Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor en Attenuates Downstream Signaling (2013)

Kommentaar: Blykt te sjen dat Cdk5 feroarsaakje fan regulering fan dopamine D2-receptors. Geweldich, translaasjefaktor deltafosb induceart de produksje fan Cdk5.

Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) PLoS ONE 8(12): e84482. doi: 10.1371/journal.pone.0084482

Abstract

De dopamine D2-receptor (DRD2) is in wichtige receptor dy't dopamine-assosjearre harsensfunksjes bemiddelet lykas stimming, beleanning en emoasje. Cyclin-ôfhinklike kinase 5 (Cdk5) is in proline-rjochte serine / threonine kinase wêrfan de funksje belutsen is yn 'e harsensbeleanningskring. Yn dit ûndersyk die bliken dat it serine 321-residu (S321) yn 'e tredde intrazellulêre lus fan DRD2 (D2i3) in nije regeljouwingside fan Cdk5 is. Cdk5-ôfhinklike phosphorylaasje fan S321 yn 'e D2i3 waard waarnommen yn in vitro en selkultuersystemen.

Wy observearre fierder dat de phosphorylaasje fan S321 de agonist-stimulearre oerflakekspresje fan DRD2 fermindere en G-proteinkoppeling nei DRD2 fermindere. Boppedat waard de streamôfwerts cAMP-paad beynfloede yn it heterolooch systeem en yn primêre neuronale kultueren fan p35-knockout-embryo's wierskynlik troch de fermindere ynhiberende aktiviteit fan DRD2. Dizze resultaten jouwe oan dat Cdk5-bemiddele phosphorylaasje fan S321 DRD2-funksje ynhibeart, en in nij regulearjend meganisme foar dopamine-sinjalearring leveret.

figueren

Citation: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor en attenuates Downstream Signaling. PLoS ONE 8(12): e84482. doi: 10.1371/journal.pone.0084482

editor: James Porter, Universiteit fan Noard-Dakota, Feriene Steaten fan Amearika

Oanpasber: Mei 20, 2013; Aksepteare: Novimber 14, 2013; Published: Desimber 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Dit is in artikel mei iepen tagong ferspraat ûnder de betingsten fan 'e Creative Commons Attribution License, wêrtroch it unferstreke gebrûk, distribúsje en reproduksjen yn elk medium, foarsafier't de oarspronklike skriuwer en boarne ynskreaun binne.

Fûnsjen: Dit wurk waard stipe troch de subsydzjes (NRF-2012R1A2A2A01012923 en NRF-2012R1A4A1028200) fan 'e Koreaanske regearing (MSIP) en ek stipe ûnder it ramt fan ynternasjonaal gearwurkingsprogramma beheard troch NRF of Korea (2012K2A1A2033117 Research Institute) Basisûndersykprogramma fan MSIP (2031-415). SKP wie in ûntfanger fan 'e 2004 en 2006 National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) Young Investigator Awards. De funders hiene gjin rol yn stúdzjeûntwerp, gegevenssammeling en analyse, beslút om te publisearjen, of tarieding fan it manuskript.

Ynteressearjende belangen: De auteurs hawwe ferklearre dat gjin konkurrearjende belangen bestean.

Ynlieding

Dopamine-sinjalearring is belutsen by ferskate harsensfunksjes, ynklusyf motorkoördinaasje, stimmingskontrôle en beleanningsmeganismen [1]. In wichtige komponint fan dopamine-sinjalearring yn vertebraten wurdt útoefene troch striatal medium spiny neuroanen (MSN's) dy't selektyf in subset fan dopamine-receptors útdrukke en dopaminergyske ynfier ûntfange benammen fan it ventral tegmentale gebiet (VTA) en substantia nigra (SN)) [2]. Dopamine-receptors binne G-protein-keppele receptors (GPCR) mei sân transmembrane domeinen en besteane út twa subtypen, D1-like en D2-like receptors, dy't wjersidige aksjes bemiddelje yn dopamine-sinjalearring [1]. Bygelyks, dopamine D1-like receptors (D1, D5) aktivearje adenylyl cyclase fia Gαs en fergrutsje it intracellular nivo fan cAMP, mar dopamine D2-like receptors (D2, D3, D4) inhibit adenylyl cyclase fia Gαi en ferminderje it intracellular nivo fan cAMP [1], [3].

Under dopamine-receptors is de D2-receptor (DRD2) belutsen by de patofysiology fan meardere grutte psychiatryske struorren, ynklusyf skizofreny en drugsferslaving [4], sadat in protte antipsychotyske medisinen op syn minst foar in part rjochtsje op DRD2. It is ek bekend dat DRD2-aktiviteit goed korrelearret mei de gedrachsgefolgen fan drugs fan misbrûk yn diermodellen [5]. Antidepresinten en effektiviteit fan stimmingsstabilisator binne ek keppele oan feroaringen yn 'e sel-oerflak-ekspresje fan DRD2 as streamôfwerts intracellulêre sinjalearring bemiddele troch PKA, ERK en GSK3 [1], [4], [6]. Nettsjinsteande dizze krityske rollen foar DRD2 yn it harsens, binne de detaillearre regeljende meganismen dy't heterogeniteit en kompleksiteit oan DRD2-eigenskippen jouwe net folslein begrepen.

Konvergearjende rigels fan bewiis jouwe oan dat meardere posttranslasjonele modifikaasjes belutsen binne by it fine-tuning fan DRD2-aktiviteit. Wiidweidige glycosylaasje fan DRD2 waard iepenbiere yn iere foto-affiniteit-labelstúdzjes [7], en disulfidebânfoarming binnen DRD2 waard ek identifisearre as in wichtige modifikaasje foar ligandbinding [8]. Fierder waarden phosphorylaasjeplakken fan DRD2 yn earste ynstânsje identifisearre troch in vitro assay mei radioisotopen, it leverjen fan rûtes foar ferskate regeljende paden bemiddele troch ferskate kinasen [9]. Yndied, proteïne kinase C (PKC) regulearret DRD2-bemiddele mobilisaasje fan intracellular kalsium en modulearret de ynteraksje fan DRD2 mei cytoskeletale aaiwiten [10]. Fosforylaasje troch GPCR kinase 2 (GRK2) regelet agonist-induzearre resensibilisaasjepatroanen fan DRD2 [11].

