DeltaFosB in The Nucleus Accumbens è fondamentale per rafforzare gli effetti della ricompensa sessuale. (2010)

COMMENTI: Delta FosB è un marker per tutte le dipendenze, sia comportamentali che chimiche. Poiché questa molecola aumenta nel circuito della ricompensa, aumentano anche i comportamenti di dipendenza. È una delle molecole coinvolte nei cambiamenti neuroplastici. Questo esperimento mostra che aumenta con l'esperienza sessuale, analogamente a come fa con le dipendenze da droghe. Nell'esperimento hanno impiegato l'ingegneria genetica per aumentare i suoi livelli oltre il "normale". Ciò ha portato a una maggiore facilitazione dell'attività sessuale. Pensiamo che questo accada con la dipendenza dal porno.

STUDIO COMPLETO

Brocche KK, Frohmader KS, Vialou V, Mouzon E, Nestler EJ, Lehman MN, Coolen LM.

Genes Brain Behav. 2010 Oct; 9 (7): 831-40 doi: 10.1111 / j.1601-183X.2010.00621.x. Epub 2010 Aug 16.

Dipartimento di Anatomia e Biologia Cellulare, Schulich School of Medicine and Dentistry, Università dell'Ontario dell'Ovest, London, Ontario, Canada.

ABSTRACT

Il comportamento sessuale nei ratti maschi è gratificante e rinforzante. Tuttavia, si sa poco dei meccanismi specifici cellulari e molecolari che mediano la ricompensa sessuale o gli effetti rinforzanti della ricompensa sulla successiva espressione del comportamento sessuale. Questo studio verifica l'ipotesi che ΔFosB, la forma troncata di FosB stabilmente stabilita, giochi un ruolo fondamentale nel rafforzamento del comportamento sessuale e nella facilitazione indotta dall'esperienza della motivazione sessuale e delle prestazioni.

È stato dimostrato che l'esperienza sessuale causa l'accumulo di ΔFosB in diverse regioni del cervello limbico incluso il nucleo accumbens (NAc), la corteccia prefrontale mediale, l'area tegmentale ventrale e il putamen caudato, ma non il nucleo preottico mediale.

Successivamente, l'induzione di c-Fos, un bersaglio a valle (represso) di ΔFosB, è stata misurata in animali sessualmente esperti e ingenui. Il numero di cellule C-Fos-immunoreattive indotte dall'accoppiamento era significativamente diminuito negli animali con esperienza sessuale rispetto ai controlli sessualmente innocui.

Infine, i livelli di ÀFosB e la sua attività nel NAc sono stati manipolati utilizzando il trasferimento genico mediato da virus per studiarne il ruolo potenziale nel mediare l'esperienza sessuale e la facilitazione indotta dall'esperienza delle prestazioni sessuali. Gli animali con sovraespressione ΔFosB mostravano una facilitazione migliorata delle prestazioni sessuali con esperienza sessuale relativa ai controlli. Al contrario, l'espressione di ΔJunD, un partner dominante dominante negativo di ΔFosB, attenuava la facilitazione indotta dall'esperienza sessuale delle prestazioni sessuali e il mantenimento a lungo termine della facilitazione rispetto alla proteina di fluorescenza verde e ai gruppi di sovraesprimono ΔFosB.

Insieme, queste scoperte supportano un ruolo critico dell'espressione ΔFosB nel NAc per gli effetti rinforzanti del comportamento sessuale e della facilitazione indotta dall'esperienza sessuale delle prestazioni sessuali.

INTRODUZIONE

Il comportamento sessuale è altamente gratificante e rinforzante per i roditori maschi (Coolen et al. 2004; Pfaus et al. 2001). Inoltre, l'esperienza sessuale altera il successivo comportamento sessuale e ricompensa (Tenk et al. 2009). Con l'esperienza di accoppiamento ripetuta, il comportamento sessuale è facilitato o "rinforzato", evidenziato da una diminuzione delle latenze per iniziare l'accoppiamento e la facilitazione delle prestazioni sessuali (Balfour et al. 2004; Pfaus et al. 2001). Tuttavia, i meccanismi cellulari e molecolari alla base della ricompensa e del rinforzo sessuale sono capiti male. È stato dimostrato che comportamenti sessuali e segnali condizionati che predicono l'accoppiamento inducono transitoriamente espressione di c-fos genico immediatamente precoce nel sistema mesolimbico di ratti maschi (Balfour et al. 2004; Pfaus et al. 2001). Inoltre, è stato recentemente dimostrato che l'esperienza sessuale induce una neuroplasticità di lunga durata nel sistema mesolimbico del ratto maschio (Frohmader et al. 2009; Brocche et al. 2010). Inoltre, nei ratti maschi, è stato dimostrato che l'esperienza sessuale induce ΔFosB, a Membro della famiglia Fos, nel nucleo accumbens (NAc) (Wallace et al. 2008). ΔFosB, una variante di giuntura troncata di FosB, è un membro unico della famiglia Fos grazie alla sua maggiore stabilità (carle et al. 2007; Ulery-Reynolds et al. 2008; Ulery et al. 2006) e svolge un ruolo nell'aumentata motivazione e ricompensa per le droghe d'abuso e la dipendenza da mediazione neuronale a lungo termine (Nestler et al. 2001). ΔFosB forma un complesso fattore di trascrizione eteromerico (proteina attivatore-1 (AP-1)) con proteine Jun, preferibilmente JunD (Chen et al. 1995; Hiroi et al. 1998). Attraverso la sovraespressione inducibile di ΔFosB, principalmente limitata allo striato usando topi bi-transgenici, viene prodotto un fenotipo comportamentale dipendente da droghe nonostante l'assenza di precedente esposizione ai farmaci (McClung et al. 2004). Questo fenotipo comportamentale include una risposta locomotoria sensibilizzata alla cocaina (Kelz et al. 1999), maggiore preferenza per la cocaina (Kelz et al. 1999) e morfina (Zachariou et al. 2006) e aumento dell'autosomministrazione di cocaina (Colby et al. 2003).

