erinevus ei ole seotud koolituse / kogemuse kestusega, vaid instrumentaalse ülesande olemusega. FR-rühma puhul täheldati BNST-s oluliselt c-Fos-i ekspressiooni suurenemist, mida täheldati nii aBNST-s kui ka pBNST-is. Nii FR kui ka PR hoova vajutamine oli seotud suurenenud c-Fos-immunopositiivsete neuronitega NAc kestas; c-Fos loendused suurenesid märkimisväärselt NA-südamikus rottide puhul, kes kasutasid FR-hoova vajutamist, kusjuures mittevajalik suundumus suurenenud c-Fos ekspressiooni suhtes rottidel, kes kasutasid PR-hoova vajutamist. c-Fos ei suurenenud VTA-s PR-ülesannetega, kuigi FR-ülesande puhul täheldati märkimisväärset suundumust suurenemise suunas. Lõpuks suurenes c-Fos hüpoglüalaalses (kraniaalnärvi XII) tuumas PR-sse koolitatud rottide ajukannas, kuid mitte FR-s.
c-Fose ekspressiooni täheldati teistes kesknärvisüsteemi piirkondades, sealhulgas amygdala ja ajukoores (Joon. 3). Kuid ekspressiooni täheldati nii kontrolltingimustes kui ka seoses PR- ja FR-ülesannetega, mis viitab sellele, et protseduuri mittespetsiifilised aspektid (käitlemine, protseduuriruumi liikumine) võisid selle aktiveerimise tulemuseks olla. Kvantitatiivne arv nendes piirkondades ei toimunud. Samamoodi täheldati aktiveerimist aju tüviregioonides peale nXII, kuid see esines koos kontroll- ja ülesannetega seotud tingimustes, mis viitab ka rolli mittespetsiifilisele erutusele või käitumuslikule aktiveerimisele.
Testisime c-Fos-i ekspressiooni vahelisi seoseid erinevates kesknärvisüsteemi piirkondades. Kombineerides hoova vajutavate rühmade andmeid, leidsime negatiivse korrelatsiooni c-Fos-i ekspressiooni vahel LH-s ja VMH-s; seega oli VMH aktiveerimine seotud LH (Pearsoni R, -0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Samuti täheldasime olulist positiivset korrelatsiooni c-Fos-i ekspressiooni vahel LH perifeerilises piirkonnas ja VTA-s (Pearsoni R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), mis on kooskõlas teadaoleva monosünaptilise ühendusega nende kahe piirkonna vahel (vt arutelu viitenumbrites). 2 ja 13). Leidsime olulise negatiivse korrelatsiooni c-Fos-i ekspressiooni vahel VTA-s ja NAc-kestas, sõltumata sellest, kas seda testiti eraldi FR-jõudluse suhtes (Pearsoni R, -0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) või PR-jõudluse jaoks (Pearsoni omad R, -0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), mis vastab teadaolevatele vastastikku sisenditele striatali piirkondade ja nigra ja VTA vahel (2, 13). Samuti testisime korrelatsioone c-Fos-i ekspressiooni erinevates kesknärvisüsteemi piirkondades ja käitumise vahel. Kombineerides hoova vajutamise rühmade andmeid, täheldasime olulist positiivset korrelatsiooni ARC-s olevate c-Fos ja aktiivsete kangide vajutuste vahel (Pearsoni R, 0.8208; t = 3.8017; P =
Sahharoosisisaldusega aktiveeritud neuronite identifitseerimine ja sahharoosi motivatsioon.