Cyclin-ôfhinklike kinase 5 (Cdk5) is in proline-rjochte serine / threonine kinase dy't foarkaraktiviteit hat troch harsensspesifike ekspresje fan har essensjele aktivators, p35 en p39 [12]. Cdk5 is belutsen by ferskate neuronale prosessen, ynklusyf neuronale migraasje en axonbegelieding, en Cdk5 en p35 nulmûzen litte defekten sjen yn kortikaal lagen [13]. Koartlyn waard oantoand dat fosforylaasje fan WAVE1 en ephexin troch Cdk5 regelet dendrityske spine morfogenese [14]. Fierder regelet Cdk5 ek oerflakekspresjenivo's fan 'e NMDA-receptor, NR2B, en NR2A-bemiddele NMDA-streamen [15], [16]. It is opmerklik dat meardere stikken bewiis in yntime relaasje suggerearje tusken Cdk5 en it dopaminesysteem. Cdk5 phosphorylates tyrosine hydroxylase (TH), regulearret syn stabiliteit, en behâldt sa dopaminergic homeostasis [17]. Yn postsynaptyske neuroanen, as it T75-residu fan dopamine en cyclysk-AMP-regulearre phosphoprotein-32kD (DARPP-32) wurdt phosphorylated troch Cdk5, kin it PKA-aktiviteit ynhibearje en sadwaande dopamine DRD1-bemiddele PKA-sinjalearring antagonisearje. [18]. Ynteressant, as kokaïne, in yndirekte agonist fan dopamine-receptors, chronysk wurdt administreare yn ratten, mRNA en proteïnenivo's fan Cdk5 ferheegje yn medium spiny neuroanen [19]. Kollektyf liket Cdk5 belutsen te wêzen by drugs-induzearre synaptyske oanpassingen. Yn dizze stúdzje litte wy in funksjonele ynteraksje fan DRD2 en Cdk5 sjen dy't de rol fan Cdk5 yn dopamine-sinjalearring fierder útwreidet.

Materialen en metoades

Antibody

Anti-konynserums waarden opwekke tsjin peptiden dy't phospho-serine 321 (pS321) fan 'e tredde intracellular loop fan DRD2 (D2i3) befetsje. Fosfo-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), waard brûkt om in peptide-konjugearre kolom te meitsjen foar affiniteitsreiniging (20401, PIERCE). Anti-pS321 antibody waard ferrike troch in affiniteit suvering systeem nei de fabrikant syn ynstruksjes. Purified phospho-antibody waard opslein yn PBS mei 0.1% natriumazide en 0.1% gelatine. Anti-mûs anty-Cdk5 antykodym (sc-249) en anty-konijn anty-p35 antybody (sc-820) waarden brûkt foar de westerske blotting en immunocytochemy fan Cdk5 / p35. Anti-mûs anty-GFP antykodym (sc-9996) waard brûkt foar de immunoprecipitaasje en Western blotting fan DRD2-GFP. Anti-konijn anty-FLAG antykodym (sc-807), anty-konyn anty-HA antylichaam (sc-805), anty-mûs anty-GST antykodym (sc-138), en anty-mûs anty-GAPDH antykody (sc- 32293) waarden kocht fan Santa Cruz Biotechnologies.

bisten

De p35 knockout-mûs wie in soarte kado fan Dr. Katsuhiko Mikoshiba by RIKEN Brain Science Institute yn Japan en brûkt foar primêre neuronkultuer. Primersets foar genotyping wiene 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC en 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT lykas earder beskreaun [20]. ICR-mûzen en Sprague Dawley-ratten waarden brûkt foar tarieding fan harsenslysate. Alle dierprosedueres waarden goedkard troch de Pohang Universiteit fan Wittenskip en Technology Ynstitúsjonele Komitee foar bistesoarch en gebrûk.

Plasmid Konstruksjes

Minsklike DRD2 lange isofoarm yn in EGFP-N1 plasmidvektor en de tredde intrazellulêre lus fan DRD2 (212-373 aminosûrresiduen ynklusyf de 29 ekstra aminosoerresiduen unyk foar DRD2 lange isofoarm) yn in pFLAG-CMV-2 plasmidefektor waarden brûkt. Human Cdk5 waard ynfoege yn in pCMV-HA plasmidvektor en minsklike p35 waard ynfoege yn in pcDNA 3.1 plasmidvektor. Human Cdk5 waard ynfoege ûnder in cytomegalovirus (CMV) promoter tegearre mei minsklike p35 yn in pcDNA 3.1 fektor om in dûbele ekspresjekonstruksje (Cdk5/p35) te meitsjen foar immunocytochemy, receptor internalization assay, [35S]-GTPγS binding assay, radioligand binding assay en cAMP enzyme immunoassay.

Yn Vitro Kinase Assay

IP-keppele in vitro kinase assay waard útfierd as folget. Ien hiele mûsharsens waard lysed yn 3 mL erythrocytes lysis buffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) troch 20 stroke fan in Dounce homogenizer om homogenisearre harsenslysaten te krijen . De lysaten waarden ynkubeare op iis foar 30 min, sonicated, en sintrifuge op 16,000 × g foar 10 min. De supernatanten waarden immunoprecipitearre mei anty-konyn anty-p35 antykodyk om in aktyf Cdk5 / p35 kompleks te krijen. Cdk5/p35-kompleks en suvere GST-fúzjeprotein waard mingd mei adenosine 5'-triposfaat, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) en ynkubeare yn kinasebuffer (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) foar 1 h by keamertemperatuer [18], [21]. Purified Cdk5 / p25 kompleks (14-516, Millipore) waard ek brûkt foar in vitro kinase assay lykas hjirboppe beskreaun. De 2 × sample laden buffer waard tafoege oan it reaksjegemik en kocht by 100 ° C. De samples waarden dêrnei ûnderwurpen oan SDS-PAGE en de droege gel waard beoardiele troch autoradiografy.

Liquid Chromatography (LC) -Mass Spectrometry (MS) / MS Analysis

It rekombinante GST-D2i3-protein waard analysearre troch LC-MS/MS nei IP-keppele in vitro kinase assay. Wy hawwe peptide-identifikaasje útfierd fan LC-MS / MS-gegevens mei X!!Tandem (ferzje Dec-01-2008). Elk RAW-gegevensbestân waard earst konvertearre nei mzXML mei de trans-proteomyske pipeline (TPP; ferzje 4.3). MS / MS-scans yn 'e omboude mzXML's waarden doe ûnderwurpen oan sykjen tsjin de UniProt-mûsprotein-sekwinsjedatabase (release 2010_07) ynklusyf GST-D2i3-sekwinsje mei X!!Tandem. De tolerânsje waard ynsteld op 3 Da foar foarrinner-ionen en 2 Da foar fragmint-ionen. Enzyme spesifisiteit foar trypsin waard brûkt. Fariabele modifikaasjeopsjes waarden brûkt foar de karbamidomethylaasje fan cysteine ​​(57.021 Da), de oksidaasje fan methionine (15.995 Da), de hydrolyse fan asparagine (0.987 Da) en de phosphorylaasje fan serine (79.966 Da).

Immunoprecipitation

Immunoprecipitaasje waard útfierd op sellysaten yn ELB lysisbuffer. Anti-GFP antykodym waard tafoege oan de lysates en ynkubearre foar 3 h by 4 ° C. Immunokompleksen waarden suvere mei protein-A agarose. De precipitaten waarden ynkubeare mei SDS sample laden buffer foar 30 min by 37 ° C, en ûnderwurpen wurde oan SDS-PAGE en Western blots.