Simile al premio per la droga, ΔFosB è sovraregolato da comportamenti naturali gratificanti e media l'espressione di questi comportamenti. La sovraespressione di ΔFosB nel NAc utilizzando i modelli di roditori aumenta il funzionamento volontario delle ruote (Werme et al. 2002), risposta strumentale al cibo (Olausson et al. 2006), assunzione di saccarosio (Wallace et al. 2008), e facilita il maschio (Wallace et al. 2008) e femmina (Bradley et al. 2005) comportamento sessuale. Pertanto, ΔFosB può essere coinvolto nel mediare gli effetti di esperienze gratificanti naturali. TL'attuale studio si espande su studi precedenti studiando specificamente il ruolo di ΔFosB nel NAc nei risultati a lungo termine dell'esperienza sessuale sul successivo comportamento di accoppiamento e sull'attivazione neurale nel sistema mesolimbico.

In primo luogo, è stato stabilito quali regioni del cervello coinvolte nel circuito della ricompensa e il comportamento sessuale esprimono il ΔFosB indotto dall'esperienza sessuale.
Successivamente, l'effetto del ΔFosB indotto dall'esperienza sessuale sull'espressione accoppiata di c-Fos, un bersaglio a valle represso da ΔFosB (Renthal et al. 2008), è stato studiato.
Infine, l'effetto della manipolazione dell'attività di ΔFosB nel NAc (sovraespressione genica ed espressione di un partner dominante negativo-vincolante) sul comportamento sessuale e sulla facilitazione dell'esperienza della motivazione sessuale e delle prestazioni è stato determinato utilizzando la tecnologia di consegna virale del vettore.

METODI

Animali

Ratti Sprague Dawley maschi adulti (200-225 grammi) sono stati ottenuti da Charles River Laboratories (Senneville, QC, Canada). Gli animali erano alloggiati in gabbie di plexiglas con un tubo a tunnel in coppie dello stesso sesso durante gli esperimenti. La sala colonia era a temperatura controllata e mantenuta su un ciclo 12 / 12 hr chiaro scuro con cibo e acqua disponibili ad libitum tranne durante i test comportamentali. Le femmine di stimolo (210-220 grammi) per le sessioni di accoppiamento hanno ricevuto un impianto sottocutaneo contenente 5% di estradiolo benzoato e 95% di colesterolo dopo ovariectomia bilaterale in anestesia profonda (0.35g ketamina / 0.052g xilazina). La recettività sessuale è stata indotta dalla somministrazione di 500μg progesterone in 0.1 mL di olio di sesamo circa 4 ore prima del test. Tutte le procedure sono state approvate dai Comitati per la cura degli animali e l'uso dell'Università dell'Ontario occidentale e sono conformi alle linee guida CCAC che riguardano gli animali vertebrati nella ricerca.

Comportamento sessuale

Le sessioni di accoppiamento si sono verificate durante la prima fase di oscuramento (tra 2-6 ore dopo l'inizio del periodo buio) in condizioni di scarsa illuminazione rossa. Prima dell'esordio dell'esperimento, gli animali sono stati divisi casualmente in gruppi. Durante le sessioni di accoppiamento i ratti maschi sono stati autorizzati a copulare fino all'eiaculazione o 1 ore, e sono stati registrati i parametri per il comportamento sessuale tra cui: latenza di montaggio (ML, tempo dall'introduzione della femmina fino alla prima montatura), latenza di intromissione (IL, tempo dall'introduzione di la femmina fino alla prima montatura con penetrazione vaginale), latenza dell'eiaculazione (EL, tempo dalla prima intromissione all'eiaculazione), intervallo post eiaculazione (PEI, tempo dall'eiaculazione alla prima successiva intromissione), numero di supporti (M; spinta pelvica senza vaginale penetrazione), numero di intromissioni (IM, montatura compresa la penetrazione vaginale) e efficienza di copulazione (CE = IM / (M + IM)) (Agmo 1997). Il numero di montature e intromissioni non è stato incluso nell'analisi per animali che non hanno mostrato l'eiaculazione. Le latenze di montaggio e di intromissione sono parametri indicativi della motivazione sessuale, mentre la latenza dell'eiaculazione, il numero di supporti e l'efficienza della copulazione riflettono le prestazioni sessuali (Scafo 2002).

Esperimento 1: espressione di ΔFosB

Ratti maschi sessualmente naif erano autorizzati a accoppiarsi in gabbie pulite (60 × 45 × 50 cm) per 5 sessioni di accoppiamento giornaliere consecutive o rimaste sessualmente ingenue. Tabella supplementare 1 delinea il paradigma comportamentale per gruppi sperimentali: naïve no sex (NNS; n = 5), sesso naïve (NS; n = 5), senza esperienza di sesso (ENS; n = 5) e sesso esperto (ES; n = 4). Gli animali NS e ES sono stati sacrificati 1 ora dopo l'eiaculazione l'ultimo giorno di accoppiamento per indagare sull'espressione c-Fos indotta dall'accoppiamento. Gli animali NNS sono stati sacrificati in concomitanza con gli animali ENN 24 ore dopo la sessione di accoppiamento finale per esaminare il ΔFosB indotto dall'esperienza sessuale. I gruppi con esperienza sessuale sono stati abbinati per comportamento sessuale prima dei test successivi. Non sono state rilevate differenze significative tra i gruppi per eventuali misure comportamentali all'interno della sessione di accoppiamento appropriata e la facilitazione del comportamento sessuale indotta dall'esperienza sessuale è stata mostrata da entrambi i gruppi esperti (Tabella supplementare 2). I controlli includevano maschi sessualmente naif gestiti in concomitanza con gli animali d'accoppiamento che assicuravano l'esposizione a odori e vocalizzazioni femminili senza contatto diretto con la femmina.