Aju tüves ei näidanud c-Fos-positiivsed neuronid TH-i suhtes positiivset immuunvärvi, mis on epinefriini ja norepinefriini (ja dopamiini) kiirust piirav ensüüm; seega ei tundunud, et FR või PR ülesanded aktiveerivad need katehhoolamiinergilised neuronid. Siiski näitasid mõned c-Fos-positiivsed neuronid trüptofaanhüdroksülaasi suhtes positiivset immuunsust, mis näitab, et serotoniini neuronite populatsioon aktiveerus. Nagu näidatud Joon. 4ARC-s ümbritsesid c-Fos-positiivsed rakukehad AGRP-ga värvitud kiududega ja täheldati samasugust mustrit NPY-kiud / c-Fos-immunovärvimiseks (pole näidatud). VAT-s näisid CR-positiivsed neuronid c-Fos-positiivsed neuronid, kuid kolokalisatsiooni ei täheldatud (andmeid pole näidatud). Joon. 5 näitab nii oreksiini kui ka MCH immunoloogilist värvimist LH-s. Oxxin neuronid leiti nii dLH kui ka peLH-s. Kuigi me täheldasime MCH-positiivseid neuroneid peLH-s, ei esinenud LH-i piirkonnas c-Fos'ga kolokalisatsiooni. Kuid me täheldasime c-Fose kolokalisatsiooni oreksiini positiivsetes neuronites peLH-s (Joon. 6, ülemine) ja väga piiratud c-Fose kolokaliseerimine MCH-ga vLH-s (Joon. 6, põhi). Tuleb rõhutada, et nii lokaliseerimine kui ka kolokaliseerimine c-Fosiga võib peptiidi neurotransmitterite nagu CRH puhul alahinnata, sest rotte ei ravitud kolhitsiiniga. Lõpuks, tuuma accumbens südamikus ja kestas (Joon. 7) täheldati nii FR kui ka PR rottide puhul GAD-ga koos immuniseerivat c-Fos, mis on neurotransmitteri GABA sünteetiline ensüüm. TH oli VTA-s kindel; siiski täheldati harva c-Fos-positiivseid neuroneid ja nad ei tundunud olevat ainult TH-ga kolokaliseerunud.
ARUTLUS
Käesolevas uuringus kasutasime vahetu varajase geeni c-Fos ekspressiooni, et hinnata akuutse kesknärvisüsteemi aktivatsiooni mustrit, mis on seotud sahharoosiga iseseisva hoova vajutamisega, kas suhteliselt mittevajaliku ülesandena (FR) või järk-järgult keerulisem ülesanne, mis peegeldab motiveeritud tasu otsimist, nagu sahharoos, ja tugevalt seotud limbilise ahelaga (22, 24, 49) (PR). Hüpotalamuse aktiveerimismustrid erinesid kahe ülesande vahel, kusjuures FR-ülesandes domineeris LH / limbiline aktiveerimine ja PR-ülesandes domineeriv mediaalne hüpotalamuse / limbiline aktivatsioon (vt Joon. 1). Sellel on mitu võimalikku põhjust. Esiteks võivad need paradigmid „kaardistada” KNS-is kvalitatiivselt erineva kogemusena. FR-i tulemusena koolitatud rotid ootavad lihtsat ja suure tasuga tegevust. Tasulise toidu prognoosimine peaks tugevalt mõjutama FR-rottidel täheldatud c-Fos-mustrit. Ilmselge kvalitatiivne erinevus aktiveerimismustris viitab sellele, et teine võimalus - et PR-loomadel on ülesande kohta rohkem kogemusi - on vähem tõenäoline ja seda toetas meie c-Fose mõõtmine rottide hüpotalamuses, kes said 20 FR-seansse , mis näitas FR rühma sarnast tegevust, mitte PR-rühma. Mõlemat võimalust saab testida, suurendades süstemaatiliselt FR väljaõppe raskust ja hinnates muutusi kesknärvisüsteemi aktiveerimisel, millisel juhul ennustatakse aktiveerimismustri kvalitatiivset muutust. Siiski, kuigi koolitusel saadud kogemuste arv ei pruugi kesknärvisüsteemi aktiveerimismustrit arvesse võtta, võib istungil saadud sahharoosihüvitiste keskmine arv: PR-ülesannet võib lihtsalt õppida kui “vähem rahuldust andvat” kogemust ja see võib olla funktsionaalselt seotud LH aktivatsiooni puudumine. Seega võib kesknärvisüsteemi aktiveerimismuster seansi alguses kajastada interotseptiivset seisundit, nagu konditsioneeritud koha paradigma: limbilise ahela aktiveerimise tugevus on seotud õppimise ja motivatsiooniga. Me täheldasime c-Fose ekspressiooni varieeruvust FRC loomade mediaalses hüpotalamuses. Eriti käibemaksus võib see varieeruda FR-rottide aktiveerimise varjamises, mille puhul täheldati suurenenud c-Fos-roti ja FRC-rottide suundumust (Tabel 3). Siiski ei erinenud üldine meditsiiniline hüpotalamuse aktiveerimine FR ja FRC loomade vahel.