GST Pull-down Assay

10 µg fan suvere GST en GST-D2i3 waarden ynkubeare mei rat-brain lysate foar 1.5 h by 4 ° C. 30 µL glutathione (GSH)-konjugearre Sepharose 4B-kralen (17-0756-01, GE Healthcare) lykwichtich mei lysisbuffer waard tafoege en ynkubeare foar ekstra 1 h. Beads waarden sammele troch centrifugaasje by 2,000 ×g en spiele mei lysisbuffer 4 kear [22], [23]. Precipitaten waarden analysearre troch Western blotting mei anty-Cdk5 en anty-p35 antykladen.

Immunocytochemistry

Transfekteare HEK 293-sellen en striatale neuroanen kultivearre op deksels waarden ien kear wosken mei fosfaatbufferde saline (PBS) en fêst troch ûnderdompeling yn kâld 4% paraformaldehyde / PBS foar 30 min. Primêr antykodym waard verdund yn 'e blokkearjende oplossing (2% hynderserum en 1% Triton X-100 yn PBS). Alexafluor-647-konjugearre anty-mûs antykody (A20990, Invitrogen) en Alexafluor-568-konjugearre anty-konyn antykody (A11011, Invitrogen) waarden brûkt as sekundêre antykladen. Hoechst waarden brûkt foar nucleus kleuring. Ofbyldings waarden krigen troch konfokale mikroskopy (Olympus, FluoView-1000).

Reseptor ynternalisaasje Assay

24 h nei transfeksje waarden sellen behannele mei 1 µM quinpirole (Q102, Sigma) foar 30 min en 90 min by 37 ° C. Sellen waarden opnij suspendearre yn 2 mL kâlde PBS en 200 µL aliquots waarden brûkt foar elke reaksje. Drug behannelingen waarden útfierd by keamertemperatuer foar 3 h by de folgjende konsintraasjes; 3 nM [3H]-spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 µM sulpiride (895, TOCRIS), 10 µM haloperidol (H1512, Sigma). Hydrofoob [3H]-spiperone waard brûkt om totaal útdrukte receptors te markearjen en hydrofiele sulpiride waard brûkt om membranous receptor-bûn te ferfangen [3H]-spiperone sinjalen. Membraan-assosjearre receptor-sinjalen waarden berekkene troch it subtrahearjen fan intrazellulêre receptorwearden fan 'e totale útdrukte receptorwearden. Sellen waarden filtere op in GF / B (Millipore) filter en wosken 3 kear mei waskbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filters waarden útdroege en oerbleaune radioaktiviteit waard metten mei in floeibere scintillaasjeteller [24].

Sel membraan Tarieding

Confluent sellen yn 100 mm kultuer-gerjochten nei transfeksje waarden wosken mei iiskâlde PBS en rispe yn 1 mL HME buffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA). Homogenisearre lysaten waarden sintrifuge mei 500 × g foar 15 min en de supernatanten waarden dêrnei 36,000 min centrifugeare mei 30 × g. Pellets opnij suspendearre yn HME-buffer waarden brûkt foar assays.

[35S]-GTPγS Binding Assay

Selmembraanfraksjes waarden foarynkubearre mei 1 µM quinpirole (Q102, Sigma) yn 'e assaybuffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0.01 mM GDP) foar 10 min. [35S]-GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) waard tafoege oan de definitive konsintraasje fan 3 nM yn 30 µL en fierder ynkubeare foar 90 min. 170 µL iiskâlde buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, en 0.1 mM GTP) waard tafoege om de reaksje te stopjen. Membranen waarden filtere op in GF / B filter (Millipore) en wosken 3 kear mei waskbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filters waarden droege en radioaktiviteit waard mjitten mei de scintillaasjeteller [25], [26].

Radioligand Binding Assay

Tariede selmembranen waarden ynkubeare mei 0.01 nM [3H]-spiperone (NET-565, PerkinElmer) en tanimmende konsintraasjes fan quinpirole (Q102, Sigma) foar 30 min yn 'e assaybuffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membranen waarden filtere op in GF / B filter (Millipore) en wosken 3 kear mei waskbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). De reaksje waard beëinige troch rappe filtraasje troch GF/C-filters. Residuele radioaktiviteit waard metten mei in floeibere scintillaasjeteller [27]-[29].

cAMP Enzyme Immunoassay

Transfekteare HEK 293-sellen waarden foarbehannele mei 10 µM rolipram (R6520, Sigma) foar 1 h, en dêrnei behannele mei 0.1 µM forskolin (F6886, Sigma) en tanimmende konsintraasjes fan quinpirole (Q102, Sigma) foar 30 min. Primêr kultivearre striatale neuroanen waarden behannele mei 10 µM rolipram foar 1 h, en dan 1 µM dopamine foar 1 h [22]. Sellysaten waarden taret mei 0.1 M HCl en cAMP-nivo's waarden ûntdutsen troch cAMP enzyme immunoassay kit (Sapphire Bioscience) nei de ynstruksje fan de fabrikant.

Primêr Cultured Striatal Neuron

Striatal gebiet waard isolearre fan it mûs embryonale harsens (E15). Dissected weefsel waard dissociated yn minimal essensjele media (MEM) (11095, Invitrogen) mei 0.25% trypsin (T4549-100, Sigma) en 0.1% DNase I foar 6 min by 37 ° C. Sellen waarden opnij suspendearre yn 'e platingmedia (MEM mei 0.01 M HEPES (pH 7.4) en 10% (vol / vol) hynderserum (16050-122, GIBCO)). Neurons waarden kultivearre foar 7 dagen in vitro (DIV 7) yn MEM mei B27 oanfolling (17504-044, Invitrogen) foardat se tapast wurde op cAMP enzyme immunoassays.

results

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 yn 'e Tredde Intracellular Loop fan DRD2 in vitro

Om nije Cdk5-substraten te identifisearjen, hawwe wy in systematyske sykopdracht útfierd mei (S / T) PX (K / H / R) as de Cdk5-erkenning konsensus-sekwinsjes [30] en identifisearre DRD2 as in kandidaatsubstraat. De konsensussekwinsje, ynklusyf serine 321, leit yn 'e tredde intrazellulêre loop fan DRD2 (D2i3) wêr't ferskate regelmeganismen belutsen binne [3], [10], [11]. De folchoarder wurdt evolúsjonêr bewarre yn DRD2 yn vertebraten, wat in funksjoneel belang fan it residu ymplisearret (Fig. 1A).

thumbnail

Ofbylding 1. Cdk5 phosphorylates serine 321 yn 'e tredde intracellular loop fan DRD2 yn vitro.