Per il sacrificio, gli animali sono stati profondamente anestetizzati con sodio pentobarbitale (270mg / kg; ip) e perfusi intracardialmente con 50 mL di 0.9% soluzione salina, seguito da 500 mL di 4% paraformaldeide in tampone fosfato 0.1 M (PB). I cervelli sono stati rimossi e post-fissati per 1 h a temperatura ambiente nello stesso fissativo, quindi immersi in 20% saccarosio e 0.01% sodio azide in 0.1 M PB e conservati a 4 ° C. Sezioni coronali (35 μm) sono state tagliate con un microtomo congelatore (H400R, Micron, Germania), raccolte in quattro serie parallele in soluzione crioprotettiva (30% saccarosio e 30% etilenglicole in 0.1 M PB) e conservate a -20 ° C. Le sezioni flottanti libere sono state lavate estesamente con soluzione tampone fosfato 0.1 M (PBS, pH 7.3-7.4) tra le incubazioni. Le sezioni sono state esposte a 1% H₂O₂ per 10 min a temperatura ambiente per distruggere le perossidasi endogene, quindi bloccato in soluzione di incubazione PBS +, che è PBS contenente albumina di siero bovino 0.1% (articolo di catalogo 005-000-121; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) e 0.4% Triton X -100 (articolo di catalogo BP151-500; Sigma-Aldrich) per 1 h. Le sezioni sono state quindi incubate per una notte a 4 ° C in un anticorpo policlonale di coniglio pan-FosB (1: 5K; sc-48 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). L'anticorpo pan-FosB è stato sollevato contro una regione interna condivisa da FosB e ΔFosB. Le cellule ΔFosB-IR erano specificamente ΔFosB-positive perché al tempo post-stimolo (24 ore) tutto il FosB indotto dallo stimolo rilevabile è degradato (Perrotti et al. 2004; Perrotti et al. 2008). Inoltre, in questo esperimento, gli animali che si accoppiavano l'ultimo giorno (NS, ES) sono stati sacrificati 1 h dopo l'accoppiamento, quindi prima dell'espressione di FosB. L'analisi Western blot ha confermato il rilevamento di ΔFosB a circa 37 kD. Dopo incubazione primaria di anticorpi, le sezioni sono state incubate per 1 h in IgG anti-coniglio di capra coniugato con biotina (1: 500 in PBS +; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) e poi 1 h in avidina-biotina-perosidasi di hoseradish (ABC elite ; 1: 1K in PBS; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). A seguito di questa incubazione le sezioni sono state elaborate in uno dei seguenti modi:

1. Singola etichettatura perossidasi

Sezioni di animali NNS ed ENS sono state utilizzate per un'analisi cerebrale dell'accumulo ΔFosB indotto dall'esperienza sessuale. Dopo l'incubazione ABC, il complesso della perossidasi è stato visualizzato dopo trattamento per 10 minuti a una soluzione cromogena contenente 0.02% 3,3'-diamminobenzidina tetraidrocloruro (DAB; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) potenziata con 0.02% nichel solfato in 0.1 M PB con perossido di idrogeno (0.015%). Le sezioni sono state lavate accuratamente in 0.1 M PB per terminare la reazione e montate su vetrini Superfrost più vetrini (Fisher, Pittsburgh, PA, USA) con gelatina 0.3% in ddH₂0. Dopo la disidratazione, tutti i vetrini sono stati coperti con DPX (dibutilftalato xilene).

2. Doppia immunofluorescenza

Le sezioni di tutti e quattro i gruppi sperimentali contenenti NAc e mPFC sono state utilizzate per l'analisi di ΔFosB e c-Fos. Dopo incubazione ABC, le sezioni sono state incubate per 10 min con tiramina biotinilata (BT; 1: 250 in PBS + 0.003% H₂O₂ Tyramid Signal Amplification Kit, NEN Life Sciences, Boston, MA) e per 30 min con strepavidina coniugata con Alexa 488 (1: 100, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA). Le sezioni sono state quindi incubate durante la notte con un anticorpo policlonale di coniglio che riconosce specificamente c-Fos (1: 150; sc-52; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), seguito da un'incubazione min 30 con anticorpo secondario coniugato Cy3 di capra anti-coniglio (1: 200; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA). Dopo la colorazione, le sezioni sono state lavate accuratamente in 0.1 M PB, montate su vetrini di vetro codificati con 0.3% di gelatina in ddH₂0 e copri-scivolo con un mezzo di montaggio acquoso (Gelvatol) contenente l'agente anti-sbiadimento 1,4-diazabiciclo (2,2) ottano (DABCO; 50 mg / ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). I controlli immunoistochimici includevano l'omissione di uno o entrambi gli anticorpi primari, con conseguente assenza di etichettatura nella lunghezza d'onda appropriata.

Analisi dei dati

Analisi del cervello di ΔFosB

Due sperimentatori ciechi al trattamento hanno eseguito la scansione del cervello su vetrini codificati. Le cellule ΔFosB-immunoreattive (-IR) in tutto il cervello sono state analizzate semi-quantitativamente usando una scala per rappresentare il numero di cellule ΔFosB-positive come delineato in Tabella 1. Inoltre, sulla base di risultati semiquantitativi, il numero di cellule ΔFosB-IR è stato conteggiato utilizzando aree standard di analisi nelle aree del cervello implicate in ricompensa e comportamento sessuale utilizzando un tubo di disegno lucida collegato a un microscopio Leica DMRD (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar , Germania): NAc (nucleo (C) e guscio (S); 400 × 600μm) analizzato a tre livelli rostrale-caudale (Balfour et al. 2004); area tegmentale ventrale (VTA; 1000 × 800μm) analizzata a tre livelli rostrale-caudale (Balfour et al. 2004) e VTA tail (Perrotti et al. 2005); corteccia prefrontale (area del cingolo anteriore (ACA); corteccia prelimbica (PL); corteccia infralimbica (IL); 600 × 800μm ciascuno); putamen caudato (CP; 800 × 800μm); e nucleo preottico mediale (MPN; 400 × 600 μm) (Figure supplementari 1-3). Sono state contate due sezioni per sottoregione e una media per animale per il calcolo della media del gruppo. Le medie di gruppo sessualmente ingenue ed esperte di cellule ΔFosB-IR sono state confrontate per ciascuna sub-regione usando t-test non appaiati.