Tuleb märkida, et kuigi meie eesmärk oli tuvastada kesknärvisüsteemi saidid, mis aitavad kaasa käitumise algusele, on ajaline lahutus mõnevõrra kaalutletud. Nagu allpool kirjeldatud, on nüüd arusaadav, et erinevate neuronite populatsioonide aktiveerimine vahendab instrumentaal- või operant-käitumise erinevaid komponente.13, 23, 33, 49). Me ei saa täielikult välistada, et aktiveerimine, mis on tingitud väga kohest bar-pressimisest või hüvedest, võib olla mõnevõrra kaasa aidanud meie täheldatud aktiveerimismudelitele. Meie tulemused annavad aluse täiendavate uurimiste läbiviimiseks konkreetsete kesknärvisüsteemide rollide kohta iseseisva ülesande erinevates aspektides või komponentides ning selliste uuringute puhul, teiste otseste varajaste geenide mõõtmist erinevate "sisselülitatud" ja "väljalülitatud" ajagraafikutega (36) on väga kasulik.
C-Fos-i ekspressioonis leitud korrelatsioonid erinevate aju piirkondade vahel toetavad hüpotalamuse ja primaarsete limbiliste piirkondade tuntud funktsionaalset ühenduvust selle konkreetse tasuülesande jaoks, näiteks LH ja VMH vahel ning LH ja VTA perforaalse piirkonna vahel. (vt arutelu viites. 2 ja 13). Uurisime ka seoseid c-Fos ekspressiooni vahel erinevates aktiveeritud piirkondades ja käitumist. ARC-s olevate c-Fos-i ja aktiivse hoova presside vaheline korrelatsioon sobib ARC aktiivsuse täpselt määratletud rolliga toidutarbimises (1); meie eelmise tähelepanekuga, et insuliini süstimine konkreetselt ARC-sse vähendas sahharoosi \ t15); eelnevate aruannetega ARC ja selle endorfiinergiliste neuronite kriitilisest rollist kokaiini eneseanalüüsi omandamisel ja läbiviimisel (40-42); ja ARC-lt kindlaksmääratud prognoosid NAc-le (17). Seega mängib ARC tõenäoliselt olulist rolli motiveeritud käitumises, et otsida ja saada mitmesuguseid rahuldust andvaid stiimuleid, sealhulgas, kuid mitte ainult, toitu. Lõpuks täheldati PR ja sahharoosiga otsimise alguses olulist PVN ja VMH aktivatsiooni. See on kooskõlas nende mediaalse hüpotalamuse tuumade hästi iseloomustatud rollidega toidu tarbimise reguleerimises, otseses sünaptilises ühenduses ARC-ga ja identifitseeritud ühendustega limbilise ahelaga (1, 27, 37).
Me leidsime olulise negatiivse korrelatsiooni VTA-s esineva c-Fos-i ekspressiooni ja NAc-kesta vahel, olenemata sellest, kas seda testiti FR-i või PR-i puhul. Oli mõnevõrra üllatav, et tugevamat VTA aktivatsiooni ei täheldatud seoses PR või FR sahharoosi enesega manustamisega (võrreldes vastavate kontrollidega). Võib-olla peegeldab see leid meie mõõtmise ajastust, keskendudes potentsiaalsetele kesknärvisüsteemidele, mis toimivad ülesande alguses ja mille jaoks need loomad olid hästi koolitatud. See oleks kooskõlas Schultzi tähelepanekute ja väitekirjaga (44), et dopamiini neuronaalne aktiveerimine toimib ootamatute stiimulite või hüvede markerina ning see aktiveerimine väheneb koos koolitusega. Siiski on tõestatud, et striatsioosse dopamiini vabanemine sukroosi võtmise ajal treenitud loomadel on väga täpne ja ajaliselt diskreetne sündmus (39). Seega on võimalik, et suundumused, mida me täheldasime, oleksid suurema uuringurühma (st rohkem statistilise jõu) tõttu väga olulised. Me täheldasime NAc aktivatsiooni koos FR ja PR sahharoosi võtmisega. Nii NAc neuronite aktiveerumist kui ka inhibeerimist on kirjeldatud seoses instrumentaalse tasu saavutamisega ning aktiveerimise / aktiivsuse muster sõltub koolitusest ja keskkonnast ning on seotud käitumise erinevate komponentidega (nt orienteerumine, lähenemine, sissevõtt).6, 33, 50). Nagu eespool mainitud, ei võtaks c-Fose mõõtmine sellist spetsiifilist aktiivsust. Carlezon on teinud ettepaneku, et „tasu” on seotud