(A) Amino acid sequence alignment toant konservearre regio's fan 'e DRD2 fan ferskate soarten (skaad). De potinsjele Cdk5-phosphorylaasje-side wurdt oanjûn troch in asterisk. (B) IP-keppele in vitro kinase-assay mei rekombinante GST-D2i3 en GST-D2i3 mutante proteins. Cdk5 / p35 kompleks ferrike út mûs harsens extract troch anti-p35 immunoprecipitation waard brûkt foar kinase reaksjes. In autoradiografy fan phosphorylated aaiwiten wurdt werjûn tegearre mei Coomassie briljante blauwe kleuring fan deselde gel. Arrowhead jout radioaktyf sinjaal oerienkommende mei GST-D2i3s en iepen pylk jout oan radioaktive sinjalen út p35. (C) MS / MS spektrum fan it phosphorylated peptide fragmint fan D2i3. De teoretyske fragmintaasjepatroanen wurde ûnder it spektrum werjûn. Under alle fragmintionen wurde de ûntdutsen y- en b-ionen yn it spektrum oanjûn. Sy6 en y7 ioanen jouwe sterk oan op de fosforylaasje fan serine 321. (D) In vitro kinase assay mei suvere Cdk5 / GST-p25 kompleks mei GST-D2i3 en GST-D2i3 mutante aaiwiten. Fosforylearre aaiwiten waarden werjûn yn in autoradiografy, tegearre mei Coomassie briljante blauwe kleuring. Arrowhead jout radioaktyf sinjaal oerienkommende GST-D2i3 en iepen pylk jout oan radioaktive sinjalen út GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Om de kapasiteit fan Cdk5 te beoardieljen om D2i3 te fosforylearjen, hawwe wy IP-keppele útfierd in vitro kinase-assays mei help fan in aktyf Cdk5 / p35-kompleks ferrike fan mûsharsenslysate troch p35-immunoprecipitaasje mei suvere rekombinante GST-D2i3 (aminosoerresiduen 212-373) proteïnen as de substraten. Wy observearre phosphorylation sinjalen yn de suvere GST-D2i3 en GST-D2i3 S297A aaiwiten, mar it sinjaal waard signifikant fermindere mei GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Om fosforylaasje fan serine 321 yn 'e GST-D2i3 fierder te ferifiearjen, hawwe wy LC-MS / MS-analyse útfierd fan' e samples fan IP-keppele in vitro kinase-assays mei LTQ XL-massaspektrometry. Konsekwint waarden fosfo-peptiden dy't oerienkomme mei de massa fan fosfo-serine 321-peptiden weromfûn (Fig. 1C). Yn betinken nommen dat de gegevens-ôfhinklike oanwinst tidens LC-MS / MS-analyze neigeraden om oerfloedige aaiwiten yn 'e stekproef te detektearjen [31], dizze gegevens suggerearje dat it serine 321-residu de dominante phosphorylaasje-site fan Cdk5 is yn 'e D2i3-regio. Om direkte fosforylaasje fan serine 321 yn 'e GST-D2i3 troch Cdk5 te bewizen, in vitro kinase-assay mei suvere Cdk5 / GST-p25-kompleks mei suvere rekombinante GST-D2i3-proteinen waard útfierd. Wy identifisearre in signifikant phosphorylation sinjaal yn de GST-D2i3 dat wie ôfwêzich yn de GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Mei-elkoar jouwe dizze resultaten oan dat it D2i3 S321-residu in foarkarsdoel is foar Cdk5-bemiddele phosphorylaasje.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 yn 'e tredde intracellular loop fan DRD2 yn sellen

Om de fosforylaasje fan serine 321 te identifisearjen, hawwe wy antylichaam spesifyk foar phospho-serine 321 (pS321) opbrocht. Samples út de IP-keppele in vitro kinase assay waarden analysearre troch Western blotting mei help fan anty-pS321 antibody. Blots lieten in ûnderskate band sjen yn 'e kinase-reaksje dy't ôfhinklik wie fan GST-D2i3 (Fig. 2A). Om de potinsjele fosforylaasje fan serine 321 yn DRD2 troch Cdk5 yn sellen te ferifiearjen, waarden anty-GFP-immunoprecipitaten fan HEK 293-sellen dy't DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP útdrukke mei of sûnder HA-Cdk5 en p35 analysearre troch Western blotting mei anty-GFP en anty-pS321 antykladen. Karakteristike smoarge bandsinjalen troch anty-GFP-antylichamen dy't bekend binne fanwegen oermjittige glycosylaasje fan DRD2 wurde allinich waarnommen yn 'e oanwêzigens fan DRD2-GFP, en anty-pS321-antylders ûntdutsen ferlykbere DRD2-sinjalen allinich mei Cdk5 / p35 co-ekspresje (Fig. 2B) [7]. Om fierder te ferifiearjen de phosphorylation fan serine 321 troch Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) en mutant foarm fan D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) waarden oanmakke. FLAG-D2i3 en FLAG-D2i3 S321A útdrukt mei of sûnder HA-Cdk5 en p35 yn HEK 293 sellen waarden analysearre troch in SDS-gel mobiliteit shift assay. In signifikante Cdk5-ôfhinklike mobiliteitsferskowing waard waarnommen foar FLAG-D2i3, mar net foar FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). Wy beoardielje ek it phosphorylaasjenivo fan DRD2 by Ser321 by agoniststimulaasje. HEK 293-sellen dy't DRD2-GFP en Cdk5 / p35-kompleks ekspresje waarden stimulearre troch quinpirole, en anty-GFP-immunoprecipitaten fan 'e sellysaten waarden analysearre troch Western blotting mei anty-GFP en anty-pS321-antylders. Wy fûnen dat Cdk5-bemiddelde phosphorylaasje fan DRD2 by Ser321 net beynfloede waard troch agoniststimulaasje, dy't oars ferskynt as GRK- en PKC-bemiddele phosphorylaasjes (Fig. 2D) [32], [33]. Mei-elkoar jouwe dizze resultaten oan dat Cdk5 it serine 321-residu fan DRD2 yn 'e sellulêre omjouwing phosphorylate kin.

thumbnail

Figure 2. Cdk5 phosphorylates serine 321 yn 'e tredde intracellular loop fan DRD2 yn sellen.