Riassunto dell'espressione ΔFosB in animali sessualmente ingenui e con esperienza

Analisi di ΔFosB e c-Fos

Le immagini sono state acquisite utilizzando una camera CCD raffreddata (Microfire, Optronics) collegata a un microscopio Leica (DM5000B, Leica Microsystems; Wetzlar, Germania) e al software Neurolucida (MicroBrightfield Inc) con impostazioni fisse della fotocamera per tutti i soggetti (utilizzando gli obiettivi 10x). Numero di cellule che esprimono c-Fos-IR o ΔFosB-IR in aree standard di analisi nel nucleo e nella shell di NAc (400 × 600μm ciascuna; Figura complementare 1) e ACA del mPFC (600 × 800μm; Figura complementare 3) sono stati contati manualmente da un osservatore cieco ai gruppi sperimentali, nelle sezioni 2 per animale utilizzando il software Neurolucida (MBF Bioscience, Williston, VT) e una media per animale. Le medie di gruppo delle cellule c-Fos o ΔFosB sono state confrontate utilizzando ANOVA a due vie (Fattori: esperienza sessuale e attività sessuale) e LSD Fisher per confronti post hoc a un livello significativo di 0.05.

Esperimento 2: manipolazione dell'espressione ÀFosB

Trasferimento genico mediato da vettori virali

Ratti Sprague Dawley maschi sessualmente ingenui sono stati divisi casualmente in gruppi prima dell'intervento stereotassico. Tutti gli animali hanno ricevuto microiniezioni bilaterali di vettori virali adeno-associati ricombinanti (rAAV) che codificano GFP (controllo; n = 12), ΔFosB wild-type (n = 11) o un partner di legame dominante negativo di ΔFosB definito ΔJunD (n = 9) nel NAc. ΔJunD diminuisce la trascrizione mediata da FOSB mediante eterodimerizzazione competitiva con ΔFosB prima di legare la regione AP-1 all'interno di promotori di geni (Winstanley et al. 2007). Il titolo del virus è stato determinato da qPCR e valutato in vivo prima dell'inizio dello studio. Titolo era 1-2 × 10¹¹ particelle infettive per ml. i vettori rAAV sono stati iniettati in un volume di 1.5 μL / lato su 7 minuti (coordinate: AP + 1.5, ML +/- 1.2 di Bregma; DV -7.6 dalla superficie del cranio secondo Paxinos e Watson, 1998) utilizzando una siringa Hamilton (5μL ; Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA). I vettori non producono tossicità maggiore delle sole infusioni di controllo (Winstanley et al, 2007; per i dettagli sulla preparazione dell'AAV, vedere Hommel et al., 2003). Gli esperimenti comportamentali hanno iniziato 3 settimane dopo le iniezioni di vettori, consentendo un'infezione virale ottimale e stabile (Wallace et al. 2008). Espressione del transgene in picchi di specie murine ai giorni 10 e rimane elevata per almeno 6 mesi (Winstanley et al. 2007). Alla fine dell'esperimento, gli animali sono stati perfusi transcardialmente e le sezioni NAc sono state immuno-processate per GFP (1: 20K; anticorpo anti-GFP di coniglio; Sonde molecolari) utilizzando una reazione ABC-perossidasi-DAB (come descritto sopra) a livello istologico verificare i siti di iniezione usando GFP come marker (Figura complementare 4). I vettori ΔFosB e ΔJunD contengono anche un segmento che esprime GFP separato da un sito di ingresso ribosomiale interno, consentendo la verifica del sito di iniezione mediante visualizzazione GFP in tutti gli animali. Solo gli animali con siti di iniezione e diffusione del virus limitato al NAc sono stati inclusi nelle analisi statistiche. La diffusione del virus era generalmente limitata a una porzione del NAc e non si diffondeva rostralmente-caudalmente in tutto il nucleo. Inoltre, la diffusione del virus appariva per lo più limitata a shell o core. Tuttavia, la variazione dei siti di iniezione e la diffusione all'interno del NAc non ha influenzato gli effetti sul comportamento. Infine, le iniezioni di GFP non hanno influenzato il comportamento sessuale o la facilitazione indotta dall'esperienza del comportamento sessuale rispetto agli animali non chirurgici di studi precedenti (Balfour et al. 2004).

Comportamento sessuale

Tre settimane dopo il parto virale, animali accoppiati a un'eiaculazione (o per 1 ore) per 4 consecutivi, sessioni di accoppiamento giornaliere per acquisire esperienza sessuale (sessioni di esperienza) e successivamente testate per l'espressione a lungo termine dell'esperienza indotta facilitazione del comportamento sessuale 1 e 2 settimane (sessioni di test 1 e 2) dopo la sessione di esperienza finale. I parametri del comportamento sessuale sono stati registrati durante tutte le sessioni di accoppiamento come descritto sopra. Le differenze statistiche per tutti i parametri durante ogni sessione di accoppiamento sono state confrontate all'interno e tra i gruppi utilizzando misure ANOVA ripetute a due vie (fattori: trattamento e sessione di accoppiamento) o ANOVA unidirezionali (latenza dell'eiaculazione, numero di supporti e intromissioni; Fattore: trattamento o accoppiamento sessione) seguiti dai test Fisher LSD o Newman-Keuls per i confronti post hoc a un livello significativo di 0.05. Nello specifico, gli effetti facilitativi dell'esperienza sessuale sui parametri di accoppiamento sono stati confrontati tra la sessione di esperienza 1 (ingenua) e le sessioni di esperienza 2, 3 o 4 ciascuna, nonché tra gruppi sperimentali all'interno di ciascuna sessione di esperienza. Inoltre, per analizzare gli effetti del trattamento (vettore) sulla facilitazione a lungo termine del comportamento sessuale, i parametri di accoppiamento sono stati confrontati tra la sessione 4 e la sessione 1 e 2 all'interno di ciascun gruppo di trattamento e confrontati tra gruppi sperimentali all'interno di ciascuna sessione di test.