peamiselt NAc neuronite, st keskmise närviliste neuronite aktiivsuse vähenemisega (3). See ei ole kooskõlas meie tähelepanekutega - oluliselt paranenud NAc c-Fos võrreldes GAD-ga kolokaliseeritud kontroll-kontrollidega ja c-Fos-positiivsete neuronitega, mis on kooskõlas keskmiste närvirakkude (GABAergic) aktiveerimisega, kuid me ei ole konkreetselt hinnanud NAc neuronaalset inhibeerimist ”. Mõlemad võivad tekkida instrumentaallülesannete ajal nii anatoomilise kui ajalise spetsiifilisusega. Selle uuringu seisukohast võib järeldada, et NAc on kaasatud instrumentaalse sahharoosi võtmise algusesse, kusjuures NAc südamik aitab kaasa motoorilisele aktiveerimisele ja NAc kest aitab kaasa nii motoorse kui ka motiveeriva ülesande täitmisele.
Samuti täheldati FR-rottidel BNST-i mõlema peamise piirkonna (eesmine ja tagumine) aktiveerimist. BNST on osa limbilisest ahelast, mis moduleerib neuroendokriinseid vastuseid korduvatele stimuleerivatele kogemustele (8, 9) ja laiemas tähenduses seostatakse korduvate stiimulite tundmaõppimisega. Ehkki tema roll on korduvalt stressitegurite kogemuste osas kõige põhjalikumalt selgitatud, näitab meie leid BNSTi laiemat rolli: BNST võib moduleerida kesknärvisüsteemi vastuseid korduvatele positiivsetele, samuti negatiivsetele või stressirohketele stiimulitele. Kuna me täheldasime seda aktiveerimist FR-i alguses, kuid mitte PR-i, tulemuslikkuse, võib BNST-i värbamine olla seotud FR koolituse suurenenud sahharoosipreemiaga. Meie tähelepanek CRF neuronite otsese aktiveerimise kohta viitab sellele, et sahharoosile reageerimine ei ole oluline stressitegur; siiski on c-Fos ekspressioon teistes PVN neuronites kooskõlas stressiahela moduleerimisega (46). Tegelikult on Ulrich-Lai ja kolleegid teatanud, et kasutades teist dieeti / söötmise paradigmat, moduleerib sahharoosi tarbimine käibemaksu funktsiooni (47). Lõpuks täheldasime hüpogloseali närvi tuuma aktiveerimist koos PR-ga, kuid mitte FR-i toimega. Selle tähtsust saab vaid spekuleerida; üks võimalus on, et sahharoosi maitse asjakohasus võib olla kõrgem rottidel, kes söövad vähem sahharoositasu.
Sahharoosiotsingut ja sahharoosi võtmist tuleks käsitleda mitmemoodilise kogemusena, mis on aja jooksul dünaamiline, sest allaneelamine põhjustaks sahharoosi kalorisisaldusega seotud perifeerseid signaale, samuti harjumust ja seansi alliesteesiat (25). Kuigi meie uurimuses on keskendutud perifeersete endokriinsignaalide, st insuliini ja leptiini mõjule toidu tasu moduleerimiseks, võib nende mõju omakorda vahetult vahendada saatjad ja neuropeptiidid, mis mängivad rolli lühi- või pikaajalises perspektiivis. toitumis- või toiduhüvitis (vt arutelu peatükis Ref. 14). Käesolev uuring annab selle kohta mõningase ülevaate; me täheldasime mõningaid MCH või oreksiini ekspresseerivate neuronite aktiveerimist, mis on oreksigeensed kaks neuropeptiidi. Need leiud võivad tegelikkuses alahinnata MCH või oreksiini rolli toidu tasustamisel, kuna immunokütokeemia mitte-kolhitsiini saanud rottidel piiras kahtlemata mõlema neuropeptiidi visualiseerimist. Aktiveeritud oreksiini neuronite identifitseerimine LH-s on üldjoontes kooskõlas arvukate uuringutega, mis mõjutavad oreksiini neuroneid söötmisel, toidu tasustamisel ja üldisemalt stimuleeriva tasu eest (nt 5, 7, 29). Me täheldasime peFLH oreksiini neuronite aktivatsiooni. Aston-Jones ja kolleegid (5) on lõhustanud LH oreksiini neuronite erinevate populatsioonide rollid tasulises käitumises ja on seostanud peFLH oreksiini neuroneid erutusse, erinevalt tasust iseenesest. Meie järeldus näitab seega LH orexini rolli erutusel ja võib-olla orientatsiooni aktiivse hoova või sahharoosi võtmise märkide poole.