Cdk5-mediated phosphorylation fan serine 321 waard analysearre mei help fan anti-pS321 antibody. (A) Samples from IP-keppele in vitro kinase-assay mei GST-D2i3-proteinen waarden analysearre troch Western blotting (WB) mei oanjûne antylders. Pylkepunten jouwe GST-D2i3s oan. (B) DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP waard útdrukt mei of sûnder HA-Cdk5 en p35 yn HEK 293-sellen. Anti-GFP immunoprecipitaten waarden analysearre troch Western blotting mei anty-GFP en anty-pS321 antykladen. De beugel jout DRD2-sinjalen oan en iepen pylkpunt jout net-spesifike sinjalen oan fan 'e anty-GFP-immunoprecipitaten. '% ynfier' is % folume fan totale lysate foar in IP reaksje. Swakke endogene Cdk5-sinjalen waarden oanjûn mei asterisken. (C) Gel mobiliteit shift assay. HEK 293 sellen transfected lykas oanjûn waarden analysearre troch Western blotting. (D) Transfekteare HEK 293-sellen waarden behannele mei quinpirole en anty-GFP-immunoprecipitaten waarden analysearre troch Western blotting mei anty-GFP en anty-pS321 antykladen. Iepen pylkpunt jout net-spesifike sinjalen oan fan anty-GFP-immunoprecipitaten.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex en DRD2 binne fysyk assosjearre

Wy ûndersochten de potensjele fysike ynteraksje tusken it Cdk5 / p35-kompleks en DRD2, om't in protte Cdk5-substraten bekend binne dat se fysyk assosjearre binne mei Cdk5 / p35-kompleks [23], [34], [35]. Earst waard it GST pull-down eksperimint útfierd. Purified rekombinant GST-D2i3 proteïne waard ynkubearre mei rat brain lysate en GST pull-down precipitaten waarden analysearre foar Western blotting. Lykas werjûn yn Fig. 3A, endogenous Cdk5 en p35 waarden identifisearre yn 'e pull-down precipitaten, wat oanjout op in fysike ynteraksje tusken DRD2 en it Cdk5 / p35 kompleks (Fig. 3A). Boppedat waarden HA-Cdk5 en p35 ûntdutsen yn 'e anty-GFP-immunoprecipitaten fan HEK 293-sellysaten dy't DRD2-GFP en Cdk5 / p35 ekspresje (Fig. 3B). Derneist hawwe wy immunocytochemyske analyzes útfierd en observearre dat DRD2-GFP, HA-Cdk5 en p35 signifikante ko-lokalisaasjesinjalen sjen litte op it membranous gebiet fan HEK 293-sellen (Fig. 3C, boppeste panels). Wy ûndersochten ek ko-lokalisaasje fan DRD2 en Cdk5 / p35 yn 'e neuronale kontekst. Konsekwint toande DRD2-GFP ek wichtige ko-lokalisaasje mei endogenous Cdk5 en p35 yn 'e kultivearre striatale neuroanen (DIV7), fierder stypjende funksjonele keppelings tusken DRD2 en Cdk5 / p35 (Fig. 3C, ûnderste panielen). De resultaten jouwe oan dat DRD2 en Cdk5 / p35 in kompleks foarmje kinne en dus it begryp stypje dat DRD2 in fysiologysk substraat fan Cdk5 is.

thumbnail

figuer 3. Cdk5 / p35 kin foarmje in kompleks mei DRD2.

(A) GST pull-down assay mei suvere rekombinant GST-D2i3 proteïne mei rat brain extract. GST pull-down precipitaten waarden ûnderwurpen oan Western blotting analyzes. 'Bead' jout it dellûk-neerslach oan sûnder GST-proteïnen. (B) Immunoprecipitaasje fan DRD2 en Cdk5 / p35 kompleks. Anti-GFP IP fan lysaten fan transfekteare sellen waarden ûnderwurpen oan Western blotting-analyzes. De beugel jout DRD2-sinjalen oan en iepen pylkpunt jout net-spesifike sinjalen oan fan 'e anty-GFP-immunoprecipitaten. In overexposed blot foar yngongen wurdt ek werjûn yn de rjochterkant. (C) Immunocytochemical analyzes fan DRD2 en Cdk5 / p35. HEK 293-sellen dy't DRD2-GFP en Cdk5 / p35 ekspresje, waarden kleurd mei anty-Cdk5 en anty-p35 antykladen (boppeste panielen). DRD2-GFP waard allinich útdrukt yn 'e kultivearre striatale neuroanen en kleurde mei anty-Cdk5 en anty-p35 antykladen (Legere panielen). Hoechst waarden brûkt foar nucleus kleuring. De skaalbalke is 5 µm. Alle ôfbyldings waarden krigen mei konfokale mikroskopy (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-mediated fosforylaasje fan DRD2 attenuates Receptor Activity

It is rapportearre dat fosforylaasje krityske eigenskippen fan GPCR's modulearret, lykas G-proteïne-keppeling, receptor-internalisaasje, intrazellulêre lokalisaasje, en assosjaasje mei modulatorproteinen [9], [11], [24]. INgonist-induced receptor internalization is in kritysk regeljouwing proses fan sinjaal transduction. Wy ûndersochten Cdk5-bemiddele modulaasje fan DRD2 ynternalisaasje. HEK 293-sellen dy't DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP útdrukke mei of sûnder Cdk5 / p35 waarden ynkubeare mei 1 µM quinpirole om agonist-stimulearre DRD2-ynternalisearring te inducearjen (Fig. 4A). [3H] -spiperone-sinjalen fan DRD2-GFP ekspresje sellen waarden signifikant fermindere by 30 min quinpirole behanneling en weromhelle op 90 min. Ynteressant, [3H] -spiperone sinjalen fan DRD2-GFP en Cdk5 / p35 ekspresje sellen waarden ek fermindere by 30 min quinpirole behanneling, mar net weromhelle op 90 min (Fig. 4A, twadde paragraaf). Oan de oare kant, [3H] -spiperone sinjalen fan DRD2 S321A-GFP ekspresje sellen waarden fermindere op 30 min en weromhelle op 90 min, nettsjinsteande de ko-ekspresje mei Cdk5 / p35. Foarige stúdzjes hawwe oantoand dat de ynternalisearre DRD2 weromkomt nei it plasmamembraan by langere agoniststimulaasje [11]. Thus it docht bliken dat Cdk5-mediated phosphorylation fan DRD2 is belutsen by de resensitization prosessen folgjende agonist-induzearre DRD2 internalization.

thumbnail

Figure 4. Cdk5-mediated phosphorylation attenuates DRD2 oerflak ekspresje en streamôfwerts sinjalearring.