RISULTATI

L'esperienza sessuale causa l'accumulo di ΔFosB

Inizialmente, è stata condotta un'indagine semiquantitativa sull'accumulo di ÀFosB in tutto il cervello in maschi sessualmente esperti rispetto ai controlli sessualmente innocenti. Una sintesi dei risultati generali è fornita in Tabella 1. L'analisi ΔFosB-IR è stata ulteriormente migliorata determinando il numero di cellule ΔFosB-IR in diverse regioni del cervello associate al limbico utilizzando aree standard di analisi. Figure 1 dimostra immagini rappresentative di DAB-Ni che colorano il NAc di animali sessualmente ingenui e con esperienza. È stata trovata una significativa regolazione del ΔFosB nelle sottoregioni di mPFC (Figura 2A), NAc core e shell (2B), caudate putamen (2B) e VTA (2C). In NAc, esistevano differenze significative a tutti i livelli rostrale-caudali nel nucleo e nella shell di NAc, e i dati mostrati in Figure 2 è la media su tutti i livelli rostro-caudali. Al contrario, non vi era un aumento significativo di ΔFosB-IR nel nucleo preottico mediale ipotalamico (NNS: Avg 1.8 +/- 0.26; ENS: Avg 6.0 +/- 1.86).

Immagini rappresentative che mostrano celle ΔFosB-IR (nere) nel NAc di gruppi naïve senza sesso (A) e esperienza senza sesso (B). aco: commissura anteriore La barra della scala indica 100 μm.

Numero di cellule ΔFosB-IR in: subregioni della corteccia prefrontale mediale A. infralimbica (IL), prelimbica (PL) e corteccia cingolata anteriore (ACA); B. Nucleo accumbens core e shell e caudate putamen (CP); C. Rostrale, medio, caudale e coda ...

L'esperienza sessuale attenua i c-Fos indotti dall'accoppiamento

L'effetto dell'esperienza sessuale sui livelli di ΔFosB nel NAc è stato confermato usando tecniche di colorazione a fluorescenza. Inoltre, sono stati analizzati gli effetti dell'esperienza sessuale sull'espressione di c-Fos. Figure 3 mostra immagini rappresentative di cellule ΔFosB- (verde) e c-Fos (rosso) -IR in tutti i gruppi sperimentali (A, NNS; B, NS; C, ENS; D, ES). L'esperienza sessuale ha aumentato significativamente l'espressione di ÀFosB nel core NAc (Figura 4A: F_1,15 = 12.0; p = 0.003) e shell (Figura 4C: F_1,15 = 9.3; p = 0.008). Al contrario, l'accoppiamento 1 ora prima della perfusione, non ha avuto un effetto sull'espressione ΔFosB (Figura 4A, C) e non è stata rilevata alcuna interazione tra esperienza sessuale e accoppiamento immediatamente prima della perfusione. C'è stato un effetto complessivo dell'accoppiamento prima della perfusione sull'espressione c-Fos sia nel core NAc (Figura 4B: F_1,15 = 27.4; p <0.001) e shell (Figura 4D: F_1,15 = 39.4; p <0.001). Inoltre, un effetto complessivo dell'esperienza sessuale è stato rilevato nel nucleo NAc (Figura 4B: F_1,15 = 6.1; p = 0.026) e shell (Figura 4D: F_1,15 = 1.7; p = 0.211) e un'interazione tra esperienza sessuale e accoppiamento prima della perfusione è stata rilevata nel nucleo di NAc (F_1,15 = 6.5; p = 0.022), con una tendenza nella shell (F_1,15 = 1.7; p = 0.211; F_1,15 = 3.4; p = 0.084). Analisi post hoc hanno dimostrato l'espressione di c-Fos indotta dall'accoppiamento nel nucleo e nel guscio di maschi sessualmente ingenui (Figura 4B, D). Tuttavia, nei maschi sessualmente esperti, il c-Fos non era significativamente aumentato nel nucleo di NAc (Figura 4B) e significativamente attenuato nel guscio (Figura 4D). Pertanto, l'esperienza sessuale ha causato una riduzione dell'espressione c-Fos indotta dall'accoppiamento. I valori P per specifici confronti a coppie sono nelle legende delle figure.

Immagini rappresentative che mostrano ΔFosB (verde) e c-Fos (rosso) in NAc per ciascun gruppo sperimentale. La barra della scala indica 100 μm.

ΔFosB indotto dall'esperienza sessuale e c-Fos indotto da accoppiamento. Numeri di cellule immunoreattive ΔFosB (Core, A; Shell, C; ACA, E) o c-Fos (Core, B; Shell; D; ACA, F) per ciascun gruppo: NNS (n = 5), NS (n = 5), ENS (n = 5) o ES (n = 4). I dati sono espressi ...