Tuleviku kaalutlusteks on sahharoosi unikaalsus või üldistatavus, mis on rahuldust andev stiimul. Kas varajase kesknärvisüsteemi aktiveerimise muster siin kirjeldame, on spetsiifiline toidule kui stiimulile või üldistub teistele rahuldust stimuleerivatele teguritele, tuleb veel kindlaks määrata. Nagu eespool mainitud, eriti FR-ülesande puhul, eeldatakse, et mitmete sahharoosipreemiate allaneelamisel on metaboolsed tagajärjed, hormoonide vabanemise moduleerimine (näiteks koletsüstokiniin, ghrelin, insuliin) ja muutused perifeerses ja kesknärvisüsteemi närvi aktivatsioonis. Nende muutuste puhul ei eeldata eeldatavasti otsest rolli mõõdetud CNS-i varajase aktiveerimise mustrites, kuid nad võivad mängida rolli sahharoositasu õppimisel koolituse ajal. Jällegi võivad sellised neuropeptiidid nagu oreksiin olla kriitiliselt seotud.
Meie uuringu kohaselt on meie esimene tõendusmaterjal spetsiifiliste mediaalsete hüpotalamuse tuumade aktiveerumise kohta sahharoosi eneseanalüüsi alguses, sealhulgas nii homöostaasi ja stressitundlikkusega seotud käibemaksu kui ka energia homeostaasi jaoks kriitilise tähtsusega ARC, toitainete tundmine ja toidu tarbimise reguleerimine. Oluline on, et me täheldasime mediaalse hüpotalamuse ja NAc aktivatsiooni koos PR-algusega, mis viitab sellele, et nii homeostaatilised kui ka mõned limbilised saidid mängivad rolli sahharoosi eneseanalüüsi alustamisel. Täiendavaid limbilisi ahelaid võib tööülesandes hilisemal ajahetkel värvata.
Perspektiivid ja tähtsus
Kuigi ajalooliselt mõjutavad motiveeriva ja tasu käitumise uuringud kõige tugevamalt kesknärvisüsteemi limbilisi ahelaid, on kogunenud suur hulk tõendeid, mis rõhutab kriitilist funktsionaalset koostoimet limbilise ja energia homeostaasi ahelate vahel. Käesolev uuring viitab nüüd konkreetsete meditsiiniliste hüpotalamuse tuumade tõenäolisele tähtsusele sahharoosi motiveeritud töös. Sellest uuringust ekstrapoleerides saab tulevastes uuringutes hinnata, kas mediaalse hüpotalamuse roll on vajalik ja kas selle aktiveerimine on seotud motiveeritud otsimisega teiste hüvede, nagu kuritarvitamise ravimite järele. Lisaks annavad selle uuringu tulemused põhjendused motiveeritud käitumise muutuste uurimiseks koos muutunud mediaalse hüpotalamuse füsioloogiaga, näiteks rasvumise korral.
TOETUSED
Seda uuringut toetasid riiklikud tervishoiuasutused DK40963. Dr Dianne Figlewicz Lattemann on vanemteadur, biomeditsiinilise laboratooriumi uurimisprogramm, veteranide osakonna Puget Soundi tervishoiusüsteem, Seattle, Washington. Dr. Sipolit toetab Läti Teadusnõukogu Grant 04.1116.
Tunnustused
Täname dr. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius ja JE Blevins nõu ja kasulike arutelude jaoks.
VIITED
;