(A) DRD2 oerflak ekspresje mjitten troch [3H]-spiperone binding assay. Transfekteare HEK293-sellen waarden stimulearre mei 1 µM quinpirole foar de oantsjutte tiid en rispe, folge troch 3 nM [3H]-spiperone behanneling foar 3 h. Radioaktiviteit waard metten en oerflaksignalen waarden berekkene. Flater bars fertsjintwurdigje gemiddelde ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Ien-way ANOVA mei Dunnett post hoc test: ferlykje alle kolommen tsjin kontrôle kolom). (B) [35S]-GTPγS binding assay. Selmembranen waarden taret út 'e sellen transfekteare lykas oanjûn. Membraanpreparaten waarden ynkubeare mei 1 µM quinpirole folge troch 3 nM [35S]-GTPγS foar 90 min. Flaterbalken fertsjintwurdigje gemiddelde ± SE (n = 8; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; One-way ANOVA mei Bonferroni post hoc test: fergelykje alle pearen fan kolommen). (C) Quinpirole-konkurrearjende [3H]-spiperone binding assay. Membraanpreparaten fan transfekteare sellen waarden ynkubeare mei 0.01 nM [3H]-spiperone en tanimmende konsintraasjes fan quinpirole foar 30 min. Net-lineêre regression waard krigen troch GraphPad. Flaterbalken jouwe gemiddelde ± SE (n = 3). (D) cAMP enzyme immunoassays yn transfekteare HEK 293 sellen. Transfekteare sellen waarden foar 10 h foarbehannele mei 1 µM rolipram, en dêrnei mei-behannele mei 0.1 µM forskolin en tanimmende konsintraasjes fan quinpirole foar 30 min. Net-lineêre regression waard krigen troch GraphPad. Flaterbalken fertsjintwurdigje gemiddelde ± SE (n = 4; **p<0.01; twa-tailed t-tests). (E) Kultuerde striatale neuroanen fan wylde type en p35 knockout-embryo's (DIV 7) waarden behannele mei 10 µM rolipram foar 1 h folge troch 1 µM dopamine foar 1 h. Flaterbalken fertsjintwurdigje gemiddelde ± SE (n = 4; **p<0.01; twa-tailed t-tests).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Wy evaluearre fierder in potinsjele feroaring fan agonist-stimulearre G-proteïne-keppeling oan DRD2 assosjearre mei Cdk5-bemiddele phosphorylaasje mei help fan [35S]-GTPγS binding assay [25], [26]. DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP mei of sûnder Cdk5 / p35 waarden útdrukt yn HEK 293 sellen. Membranen waarden taret en stimulearre mei 1 µM quinpirole en fierder tastien [35S]-GTPγS ynkorporaasje. DRD2-GFP en Cdk5 / p35 ekspresje selmembraan toande signifikant beheind [35S]-GTPγS-bining yn ferliking mei alle oare selmembranen (Fig. 4B). Dizze resultaten jouwe oan dat Cdk5-mediated phosphorylation down-regulearret agonist-stimulearre G-protein binding by DRD2.

Derneist, quinpirole-konkurrearjende [3H]-spiperone-binende assays waarden útfierd om elke potensjele feroaring yn agonist-affiniteit by DRD2 te ûndersiikjen troch Cdk5-bemiddele phosphorylaasje. Kompetitive bining fan [3H]-spiperone by behanneling fan tanimmende konsintraasjes fan quinpirole nei de membraanpreparaat fan transfektearre waard mjitten. Konkurrearjende bining fan quinpirole en [3H]-spiperone by DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP makken ferlykbere logKi wearden (-9.789 foar DRD2-GFP; -9.691 foar DRD2 S321A-GFP), wat oanjout dat de affiniteit fan ligand nei DRD2 net signifikant beynfloede wurdt troch Cdk5-bemiddele phosphorylaasje by DRD2 (Fig. 4C).

Cdk5-bemiddele fosforylaasje regelet it DRD2-cAMP-sinjaalpaad nei ûnderen

Dêrnei ûndersochten wy oft de wiziging fan DRD2 troch Cdk5 ynfloed hat op streamôfwerts sinjaalpaden. Wy kontrolearren DRD2-bemiddele ynhibysje fan forskolin-stimulearre cAMP-produksje troch adenylyl cyclase yn 'e sellen dy't DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP ekspresje mei cAMP enzyme immunoassay. DRD2-ekspresje sellen lieten fermindere cAMP-nivo's sjen yn antwurd op quinpirole op in dose-ôfhinklike manier. Opmerklik fermindere ko-ekspresje fan Cdk5 / p35 de maksimale ynhibysje fan cAMP-formaasje signifikant (figuer 4D, lofts paniel). Oan 'e oare kant, yn' e DRD2 S321A-GFP ekspresearjende sellen, waarden de cAMP-formaasjes effektyf ynhibearre yn antwurd op quinpirole-behanneling, nettsjinsteande de ekspresje fan Cdk5 / p35 (figuer 4D, rjochter paniel). Dizze resultaten jouwe oan dat Cdk5-bemiddele phosphorylaasje fan DRD2 de remmende aktiviteit fan DRD2 op 'e streamôfwerts cAMP-sinjaalpaad ferminderet. Om de ferskynsels fierder te befêstigjen yn in mear fysiologysk relevante ynstelling, hawwe wy gebrûk makke fan primêre kultivearre neuroanen fan knockout-embryo's dy't tekoart binne yn p35, in essensjele Cdk5-aktivator. Primêre kultivearre striatale neuroanen waarden behannele mei 1 µM dopamine en analysearre troch cAMP enzyme immunoassay. Neuronen fan p35 knockout-mûzen eksposearren fermindere cAMP-nivo's yn ferliking mei wyldtype neuroanen as stimulearre mei dopamine (Fig. 4E). Ttegearre, konkludearren wy dat Cdk5-bemiddele phosphorylaasje fan DRD2 resulteart yn in fermindering fan 'e remmende toan op' e cAMP-paad útoefene troch DRD2.

Diskusje

Wy identifisearre DRD2 as in nij substraat fan Cdk5. De phosphorylaasje liket DRD2-oerflak-ekspresje nei ûnderen te regulearjen troch it lot fan DRD2 te beynfloedzjen nei receptor-ynternalisearring, wêrtroch DRD2 G ferminderje.i-koppeling en streamôfwerts cAMP paad. Om't it phosphorylaasjeresidu S321 sawol yn DRD2 lange as koarte isofoarmen bestiet, kin it meganisme foarsteld yn dizze stúdzje in algemiene modus fan regeling wêze yn DRD2-bemiddele sinjalearring.

DRD2 yn medium spiny neuroanen is net allinich beskôge as in wichtich dopamine-receptor-subtype, mar is ek erkend foar syn gefoelichheid foar feroaringen yn beskikberens yn antwurd op miljeu-stimuli. Agonist-induzearre desensibilisaasje en resensibilisaasje fan DRD2 binne wiidweidich studearre [11], [24]. Benammen in oantal stúdzjes hawwe sjen litten dat de effekten fan chronike psychostimulant eksposysje, lykas kokaïne en amfetamine, dy't it ekstrazellulêre nivo fan dopamine yn 'e striatale synapse ferheegje, wurde begelaat troch dynamyske feroaringen fan DRD2 postsynaptysk [36]. Ja, chronike kokaïne-brûkers binne bekend dat se DRD2-nivo's yn it striatale gebiet fermindere hawwe, en DRD2-beskikberens yn 'e nucleus accumbens (NAcc) toant in negative korrelaasje mei it drugssykjen en fersterkingsgedrach yn mûzen en primaten [37]-[39]. Dizze befinings jouwe oan dat de funksjonaliteit fan DRD2 tige gefoelich is foar adaptive of kompensearjende regeljouwing yn reaksje op ferskate stimuli, ynklusyf chronike eksposysje foar drugs. Us resultaten litte sjen dat it S321-residu yn 'e tredde intrazellulêre loop fan DRD2 kin wurde phosphorylearre troch Cdk5, wat resulteart yn in fermindering fan remmende ynfloed fan DRD2 op' e cAMP-paad. Dizze ynteraksje stelt in nije regeljouwingmeganisme foar ferbûn mei Cdk5 yn dopaminoceptive neuroanen dy't keppele wurde kinne oan 'e dynamyske aard fan DRD2-oerflakbeskikberens.