L'effetto dell'esperienza sessuale sui livelli di c-Fos indotti dall'accoppiamento non era limitato al NAc. Un'analoga attenuazione dell'espressione di c-Fos è stata osservata nell'ACA in animali sessualmente esperti rispetto ai controlli sessualmente innocenti. L'esperienza sessuale ha avuto un effetto significativo sull'espressione ΔFosB nell'ACA (Figura 4E: F_1,15 = 154.2; p <0.001). L'accoppiamento prima della perfusione non ha avuto effetto sull'espressione di ΔFosB (Figura 4C) ma significativamente aumentato c-Fos (Figura 4F: F_1,15 = 203.4; p <0.001) nell'ACA. Inoltre, l'espressione di c-Fos indotta dall'accoppiamento nell'ACA è stata significativamente ridotta dall'esperienza sessuale (Figura 4F: F_1,15 = 15.8; p = 0.001). Un'interazione a due vie tra l'esperienza sessuale e l'accoppiamento prima della perfusione è stata rilevata per l'espressione c-Fos (Figura 4F: F_1,15 = 15.1; p <0.001). I valori P per confronti a coppie specifici sono nelle legende delle figure. Infine, non c'è stata una riduzione significativa nell'espressione di c-Fos indotta dall'accoppiamento nel nucleo preottico mediale (NS: Avg 63.5 +/- 4.0; ES: Avg 41.4 +/- 10.09), un'area in cui l'esperienza di accoppiamento non ha causato un aumento dell'espressione di ΔFosB, indicando che l'espressione di c-Fos indotta dall'accoppiamento non è stata influenzata in tutte le aree del cervello.

ΔFosB nel NAc media il rinforzo del comportamento sessuale

Per esplorare un potenziale meccanismo molecolare per il rinforzo del comportamento sessuale, come dimostrato dalla facilitazione indotta dall'esperienza del comportamento sessuale, sono stati determinati gli effetti della manipolazione locale dei livelli di ÀFosB e della sua attività trascrizionale. L'esperienza sessuale durante le quattro sessioni di esperienza consecutive ha avuto un effetto significativo sulla latenza del montante (Figura 5A: F_1,23 = 13.8; p = 0.001), latenza di intromissione (Figura 5B: F_1,23 = 18.1; p <0.001) e latenza dell'eiaculazione (Figura 5C: GFP, F_11,45 = 3.8; p = 0.006). Gli animali di controllo GFP hanno mostrato l'attesa facilitazione indotta dall'esperienza del comportamento sessuale e mostrato latenze significativamente più basse al primo attacco, prima intromissione ed eiaculazione durante la sessione di esperienza 4 rispetto alla sessione 1 (Figura 5A-C; vedere la legenda delle figure per i valori di p). Questa facilitazione del comportamento sessuale indotta dall'esperienza è stata osservata anche nel gruppo ΔFosB per le latenze di mount e di intromissione, ma non è stata rilevata una differenza significativa nella latenza dell'eiaculazione (Figura 5A-C). Al contrario, gli animali ΔJunD mostravano una facilitazione stentata; anche se le latenze per i montaggi, le intromissioni e le eiaculazioni diminuivano con ripetute sessioni di accoppiamento, nessuno di questi parametri raggiunse significatività statistica se confrontato tra le sessioni di esperienza 1 e 4 (Figura 5A-C). Tra i confronti di gruppo per ciascuna sessione di esperienza mostra che ΔJunD ha avuto latenze significativamente più lunghe per montare, intromettere ed eiaculare durante le sessioni di esperienza rispetto a ΔFosB e GFP (Figura 5A-C). Inoltre, sia l'esperienza sessuale che il trattamento hanno avuto effetti significativi sull'efficienza della copulazione (Figura 5F: esperienza sessuale, F_1,12 = 22.5; p <0.001; trattamento, F_1,12 = 3.3; p = 0.049). I maschi ΔFosB hanno aumentato l'efficienza di copulazione durante la sessione di esperienza 4 rispetto alla sessione 1 (Figura 5F). Inoltre, gli animali ΔFosB avevano significativamente meno supporti che precedono l'eiaculazione durante il giorno della sessione 4, rispetto alla sessione 1 (Figura 5D: F_10,43 = 4.1; p = 0.004), e che i maschi ΔJunD avevano significativamente più supporti che precedevano l'eiaculazione, riducendo così significativamente l'efficacia della copula, rispetto a uno degli altri due gruppi (Figura 5D e F). Pertanto, gli animali GFP e ΔFosB mostravano una facilitazione indotta dall'esperienza del comportamento sessuale e delle prestazioni sessuali, mentre gli animali non vivevano.

Comportamento sessuale degli animali GFP (n = 12), ΔFosB (n = 11) e ΔJunD (n = 9): latenza di montaggio (A), latenza di intromissione (B), latenza di eiaculazione (C), numero di supporti (D), numero di intromissioni (E) e efficienza di copulazione (F). I dati sono espressi ...

Per verificare l'ipotesi che l'espressione di ÀFosB sia fondamentale per l'espressione a lungo termine della facilitazione indotta dall'esperienza del comportamento sessuale, gli animali sono stati sottoposti a test 1 settimane (sessione di test 1) e 2 (sessione di test 2) dopo la sessione di esperienza finale. Infatti, il comportamento sessuale facilitato è stato mantenuto in entrambi i gruppi GFP e ΔFosB in quanto nessuno dei parametri comportamentali differiva tra le sessioni di test 1 o 2 e la sessione di esperienza finale 4, all'interno dei gruppi GFP e ΔFosB (Figura 5A-C; ad eccezione della latenza dell'eiaculazione e dell'efficienza di copulazione nella sessione di test 1 per gli animali ΔFosB). Differenze significative tra gli animali ΔJunD e GFP o ΔFosB sono stati rilevati in entrambe le sessioni di test per tutti i parametri di comportamento sessuale (Figura 5A-F). Non sono state rilevate differenze tra o all'interno di gruppi quando si confrontano i numeri di intromissioni, PEI o percentuali di animali che sono stati eiaculati (100% di maschi in tutti i gruppi eiaculati durante le ultime quattro sessioni di accoppiamento).