It moat opmurken wurde dat Cdk5 bekend is om in wichtige komponint te wêzen yn it bemiddeljen fan adaptive feroaringen fan 'e neuronale omjouwing. Bygelyks, strukturele en funksjonele feroarings fan dendrityske stekels yn 'e neuroanen fan' e limbike sirkwy binne ien fan 'e gefolgen fan werhelle psychostimulant eksposysje [40]. Dizze wizigingen wurde begelaat troch ferskate molekulêre wizigingen, ynklusyf de yndeksje fan cAMP-antwurd elemint-binend proteïne (CREB) en ΔFosB, transkripsjefaktoaren dy't in duorsume upregulaasje fertoane yn reaksje op chronike kokaïne-administraasje [41], [42]. Wichtich is Cdk5 in doel fan ΔFosB [19], en in protte krityske komponinten belutsen by dendrityske spinedynamyk, lykas PSD-95, p21-aktivearre kinase (PAK), β-catenin, en spinophilin, waarden rapportearre as Cdk5-substraten [43]-[46]. Konsekwint, genetyske as pharmakologyske manipulaasjes fan Cdk5-aktiviteit ûntsteane feroaringen fan dendrityske spinemorfology en gedrachsreaksjes op kokaïne, wat krityske rollen foar Cdk5 ymplisearret yn 'e molekulêre en morfologyske feroaringen fan mesolimbyske dopamine-sirkels. [47], [48]. Us resultaten litte sjen dat DRD2 in nij doel fan Cdk5 is, jout ekstra ynsjoch yn 'e adaptive feroaringen fan it dopaminesysteem yn reaksje op chronike medisyneksposysjes fanwegen de folgjende ΔFosB-bemiddele upregulaasje fan Cdk5 kin in tonic ferheging yn 'e phosphorylaasje fan DRD2 ynliede. . Boppedat is bekend dat DRD2 ferskate sellulêre prosessen beynfloedet, ynklusyf regeling fan cAMP- en MAP-kinase-paden en streamôfwerts fan transkripsjonele barrens. [42], [49]. Sa kinne de befiningen yn dizze stúdzje net allinich in direkte regeling fan DRD2 troch Cdk5 ôfbyldzje, mar ek in nij ynsjoch leverje yn 'e adaptive antwurden fan dopaminesysteem nei chronike eksposysje foar drugs.

Author Contributions

Betocht en ûntwurp de eksperiminten: JJ YUP DH SKP. Utfierd de eksperiminten: JJ YUP DKK YK. Analysearre de gegevens: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Bydroegen reagents / materialen / analyse ark: YHS. Skreau it papier: JJ SKP.

Referinsjes

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) Dopamine-receptors: fan struktuer nei funksje. Physiol Rev 78: 189-225.
  2. 2. Wise RA (2002) Brain reward circuitry: ynsjoch út unsensed stimulâns. Neuron 36: 229-240. doi: 10.1016/s0896-6273(02)00965-0
  3. Besjoch artikel
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Besjoch artikel
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Besjoch artikel
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Besjoch artikel
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Besjoch artikel
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Besjoch artikel
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Besjoch artikel
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Besjoch artikel
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Besjoch artikel
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Besjoch artikel
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Besjoch artikel
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Besjoch artikel
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Besjoch artikel
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Besjoch artikel
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Besjoch artikel
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Besjoch artikel
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Besjoch artikel
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Besjoch artikel
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Besjoch artikel
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Besjoch artikel
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Besjoch artikel
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Besjoch artikel
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Besjoch artikel
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Besjoch artikel
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Besjoch artikel
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Besjoch artikel
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Besjoch artikel
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Besjoch artikel
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Besjoch artikel
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. Besjoch artikel
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. Besjoch artikel
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. Besjoch artikel
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. Besjoch artikel
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. Besjoch artikel
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. Besjoch artikel
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. Besjoch artikel
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. Besjoch artikel
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. Besjoch artikel
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. Besjoch artikel
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. Besjoch artikel
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. Besjoch artikel
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. Besjoch artikel
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. Besjoch artikel
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. Besjoch artikel
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. Besjoch artikel
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. Besjoch artikel
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. Besjoch artikel
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) Dopamine receptor signaling. J Recept Signal Transduct Res 24: 165-205. doi: 10.1081/lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, et al. (2008) Mooglike belutsenens fan post-dopamine D2-receptor-sinjalearjende komponinten yn 'e pathofysiology fan skizofrenia. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197-205. doi: 10.1017/s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (2002) Rol fan dopamine D2-like receptors yn kokaïne sels-administraasje: stúdzjes mei D2 receptor mutante mûzen en nije D2 receptor antagonisten. J Neurosci 22: 2977-2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA, et al. (2012) Valproate feroaret dopamine-sinjalearring yn feriening mei yndeksje fan Par-4-proteinekspresje. PLoS One 7: e45618. doi: 10.1371/journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) Differinsjaal glycosylaasje en intrazellulêre hannel foar de lange en koarte isofoarmen fan 'e D2 dopamine-receptor. J Biol Chem 270: 29819-29824. doi: 10.1074/jbc.270.50.29819
  149. 8. Reader TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM. Neurochem Res 1992: 3-2. doi: 17/bf749
  150. 9. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR, et al. (1994) Fosforylaasje en palmitoylaasje fan 'e minsklike D2L dopamine-receptor yn Sf9-sellen. J Neurochem 63: 1589-1595. doi: 10.1046/j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY. Mol Pharmacol 2000: 2-280.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (2010) Agonist-induzearre endozytosis en receptor phosphorylation mediate resensibilisaasje fan dopamine D (2) receptors. Mol Endocrinol 24: 574-586. doi: 10.1210/me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 is in neural-spesifike regeljouwing subunit fan cyclin-ôfhinklike kinase 5. Nature 371: 419-423. doi: 10.1038/371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) In desennium fan CDK5. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749-759. doi: 10.1038/35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Cyclin-ôfhinklike kinase 5 ferbynt ekstrazellulêre cues nei actin cytoskelet by dendrityske spine-ûntwikkeling. Sel Adh Migr 1: 110–112. doi: 10.4161/cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y. Nat Neurosci 2003: 5-1. doi: 6/nn1039
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 regelet de phosphorylaasje fan tyrosine 1472 NR2B en de oerflakekspresje fan NMDA-receptors. J Neurosci 28: 415-424. doi: 10.1523/jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Cyclin-ôfhinklike kinase 5 phosphorylates serine 31 fan tyrosine hydroxylase en regelet syn stabiliteit. J Biol Chem 279: 54487-54493. doi: 10.1074/jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, et al. (1999) Fosforylaasje fan DARPP-32 troch Cdk5 modulearret dopamine-sinjalearring yn neuroanen. Natuer 402: 669-671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, et al. (2001) Effekten fan chronike bleatstelling oan kokaïne wurde regele troch it neuronale proteïne Cdk5. Natuer 410: 376-380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, et al. (2001) Synergistyske bydragen fan cycline-ôfhinklike kinase 5 / p35 en Reelin / Dab1 oan 'e posisjonearring fan kortikale neuroanen yn' e ûntwikkeljende mûsharsens. Proc Natl Acad Sci USA 98: 2764-2769. doi: 10.1073/pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Cyclin-ôfhinklike kinase 5 phosphorylates it N-terminale domein fan it postsynaptyske tichtensprotein PSD-95 yn neuroanen. J Neurosci 24: 865-876. doi: 10.1523/jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Luke MP, Affar el B, et al. (2005) Par-4 keppelt dopamine-sinjalearjen en depresje. Sel 122: 275-287. doi: 10.1016/j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, et al. (2000) NUDEL is in roman Cdk5 substraat dat assosjearret mei LIS1 en cytoplasmysk dynein. Neuron 28: 697-711. doi: 10.1016/s0896-6273(00)00147-1
  165. 24. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS, et al. (2001) Differinsjaal regeling fan 'e dopamine D2- en D3-receptors troch G-protein-keppele receptorkinasen en beta-arrestins. J Biol Chem 276: 37409-37414. doi: 10.1074/jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) Differinsjaal ûntkoppeling fan A1 adenosine en D2 dopamine receptors troch suramin en didemethylated suramin (NF037). Mol Pharmacol 53: 808-818.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, et al. (2000) Bining fan calmodulin oan 'e D2-dopamine-receptor ferminderet receptor-sinjalearring troch it arrestearjen fan' e G-proteïne-aktivearring-skeakel. J Biol Chem 275: 32672-32680. doi: 10.1074/jbc.m002780200
  168. 27. List SJ, Seeman P (1981) Resolúsje fan dopamine en serotonine receptor komponinten fan [3H] spiperone binding oan rat harsens regio. Proc Natl Acad Sci USA 78: 2620-2624. doi: 10.1073/pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, Strange PG (1998) Agonist aksje by D2 (lange) dopamine receptors: ligand binding en funksjonele assays. Br J Pharmacol 124: 978-984. doi: 10.1038/sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) Dopamine ferpleatst [3H]domperidon fan plakken mei hege affiniteit fan 'e dopamine D2-receptor, mar net [3H]raclopride of [3H]spiperone yn isotoanysk medium: gefolgen foar minsklike positron-emisje. tomografy. Synapse 49: 209-215. doi: 10.1002/syn.10232
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB. Nucleic Acids Res 2003: 2.0-31. doi: 3635/nar/gkg3641
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) In model foar willekeurige sampling en skatting fan relative proteïne oerfloed yn shotgun proteomics. Anal Chem 76: 4193-4201. doi: 10.1021/ac0498563
  173. 32. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999) Sekwestraasje fan dopamine D2-receptors hinget ôf fan koekspresje fan G-protein-keppele receptorkinases 2 of 5. Eur J Biochem 260: 112-119. doi: 10.1046/j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) Protein kinase C bemiddelet phosphorylaasje, desensibilisaasje en hannel fan 'e D2 dopamine-receptor. J Biol Chem 279: 49533-49541. doi: 10.1074/jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, et al. (2011) Cdk5-mediated phosphorylation fan endophilin B1 is fereaske foar induced autophagy yn modellen fan Parkinson's sykte. Nat Cell Biol 13: 568-579. doi: 10.1038/ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (2001) p35 / cdk5 bindet en phosphorylates beta-catenin en regelet beta-catenin / presenilin-1 ynteraksje. Eur J Neurosci 13: 241-247. doi: 10.1046/j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) De dopaminehypoteze fan 'e fersterkjende eigenskippen fan kokaïne. Trends Neurosci 14: 299-302. doi: 10.1016/0166-2236(91)90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, et al. (1990) Effekten fan chronike kokaïne misbrûk op postsynaptyske dopamine-receptors. Am J Psychiatry 147: 719-724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE, et al. (2007) Nucleus accumbens D2/3-receptors foarsizze traitimpulsiviteit en kokaïnefersterking. Wittenskip 315: 1267-1270. doi: 10.1126/science.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL, et al. (2006) PET-ôfbylding fan dopamine D2-receptors by chronike kokaïne sels-administraasje yn monkeys. Nat Neurosci 9: 1050-1056. doi: 10.1038/nn1737
  181. 40. Robinson TE, Kolb B (1997) Persistente strukturele modifikaasjes yn nucleus accumbens en prefrontale cortex neuroanen produsearre troch eardere ûnderfining mei amfetamine. J Neurosci 17: 8491-8497.
  182. 41. Robinson TE, Kolb B (1999) Feroarings yn 'e morfology fan dendriten en dendrityske spines yn' e kearn accumbens en prefrontale cortex nei werhelle behanneling mei amfetamine of kokaïne. Eur J Neurosci 11: 1598-1604. doi: 10.1046/j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regeling fan gene ekspresje en kokaïne beleanning troch CREB en DeltaFosB. Nat Neurosci 6: 1208-1215. doi: 10.1038/nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, et al. (2000) Spinophilin regelet de formaasje en funksje fan dendrityske spines. Proc Natl Acad Sci USA 97: 9287-9292. doi: 10.1073/pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Modulêr ferfier fan postsynaptyske tichtens-95-klusters en assosjaasje mei stabile rôljefoarrinners yn 'e iere ûntwikkeling fan kortikale neuroanen. J Neurosci 21: 9325-9333.
  186. 45. Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) Depolarisaasje driuwt beta-Catenin yn neuronale spines dy't feroaringen yn synaptyske struktuer en funksje befoarderje. Neuron 35: 91-105. doi: 10.1016/s0896-6273(02)00764-x
  187. 46. ​​Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, et al. (2004) Feroare kortikale synaptyske morfology en beheinde ûnthâldkonsolidaasje yn foarbrain-spesifike dominant-negative PAK transgene mûzen. Neuron 42: 773-787. doi: 10.1016/j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ, et al. (2007) Cdk5 modulearret kokaïnebeleanning, motivaasje, en striatale neuron-eksitabiliteit. J Neurosci 27: 12967-12976. doi: 10.1523/jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW, et al. (2008) Striatal dysregulaasje fan Cdk5 feroaret lokomotorreaksjes op kokaïne, motor learen, en dendrityske morfology. Proc Natl Acad Sci USA 105: 18561-18566. doi: 10.1073/pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) Nije ferbiningen meitsje: rol fan ERK / MAP kinase-sinjaal yn neuronale plastykens. Neuron 23: 11–14. doi: 10.1016/s0896-6273(00)80747-3