DISCUSSIONE

L'attuale studio ha dimostrato che l'esperienza sessuale causa un accumulo di ΔFosB in diverse regioni del cervello associate al limbic, tra cui il nucleo e la shell di NAc, mPFC, VTA e caudato putamen. Inoltre, l'esperienza sessuale attenuava l'espressione indotta dall'accoppiamento di c-Fos nel NAc e ACA. Infine, ΔFosB nel NAc ha dimostrato di essere fondamentale nel facilitare la mediazione dell'accoppiamento durante l'acquisizione dell'esperienza sessuale e l'espressione a lungo termine della facilitazione indotta dall'esperienza del comportamento sessuale. In particolare, la riduzione della trascrizione mediata da ΔFOSB ha attenuato la facilitazione indotta dall'esperienza della motivazione sessuale e delle prestazioni, mentre la sovraespressione di ΔFosB in il NAc ha causato una maggiore facilitazione del comportamento sessuale, in termini di aumento delle prestazioni sessuali con meno esperienza. Insieme, le scoperte attuali supportano l'ipotesi che ΔFosB sia un mediatore molecolare critico per la plasticità neuronale e comportamentale a lungo termine indotta dall'esperienza sessuale.

Le scoperte attuali estendono studi precedenti che mostrano ΔFosB indotto dall'esperienza sessuale nel NAc nei ratti maschi (Wallace et al. 2008) e criceti femminili (Hedges et al. 2009). Wallace et al. (2008) ha dimostrato che rAAV-La sovraespressione di ÀFosB nel NAc ha migliorato il comportamento sessuale negli animali sessualmente ingenui durante la prima sessione di accoppiamento, come evidenziato da un minor numero di intromissioni all'eiaculazione e da intervalli post-eiaculatori più brevi, ma non ha avuto effetti sui maschi sessualmente esperti (Wallace et al. 2008).

Al contrario, l'attuale studio non ha dimostrato effetti della sovraespressione ΔFosB nei maschi sessualmente naïve durante il primo test, ma piuttosto durante e dopo l'acquisizione di esperienza sessuale. Gli over-expressors di ÀFosB hanno dimostrato un aumento delle prestazioni sessuali (maggiore efficienza di copulazione) rispetto agli animali GFP.

Inoltre, l'attuale studio ha testato il ruolo di ΔFosB bloccando la trascrizione mediata da ΔFosB utilizzando un vettore virale che esprime ΔJunD. La prevenzione dell'esperienza indotta dall'esperienza dell'espressione ΔFosB ha inibito la facilitazione indotta dall'esperienza della motivazione sessuale (aumentata latenza di supporto e di intromissione) così come le prestazioni sessuali (aumento della latenza dell'eiaculazione e numero di cavalcature) e successiva espressione a lungo termine del comportamento sessuale facilitato.

Quindi, questi dati sono i primi a indicare un ruolo obbligatorio per ΔFosB nell'acquisizione della facilitazione indotta dall'esperienza del comportamento sessuale. Inoltre, questi dati mostrano che ΔFosB è anche criticamente coinvolto nell'espressione a lungo termine del comportamento facilitato indotto dall'esperienza. Proponiamo che questa espressione a lungo termine di comportamento facilitato rappresenti una forma di memoria per la ricompensa naturale, quindi ΔFosB in NAc è un mediatore della memoria di ricompensa. L'esperienza sessuale ha anche aumentato i livelli di ÀFosB nel VTA e nell'mPFC, aree implicate nella ricompensa e nella memoria (Balfour et al. 2004; Phillips et al. 2008). Sono necessari studi futuri per chiarire un potenziale significato di up-regulation ΔFosB in queste aree per la memoria di ricompensa.

L'espressione ΔFosB è altamente stabile, quindi ha un grande potenziale come mediatore molecolare di adattamenti persistenti del cervello dopo perturbazioni croniche (Nestler et al. 2001). ΔFosB ha dimostrato di aumentare gradualmente il NAc su più iniezioni di cocaina e persistere per un massimo di diverse settimane (Spero et al. 1992; Spero et al. 1994). Questi cambiamenti nell'espressione di NAc ΔFosB sono associati a sensibilizzazione e dipendenza da farmaci (Chao & Nestler 2004; McClung & Nestler 2003; McClung et al. 2004; Nestler 2004, 2005, 2008; Nestler et al. 2001; Zachariou et al. 2006). Al contrario, il ruolo di ΔFosB nel mediare la ricompensa naturale è stato sottovalutato. Recenti prove sono emerse suggerendo che l'induzione di ΔFosB nel NAc è coinvolta in ricompensa naturale. I livelli di ÀFosB sono aumentati in modo simile nel NAc dopo l'assunzione di saccarosio e il funzionamento della ruota. La sovraespressione di ΔFosB nello striato usando topi transgenici o vettori virali nei ratti causa un aumento dell'assunzione di saccarosio, motivazione migliorata per il cibo e aumento della corsa spontanea della ruota (Olausson et al. 2006; Wallace et al. 2008; Werme et al. 2002). I dati attuali si aggiungono sostanzialmente a questi rapporti e supportano ulteriormente la nozione che ΔFosB è un mediatore critico per il rafforzamento della ricompensa e la memoria della ricompensa naturale.

ΔFosB può mediare il rinforzo del comportamento sessuale indotto dall'esperienza attraverso l'induzione della plasticità nel sistema mesolimbico. In effetti, l'esperienza sessuale provoca una serie di cambiamenti duraturi nel sistema mesolimbico (Bradley & Meisel 2001; Frohmader et al. 2009; Brocche et al. 2010). Ilt il livello comportamentale, una risposta locomotoria sensibilizzata all'anfetamina e una ricompensa di anfetamina migliorata sono stati mostrati in ratti maschi sessualmente esperti (Brocche et al. 2010); una alterata risposta locomotoria all'anfetamina è stata osservata anche con criceti femmina (Bradley & Meisel 2001). Inoltre, sono stati riscontrati aumenti del numero di spine dendritiche e la complessità dei pergolati dendritici dopo un periodo di astinenza dall'esperienza sessuale nei ratti maschi (Brocche et al. 2010). Lo studio attuale suggerisce che ΔFosB potrebbe essere uno specifico mediatore molecolare dei risultati a lungo termine dell'esperienza sessuale. In accordo, ΔFosB è stato recentemente dimostrato di essere importante per indurre cambiamenti della colonna vertebrale dendritica in risposta alla somministrazione cronica di cocaina (Dietz et al. 2009; Maze et al. 2010).

Non è chiaro quale neurotrasmettitore (i) a monte sia responsabile di indurre ΔFosB nel NAc, ma il DA è stato proposto come candidato (Nye et al. 1995). Praticamente tutte le droghe d'abuso, tra cui cocaina, anfetamina, oppiacei, cannabinoidi ed etanolo, oltre a premi naturali, aumentano ΔFosB nel NAc (Perrotti et al. 2005; Wallace et al. 2008; Werme et al. 2002). Sia le droghe d'abuso che i benefici naturali aumentano la concentrazione di DA sinaptica nel NAc (Damsma et al. 1992; Hernandez e Hoebel 1988a, b; Jenkins & Becker 2003). L'induzione ΔFosB da parte di droghe d'abuso è stata dimostrata nelle cellule contenenti recettori DA e il ΔFosB indotto dalla cocaina è bloccato da un antagonista del recettore D1 DAt (Nye et al. 1995). Quindi, il rilascio di DA è ipotizzato per stimolare l'espressione di ÀFosB e quindi mediare la neuroplasticità legata alla ricompensa. Sostenendo ulteriormente l'idea che i livelli di ÀFosB siano dipendenti dalla DA è la scoperta che le aree del cervello in cui l'esperienza sessuale ha alterato i livelli di ΔFosB ricevono un forte input dopaminergico dal VTA, inclusa la corteccia prefrontale mediale e l'amigdala basolaterale.

Tuttavia, al contrario, il ΔFosB non è aumentato nell'area preottica mediale, anche se quest'area riceve input dopaminergici, anche se da fonti ipotalamiche (Miller & Lonstein 2009). Sono necessari studi futuri per verificare se l'espressione ΔFosB indotta da accoppiamento e gli effetti dell'esperienza sessuale sulla motivazione sessuale e le prestazioni dipendono dall'azione DA. Il ruolo di DA nella ricompensa sessuale nei ratti maschi non è attualmente del tutto chiaro (Agmo & Berenfeld 1990; Pfaus 2009). Vi sono ampie prove che il DA viene rilasciato nel NAc durante l'esposizione a una femmina o accoppiamento (Damsma et al. 1992) e i neuroni DA sono attivati durante il comportamento sessuale (Balfour et al. 2004). Tuttavia, le iniezioni sistemiche di antagonista del recettore DA non impediscono la preferenza del luogo condizionato indotto dalla ricompensa sessuale (Agmo & Berenfeld 1990) e l'ipotesi che la DA sia fondamentale per il rinforzo indotto dall'esperienza dell'accoppiamento non è stata testata.

Inoltre, non è chiaro quali siano i mediatori a valle degli effetti ΔFosB sul comportamento sessuale. ΔFosB ha dimostrato di agire sia come attivatore trascrizionale che come repressore attraverso un meccanismo dipendente da AP-1 (McClung & Nestler 2003; Peakman et al. 2003). Sono stati identificati numerosi geni bersaglio, tra cui il gene c-fos precoce immediato (Spero et al. 1992; Spero et al. 1994; Morgan & Curran 1989; Renthal et al. 2008; Zhang et al. 2006), cdk5 (Bibb et al. 2001), dinorfina (Zachariou et al. 2006), sirtuin-1 (Renthal et al. 2009), Subunità NFκB (Ang et al. 2001) Dele la subunità GluR2 del recettore del glutammato AMPA (Kelz et al. 1999). I risultati attuali dimostrano che i livelli di c-Fos indotti dall'accoppiamento sono stati ridotti dall'esperienza sessuale nelle aree del cervello con un aumento di ΔFosB (NAc e ACA). La soppressione di c-Fos sembra dipendere dal periodo trascorso dall'ultimo accoppiamento e ripetute sedute di accoppiamento, come negli studi precedenti, tale diminuzione del c-Fos non è stata rilevata nei ratti maschi testati durante la settimana 1 successiva alla sessione di accoppiamento finale (Balfour et al. 2004) o dopo un'esperienza sessuale consistente in un'unica sessione di accoppiamento (Lopez & Ettenberg 2002). Inoltre, l'attuale scoperta è coerente con l'evidenza che ΔFosB reprime il gene c-fos dopo esposizione cronica alle anfetamine (Renthal et al. 2008). In linea con questi risultati, l'induzione di numerosi mRNA di geni precoci immediati (c-fos, fosB, c-jun, junB e zif268) è stata ridotta a seguito di ripetute iniezioni di cocaina rispetto alle iniezioni di farmaci acuti (Spero et al. 1992; Spero et al. 1994) e il c-fos indotto dalle anfetamine è stato soppresso in seguito al ritiro dalla somministrazione cronica di anfetamine (Jaber et al. 1995; Renthal et al. 2008). La rilevanza funzionale della down-regulation dell'espressione di c-Fos dopo trattamento farmacologico cronico o esperienza sessuale rimane poco chiara, ed è stato suggerito di essere un importante meccanismo omeostatico per regolare la sensibilità di un animale all'esposizione ripetuta alla ricompensa (Renthal et al. 2008).

In conclusione, l'attuale studio dimostra che ΔFosB nel NAc svolge un ruolo fondamentale nella memoria della ricompensa sessuale, supportando la possibilità che ΔFosB sia importante per il rafforzamento della ricompensa generale e la memoria. I risultati del presente studio chiariscono ulteriormente la nostra comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari che mediano la ricompensa e la motivazione sessuale, e aggiungono un corpus di letteratura che mostra che ΔFosB è un giocatore importante nello sviluppo della dipendenza, dimostrando un ruolo per ΔFosB in ricompensa naturale rinforzo.

Materiale supplementare

Supporta Fig S1-S4 e Tabella S1-S2

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Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni dal Canadian Institutes of Health Research a LMC, National Institute of Mental Health a EJN e Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada a KKP e LMC.

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